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Bioengineering

माइक्रोबियल रासायनिक और प्रोटीन उत्पादन के लिए प्रकाश-नियंत्रित किण्वन

Published: March 22, 2022 doi: 10.3791/63269
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3,4
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University
* These authors contributed equally

Summary

माइक्रोबियल चयापचय का ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण किण्वन प्रक्रियाओं पर लचीला गतिशील नियंत्रण प्रदान करता है। यहां प्रोटोकॉल से पता चलता है कि विभिन्न वॉल्यूमेट्रिक पैमाने पर रासायनिक और प्रोटीन उत्पादन के लिए नीले प्रकाश-विनियमित किण्वन कैसे स्थापित किए जाएं।

Abstract

माइक्रोबियल सेल कारखानों नवीकरणीय feedstocks से रसायनों और पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक स्थायी विकल्प प्रदान करते हैं। हालांकि, आनुवांशिक संशोधनों के साथ एक सूक्ष्मजीव पर अधिक बोझ डालना मेजबान फिटनेस और उत्पादकता को कम कर सकता है। इस समस्या को गतिशील नियंत्रण का उपयोग करके दूर किया जा सकता है: एंजाइमों और मार्गों की अपरिवर्तनीय अभिव्यक्ति, आमतौर पर सेलुलर विकास और उत्पादन को संतुलित करने के लिए रासायनिक या पोषक तत्व-आधारित एडिटिव्स का उपयोग करके। ऑप्टोजेनेटिक्स जीन अभिव्यक्ति को गतिशील रूप से विनियमित करने की एक गैर-आक्रामक, अत्यधिक ट्यूनेबल और प्रतिवर्ती विधि प्रदान करता है। यहां, हम वर्णन करते हैं कि रसायनों या पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए इंजीनियर एस्चेरिचिया कोलाई और Saccharomyces cerevisiae के प्रकाश-नियंत्रित किण्वन को कैसे स्थापित किया जाए। हम चर्चा करते हैं कि चयनित समय पर प्रकाश कैसे लागू किया जाए और बेहतर किण्वन नियंत्रण और उत्पादकता के लिए माइक्रोबियल विकास और उत्पादन को कम करने के लिए खुराक, साथ ही साथ सर्वोत्तम परिणामों के लिए प्रमुख अनुकूलन विचार। इसके अतिरिक्त, हम वर्णन करते हैं कि प्रयोगशाला-पैमाने पर बायोरिएक्टर प्रयोगों के लिए प्रकाश नियंत्रण को कैसे लागू किया जाए। ये प्रोटोकॉल बेहतर किण्वन प्रदर्शन के लिए इंजीनियर सूक्ष्मजीवों में ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण को अपनाने की सुविधा प्रदान करते हैं।

Introduction

ऑप्टोजेनेटिक्स, प्रकाश-उत्तरदायी प्रोटीन के साथ जैविक प्रक्रियाओं का नियंत्रण, रासायनिक और प्रोटीन उत्पादन के लिए गतिशील रूप से माइक्रोबियल किण्वन को नियंत्रित करने के लिए एक नई रणनीति प्रदान करता है1,2। इंजीनियर चयापचय मार्गों का बोझ और कुछ मध्यवर्ती और उत्पादों की विषाक्तता अक्सर सेल विकास को बाधित करती है3। इस तरह के तनाव खराब बायोमास संचय और कम उत्पादकता 3 को जन्म दे सकते हैं। इस चुनौती को अस्थायी रूप से किण्वन को विकास और उत्पादन चरण में विभाजित करके संबोधित किया जा सकता है, जो क्रमशः बायोमास संचय या उत्पाद संश्लेषण के लिए चयापचय संसाधनों को समर्पित करते हैं। हमने हाल ही में दिखाया है कि इस दो-चरण किण्वन में विकास से उत्पादन के लिए संक्रमण को रोशनी की स्थिति में परिवर्तन के साथ प्रेरित किया जा सकता है5,6,7। प्रकाश इनपुट 8 की उच्च tunability, उत्क्रमण, और orthogonality प्रकाश-नियंत्रित किण्वन के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं जो पारंपरिक दो-चरण किण्वन4,9,10,11 के गतिशील नियंत्रण में उपयोग किए जाने वाले रासायनिक प्रेरकों के साथ दोहराने के लिए मुश्किल या असंभव हैं।

एरिथ्रोबैक्टर लिटोरलिस से व्युत्पन्न नीले प्रकाश उत्तरदायी EL222 प्रोटीन का उपयोग Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13 में चयापचय इंजीनियरिंग के लिए कई ऑप्टोजेनेटिक सर्किट विकसित करने के लिए किया गया है। EL222 में एक प्रकाश-ऑक्सीजन-वोल्टेज सेंसर (LOV) डोमेन होता है जो नीले प्रकाश सक्रियण (465 एनएम) पर एक संरचनात्मक बदलाव से गुजरता है, जो इसे अपने संज्ञेय डीएनए अनुक्रम (C120)13 को बांधने की अनुमति देता है। वायरल VP16 सक्रियण डोमेन (VP16-EL222) के लिए EL222 फ्यूजिंग एक नीले प्रकाश उत्तरदायी प्रतिलेखन कारक है कि प्रतिवर्ती सिंथेटिक प्रमोटर PC120 से S. cerevisiae7 और अन्य जीवों 14 में जीन अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकते हैं में परिणाम. EL222 पर आधारित कई सर्किट विकसित किए गए हैं और S. cerevisiae में रासायनिक उत्पादन के लिए उपयोग किए जाते हैं, जैसे कि मूल प्रकाश-सक्रिय OptoEXP system7, जिसमें ब्याज का जीन सीधे PC120 (चित्रा 1A) से व्यक्त किया जाता है। हालांकि, उच्च सेल घनत्व पर प्रकाश प्रवेश की चिंताओं को आमतौर पर किण्वन के उत्पादन चरण में सामना करना पड़ता है, हमें उल्टे सर्किट विकसित करने के लिए प्रेरित किया जाता है जो अंधेरे में प्रेरित होते हैं, जैसे कि OptoINVRT और OptoQ-INVRT सर्किट (चित्रा 1B) 5,7,13। ये प्रणालियां गैलेक्टोज (जीएएल) या क्विनिक एसिड (क्यू) रेग्यूलन को क्रमशः एस सेरेविसिया और एन क्रैसा से उपयोग करती हैं, जो वीपी 16-ईएल 222 के साथ अपने संबंधित दमनकर्ताओं (GAL80 और QS) को नियंत्रित करती हैं, ताकि प्रकाश में जीन अभिव्यक्ति को दबाया जा सके और इसे अंधेरे में दृढ़ता से प्रेरित किया जा सके। OptoEXP और OptoINVRT सर्किट के संयोजन के परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति का द्विदिश नियंत्रण होता है, जिससे दो-चरण किण्वन सक्षम होते हैं जिसमें विकास चरण नीली रोशनी के साथ प्रेरित होता है, और अंधेरे के साथ उत्पादन चरण (चित्रा 2 ए) 5,7।

उत्पादन चरण के दौरान जीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए अंधेरे के बजाय प्रकाश का उपयोग करने से ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण की क्षमताओं का बहुत विस्तार होगा, लेकिन आमतौर पर किण्वन के इस चरण में सामना किए जाने वाले उच्च सेल घनत्व की प्रकाश प्रवेश सीमाओं पर काबू पाने की भी आवश्यकता होगी। इस अंत तक, हमने सर्किट विकसित किए हैं, जिन्हें OptoAMP और OptoQ-AMP के रूप में जाना जाता है, जो नीली रोशनी उत्तेजना के लिए ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रिया को बढ़ाते हैं। ये सर्किट VP16-EL222 के जंगली-प्रकार या अतिसंवेदनशील उत्परिवर्ती का उपयोग करते हैं ताकि GAL या Q regulons के ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर Gal4p या QF2 के उत्पादन को नियंत्रित किया जा सके, क्रमशः, light12,13 (चित्रा 1C) के साथ बढ़ी हुई संवेदनशीलता और मजबूत जीन अभिव्यक्ति प्राप्त की जा सके। OptoAMP सर्किट एक ऑप्टिकल घनत्व (600 एनएम पर मापा) पर 5 एल बायोरिएक्टर में पूर्ण और सजातीय प्रकाश प्रेरण प्राप्त कर सकते हैं; OD600) कम से कम 40 के मूल्यों में केवल ~ 0.35% रोशनी के साथ (थोक सतह के केवल ~ 7% पर 5% प्रकाश खुराक)। यह OptoEXP की तुलना में संवेदनशीलता की एक उच्च डिग्री को दर्शाता है, जिसके लिए 100% रोशनी 12 के करीब की आवश्यकता होती है। उच्च कोशिका घनत्व पर प्रकाश के साथ जीन अभिव्यक्ति को प्रभावी ढंग से प्रेरित करने की क्षमता किण्वन के गतिशील नियंत्रण के लिए नए अवसर खोलती है। इसमें दो से अधिक अस्थायी चरणों में ऑपरेटिंग किण्वन शामिल हैं, जैसे कि तीन-चरण किण्वन, जिसमें विकास, प्रेरण और उत्पादन चरण रासायनिक उत्पादन को अनुकूलित करने के लिए अद्वितीय प्रकाश अनुसूचियों के साथ स्थापित किए जाते हैं (चित्रा 2 बी) 12।

Figure 1
चित्रा 1: S. cerevisiae के गतिशील नियंत्रण के लिए ऑप्टोजेनेटिक सर्किट। OptoEXP, OptoINVRT, और OptoAMP सर्किट प्रकाश-संवेदनशील VP16-EL222 सिस्टम पर आधारित हैं। (ए) ऑप्टोएक्सपी सर्किट में, नीली रोशनी के संपर्क में आने से वीपी 16-ईएल 222 के एक संरचनात्मक परिवर्तन और dimerization का कारण बनता है, जो डीएनए-बाइंडिंग डोमेन को उजागर करता है और PC120 से प्रतिलेखन की अनुमति देता है। इस आंकड़े को झाओ एट अल.7 से संशोधित किया गया है। (बी) OptoINVRT सर्किट अंधेरे में अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए GAL (दिखाया गया) या Q regulons का दोहन करता है। GAL-आधारित परिपथों में, VP16-EL222 और GAL4 को संरचनात्मक रूप से व्यक्त किया जाता है, जबकि PC120 GAL80 दमनकारी की अभिव्यक्ति को चलाता है (Q-आधारित सर्किट में, GAL4 और GAL80 को क्रमशः QF2 और QS द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, और GAL प्रमोटर के बजाय एक सिंथेटिक QUAS-युक्त प्रमोटर का उपयोग किया जाता है)। प्रकाश में, Gal80p PGAL1 से ब्याज के जीन के सक्रियण को रोकता है। अंधेरे में, GAL80 व्यक्त नहीं किया जाता है और इसे एक संवैधानिक डिग्रोन डोमेन (छोटे भूरे रंग के डोमेन) में फ्यूज करके तेजी से अपमानित किया जाता है, जो Gal4p द्वारा PGAL1 के सक्रियण के लिए अनुमति देता है। यह आंकड़ा झाओ एट अल.5 से संशोधित किया गया है। (C) OptoAMP सर्किट भी VP16-EL222 का उपयोग करने के लिए GAL (दिखाया गया) या Q regulons को नियंत्रित करने के लिए। इन सर्किटों में, GAL80 दमनकारी (या क्यूएस) को संरचनात्मक रूप से व्यक्त किया जाता है और अंधेरे में तंग दमन सुनिश्चित करने वाले फोटो-संवेदनशील डिग्रोन (छोटे नीले डोमेन) से जुड़ा होता है। PC120 और एक अतिसंवेदनशील VP16-EL222 उत्परिवर्ती नियंत्रण अभिव्यक्ति GAL4 (या QF2) प्रकाश के साथ, जो दृढ़ता से प्रकाश में PGAL1 (या एक QUAS युक्त प्रमोटर) को सक्रिय करता है। GAL-व्युत्पन्न सर्किट PGAL1 के इंजीनियर रूपों का उपयोग कर सकते हैं, जैसे कि PGAL1-M या PGAL1-S, जिसमें गतिविधि में वृद्धि हुई है, साथ ही GAL regulon (PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7) द्वारा नियंत्रित जंगली प्रकार के प्रमोटर भी हैं। इस आकृति को Zhao et al.12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: समय के माध्यम से दो- और तीन-चरण किण्वन। (A) उल्टे सर्किट के साथ संचालित दो-चरण किण्वनों में एक प्रकाश-संचालित विकास चरण और एक अंधेरे उत्पादन चरण शामिल होते हैं। विकास चरण में, बायोमास जमा होता है क्योंकि उत्पादन मार्ग दमित रहता है। वांछित OD600 तक पहुंचने पर, कोशिकाओं को उत्पादन चरण के लिए ताजा मीडिया में पुन: निलंबित होने से पहले चयापचय रूप से समायोजित करने के लिए अंधेरे में स्थानांतरित कर दिया जाता है। (बी) तीन चरण की प्रक्रिया में, विकास, इनक्यूबेशन, और उत्पादन चरणों को अद्वितीय प्रकाश अनुसूचियों द्वारा परिभाषित किया जाता है, जिसमें एक अंधेरे विकास अवधि, स्पंदित इनक्यूबेशन और पूरी तरह से प्रकाशित उत्पादन चरण शामिल हो सकते हैं। चित्र Biorender के साथ बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऑप्टोजेनेटिक सर्किट भी ई कोलाई में रासायनिक और प्रोटीन उत्पादन के गतिशील नियंत्रण के लिए विकसित किए गए हैं। OptoLAC सर्किट प्रकाश-उत्तरदायी pDawn सर्किट का उपयोग करके जीवाणु LacI दमनकारी को नियंत्रित करते हैं, जो YF1 / FixJ दो-घटक system6 (चित्रा 3) पर आधारित है। OptoINVRT5 के समान, OptoLAC सर्किट को प्रकाश में जीन अभिव्यक्ति को दबाने और अंधेरे में इसे प्रेरित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। OptoLAC सर्किट का उपयोग करके अभिव्यक्ति का स्तर मानक आइसोप्रोपाइल β-डी-1-थायोगैलेक्टोप्रानोसाइड (आईपीटीजी) प्रेरण के साथ प्राप्त किए गए लोगों से मेल खा सकता है या उससे अधिक हो सकता है, इस प्रकार रासायनिक प्रेरण की ताकत को बनाए रखता है, जबकि बढ़ी हुई ट्यूनेबिलिटी और उत्क्रमण 6 की पेशकश करता है। इसलिए, ऑप्टोलैक सर्किट ई कोलाई में चयापचय इंजीनियरिंग के लिए प्रभावी ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण को सक्षम करते हैं।

Figure 3
चित्रा 3: ई कोलाई के गतिशील नियंत्रण के लिए OptoLAC सर्किट। OptoLAC सर्किट अंधेरे में सक्रियण और प्रकाश में दमन प्राप्त करने के लिए pDawn प्रणाली और लाख operon अनुकूलित. अंधेरे में, YF1 फॉस्फोराइलेट्स FixJ, जो तब CI दमनकर्ता को व्यक्त करने के लिए PFixK2 प्रमोटर को सक्रिय करता है। सीआई दमनकारी पीआर प्रमोटर से एलएसीआई दमनकर्ता की अभिव्यक्ति को रोकता है, जो एक लाखो-युक्त प्रमोटर से ब्याज के जीन के प्रतिलेखन की अनुमति देता है। इसके विपरीत, नीली रोशनी वाईएफ 1 नेट किनेज गतिविधि को कम करती है, फिक्सजे फॉस्फोराइलेशन को उलट देती है और इस प्रकार सीआई अभिव्यक्ति, जो एलएसीआई की अभिव्यक्ति को कम करती है और एलएसीओ-युक्त प्रमोटर से अभिव्यक्ति को रोकती है। इस आंकड़े को लालवानी एट अल.6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हम यहां रासायनिक या प्रोटीन उत्पादन के लिए एस सेरेविसिया और ई कोलाई के प्रकाश-नियंत्रित किण्वन के लिए बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। खमीर और बैक्टीरिया दोनों के लिए, हम पहले एक प्रकाश-संचालित विकास चरण और ऑप्टोइनवीआरटी और ऑप्टोलैक सर्किट द्वारा सक्षम एक अंधेरे-प्रेरित उत्पादन चरण के साथ किण्वन पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इसके बाद, हम ऑप्टोएएमपी सर्किट द्वारा सक्षम तीन-चरण (विकास, प्रेरण, उत्पादन) प्रकाश-नियंत्रित किण्वन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम वर्णन करते हैं कि माइक्रोप्लेट से लैब-स्केल बायोरिएक्टर तक ऑप्टोजेनेटिक रूप से नियंत्रित किण्वन को कैसे बढ़ाया जाए। इस प्रोटोकॉल के साथ, हम रासायनिक या प्रोटीन उत्पादन के लिए प्रकाश-नियंत्रित किण्वन करने के लिए एक पूर्ण और आसानी से पुन: प्रस्तुत करने योग्य मार्गदर्शिका प्रदान करना चाहते हैं।

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Protocol

1. प्रकाश नियंत्रित रासायनिक उत्पादन एस cerevisiae OptoINVRT7 सर्किट का उपयोग कर

  1. तनाव निर्माण
    1. अपने 3 auxotrophy के साथ एक तनाव प्राप्त करें, क्योंकि यह मार्कर अधिकांश मौजूदा OptoINVRT plasmids5 के लिए आवश्यक है। यदि एक जीन के ऑप्टोजेनेटिक विनियमन की मांग कर रहे हैं जो एस सेरेविसिया के मूल निवासी हैं, तो एक तनाव का निर्माण करें जिसमें जीन की किसी भी अंतर्जात प्रतिलिपि को हटा दिया जाता है।
    2. OptoINVRT7 सर्किट युक्त प्लास्मिड को रैखिक करें, जैसे कि EZ-L4395, और मानक लिथियम-एसीटेट परिवर्तन विधियों का उपयोग करके इसे auxotrophic तनाव के his3-locus में एकीकृत करें15। यदि EZ-L439 प्लास्मिड का उपयोग कर रहे हैं, जिसमें प्रकाश में PGAL1 को दबाने और इसे अंधेरे में सक्रिय करने के लिए घटक शामिल हैं, तो PmeI प्रतिबंध साइट पर linearize करें।
    3. परिवर्तन के बाद, 1 मिनट के लिए 150 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और धीरे-धीरे ताजा हिस्टिडीन-ड्रॉपआउट सिंथेटिक पूर्ण माध्यम (एससी-हिज़) माध्यम के 200 μL में पुन: निलंबित करें।
    4. एससी-उसके अगर प्लेटों पर पूरे सेल की मात्रा को प्लेट करें और उपनिवेशों के प्रकट होने तक 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. मानक लिथियम एसीटेट परिवर्तन प्रोटोकॉल का उपयोग करके इस तनाव से सक्षम कोशिकाओं को तैयार करें, और उन्हें एक प्लास्मिड के साथ परिवर्तित करें जिसमें जीन (ओं) को शामिल किया जाता है, जिसे PGAL1-M या PGAL1-S प्रमोटर 5 के ऑप्टोजेनेटिक रूप से डाउनस्ट्रीम में नियंत्रित किया जा सकता है।
      नोट: एक प्लास्मिड का उपयोग करना जो δ-साइटों (YARCdelta5) पर एकीकृत करता है और Zeocin के साथ चयन करता है, स्थिर multicopy एकीकरण 7,16,17,18 के लिए अनुमति देता है।
    6. परिवर्तन के बाद, 1 मिनट के लिए 150 x g पर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और धीरे-धीरे ताजा एससी-ड्रॉपआउट माध्यम के 200 μL में फिर से निलंबित करें।
      नोट: PGAL1-M प्रमोटर Mig1p दमन साइटों को हटा दिया गया है, जबकि PGAL1-S PGAL1-M का एक इंजीनियर संस्करण है, जिसमें अतिरिक्त Gal4p उत्प्रेरक बाध्यकारी साइटें हैं। अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए नियमित PGAL1 प्रमोटर का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, अभिव्यक्ति की ताकत इन इंजीनियर प्रवर्तकों की तुलना में कम होगी।
    7. एक खमीर निकालने पेप्टोन डेक्सट्रोज (वाईपीडी) अगर प्लेट पर पूरे सेल की मात्रा प्लेट अगर δ-साइटों में एकीकृत, या एक एससी-ड्रॉपआउट प्लेट यदि एक चयन मार्कर युक्त प्लास्मिड के साथ बदल रहा है। ऑप्टोजेनेटिक रूप से नियंत्रित जीन को दमित रखने के लिए निरंतर नीली रोशनी के तहत 16 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: कुछ उपभेदों के लिए, कालोनियों को नीले प्रकाश दालों में इनक्यूबेट किए जाने पर तेजी से बढ़ सकता है (उदाहरण के लिए, 1 s on / 79 s off, 5 s on / 75 s off, 10 s on / 70 s off, आदि) के बजाय निरंतर रोशनी में, जिसे प्रत्येक तनाव के लिए प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए, यदि आवश्यक हो तो।
    8. किसी भी 465 एनएम प्रकाश स्रोत का उपयोग करें और प्लेट के ऊपर एक एलईडी पैनल ~ 40 सेमी रखें जैसे कि प्रकाश की तीव्रता ~ 80-110 μmol / m2 / s है। क्वांटम मीटर का उपयोग करके तीव्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    9. यदि δ-साइटों में एकीकृत किया जाता है, तो YPD प्लेटों पर प्लेट की एक प्रतिकृति बनाएं जिसमें 400 μg / mL और 1,200 μg / mL के बीच Zeocin सांद्रता की एक श्रृंखला शामिल है ताकि विभिन्न प्रकार के एकीकरण प्रतिलिपि संख्या5,7,12,16,17,18 के लिए चयन किया जा सके। 2-3 दिनों के लिए स्थिर या स्पंदित नीली रोशनी के तहत 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिकृति प्लेटों को इनक्यूबेट करें जब तक कि उपनिवेश दिखाई न दें।
  2. सबसे अच्छी कॉलोनियों के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग
    1. प्रत्येक प्लेट से आठ कॉलोनियों का चयन करें और उन्हें 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में 2% ग्लूकोज के साथ पूरक एससी-उनके माध्यम के 1 मिलीलीटर को टीका लगाने के लिए उपयोग करें। कोशिकाओं के नीचे 24-अच्छी तरह से प्लेटों में बढ़ो रात भर (16-20 ज) 30 डिग्री सेल्सियस पर 200 आरपीएम (19 मिमी कक्षीय व्यास) के साथ निरंतर नीली रोशनी रोशनी के तहत मिलाते हुए।
    2. अगली सुबह, एक ताजा एससी के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक संस्कृति को पतला करें- 2% ग्लूकोज से OD600 मूल्यों के साथ 0.01-0.3 तक के मूल्यों के साथ उसका माध्यम और 200 आरपीएम झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर या स्पंदित प्रकाश के तहत 24-अच्छी तरह से प्लेटों में बढ़ता है जब तक कि वे 2 और 9 OD600 मूल्यों (चित्रा 4 ए) के बीच सेल घनत्व तक नहीं पहुंच जाते। इस विकास चरण के लिए आवश्यक समय की मात्रा तनाव पर निर्भर करेगी।
    3. प्रकाश पैनल को बंद करने और एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेटों को लपेटने से 200 आरपीएम हिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए अंधेरे में प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
      नोट:: यह चरण कोशिकाओं को उत्पादन मीडिया में पुन: निलंबन से पहले उत्पादन चरण में चयापचय रूप से संक्रमण करने की अनुमति देता है।
    4. उत्पादन चरण शुरू करने के लिए, 5 मिनट के लिए 234 x g पर 24-अच्छी तरह से प्लेट में संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और 2% ग्लूकोज के साथ ताजा एससी-ड्रॉपआउट माध्यम के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। बाँझ माइक्रोप्लेट सील टेप का उपयोग करके वांछित उत्पाद के वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेटों को सील करें।
    5. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए अंधेरे में सील प्लेटों को किण्वित करें। सुनिश्चित करें कि प्लेटों को एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा जाता है ताकि प्रकाश के किसी भी जोखिम को रोका जा सके।
      नोट: पन्नी में प्लेटों को लपेटना किण्वन में ऑक्सीजन या गैस की उपलब्धता को सीमित नहीं करता है; हालांकि, बाँझ सील टेप गैस हस्तांतरण को सीमित करता है। यदि आवश्यक हो तो ऑक्सीजन का परिचय देने के लिए टेप में छोटे छेद किए जा सकते हैं।
  3. कटाई और विश्लेषण
    1. किण्वन फसल के लिए, 234 x g पर 5 मिनट के लिए प्लेटों को सेंट्रीफ्यूज करें और supernatant के 800 μL को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    2. ब्याज के रसायन के आधार पर, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस), या उपयोग किए जाने वाले उपकरण के लिए सबसे उपयुक्त नमूना तैयारी तकनीक का उपयोग करके एक और विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग करके विश्लेषण करें।

2. ई कोलाई OptoLAC प्रणाली का उपयोग कर प्रकाश नियंत्रित प्रोटीन उत्पादन

  1. तनाव निर्माण
    1. सह-रूपांतरण electrocompetent BL21 DE3 ΠlacI ΠlacI-DE3 एक प्लास्मिड के साथ जिसमें OptoLAC1B या OptoLAC2B circuit6 और एक प्लास्मिड होता है जो PT7 प्रमोटर 19 से ब्याज के पुनः संयोजक प्रोटीन को व्यक्त करता है।
    2. बदलने के बाद, catabolite दमन (SOC; 2% tryptone, 0.5% खमीर निकालने, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM ग्लूकोज) के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के 1 mL में 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करें रोटेशन या मिलाते हुए 37 °C पर।
      नोट: ब्याज के प्रोटीन युक्त प्लास्मिड OptoLAC प्लास्मिड (यानी, विभिन्न प्रतिरोध मार्कर और प्रतिकृति की उत्पत्ति) के साथ संगत होना चाहिए और laci की एक प्रतिलिपि शामिल नहीं होना चाहिए।
    3. 3 मिनट के लिए 4845 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और लाइसोजेनी शोरबा (एलबी) मीडिया के 200 μL में गोली को केंद्रित करें। उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एक एलबी अगर प्लेट पर पूरी केंद्रित कोशिकाओं को प्लेट करें और प्रोटीन अभिव्यक्ति को दमित रखने के लिए निरंतर नीली रोशनी के तहत रातभर 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ें।
  2. अभिव्यक्ति सत्यापित करने के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग
    1. तीन एकल कॉलोनियों को लें और 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में उचित एंटीबायोटिक दवाओं के साथ एलबी मीडिया के 1 मिलीलीटर को टीका लगाने के लिए उनका उपयोग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (16-20 ज) बढ़ो, जिसमें 200 आरपीएम निरंतर नीली रोशनी (चित्रा 4 ए) के तहत मिलाते हुए।
    2. अगले दिन, एक माइक्रोवोल्यूम माप के साथ एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में OD600 को मापने के लिए संस्कृति के 1.5 μL का उपयोग करें। 24-अच्छी तरह से प्लेटों में ताजा एलबी के 1 मिलीलीटर में संस्कृतियों को पतला करें OD600 मूल्यों के लिए 0.01-0.1 से लेकर।
    3. 2-3 घंटे के लिए नीली रोशनी के नीचे 200 आरपीएम मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को बढ़ाएं। दूसरे घंटे से शुरू करते हुए, हर 15 मिनट में OD600 माप लें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि संस्कृतियां 0.1-1.5 की OD600 रेंज को अधिक न बढ़ाएं।
    4. एक बार जब संस्कृतियां वांछित OD600 पर होती हैं, तो प्रकाश पैनल को बंद कर दें और उत्पादन चरण शुरू करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेट को लपेटें। प्लेट को 8 घंटे (37 डिग्री सेल्सियस), 20 घंटे (30 डिग्री सेल्सियस), या 48 घंटे (18 डिग्री सेल्सियस) के लिए अंधेरे में रखें, जिसमें 200 आरपीएम मिलाते हैं।
    5. मापने और प्रत्येक संस्कृति के अंतिम OD600 मूल्य रिकॉर्ड करें।
  3. कटाई और विश्लेषण
    1. प्रत्येक संस्कृति के 800 μL को 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 17,000 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
    2. Resuspension बफर के 200 μL में सेल गोली resuspend (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM).
      नोट: NaCl की एकाग्रता पुनः संयोजक प्रोटीन का विश्लेषण किया जा रहा है के आधार पर समायोजित किया जा सकता है।
    3. 6x सोडियम डोडेसिल सल्फेट (SDS) नमूना बफर (Tris 375 mM, pH 6.8, SDS 9%, ग्लिसरॉल 50%, ब्रोमोफेनोल ब्लू 0.03%, DTT 9%) के 50 μL जोड़ें। एक thermomixer में 700 rpm पर मिलाते हुए के साथ 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर incubate.
    4. लोड ~ 3-20 एक 12% SDS-पेज जेल में संस्कृति के μL. एक गाइड के रूप में अंतिम OD600 माप का उपयोग करते हुए, प्रत्येक नमूने के लिए लगभग समान मात्रा में प्रोटीन लोड करें (1 के अंतिम OD600 मान के अनुरूप नमूने के 10 μL के बराबर)। जेल पूरी तरह से हल होने तक 100 वी पर वैद्युतकणसंचलन चलाने के लिए बिजली की आपूर्ति का उपयोग करें।
    5. एक माइक्रोवेव ओवन में 30-40 सेकंड के लिए गर्म करके, और फिर कम से कम 15 मिनट के लिए एक प्लेटफ़ॉर्म रोटेटर पर इनक्यूबेट करके कूमासी शानदार नीले जी -250 समाधान के साथ जेल को दाग दें।
    6. विआयनीकृत पानी के साथ दो बार कुल्ला करें और कम से कम 30 मिनट (या रात भर) के लिए एक प्लेटफ़ॉर्म रोटेटर पर डेस्टेन करें, दाग को अवशोषित करने में मदद करने के लिए एक गाँठ में बंधे दो सफाई पोंछे जोड़ना। जेल को माइक्रोवेव ओवन में पर्याप्त मात्रा में पानी में 15 मिनट के लिए उबालें ताकि डीस्टेनिंग प्रक्रिया को गति दी जा सके।

3. तीन चरण किण्वन एस cerevisiae OptoAMP प्रणाली का उपयोग कर

  1. तनाव निर्माण
    1. एक his3 auxotrophic मार्कर के साथ एक तनाव प्राप्त करें, क्योंकि यह मार्कर मौजूदा OptoAMP plasmids5 का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। यदि एक जीन के ऑप्टोजेनेटिक विनियमन की मांग की जाती है जो एस सेरेविसिया के मूल निवासी हैं, तो एक तनाव का निर्माण करें जिसमें इस जीन की अंतर्जात प्रतिलिपि हटा दी जाती है।
    2. OptoAMP4 सर्किट युक्त एक प्लास्मिड को रैखिक करें, जैसे कि EZ-L58012, और मानक लिथियम-एसीटेट परिवर्तन विधियों का उपयोग करके इसे auxotrophic तनाव के his3 लोकस में एकीकृत करें। यदि EZ-L580 का उपयोग कर रहे हैं, तो PmeI प्रतिबंध साइट पर प्लास्मिड linearize.
    3. परिवर्तन के बाद, कोशिकाओं को 150 x g पर 1 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें और धीरे-धीरे ताजा SC-His माध्यम के 200 μL में पुन: निलंबित करें।
    4. चयनात्मक मीडिया (एससी-हिस-अगर) पर पूरे सेल वॉल्यूम को प्लेट करें और उपनिवेशों के प्रकट होने तक 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. इस तनाव से सक्षम कोशिकाओं को तैयार करें और उन्हें एक प्लास्मिड के साथ परिवर्तित करें जिसमें जीन (ओं) को PGAL1-S प्रमोटर 12 के ऑप्टोजेनेटिक रूप से डाउनस्ट्रीम रूप से नियंत्रित किया जा सके।
      नोट: एक प्लास्मिड का उपयोग करना जो δ-साइटों पर एकीकृत होता है और Zeocin के साथ चयन करता है, स्थिर मल्टीकॉपी एकीकरण और चयन के लिए अनुमति देता है।
    6. बदलने के बाद, 1 मिनट के लिए 150 x g पर संस्कृति को सेंट्रीफ्यूज करें और धीरे-धीरे ताजा एससी-ड्रॉपआउट माध्यम के 200 μL में फिर से निलंबित करें।
      नोट: PGAL1-S प्रमोटर PGAL1 प्रमोटर जिसमें Mig1p दमन साइटों को हटा दिया जाता है और अतिरिक्त Gal4p उत्प्रेरक बाइंडिंग साइटों को जोड़ा जाता है का एक सिंथेटिक संस्करण है। नियमित PGAL1 प्रमोटर का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, अभिव्यक्ति की ताकत इस इंजीनियर प्रमोटर की तुलना में कम होगी।
    7. एक YPD या SC-ड्रॉपआउट अगर प्लेट पर पूरे सेल की मात्रा प्लेट और अंधेरे में 16 ज के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे)। अंधेरे में इनक्यूबेटिंग ऑप्टोजेनेटिक रूप से नियंत्रित जीन को दमित रखता है, जो कोशिकाओं को रासायनिक उत्पादन के बजाय सेल विकास की ओर अपने चयापचय संसाधनों को निर्देशित करने की अनुमति देता है।
    8. यदि δ-साइटों में एकीकृत, YPD प्लेटों पर प्रतिकृति प्लेट जिसमें विभिन्न प्रकार के एकीकरण प्रतिलिपि संख्याओं के लिए चयन करने के लिए Zeocin सांद्रता की एक श्रृंखला होती है। 2-3 दिनों के लिए अंधेरे में 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें (एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटा गया) जब तक कि उपनिवेश दिखाई न दें।
  2. सबसे अच्छी कॉलोनियों के लिए प्रारंभिक स्क्रीनिंग
    1. प्रत्येक प्लेट से आठ कॉलोनियों का चयन करें और 24-अच्छी तरह से प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में 2% ग्लूकोज के साथ 1 मिलीलीटर एससी-उसके माध्यम को टीका लगाने के लिए उनका उपयोग करें। 200 आरपीएम हिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रात भर (16-20 घंटे) कोशिकाओं को बढ़ाएं।
    2. अगली सुबह, ताजा एससी के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक संस्कृति को पतला करें- 0.1 OD600 के लिए 2% ग्लूकोज के साथ उसका माध्यम और 30 °C पर 200 आरपीएम हिलाते हुए अंधेरे में बढ़ते हुए जब तक कि वे 3 के OD600 तक नहीं पहुंच जाते। प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में प्लेटों को लपेटें। इस विकास चरण के लिए आवश्यक समय की मात्रा तनाव पर निर्भर करेगी।
    3. प्रेरण चरण शुरू करने के लिए, स्पंदित प्रकाश के तहत प्लेटों को इनक्यूबेट करें (उदाहरण के लिए, 5 s on/ 95 s off) 200 rpm मिलाने के साथ 30 °C पर 12 h के लिए। किसी भी 465 एनएम प्रकाश स्रोत का उपयोग करें और प्लेट के ऊपर एक एलईडी पैनल रखें जैसे कि इष्टतम परिणामों के लिए प्रकाश तीव्रता ~ 80-110 μmol / m2 / s है (चित्रा 4 ए)।
      नोट: इस इनक्यूबेशन के लिए इष्टतम प्रकाश नाड़ी अवधि उत्पादित किया जा रहा रसायन के आधार पर भिन्न होगा। 0.1% (उदाहरण के लिए, 999 s पर 1 s) से 100% (पूर्ण प्रकाश) तक प्रकाश अनुसूचियों की एक श्रृंखला को स्क्रीन करने की सिफारिश की जाती है।
    4. उत्पादन चरण शुरू करने के लिए, 5 मिनट के लिए 234 x g पर संस्कृतियों को सेंट्रीफ्यूज करें और 2% ग्लूकोज के साथ ताजा एससी-हिज़ माध्यम में फिर से निलंबित करें। बाँझ माइक्रोप्लेट सील टेप का उपयोग करके वांछित उत्पाद के वाष्पीकरण को रोकने के लिए प्लेटों को सील करें।
    5. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए प्रकाश में सील प्लेटों को किण्वित करें। इस चरण के दौरान प्रकाश अनुसूची को अनुकूलित करें क्योंकि कुछ रसायनपूरे प्रकाश के बजाय स्पंदित उत्पादन चरण से लाभान्वित होते हैं।
  3. कटाई और विश्लेषण
    1. 234 x g पर 5 मिनट के लिए प्लेटों centrifuging और 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में supernatant के 800 μL स्थानांतरित करके किण्वन फसल।
    2. ब्याज के रसायन के आधार पर, HPLC, GC-MS, या किसी अन्य विश्लेषणात्मक विधि का उपयोग करके नमूना तैयारी तकनीक का उपयोग करके विश्लेषण करें जो उपयोग किए जाने वाले उपकरण के लिए सबसे उपयुक्त है।

4. एक प्रकाश नियंत्रित बायोरिएक्टर में ई कोलाई से रासायनिक (mevalonate) उत्पादन

  1. प्रारंभिक टीकाकरण और बायोरिएक्टर सेटअप
    1. M9 न्यूनतम लवण (3.37 mM Na2HPO4, 2.2 mM KH2PO4, 0.855 mM NaCl, 0.935 mM NH4Cl) के 5 mL में प्रकाश-नियंत्रित रासायनिक उत्पादन के साथ इंजीनियर एक ई कोलाई स्ट्रेन की एक कॉलोनी को 0.2% w / v casamino एसिड, 5% w / v ग्लूकोज, और ट्रेस धातु मिश्रण 20 (0.0084 g / L EDTA) के साथ पूरक के साथ संक्रमित करें 0.0025 g/L CoCl2, 0.015 g/L MnCl2, 0.0015 g/L CuCl2, 0.003 g/L H3BO3, 0.0025 g/L Na2MoO4, 0.008 g/L ZnCl2, 0.06 g/L Fe (III) साइट्रेट, 0.0045 g/L थायमिन, 1.3 g/L MgSO4 में एक शंक्वाकार ट्यूब।
    2. नीले प्रकाश रोशनी के तहत 200 आरपीएम मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर रातभर संस्कृति को बढ़ाएं।
    3. बायोरिएक्टर पोत हेड प्लेट सेट करें, यह सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित पोर्ट स्थापित हैं: थर्मल जांच के लिए डालें; भंग ऑक्सीजन (डीओ) जांच; गैस sparger - एक 0.2 μm फिल्टर के माध्यम से हवा स्रोत से कनेक्ट; प्ररित करनेवाला; गैस संघनित्र - एक 0.2 μm फिल्टर से कनेक्ट; शीतलन लाइन (x2); फ़ीड लाइनों (x2) - मीडिया के अलावा के लिए एक, पीएच नियंत्रण के लिए एक; नमूना लाइन - सुनिश्चित करें कि यह पोत के नीचे तक पहुंचता है; खाली बंदरगाह; पीएच प्रोब - स्थापना से पहले पीएच = 4 और पीएच = 7 के मानकों के साथ जांच को कैलिब्रेट करें, या तो जहाज के बाकी हिस्सों के साथ आटोक्लेव करें या 95% इथेनॉल के साथ निष्फल करें और सेटअप से पहले एसेप्टिक रूप से डालें।
    4. फ़िल्टर किए गए पानी के 1 एल के साथ बर्तन को भरें, और हेड प्लेट को संलग्न करें और कसें, यह सुनिश्चित करें कि ओ-रिंग स्नगली फिट बैठता है और सील करता है।
    5. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ रिएक्टर में किसी भी उद्घाटन कवर.
    6. टयूबिंग की तीन स्ट्रिप्स तैयार करें: एक पानी को हटाने के लिए, एक फ़ीड डालने के लिए, और एक पीएच नियंत्रण के लिए। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सिरों को कवर और एल्यूमीनियम पन्नी में सभी टयूबिंग लपेटें।
      नोट: NH4OH, जिसका उपयोग पीएच समायोजन के लिए किया जाता है, सिलिकॉन टयूबिंग में सुचारू रूप से प्रवाहित नहीं होता है, जिससे गलत प्रवाह दर और संस्कृति का अधिक-बेसिफिकेशन हो सकता है। इस समस्या से बचने के लिए, NH4OH फ़ीड के लिए biocompatible पंप टयूबिंग (BPT) का उपयोग करें।
    7. बायोरिएक्टर और टयूबिंग को आटोक्लेव करें, 30 मिनट के तरल चक्र का उपयोग करके।
    8. आटोक्लेव से सामग्री निकालें। एक बार संभालने के लिए पर्याप्त शांत होने के बाद, प्ररित करनेवाला, पीएच और डीओ जांच, वायु स्रोत, कंडेनसर इनलेट और आउटलेट, और कूलिंग इनलेट और आउटलेट को नियंत्रण स्टेशन से कनेक्ट करें।
    9. थर्मल जांच डालें और एक हीटिंग जैकेट के साथ पोत को कवर करें। प्रकाश जोखिम से संस्कृति को अवरुद्ध करने से बचने के लिए पोत के शीर्ष की ओर जैकेट को सुरक्षित करें।
    10. नमूना लाइन के लिए बाँझ ट्यूबों में से एक कनेक्ट और नमूना पंप के माध्यम से सुरक्षित. दूसरे छोर को इस तरह रखें कि यह एक खाली कंटेनर में बहता है जो कम से कम 1 एल पकड़ सकता है।
    11. फ़ीड लाइनों में से एक के लिए एक और बाँझ ट्यूब कनेक्ट करें और फ़ीड पंपों में से एक के माध्यम से सुरक्षित। M9 मीडिया की एक बोतल के लिए ट्यूब के दूसरे छोर कनेक्ट करें। रिएक्टर में मीडिया फ़ीड.
    12. फ़ीड लाइनों में से एक के लिए एक और बाँझ ट्यूब कनेक्ट करें और फ़ीड पंपों में से एक के माध्यम से सुरक्षित। ट्यूब के दूसरे छोर को 28% -30% NH4OH वाली बोतल से कनेक्ट करें।
      सावधानी: NH4OH संक्षारक है। एक फ़ीड बोतल में स्थानांतरित करते समय एक धुएं के हुड में काम करें और सुनिश्चित करें कि फ़ीड बोतल को माध्यमिक रोकथाम में रखा गया है।
    13. रिएक्टर से 20 सेमी दूर एक त्रिकोणीय गठन में तीन प्रकाश पैनलों को रखें, यह जांचते हुए कि पोत की सतह पर प्रकाश तीव्रता प्रत्येक पक्ष से ~ 80-110 μmol / m2 / s तक पहुंचती है (चित्रा 4 बी)।
    14. अगले दिन, बायोरिएक्टर सिस्टम और चिलर को चालू करें। रिएक्टर तापमान सेटपॉइंट को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें, पीएच सेटपॉइंट को 7.0 पर सेट करें, और आंदोलन को 200 आरपीएम पर सेट करें। हीटिंग जैकेट चालू होना चाहिए।
    15. तापमान और डीओ माप स्थिर होने तक पहले प्रतीक्षा करके डीओ जांच को कैलिब्रेट करें (यह 100% सेटपॉइंट होगा)। उसके बाद, सिस्टम से जांच डिस्कनेक्ट करें (यह 0% setpoint होगा)। जब तक कि जांच कनेक्ट डे है, तो DO माप 100% पर स्थिर होने तक दोहराएँ, और फिर DO setpoint को 20% पर सेट करें.
  2. प्रकाश-नियंत्रित रासायनिक उत्पादन
    1. 0.001-0.1 के एक प्रारंभिक OD600 के लिए बायोरिएक्टर को संक्रमित करें। विकास शुरू करने के लिए प्रकाश पैनलों को चालू करें।
    2. 3 घंटे के बाद, प्रेरण के इष्टतम सेल घनत्व को बढ़ाने से बचने के लिए OD600 माप लेने के लिए नमूना लाइन से नमूने लेना शुरू करें (πs)। एक बार इष्टतम तक पहुँच गया है (mevalonate उत्पादन के लिए इष्टतम मूल्य 0.17 है), प्रकाश पैनलों को बंद कर दें, एल्यूमीनियम पन्नी में रिएक्टर को कवर करें, और अंधेरे उत्पादन चरण को शुरू करने के लिए काले कपड़े में सेटअप लपेटें।
    3. एंटीफोम के 50 μL जोड़ें, अंधेरे में स्विच करने के बाद 8 ज। खाली बंदरगाह को खोलें और एंटीफोम को सीधे रिएक्टर में पिपेट करें।
    4. HPLC या GC विश्लेषण के लिए समय-समय पर नमूने लेने के लिए नमूना पोर्ट का उपयोग करें।
  3. Disassembly और Analysis
    1. प्रयोग समाप्त होने के बाद, सिस्टम को बंद कर दें। ध्यान से डीओ और पीएच जांच को खोलें और उन्हें साबुन और पानी से धोएं। सिर की प्लेट को खोलें और ब्रश का उपयोग करके इसे साबुन और पानी से धो लें।
    2. संस्कृति को एक खाली कंटेनर में स्थानांतरित करें और 10% v / v की अंतिम एकाग्रता में ब्लीच जोड़ें। एक धुएं हुड में जगह है और 30 मिनट के बाद का निपटान.
    3. एक ब्रश का उपयोग करके रिएक्टर पोत को साबुन और पानी से धोएं।
    4. ब्याज के उत्पाद के आधार पर विश्लेषण के लिए नमूने तैयार करें। मेवेलोनेट उत्पादन के लिए, 0.5 M HCl के 140 μL के साथ संस्कृति के 560 μL और 1 मिनट के लिए उच्च गति पर भंवर मिश्रण करें। यह मेवालोनेट को (±) -मेवेलोलोनलैक्टोन में परिवर्तित करता है।
      सावधानी: HCl एक स्वास्थ्य खतरा है। उचित पीपीई के साथ संभालें और सुनिश्चित करें कि नमूना ट्यूबों को भंवर से पहले ठीक से कैप किया गया है।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 17,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज। एक HPLC शीशी के लिए supernatant के 250 μL स्थानांतरण.
    6. मेवालोनेट के लिए, एक कार्बनिक एसिड आयन विनिमय स्तंभ का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण करें। अपवर्तक सूचकांक डिटेक्टर (RID) का उपयोग करके उत्पादन को मापें, शिखर क्षेत्रों की तुलना (±) -मेवेलोलोनोलैक्टोन के मानक से करें।

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Representative Results

जैव ईंधन, थोक रसायनों, प्रोटीन, और प्राकृतिक उत्पादों सहित विभिन्न प्रकार के उत्पादों का उत्पादन करने के लिए माइक्रोबियल चयापचय के ऑप्टोजेनेटिक विनियमन को सफलतापूर्वक लागू किया गया है5,6,7,12,13। इनमें से अधिकांश प्रक्रियाओं को प्रकाश में होने वाले सेल विकास के लिए डिज़ाइन किया गया है (जब कम सेल घनत्व प्रकाश प्रवेश के साथ न्यूनतम चुनौतियों का सामना करता है), और कोशिकाओं के बढ़ने के बाद उत्पादन को अंधेरे से प्रेरित किया जाता है। विभिन्न रसायनों कि इस दृष्टिकोण का उपयोग कर खमीर से उत्पादित किया गया है, लैक्टिक एसिड, एक मूल्यवान बहुलक अग्रदूत और खाद्य additive, साथ ही isobutanol, एक अगली पीढ़ी के जैव ईंधन सहित. दोनों रसायनों के लिए, एक आम चुनौती एस सेरेविसिया के मजबूत ड्राइव से उपजी है ताकि ब्याज के उत्पाद के बजाय इथेनॉल उत्पादन की ओर ग्लूकोज को चयापचय किया जा सके और गंभीर विकास दोष पैदा किए बिना इथेनॉल किण्वन मार्ग को हटाने में असमर्थता हो। प्रकाश-सक्रिय ऑप्टोएक्सपी और प्रकाश-दमित ऑप्टोइनवीआरटी सर्किट के संयोजन का उपयोग इथेनॉल किण्वन के लिए आवश्यक पाइरूवेट डीकार्बोक्सिलेज (पीडीसी 1) के लिए जीन को चुनिंदा रूप से प्रकाश के साथ सक्रिय करने के लिए किया गया है, और अंधेरे 5 (चित्रा 5 ए, बी) में वांछित उत्पाद के लिए मार्ग को प्रेरित करता है। प्रेरण के एक अनुकूलित सेल घनत्व के साथ इस रणनीति का उपयोग करते हुए (πs), दोनों वांछित रसायनों के उच्च titers प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 5C, D), optogenetics द्वारा की पेशकश की द्विदिश नियंत्रण के मूल्य पर प्रकाश डाला।

जबकि अधिकांश खमीर-आधारित ऑप्टोजेनेटिक प्रक्रियाओं ने प्रकाश-संचालित विकास चरण और अंधेरे-प्रेरित उत्पादन चरण पर ध्यान केंद्रित किया है, अतिरिक्त संवेदनशील और मजबूत ऑप्टोएएमपी सर्किट के हाल के विकास ने प्रकाश-संचालित किण्वन के अवसरों को भी खोल दिया है। ये प्रकाश-चालित किण्वन पहले से वर्णित प्रक्रियाओं के समान हैं; हालांकि, प्रकाश अनुसूचियों को उलट दिया जाता है जैसे कि उत्पादन प्रकाश में होता है। इसके अलावा, ये सर्किट तीन-चरण प्रक्रियाओं के कार्यान्वयन की अनुमति देते हैं, जो मानक दो-चरण दृष्टिकोण की तुलना में उत्पादन में अधिक लचीलापन और नियंत्रण जोड़ता है। इन सर्किटों की संवेदनशीलता और ताकत को देखते हुए, इन तीन-चरण प्रक्रियाओं को आमतौर पर प्रत्येक चरण में विभिन्न प्रकाश कार्यक्रमों की स्क्रीनिंग करके अनुकूलित किया जाता है। इष्टतम प्रकाश दालें तनाव और ब्याज के उत्पाद पर निर्भर करती हैं। इस तरह के सर्किट को सफलतापूर्वक लैक्टिक एसिड और आइसोबुटानोल 12 (चित्रा 6) के अलावा, चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ एक प्राकृतिक उत्पाद, नारिंगेनिन के उत्पादन के लिए लागू किया गया है। सभी तीन रसायनों का बढ़ा हुआ उत्पादन मार्ग जटिलताओं की एक श्रृंखला में ऑप्टोजेनेटिक विनियमन के मूल्य के साथ-साथ तीन-चरण किण्वन द्वारा पेश की गई नई क्षमता को दर्शाता है।

खमीर में इन प्रदर्शनों से परे, ऑप्टोजेनेटिक्स को बैक्टीरिया वर्कहॉर्स ई कोलाई में प्रोटीन और रसायनों के उत्पादन को बढ़ाने के लिए भी लागू किया गया है। इस मेजबान के साथ किण्वन ने सर्किट 6 के ऑप्टोलैक सूट का उपयोग करके एक प्रकाश-संचालित विकास और अंधेरे-प्रेरित उत्पादन ढांचे का पालन किया है। जब एक पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी) या प्रतिलेखन कारक FdeR का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो प्रकाश-नियंत्रित उत्पादन मानक IPTG प्रेरण के साथ प्राप्त स्तरों से तुलनीय या बेहतर होता है, लेकिन उत्पादन के मध्यवर्ती स्तरों के लिए आसान ट्यूनेबिलिटी के साथ (चित्रा 7 ए)। इसके अलावा, ऑप्टोलैक सर्किट को मेवेलोनेट का उत्पादन करने के लिए लागू किया गया है, जो माइक्रोप्लेट और बायोरिएक्टर दोनों स्तरों पर एक महत्वपूर्ण टेरपेनोइड अग्रदूत है (चित्रा 7 बी, सी)। ये चयनित परिणाम माइक्रोबियल रासायनिक और प्रोटीन उत्पादन के लिए ऑप्टोजेनेटिक विनियमन की ताकत, बहुमुखी प्रतिभा और ट्यूनेबिलिटी का एक सामान्य अवलोकन देते हैं।

Figure 4
चित्रा 4: प्लेटों और बायोरिएक्टर को रोशन करने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप( ए) 24-वेल प्लेटों को शेकर के ऊपर लगभग 40 सेमी ऊपर नीले एलईडी लाइट पैनल को रखकर हिलाते हुए रोशन किया जा सकता है। प्रकाश की तीव्रता को क्वांटम मीटर के साथ मापा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह ~ 80-110 μmol / m2 / s के बीच है (बी) बायोरिएक्टर को रोशन करने के लिए, बायोरिएक्टर के चारों ओर त्रिकोणीय गठन में तीन प्रकाश पैनल रखें। 24-अच्छी तरह से प्लेटों के साथ, प्रकाश की तीव्रता को मापा जाना चाहिए और सभी पक्षों से ~ 80-110 μmol / m2 / s तक पहुंचने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। चित्र Biorender के साथ बनाया गया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एस सेरेविसिया से रसायनों का प्रकाश-दमित उत्पादन। लैक्टिक एसिड (ए) या आइसोबुटानोल (बी) के उत्पादन को बढ़ाने के लिए, विशिष्ट मार्गों को चुनिंदा रूप से सक्रिय करने के लिए प्रकाश और अंधेरे-अपरिवर्तनीय सर्किट के संयोजन का उपयोग किया गया है। दोनों परिदृश्यों में, आवश्यक इथेनॉल उत्पादन मार्ग OptoEXP के साथ PDC1 अभिव्यक्ति को नियंत्रित करके प्रकाश में प्रेरित होता है, जबकि उत्पादन मार्ग एक OptoINVRT सर्किट का उपयोग करके अंधेरे में सक्रिय होते हैं। (C) लैक्टिक एसिड के उत्पादन का परीक्षण OptoINVRT सुइट से दो परिपथों के साथ πs मानों की एक सीमा पर किया गया था। OptoINVRT7 संस्करण ने 7.0 के इष्टतम मूल्य के साथ सबसे अच्छा प्रदर्शन किया। (डी) OptoINVRT7 संस्करण भी अन्य सर्किट की तुलना में isobutanol उत्पादन को अधिकतम किया, 8.75 के एक इष्टतम के साथ। ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. आँकड़े एक दो तरफा टी-टेस्ट का उपयोग करके व्युत्पन्न किए जाते हैं। डेटा को माध्य मानों के रूप में दिखाया गया है और त्रुटि पट्टियाँ चार प्रतिकृतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। यह आंकड़ा झाओ एट अल.5 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एस cerevisiae के तीन चरण किण्वन में रसायनों का प्रकाश-सक्रिय उत्पादन। OptoAMP सर्किट का उपयोग करके किण्वन तीन गतिशील चरणों के साथ काम कर सकते हैं: विकास (i), प्रेरण (ii), और उत्पादन (iii), प्रत्येक को विभिन्न प्रकाश शुल्क चक्रों द्वारा परिभाषित किया गया है। (ए) लैक्टिक एसिड का जैवसंश्लेषण एलडीएच अभिव्यक्ति के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण द्वारा नीली रोशनी में प्रेरित होता है। (बी) लैक्टिक एसिड उत्पादन को विकास चरण में स्पंदित (1 एस ऑन / 79 एस ऑफ) प्रकाश अनुसूची और प्रेरण और उत्पादन चरणों में पूर्ण रोशनी का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है। (ग) आइसोबुटानोल का उत्पादन आईएलवी2 अभिव्यक्ति को ऑप्टोजेनेटिक रूप से नियंत्रित करके प्रेरित किया जाता है। (डी) आइसोबुटानोल उत्पादन को स्पंदित विकास चरण (1 एस ऑन / 79 एस ऑफ), पूरी तरह से प्रकाशित प्रेरण चरण, और स्पंदित (2 एस ऑन / 118 एस ऑफ) उत्पादन चरण का उपयोग करके अनुकूलित किया जाता है। (ई) नारिंगेनिन के लिए अधिक जटिल बायोसिंथेटिक मार्ग का नियंत्रण, टीएएल और पीएएल जीन की ऑप्टोजेनेटिक रूप से नियंत्रित अभिव्यक्ति से प्रेरित है। (एफ) नारिंगेनिन जैवसंश्लेषण को एक स्पंदित विकास (1 एस ऑन / 79 एस ऑफ), पूरी तरह से प्रकाशित प्रेरण और अंधेरे उत्पादन चरण का उपयोग करके सबसे अच्छा अनुकूलित किया जाता है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, एनएस = कोई महत्व नहीं है। आँकड़े एक दो तरफा टी-टेस्ट का उपयोग करके व्युत्पन्न किए जाते हैं। डेटा को माध्य मानों के रूप में दिखाया गया है और त्रुटि पट्टियाँ चार स्वतंत्र प्रतिकृतियों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं। इस आंकड़े को झाओ एट अल.12 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: ई कोलाई में पुनः संयोजक प्रोटीन और रसायनों का ऑप्टोजेनेटिक उत्पादन। OptoLAC प्रणाली का उपयोग टिटर्स पर प्रोटीन और रसायनों दोनों का उत्पादन करने के लिए किया गया है जो IPTG के साथ रासायनिक प्रेरण का उपयोग करके पहुंचने वाले लोगों की तुलना में तुलनीय हैं, या उनसे अधिक हैं। (ए) FdeR की ऑप्टोजेनेटिक अभिव्यक्ति विभिन्न प्रकार के प्रकाश शुल्क चक्रों का उपयोग करके मजबूत और ट्यूनेबल दोनों है, जैसा कि पश्चिमी धब्बा के साथ हल और परिमाणित किया गया है। (बी) मेवेलोनेट उत्पादन के लिए इंजीनियर किया गया एक तनाव इष्टतम मूल्य पर 24-अच्छी तरह से पैमाने पर आईपीटीजी प्रेरण का उपयोग करके प्राप्त टिटर्स से अधिक है । (c) एक 2 L बायोरिएक्टर में mevalonate का ऑप्टोजेनेटिक उत्पादन माइक्रोप्लेट्स से परे उत्पादन की स्केलेबिलिटी को दर्शाता है। * पी < 0.05. ** पी < 0.01, *** पी < 0.001. आँकड़े एक दो तरफा टी-टेस्ट का उपयोग करके व्युत्पन्न किए जाते हैं। सभी डेटा को माध्य मानों के रूप में दिखाया गया है और त्रुटि सलाखों को जैविक रूप से स्वतंत्र नमूनों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ए) और (सी) के लिए डेटा तीन प्रतिकृतियों का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि (बी) के लिए, बाएं से दाएं प्रतिकृतियों की संख्या = 4, 4, 6, 3, 4, 4, 4, 4, 4। इस आंकड़े को लालवानी एट अल.6 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

गतिशील नियंत्रण लंबे समय से चयापचय इंजीनियरिंग और पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए पैदावार में सुधार करने के लिए लागू किया गया है4. एंजाइमेटिक अभिव्यक्ति में बदलाव को आमतौर पर आईपीटीजी 21, गैलेक्टोज 22 और टेट्रासाइक्लिन 23 जैसे रासायनिक प्रेरकों का उपयोग करके लागू किया जाता है, लेकिन तापमान और पीएच जैसी प्रक्रिया स्थितियों का उपयोग करके भी मध्यस्थता की गई है। जीन अभिव्यक्ति का ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण किण्वन मापदंडों या मीडिया संरचना में परिवर्तन की आवश्यकता को समाप्त करता है, जिससे यह पारंपरिक प्रेरण रणनीतियों के लिए एक आसानी से लागू विकल्प बन जाता है। जिस आसानी से प्रकाश को चालू या बंद किया जा सकता है, वह जीन खुराक की तेजी से और प्रतिवर्ती ट्यूनिंग जैसी नई क्षमताएं भी प्रदान करता है। इसके अलावा, जबकि ये प्रोटोकॉल नीले प्रकाश-उत्तरदायी प्रणालियों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, ऑप्टोजेनेटिक उपकरणों का अस्तित्व जो मौजूदा प्रकाश प्रतिक्रियाओं को उलटते हैं24 या प्रकाश 25,26,27,28,29 के अन्य तरंग दैर्ध्य का जवाब देते हैं, नियंत्रण के अभूतपूर्व स्तर के लिए कई मार्गों को ऑर्थोगोनल रूप से नियंत्रित करने की रोमांचक क्षमता प्रदान करता है। इस तरह के फायदे प्रकाश को माइक्रोबियल किण्वन पर लचीले नियंत्रण के लिए एक बहुमुखी नया समाधान बनाते हैं।

सर्वोत्तम उपनिवेशों के लिए स्क्रीनिंग से परे, जैसा कि प्रोटोकॉल में चर्चा की गई है, अन्य पैरामीटर जैसे कि सेल घनत्व जिस पर संस्कृतियों को विकास से उत्पादन (πs), उत्पादन की लंबाई और इनक्यूबेशन अवधि, और प्रकाश शुल्क चक्रों को भी अनुकूलित किया जाना चाहिए। इन मापदंडों के सबसे अच्छे मूल्य उत्पाद- और तनाव-निर्भर हैं और इस प्रकार किसी भी नए एप्लिकेशन के लिए फिर से अनुकूलित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, विषाक्त अंतिम उत्पादों को शामिल करने वाले मार्गों को उच्च मूल्यों से लाभ हो सकता है, जो उत्पादन को प्रेरित करने से पहले कोशिकाओं के पर्याप्त संचय के लिए अनुमति देते हैं6,7, जबकि एक कमजोर लेकिन कम रिसाव सर्किट कुल अभिव्यक्ति समय को अधिकतम करने के लिए कम मूल्यों का पक्ष ले सकता है। इसी तरह, कुछ मार्ग और पुनः संयोजक प्रोटीन मध्यवर्ती अभिव्यक्ति के स्तर से लाभान्वित हो सकते हैं, जिसे अद्वितीय प्रकाश कर्तव्यों के साथ प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, किण्वन के मामले में जो ऑप्टोएएमपी सर्किट का उपयोग करते हैं, अस्थायी चरणों की संख्या को अनुकूलित किया जा सकता है। जबकि प्रदर्शित प्रोटोकॉल एक तीन-चरण प्रक्रिया का वर्णन करता है, इन सर्किटों का उपयोग करके किण्वन को अद्वितीय प्रकाश शुल्क अनुसूची और अवधि द्वारा परिभाषित चरणों की एक बड़ी संख्या के साथ नियंत्रित किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रदर्शन को अनुकूलित करने के लिए इन मापदंडों की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए।

प्रकाश संदूषण के स्रोतों से बचना प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान एक महत्वपूर्ण विचार प्रस्तुत करता है। उन प्रक्रियाओं के लिए जिन्हें बाद के चरणों तक प्रकाश उत्तेजना की देरी की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, अंधेरे से प्रकाश किण्वन), एक अंधेरे कमरे में काम करना ऑप्टोजेनेटिक सिस्टम के समय से पहले सक्रियण से बचने की सलाह दी जा सकती है। इन मामलों में, प्रयोगात्मक सेटअप के दौरान दृश्यता के लिए एक निष्क्रिय प्रकाश स्रोत लागू किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, नीले प्रकाश-सक्रिय प्रणालियों के साथ काम करते समय ~ 700 एनएम का एक दूर-लाल प्रकाश स्रोत)। प्रकाश-प्रेरित विकास (अंधेरे के लिए प्रकाश) के साथ शुरू होने वाली प्रक्रियाओं का एक लाभ यह है कि प्रारंभिक प्रयोगात्मक जोड़तोड़ पर्याप्त दृश्यता के साथ परिवेश प्रकाश के तहत किया जा सकता है।

जिस आसानी से किण्वन के लिए बड़ी संख्या में प्रकाश शुल्क अनुसूचियों को लागू किया जा सकता है, वह बायोसिंथेटिक मार्गों को संतुलित करने और किण्वन उत्पादकता को अधिकतम करने वाली इष्टतम स्थितियों को स्पष्ट करने के लिए उच्च-थ्रूपुट विधियों को विकसित करने का अवसर प्रस्तुत करता है। विभिन्न शक्तियों के प्रवर्तकों द्वारा व्यक्त किए गए प्रत्येक एंजाइम वाले बड़ी संख्या में संयोजित निर्माणों का परीक्षण करके चयापचय मार्गों को संतुलित करने के बजाय, बहुत कम संख्या में निर्माणों से विभिन्न प्रकाश कर्तव्य चक्रों का उपयोग करके जीन अभिव्यक्ति के स्तर को अलग-अलग करके मार्गों को संतुलित किया जा सकता है। यह अधिक बोझिल प्रयोगात्मक सेटअप की आवश्यकता को कम करता है, जैसे कि विभिन्न प्रेरण मीडिया में पुनर्संपन या रासायनिक प्रेरकों के लिए सीरियल dilutions। ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों को संभावित रूप से सिलिको नियंत्रकों में उपयोग करके थ्रूपुट बढ़ाने के लिए स्वचालित भी किया जा सकता है ताकि विभिन्न नमूना पूल 30 को विशेष रूप से समयबद्ध या स्थानीयकृत प्रकाश दालों को वितरित किया जा सके। हालांकि, विभिन्न प्रकाश स्थितियों के तहत उच्च-थ्रूपुट प्रयोगों को प्रकाश के क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए पर्याप्त रूप से अलग किया जाना चाहिए, जो स्थानिक बाधाओं को पैदा कर सकता है। इसके अतिरिक्त, प्रकाश उत्तेजना की आवश्यकता निरंतर माप के लिए अधिकांश प्लेट पाठकों और माइक्रो बायोरिएक्टर के उपयोग को रोकती है। हालांकि अभी तक व्यावसायिक रूप से व्यापक रूप से उपलब्ध नहीं है, हाल ही में उच्च-थ्रूपुट और निरंतर ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों के लिए कई उपकरण और एल्गोरिदम विकसित किए गए हैं, जो इन स्थानिक बाधाओं को संबोधित करने में मदद करते हैं31,32,33,34। इस प्रकार, इन सीमाओं के बावजूद, ऑप्टोजेनेटिक्स उन्नत नियंत्रण क्षमता प्रदान करते हुए प्रयोगात्मक थ्रूपुट को बढ़ाने की एक बड़ी क्षमता प्रदान करता है।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल और वीडियो उम्मीद है कि अन्य शोधकर्ताओं के लिए सेलुलर चयापचय और माइक्रोबियल किण्वन के ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण को अपनाने के लिए बाधाओं को कम करेंगे। ऑप्टोजेनेटिक्स बुनियादी अनुसंधान और जैव-तकनीकी अनुप्रयोगों के लिए एक सक्षम तकनीक है जो जीन अभिव्यक्तियों के ठीक-ठाक नियंत्रण से लाभान्वित हो सकती है, जैसे कि आनुवांशिकी, आणविक और कोशिका जीव विज्ञान, चयापचय, सिस्टम जीव विज्ञान, और साइबरजेनेटिक्स 35,36,37,38। इसके अतिरिक्त, जीन अभिव्यक्ति के ऑप्टोजेनेटिक विनियमन को अन्य सूक्ष्मजीवों जैसे बेसिलस सबटिलिस और स्यूडोमोनास एरुगिनोसा में प्रदर्शित किया गया है, यह सुझाव देते हुए कि प्रकाश नियंत्रण के लाभों को विविध प्रजातियों के अध्ययन और अनुप्रयोग तक बढ़ाया जा सकता है39,40,41। ये संभावनाएं चयापचय इंजीनियरिंग, प्रोटीन उत्पादन और अन्य जैव-तकनीकी अनुप्रयोगों के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स की भविष्य की क्षमता को उजागर करती हैं।

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Disclosures

लेखकों ने इस लेख में वर्णित ऑप्टोजेनेटिक सर्किट और विधियों के लिए कई पेटेंट के लिए आवेदन किया है।

Acknowledgments

इस शोध को अमेरिकी ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, जैविक और पर्यावरण अनुसंधान पुरस्कार संख्या DE-SC0019363 के कार्यालय, NSF कैरियर पुरस्कार CBET-1751840, प्यू चैरिटेबल ट्रस्ट, और कैमिल ड्रेफस शिक्षक-विद्वान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Agar powder Thermo Fisher Scientific 303991049
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid N/A N/A See Reference 1
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
PmeI New England Biolabs R0560L
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
Replica-plating device Thomas Scientific F37848-0000
Replica-plating pads Sunrise Science Products 3005-012
SC-His powder Sunrise Science Products 1303-030
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100
Sterile sealing film Excel Scientific STR-SEAL-PLT
YPD agar plates VWR 100217-054
Zeocin Thermo Fisher Scientific R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer Cepham Life Sciences 10502
12% Acrylamide protein gels Thermo Fisher Scientific NP0341BOX
24-well culture plate USA Scientific CC7672-7524
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Blue LED panel HQRP 884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250 Thermo Fisher Scientific 20279
Electrophoresis cell Bio-Rad 1658004
Electrophoresis power supply Bio-Rad 1645050
LB broth (Miller) Fisher Scientific BP97235
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NaCl Thomas Scientific SX0425-1
OptoLAC plasmids N/A N/A See Reference 2
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Petri dish Celltreat 229656
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SOC medium Thermo Fisher Scientific 15544034
Thermomixer Eppendorf 5382000015
Tris base Fisher Scientific BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid N/A N/A See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil Reynolds B004NG90YO
Antifoam Sigma-Aldrich A8311
Bioreactor with control station Eppendorf B120110001
BioSpectrometer with μcuvette Eppendorf 6135000923
Bleach VWR Scientific 89501-620 (CS)
Blue LED panel HQRP 884667106091218
BPT tubing Fisher Scientific 14-170-15
Glucose Thermo Fisher Scientific 501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific 7647-01-0
M9 Minimal Salts Thermo Fisher Scientific A1374401
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002403
Microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510
NH4OH Solution Sigma-Aldrich I0503-1VL
Orbital Shaker Yamato Scientific America SOU-300
Quantum meter Apogee Instruments MQ-510
SC Complete powder Sunrise Science Products 1459-100

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References

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Bioengineering अंक 181
माइक्रोबियल रासायनिक और प्रोटीन उत्पादन के लिए प्रकाश-नियंत्रित किण्वन
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Hoffman, S. M., Lalwani, M. A., Avalos, J. L. Light-Controlled Fermentations for Microbial Chemical and Protein Production. J. Vis. Exp. (181), e63269, doi:10.3791/63269 (2022).

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