Summary
Het huidige protocol beschrijft de isolatie van fycobilisomen uit cyanobacteriën door centrifugering door middel van een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt. De fracties van intacte fycobilisomen worden bevestigd door 77K fluorescerend emissiespectrum en SDS-PAGE-analyse. De resulterende fycobilisoomfracties zijn geschikt voor negatieve kleuring van TEM en massaspectrometrie-analyse.
Abstract
In cyanobacteriën is fycobilisoom een vitaal antenne-eiwitcomplex dat licht oogst en energie overbrengt naar fotosysteem I en II voor fotochemie. Het bestuderen van de structuur en samenstelling van fycobilisoom is van groot belang voor wetenschappers omdat het de evolutie en divergentie van fotosynthese in cyanobacteriën onthult. Dit protocol biedt een gedetailleerde en geoptimaliseerde methode om cyanobacteriële cellen tegen lage kosten te breken door een kralenklopper efficiënt. Het intacte fycobilisoom kan vervolgens uit het celextract worden geïsoleerd door sucrose gradiënt ultracentrifugatie. Deze methode heeft aangetoond geschikt te zijn voor zowel model- als niet-modelcyanobacteriën met verschillende celtypen. Een stapsgewijze procedure wordt ook aangeboden om de integriteit en eigenschap van fycobiliproteïnen te bevestigen door 77K fluorescentiespectroscopie en SDS-PAGE gekleurd door zinksulfaat en Coomassie Blue. Het geïsoleerde fycobilisoom kan ook worden onderworpen aan verdere structurele en compositorische analyses. Over het algemeen biedt dit protocol een nuttige startgids waarmee onderzoekers die niet bekend zijn met cyanobacteriën snel intact fycobilisoom kunnen isoleren en karakteriseren.
Introduction
Fycobilisoom (PBS) is een enorm in water oplosbaar pigmenteiwitcomplex dat zich hecht aan de cytoplasmatische kant van de fotosystemen in de thylakoïde membranen van cyanobacteriën1. PBS bestaat voornamelijk uit gekleurde fycobiliproteïnen en kleurloze linkereiwitten1,2. De fycobiliproteïnen kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdgroepen: phycoerythrin, phycoerythrocyanine, phycocyanine en allophycocyanin3. De vier belangrijkste groepen absorberen verschillende golflengten van lichtenergie in het bereik van 490-650 nm, die chlorofylen inefficiënt absorbeerden3. De PBS kan dienen als een lichtoogstantenne voor het verzamelen van lichtenergie en deze te leveren aan Photosystem II en I4.
De structuur en samenstelling van PBS verschillen van soort tot soort. Gezamenlijk zijn drie vormen van fycobilisoom (hemidiscodiaal, bundelvormig en staafvormig) geïdentificeerd in verschillende cyanobacteriële soorten5. Zelfs bij dezelfde soort verandert de samenstelling van PBS als reactie op de omgeving, zoals lichtkwaliteit en uitputting van voedingsstoffen6,7,8,9,10,11. Daarom is de experimentele procedure om PBS te isoleren van cyanobacteriën van groot belang geweest bij het bestuderen van PBS12. Gedurende meerdere decennia hebben veel verschillende protocollen PBS geïsoleerd en de structuur, samenstelling en functie ervan geanalyseerd6,7,8,12,13,14,15,16,17. De grote verscheidenheid aan methoden voor PBS-isolatie biedt inderdaad flexibiliteit bij het isoleren van het complex in verschillende soorten met verschillende reagentia en instrumenten. Het maakt het echter ook moeilijker om een geschikt protocol te kiezen voor wetenschappers die niet bekend zijn met cyanobacteriën en PBS. Daarom wordt in dit werk een gegeneraliseerd en eenvoudig protocol ontwikkeld voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het starten van PBS-isolatie van cyanobacteriën.
De methoden voor het isoleren van PBS uit eerdere publicaties worden hier samengevat. Omdat PBS een in water oplosbaar eiwitcomplex is en gemakkelijk kan worden gedissocieerd, is een fosfaatbuffer met hoge ionische sterkte nodig om PBS tijdens extractie te stabiliseren18. Verschillende onderzoeksartikelen die methoden beschrijven voor de isolatie van PBS van cyanobacterium zijn in het verleden gepubliceerd. De meeste methoden vereisen een hoge concentratie fosfaatbuffer8,14,15,18,19. De procedures voor mechanische verstoring van de cellen variëren echter, zoals glasparels-ondersteunde extractie, ultrasoonapparaat20 en Franse pers6,8,14. Verschillende fycobiliproteïnen kunnen worden verkregen door precipitatie met ammoniumsulfaat20 en gezuiverd door HPLC21 of een chromatografische kolom22. Aan de andere kant kan intact PBS gemakkelijk worden geïsoleerd door sucrosedichtheidsgradiënt ultracentrifugatie6,8,15.
In dit protocol werden één modelcyanobacterie en één niet-model cyanobacterie gebruikt als materialen voor PBS-isolatie. Het gaat om model eencellige glucosetolerante Synechocystis sp. PCC 6803 (hierna Syn6803) en niet-model filamenteuze Leptolyngbya sp. JSC-1 (hierna JSC-1), respectievelijk7,23,24. Het protocol begint met verstoring van de eencellige en filamenteuze cyanobacteriën in een fosfaatbuffer met hoge ionische sterkte. Na lysis worden de supernatanten verzameld door centrifugeren en vervolgens behandeld met een niet-ionisch reinigingsmiddel (Triton X-100) om de in water oplosbare eiwitten uit de thylakoïde membranen op te lossen. De totale in water oplosbare eiwitten worden toegepast op een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt om de PBS te fractioneren. De discontinue sucrosegradiënt in dit protocol bestaat uit vier sucrose-oplossingen en verdeelt de intacte PBS in de laagste fracties van sucroselaag25. De integriteit van PBS kan worden geanalyseerd door SDS-PAGE, zinkkleuring en 77K fluorescentiespectroscopie6,7,8,26. Deze methode is geschikt voor wetenschappers die intact PBS willen isoleren van cyanobacteriën en de spectrale, structurele en compositorische eigenschappen ervan willen bestuderen.
Er zijn verschillende voordelen van dit protocol. (1) Deze methode is gestandaardiseerd en kan worden gebruikt voor het isoleren van intact PBS van zowel eencellige als filamenteuze cyanobacteriën. De meeste artikelen beschrijven de methode die werd toegepast in één type cyanobacteriën4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Deze methode wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur, aangezien PBS dissocieert bij lage temperatuur19,27. (3) Deze methode beschrijft het gebruik van een kralenklopper om de cellen te verstoren; daarom is het goedkoper en veiliger dan hogedruk Franse pers en mogelijke gehoorschade door sonicator in andere methoden8,13,14,20. (4) Deze methode isoleert intact PBS door middel van ultracentrifugatie van sucrosegradiënt. Op deze manier kan intact PBS met verschillende maten en gedeeltelijk gedissocieerde PBS worden gescheiden op basis van sucroseconcentratie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De Synechocystis sp. PCC 6803, de model glucosetolerante stam, werd verkregen van Dr. Chu, Hsiu-An bij Academia Sinica, Taiwan. Leptolyngbya sp. JSC-1, de niet-model filamenteuze, werd verkregen van Dr. Donald A. Bryant aan de Pennsylvania State University, VS.
1. Celkweek en oogsten
- Ent Syn6803- of JSC-1-cellen met behulp van een metallische inentingslus in een erlenmeyer van 100 ml met 50 ml B-HEPES-medium28. Kweek de cellen bij 30 °C onder 50 μmol fotonen m-2 s-1 (witlicht-LED) in 1% (v/v) CO2 met constant roeren door een magneetroerder (120 rpm) totdat de cultuur de mid-exponentiële groeifase bereikt (OD750 = 0,6-0,8).
OPMERKING: Oogst de celcultuur wanneer de optische dichtheid van de cultuur bij 750 nm (OD750) 0,6-0,8 bereikt door over te brengen naar een nieuwe kolf. Optische dichtheid werd routinematig gebruikt om de microbiële celdichtheid in vloeibare culturen te schatten29. De golflengten van 720-750 nm werden gebruikt in verschillende studies voor het meten van cyanobacteriële groei30,31,32. In dit protocol wordt OD750 gebruikt omdat JSC-1 pigmenten kan produceren die verrood licht absorberen7. Als alternatief werd de chlorofylconcentratie ook gebruikt om de groei van cyanobacteriën te meten33. - Breng de celcultuur (OD750 ~0,8) over in een erlenmeyer van 1 liter en verdun deze tot OD750 = 0,2 in 500 ml B-HEPES-medium. Kweek de cultuur tot de late exponentiële groeifase (OD750 = 0,8-1,0) in dezelfde hierboven genoemde toestand (stap 1.1) en oogst vervolgens de cultuur door centrifugering.
- Centrifugeer de cultuur bij 10.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant volledig weg.
OPMERKING: De celkorrels kunnen tot 6 maanden bij -80 °C worden bewaard.
2. Lysis van cellen
- Suspensie van de celkorrels en was tweemaal met 0,75 M K-fosfaatbuffer, pH 7.
OPMERKING: Om 0,75 M K-fosfaatbuffer bij pH 7 te maken, bereidt u 1,5 M K2HPO4 en 1,5 M KH2PO4 afzonderlijk voor. Meng 615 ml 1,5 M K2HPO4 en 385 ml 1,5 M KH2PO4 om 1,5 M K-fosfaatbuffer bij pH 7 te krijgen. Verdun het eenvoudig met dezelfde hoeveelheid ddH2O om 0,75 M K-fosfaatbuffer te maken bij pH 7. - Pellet de cellen in centrifugebuizen van 50 ml door centrifugering bij 10.000 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen met 0,75 M K-fosfaatbuffer. Meet het natte gewicht van de pellet met een elektronische balans en resuspend 1 g nat gewicht van de pellet in 5 ml van de buffer.
OPMERKING: Het natte gewicht van een pellet werd gemeten door het gewicht van een lege centrifugebuis af te trekken van het gewicht van de centrifugebuis die de celpellet bevat. - Voeg 1 ml celsuspensie en 0,4-0,6 g glasparels van 0,1 mm (zie materiaaltabel) toe aan een injectieflacon met schroefdop van 2 ml.
- Breek de cellen gedurende 30 s door een kralenklopper (zie Tabel met materialen). Laat de buizen 2 minuten afkoelen in een waterbad op kamertemperatuur en herhaal de breekcyclus 5 keer.
- Centrifugeer na lysis de injectieflacons bij 500 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur. Verzamel het supernatant met een pipet in een centrifugebuis van 15 ml. Was de kralen één keer met 0,5 ml K-fosfaatbuffer van 0,75 M en breng ze vervolgens over op dezelfde centrifugebuis.
- Voeg Triton X-100 (2% w/v, eindconcentratie) toe aan de gelyseerde celsuspensie en incubeer op een schommelende shaker (40 rpm) bij kamertemperatuur totdat de oplossing homogeen wordt (~ 20 min).
- Centrifugeer de buizen gedurende 20 minuten bij 17.210 g om de intacte cellen en het vuil van grote cellen te verwijderen. Bewaar het supernatant zonder de bovenste Triton-micellaag bij kamertemperatuur gedurende maximaal 1 uur.
OPMERKING: Het supernatant bevat twee gescheiden lagen. De bovenste hydrofobe Triton X-laag bevat chlorofylbindende eiwitten en hydrofobe staafvormige fycobilisomen6. De onderste waterige laag bevat in water oplosbaar PBS.
3. Bereiding van de sucrosegradiëntbuffers en PBS-isolatie
- Maak vier concentraties sucrose (2,0 M, 1,0 M, 0,75 M en 0,5 M) in 0,75 M K-fosfaatbuffer bij pH 7.
OPMERKING: Er wordt voorgesteld om 1,5 M K-fosfaatbuffer bij pH 7 te gebruiken om de sucrosegradiënt te bereiden, omdat het toevoegen van sucrose de concentratie van K-fosfaatbuffer verdunt. Nadat sucrose volledig is opgelost, voegt u ddH2O toe om de concentratie aan te passen tot 0,75 M, pH 7. - Plaats 2,8 ml sacharosebuffer van 2,0 m aan de onderkant van de centrifugebuis van 40 ml en leg deze af met drie lagen sacharose-oplossingen (8 ml 1,0 m; 12 ml 0,75 m en 11 ml 0,5 m voor centrifugebuis van 40 ml) en ten slotte PBS-houdende de bovennatuurlijke fractie (3,0 ml) (figuur 1A).
OPMERKING: Voeg voorzichtig de sucrose-oplossing toe en laat sucrose heel langzaam in de buis vallen. Houd de pipetpunt net boven het oppervlak van de oplossing in de buis tijdens het laden van de oplossing. Sucroselagen kunnen worden waargenomen wanneer ze langzaam worden gelaagd. - Centrifugeer de resulterende gradiënten bij 125.800 x g gedurende ~16h-20 h bij 25 °C.OPMERKING: Voor deze stap is een ultracentrifuge (zie Tabel met materialen) vereist.
- Condenseer bij ultra-centrifugatie de gefractioneerde PBS en fycobiliproteïnen tussen de lagen. Blauwe banden in Syn6803 (paarse banden getoond in JSC-1) werden waargenomen in de interfaces (figuur 1D).
- Verzamel de fracties langzaam met een pipet van de bovenkant van de sucrosegradiënten. Verwijder de sacharose door herhaaldelijk te concentreren (3.500 x g gedurende 20 min) en verdun de fracties met 0,75 M K-fosfaatbuffer in membraancentrifugaalfiltereenheden (10 K moleculaire gewichtsafsnijding, zie Tabel met materialen).
4. Meting van PBS-fluorescentie bij 77K
OPMERKING: Een fluorimeter uitgerust met een vloeistofstikstofcontainer (zie Tabel met materialen) wordt gebruikt om fluorescentiespectra bij 77K te meten.
- Verdun het geconcentreerde PBS-monster met 0,75 M K-fosfaatbuffer tot een winst van ten minste 500 μL.
OPMERKING: De concentraties van fycocyanine van monsters waren ~ 4,2 μg ml-1 op basis van de formule: (OD615 0,474 x OD652) / 5,34 [mg / ml] 34. - Voeg 500 μL van het PBS-monster toe aan een transparante glazen buis en vries de buis in vloeibare stikstof totdat deze volledig bevroren is. Verplaats de bevroren buis naar een transparante Dewar-container (zie Tabel met materialen) die vooraf is gevuld met vloeibare stikstof.
OPMERKING: De binnendiameter van de glazen buis is 3 mm in dit protocol. Dunne glazen buizen werden gebruikt om de reabsorptie van korte golflengte-emissie in het monster te minimaliseren. - Kies de excitatiegolflengten voor fycoerythrin en phycocyanine om respectievelijk 550 nm en 580 nm te zijn.
OPMERKING: Fluorescentie-emissies werden geregistreerd van 560-800 nm (voor 550 nm excitatie) of 600-800 nm (voor 580 nm excitatie).
5. SDS-PAGE analyse van PBS
- Bufferwissel de geconcentreerde PBS-monsters in 0,75 M K-fosfaat met 50 mM Tris-buffer (pH 8,0) in membraancentrifugaalfiltereenheden (3K moleculaire gewichtsafsnijding, zie Materialentabel).
- Meng 50 μL PBS-oplossing met 10 μL 6x SDS-laadbuffer [300 mM Tris pH 6,8, 12% (w/v) Natriumdodecylsulfaat, 0,06% (w/v) Bromfenolblauw, 50% (v/v) Glycerol, 6% (v/v) β-Mercaptoethanol] (zie Materialentabel) in een microcentrifugebuis en incubeer bij 95 °C gedurende 10 minuten in een warmteblok.
- Scheid de eiwitmonsters met SDS-PAGE (8%-20% (w/v) polyacrylamidegel) en ga verder met zink- en Coomassie-kleuring. De gedetailleerde procedure is beschreven in Reference8.
- Voor zinkkleuring incubeer de gel in 50 mM ZnSO4-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, was de gel met gedestilleerd water en visualiseer zink-geïnduceerde fluorescentie onder UV-bestraling (312 nm).
- Voor Coomassie blauwe kleuring, incubeer de gel in Coomassie Blue kleuringsbuffer [0,25% (w / v) van Coomassie R-250, 10% (v / v) van azijnzuur, 50% (v / v) van Methanol, zie Tabel van materialen] gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de gel tweemaal met gedestilleerd water om de resterende kleuringsbuffer te verwijderen en incubeer de gel met een ontdooiingsbuffer [10% (v/v) azijnzuur, 30% (v/v) methanol] op een schommelende shaker (40 rpm) bij kamertemperatuur 's nachts. Visualiseer de volledig gedesineerde gel met een digitale camera of een scanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De Syn6803- en JSC-1-cellen werden gekweekt in kegelkolven met constant roeren in B-HEPES-medium bij 30 °C, onder een LED-wit licht (50 μmol fotonen m-2s-1) in een groeikamer gevuld met 1% (v/v) CO2. In de exponentiële groeifase (OD750 = ~0,5) werden de cellen gesubcultureerd tot vers medium met een uiteindelijke optische dichtheid OD750 = ~0,2. Na het bereiken van de late exponentiële groeifase (OD750 = 0,6-0,8) werden de culturen verzameld en gecentrifugeerd (10.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten). Het supernatant werd weggegooid en de celkorrels werden opgeslagen bij -80 °C totdat de volgende stap beschikbaar was.
Om de cellen te breken, werden de cellen eerst bij kamertemperatuur ontdooid. De cellen werden verstoord door kralen kloppen met 0,1 mm glasparels binnen de 0,75 M K-fosfaatbuffer. Volledige cellysis toont het supernatant in donkerblauwgroene kleur vóór centrifugatie (figuur 1B). Na oplosbaarheid door Triton X-100 en centrifugering om de onoplosbare membranen en celresten te verwijderen, werd het supernatant op de bovenkant van sucrosegradiëntoplossing geladen in een centrifugebuis van 40 ml (figuur 1C). Na 18 uur centrifugeren verhuisde de intacte PBS naar het midden van het verloop als een helderblauwe band voor Syn6803 en een paarse band voor JSC-1. Het verschil in hun kleur is het gevolg van de verschillende samenstellingen van PBS in Syn6803 en JSC-1. De PBS van Syn6803 draagt phycocyanin35, terwijl de PBS van JSC-1 phycocyanine en phycoerythrin7 draagt. Het resultaat van sucrose dichtheid-gradiëntscheiding van geïsoleerde PBS toont verschillende fracties van gedissocieerde fycobiliproteïnen, en de laagste fractie vertegenwoordigt de intacte PBS (figuur 1D).
De absorptiespectra van de verschillende fracties pbs geïsoleerd uit JSC-1 en Syn6803 worden vergeleken in figuur 2A. De gedetailleerde procedure van absorptiespectra is beschreven in de artikelen7,8. De absorptiespectra van de gedissocieerde PBS en intacte PBS van JSC-1 en Syn6803 hebben dezelfde piek bij 622 nm, overeenkomend met de phycocyanine. En de fycoerythrinabsorptiepiek bij 571 nm wordt gevonden in zowel gedissocieerde PBS als intacte PBS van JSC-1. Allophycocyanine vertoont een kleine piek met een schouder bij 670 nm in de intacte PBS-fracties van JSC-1 en Syn6803. De spectrale verschillen geven aan dat de verhouding staaf (phycocyanine) tot kern (allophycocyanine) hoger is in de gedissocieerde PBS dan in de intacte PBS-fractie, omdat de spectrale eigenschappen van fycobiliproteïnen eerder zijn bepaald5. Omdat de gedissocieerde PBS en de intacte PBS-fracties vergelijkbare absorptiespectra en fluorescerende emissiekenmerken bij kamertemperatuur vertonen, werd 77K fluorescentiespectroscopie vervolgens gebruikt om de verschillende fracties geïsoleerd uit de sucrosegradiënt te analyseren. 77K fluorescerende emissiespectra van de gedissocieerde PBS en de intacte PBS-fracties werden met 580 nm geëxciteerd. De emissiespectra van de gedissocieerde PBS hebben één sterke piek bij ~650 nm in Syn6803 en JSC-1, die de emissie van fycocyanine vertegenwoordigen (figuur 2B). De fluorescerende emissiespectra van de intacte PBS laten twee fluorescerende maximale emissiepieken zien: de zwakke bij 651 nm en de sterke bij 684 nm, waaruit blijkt dat de energie die door phycocyanine wordt geoogst, efficiënt werd overgedragen aan allophycocyanine en terminale emitters (ApcD en ApcE) in de kern9 (figuur 2C). Deze kenmerken tonen aan dat de laagste fracties in de sucrosegradiënt intacte PBS bevatten.
De gedissocieerde PBS en de intacte PBS werden gescheiden door SDS-PAGE op een 8%-20% (w/v) SDS polyacrylamide lineaire gradiënt gel. De α en β subeenheden van phycocyanine en allophycocyanine waren zichtbaar op de gel zonder kleuring (figuur 3A). De gel werd vervolgens gedurende 10 minuten gekleurd met 10 mM ZnSO4. De chromofoorbevattende fycobiliproteïnen werden waargenomen door de zinkkleuring tijdens UV-bestraling8. Phycobiliproteïne-subeenheden (14-21 kDa) zijn sterk fluorescerend en de ApcE (pijl) vertoonde zwakke fluorescentie (figuur 3B). Verder toont Coomassie Blue-kleuring de verschillende eiwitsamenstelling tussen de gedissocieerde PBS-fracties en de intacte PBS-fracties (figuur 3C). De bovenste fracties bevatten andere niet-PBS in water oplosbare eiwitten omdat er meer eiwitten worden gekleurd dan in intacte PBS-fracties. De intacte PBS in Syn6803 toont een prominente ApcE-band (pijl) die ontbreekt in de gedissocieerde PBS-fracties (figuur 3C).
De volumeverhouding tussen het PBS-extract en de sucrosegradiënt is van cruciaal belang voor het verkrijgen van scherpe banden in de sucrosegradiënt na ultracentrifugatie. De voorgestelde verhouding van opgeloste PBS-extracten tot sucrose gradiëntoplossing is 1:10. Op basis van eerdere ervaringen toont het maken van de sucrosegradiënt in centrifugebuizen van 40 ml een hogere resolutie dan de sucrosegradiënt in de buizen van 13 ml. De discontinue sucrosegradiënt diffundeert in de loop van de tijd als gevolg van trillingen op de bank. Daarom kan de centrifugebuis van 13 ml een goede keuze zijn voor het gelijktijdig verwerken van veel monsters. Om dat aan te tonen, zijn de sucrosegradiënten in centrifugebuizen van 13 ml in de verhoudingen 1:3 en 1:10 bereid tussen de ruwe extracten van Syn6803 of JSC-1 tot de sucrosegradiëntoplossing (figuur 4A). Na ultracentrifugatie vertoont de sucrosegradiënt bereid in verhouding 1:3 bredere banden dan de gradiënt gemaakt bij verhouding 1:10 (figuur 4B). De laagste fracties van elke gradiënt bevatten intacte PBS, bevestigd door 77K fluorescerende emissiespectroscopie.
Figuur 1: Verstoring van Syn6803- en JSC-1-cellen en sucrosegradiënt ultracentrifugatie. (A) Schematische illustratie van het bereiden van de stopgezette sucrosegradiënt in een centrifugebuis van 40 ml. (B) De injectieflacons met schroefdop werden gevuld met 0,4 g glasparels en 1 ml celsuspensie van Syn6803 of JSC-1, en vervolgens werden de cellen gelyseerd door een kralenklopper. (C) Het supernatant van Triton X-100 opgelost extract was gelaagd op de top van een sucrosedichtheidsgradiënt. (D) Na centrifugeren gedurende 18 uur werden de PBS-fracties gevisualiseerd als heldere blauwe banden in de gradiënt in Syn6803 en als paarse banden in JSC-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Spectroscopische karakterisering van verschillende fracties van sucrosegradiënten. (A) Absorptiespectra van gedissocieerde PBS en intacte PBS-fracties van JSC-1 en Syn6803. Fluorescentie-emissiespectra werden gemeten bij 77 K met behulp van de excitatiegolflengte bij 580 nm voor (B) de gedissocieerde PBS-fracties en (C) de intacte PBS-fracties van Syn6803 en JSC-1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: SDS-PAGE analyse van PBS geïsoleerd uit sucrose gradiënten. De gedissocieerde en de intacte PBS-fracties werden gekwantificeerd (20 μg eiwit per baan) en geladen op een 8%-20% (w/v) gradiënt polyacrylamidegel. Na gel-elektroforese werd de gel vervolgens gevisualiseerd door zinkkleuring en Coomassie Blue-kleuring. (A) De kleur van fycobiliproteïnen is zichtbaar op de gel zonder kleuring. (B) Zink-gekleurde gel toont de fluorescentie van fycobiliproteïnen. (C) De gel gekleurd met Coomassie Blue vertoont fycobiliproteïnen en andere eiwitten. De pijlen geven de posities van de ApcE aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: De sucrosegradiënt gemaakt in centrifugebuizen van 13 ml. De verhoudingen tussen het ruwe extract en de sucrosegradiëntoplossing zijn bovenaan de afbeeldingen aangegeven. (A) Het supernatant van Triton X-100 opgeloste extracten van Syn6803 en JSC-1 was gelaagd over sucrose dichtheidsgradiënten met verschillende verhoudingen van de opgeloste extracten tot sucrose gradiënt oplossing. (B) Na centrifugeren gedurende 18 uur werden de PBS-fracties in Syn6803 en JSC-1 waargenomen in de sucrosegradiënten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een eenvoudige en standaardmethode voor het isoleren van intacte PBS in twee soorten cyanobacteriën, eencellig model Syn6803 en filamenteuze niet-model JSC-1. De kritische stappen van het protocol zijn celhomogenisatie en ultracentrifugatie op een discontinue dichtheidsgradiënt van sucrose. Over het algemeen is de verstoring van filamenteuze cellen gecompliceerder dan eencellige cellen. Het verhogen van de hoeveelheid uitgangsmateriaal (het natte gewicht van de celkorrel) en de herhaling van het kralen kloppen waren nuttig om de opbrengst van PBS uit filamenteuze cyanobacteriële cellen te verhogen. Voor de filamenteuze cyanobacterie JSC-1 werden drie keer meer cellen gebruikt dan eencellige, Syn6803. Bovendien, om de filamenteuze cyanobacterie volledig te breken, moet het vaker parelen dan de eencellige cyanobacteriën om de donkere blauwachtig paarse kleur in de extractiebuffer te observeren.
De duur van het kralen slaan wordt niet voorgesteld om 30 s te overschrijden, omdat de monsters tijdens elke kralencyclus worden opgewarmd. De buizen worden aanbevolen om tussen elke cyclus op kamertemperatuur op een bank (of in een waterbad) af te koelen, omdat de intacte PBS gemakkelijk bij lage temperatuur kan worden gedissocieerd25. Daarom wordt voorgesteld om elke procedure in dit protocol bij kamertemperatuur uit te voeren. Veel onderzoeksartikelen hebben verschillende celverstoringsmethoden beschreven, waaronder een hogedrukhomogenisator (French-Press) of een sonicator6,8,20. Een kralenmolenhomogenisator wordt voorgesteld omdat deze goedkoper, veiliger, gemakkelijker te hanteren, sneller, toegankelijker en efficiënter is in het verwerken van meerdere monsters tegelijkertijd.
Fycobilisomen vertonen drie verschillende vormen, hemidiscoidaal, bundelvormig en staafvormig5. De intacte fycobilisomen geïsoleerd in figuur 2 behoren tot de hemidiscoïdale vorm zoals besproken in eerdere publicaties7,13,36. De bovenste fractie die gedissocieerde PBS vertegenwoordigt, kan echter ook staafvormige PBS bevatten. Syn6803 en JSC-1 coderen een specifieke rod-core linker CpcL, wat de aanwezigheid van staafvormige PBS suggereert naast de hemidiscoidale PBS6,37. Staafvormige PBS is direct geïdentificeerd in Syn6803, maar niet in JSC-17,13,37. Aan de andere kant remodelleert JSC-1 zijn PBS door type III chromatische acclimatisatie uit te voeren in groen / rood licht en verrood licht fotoacclimatie in rood / verrood licht6,7. Al deze verschillen wijzen erop dat er naast de laagste intacte hemidiscoïdale PBS-fractie ook andere soorten PBS in de sucrosegradiënten kunnen zitten. Er zijn bijvoorbeeld twee soorten PBS tegelijkertijd aanwezig wanneer Synechococcus sp. PCC 7335 en JSC-1 wennen aan verrood licht8,13. Er wordt gesuggereerd dat de persoon die PBS isoleert van een niet-gekarakteriseerde cyanobacteriële stam voorzichtiger moet zijn bij het analyseren van elke fractie in de sucrosegradiënt om mogelijke soorten PBS te identificeren.
Over het algemeen biedt dit protocol een goedkope, eenvoudige en snelle methode voor celverstoring. Het is ook aangetoond dat deze methode betrouwbaar is om PBS te isoleren van verschillende cyanobacteriën met verschillende celtypen en PBS-samenstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdig belang te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University voor het handige gebruik van de ultracentrifuge. De cyanobacteriële stammen Synechocystis sp. PCC 6803 en Leptolyngbya sp. JSC-1 werden geschonken door respectievelijk Dr. Chu, Hsiu-An aan de Academia Sinica, Taiwan, en Dr. Donald A. Bryant aan de Pennsylvania State University, VS. Dit werk werd gefinancierd door het Ministerie van Wetenschap en Technologie (Taiwan) (109-2636-B-002-013- en 110-2628-B-002-065-) en het Ministerie van Onderwijs (Taiwan) Yushan Young Scholar Program (109V1102 en 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N.
- Glazer, A. N.
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. Methods in Enzymology. , Academic Press. 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
