Summary
Текущий протокол детализирует выделение фикобилисом из цианобактерий путем центрифугирования через прерывистый градиент плотности сахарозы. Фракции интактных фикобилисом подтверждаются флуоресцентным спектром излучения 77K и анализом SDS-PAGE. Полученные фикобилисомные фракции пригодны для отрицательного окрашивания ТЭМ и масс-спектрометрического анализа.
Abstract
В цианобактериях фикобилисома является жизненно важным антенным белковым комплексом, который собирает свет и передает энергию фотосистеме I и II для фотохимии. Изучение структуры и состава фикобилисом представляет большой интерес для ученых, поскольку выявляет эволюцию и дивергенцию фотосинтеза у цианобактерий. Этот протокол обеспечивает подробный и оптимизированный метод эффективного разрушения цианобактериальных клеток при низких затратах с помощью бисера. Интактная фикобилисома затем может быть выделена из клеточного экстракта путем ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Этот метод продемонстрировал пригодность как для модельных, так и для немодельных цианобактерий с различными типами клеток. Также предусмотрена пошаговая процедура для подтверждения целостности и свойства фикобилипротеинов с помощью флуоресцентной спектроскопии 77K и SDS-PAGE, окрашенных сульфатом цинка и Coomassie Blue. Изолированная фикобилисома также может быть подвергнута дальнейшему структурному и композиционному анализу. В целом, этот протокол обеспечивает полезное начальное руководство, которое позволяет исследователям, незнакомым с цианобактериями, быстро изолировать и охарактеризовать интактную фикобилисому.
Introduction
Фикобилисома (PBS) представляет собой огромный водорастворимый пигментно-белковый комплекс, который прикрепляется к цитоплазматической стороне фотосистем в тилакоидных мембранах цианобактерий1. PBS в основном состоит из цветных фикобилипротеинов и бесцветных линкерных белков1,2. Фикобилипротеины можно разделить на четыре основные группы: фикоэритрин, фикоэритроцианин, фикоцианин и аллофикоцианин3. Четыре основные группы поглощают различные длины волн световой энергии в диапазоне 490-650 нм, которую хлорофиллы поглощали неэффективно3. PBS может служить в качестве светособирающей антенны для сбора световой энергии и доставки ее в Фотосистему II и I4.
Структура и состав PBS варьируются от вида к виду. В совокупности три формы фикобилисомы (гемидискодиальная, пучкообразная и палочковидная) были идентифицированы у разных видов цианобактерий5. Даже у одних и тех же видов состав PBS изменяется в ответ на окружающую среду, например, качество света и истощение питательных веществ6,7,8,9,10,11. Таким образом, экспериментальная процедура выделения PBS из цианобактерий сыграла важную роль в изучении PBS12. В течение нескольких десятилетий множество различных протоколов изолировали PBS и анализировали его структуру, состав и функции6,7,8,12,13,14,15,16,17. Большое разнообразие методов изоляции PBS действительно обеспечивает гибкость в выделении комплекса у разных видов с различными реагентами и инструментами. Тем не менее, это также затрудняет выбор подходящего протокола для ученых, незнакомых с цианобактериями и PBS. Поэтому в этой работе разработан обобщенный и простой протокол для тех, кто заинтересован в запуске выделения PBS из цианобактерий.
Методы изоляции PBS от предыдущих публикаций кратко изложены здесь. Поскольку PBS является водорастворимым белковым комплексом и легко диссоциируется, для стабилизации PBS во время экстракции требуется фосфатный буфер высокой ионной силы18. В прошлом было опубликовано несколько исследовательских статей, описывающих методы выделения PBS из цианобактерий. Большинство методов требуют высокой концентрации фосфатного буфера8,14,15,18,19. Тем не менее, процедуры механического разрушения клеток различаются, такие как экстракция стеклянных шариков, обработка ультразвуком20 и френч-пресс6,8,14. Различные фикобилипротеины могут быть получены путем осаждения сульфатом аммония20 и очищены ВЭЖХ21 или хроматографической колонкой22. С другой стороны, интактный PBS может быть легко выделен ультрацентрифугированием градиента плотности сахарозы6,8,15.
В этом протоколе в качестве материалов для выделения PBS использовались одна модельная цианобактерия и одна немодельная цианобактерия. Это модель одноклеточная глюкозотоустойчивая Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Syn6803) и немодельная нитевидная Leptolyngbya sp. JSC-1 (далее JSC-1), соответственно7,23,24. Протокол начинается с разрушения одноклеточных и нитевидных цианобактерий в фосфатном буфере высокой ионной силы. После лизиса супернатанты собирают центрифугированием, а затем обрабатывают неионным детергентом (Triton X-100) для растворимости водорастворимых белков из тилакоидных мембран. Общие водорастворимые белки наносят на прерывистый градиент плотности сахарозы для фракционирования PBS. Прерывистый градиент сахарозы в этом протоколе состоит из четырех растворов сахарозы и разделяет неповрежденный PBS на самые низкие фракции слоя сахарозы25. Целостность PBS может быть проанализирована с помощью SDS-PAGE, цинкового окрашивания и 77K флуоресцентной спектроскопии6,7,8,26. Этот метод подходит для ученых, которые стремятся выделить неповрежденный PBS из цианобактерий и изучить его спектральные, структурные и композиционные свойства.
Есть несколько преимуществ этого протокола. (1) Этот метод стандартизирован и может быть использован для выделения интактных PBS как из одноклеточных, так и из нитевидных цианобактерий. В большинстве статей описывается метод, применяемый в одном типе цианобактерий4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Этот метод выполняется при комнатной температуре, так как PBS диссоциирует при низкой температуре19,27. (3) Этот метод описывает использование бисерного битера для разрушения клеток; поэтому он дешевле и безопаснее, чем французский пресс высокого давления и возможное повреждение слуха от ультразвукового аппарата другими методами8,13,14,20. (4) Этот метод изолирует интактный PBS путем ультрацентрифугирования градиента сахарозы. Таким образом, интактные PBS с различными размерами и частично диссоциированные PBS могут быть разделены в зависимости от концентрации сахарозы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Synechocystis sp. PCC 6803, модельно-толерантного штамма, была получена от доктора Чу, Сю-Ана в Academia Sinica, Тайвань. Leptolyngbya sp. JSC-1, немодельная нить, была получена от доктора Дональда А. Брайанта из Университета штата Пенсильвания, штат США.
1. Культивирование и сбор клеток
- Инокулируют ячейки Syn6803 или JSC-1 с помощью металлической петли инокуляции в коническую колбу объемом 100 мл, содержащую 50 мл среды B-HEPES28. Культивируйте клетки при 30 °C при 50 мкмоль фотонах m-2 s-1 (светодиод белого света) в 1% (v/v) CO2 с постоянным перемешиванием магнитной мешалкой (120 об/мин) до тех пор, пока культура не достигнет среднеэкспоненциальной фазы роста (OD750 = 0,6-0,8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Собирают клеточную культуру, когда оптическая плотность культуры при 750 нм (OD750) достигает 0,6-0,8 путем переноса в новую колбу. Оптическая плотность обычно использовалась для оценки плотности микробных клеток в жидких культурах29. Длины волн от 720-750 нм использовались в различных исследованиях для измерения роста цианобактерий30,31,32. В этом протоколе OD750 используется, потому что JSC-1 может производить пигменты, которые поглощают дальний красный свет7. Альтернативно, концентрация хлорофилла также использовалась для измерения роста цианобактерий33. - Переложите культуру клеток (OD750 ~ 0,8) в коническую колбу объемом 1 л и разбавьте ее до OD750 = 0,2 в 500 мл среды B-HEPES. Выращивайте культуру до поздней фазы экспоненциального роста (OD750 = 0,8-1,0) в том же состоянии, упомянутом выше (шаг 1.1), а затем собирайте культуру путем центрифугирования.
- Центрифугируют культуру при 10 000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре и полностью выбрасывают супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гранулы клеток могут храниться при -80 °C до 6 месяцев.
2. Лизис клеток
- Суспендировать гранулы клеток и промыть дважды с буфером 0,75 М К-фосфата, рН 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить 0,75 М К-фосфатного буфера при рН 7, приготовьте 1,5 М K2HPO4 и 1,5 М KH2PO4 отдельно. Смешайте 615 мл 1,5 М K2HPO4 и 385 мл 1,5 М KH2PO4, чтобы получить 1,5 М К-фосфатного буфера при рН 7. Просто разбавьте его тем же количеством ddH2O, чтобы получить 0,75 М К-фосфатного буфера при рН 7. - Гранулируйте ячейки в 50 мл центрифужных трубок центрифугированием при 10 000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте клетки с буфером 0,75 М К-фосфата. Измерить влажный вес гранулы электронными весами и повторно суспендировать 1 г влажного веса гранулы в 5 мл буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Влажный вес гранулы измеряли путем вычитания веса пустой центрифужной трубки из массы центрифужной трубки, содержащей ячейку гранулы. - Добавьте 1 мл клеточной суспензии и 0,4-0,6 г стеклянных шариков 0,1 мм (см. Таблицу материалов) во флакон с винтовой крышкой 2 мл.
- Разбейте ячейки на 30 с бисером (см. Таблицу материалов). Дайте трубкам остыть на водяной бане комнатной температуры в течение 2 мин и повторите цикл разрыва 5 раз.
- После лизиса центрифугируют флаконы при 500 х г в течение 10 с при комнатной температуре. Соберите супернатант с пипеткой в центрифужную трубку объемом 15 мл. Вымойте шарики 0,5 мл 0,75 М К-фосфатного буфера один раз, затем переложите в ту же центрифужную трубку.
- Добавляют Тритон Х-100 (2% мас./об., конечная концентрация) в лизированную клеточную суспензию и инкубируют на качающемся шейкере (40 об/мин) при комнатной температуре до тех пор, пока раствор не станет однородным (~20 мин).
- Центрифугируйте трубки по 17 210 г в течение 20 мин для удаления неповрежденных клеток и крупных клеточных обломков. Хранить супернатант без верхнего слоя мицеллы тритона при комнатной температуре до 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант содержит два разделенных слоя. Верхний гидрофобный слой Triton X содержит хлорофилл-связывающие белки и гидрофобные палочковидные фикобилисомы6. Нижний водный слой содержит водорастворимый ПБС.
3. Подготовка буферов градиента сахарозы и изоляция PBS
- Получают четыре концентрации сахарозы (2,0 М, 1,0 М, 0,75 М и 0,5 М) в буфере 0,75 М К-фосфата при рН 7.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагается использовать 1,5 М К-фосфатный буфер при рН 7 для получения градиента сахарозы, поскольку добавление сахарозы разбавляет концентрацию буфера К-фосфата. После того, как сахароза полностью растворится, добавляют ddH2O для регулировки концентрации до 0,75 М, рН 7. - Поместите 2,8 мл буфера сахарозы 2,0 М на дно 40 мл центрифужной трубки и наложите три слоя растворов сахарозы (8 мл 1,0 М; 12 мл 0,75 М и 11 мл 0,5 М на 40 мл центрифужной трубки) и, наконец, PBS-содержащую фракцию надосадочного вещества (3,0 мл) (рисунок 1А).
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно добавьте раствор сахарозы и дайте сахарозе очень медленно опуститься внутрь трубки. Держите наконечник пипетки чуть выше поверхности раствора в трубке во время загрузки раствора. Слои сахарозы можно наблюдать, когда они слоистые медленно. - Центрифугируйте полученные градиенты при 125 800 х г в течение ~16h-20 ч при 25 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа требуется ультрацентрифуга (см. Таблицу материалов).
- При ультрацентрифугировании конденсируют фракционированные PBS и фикобилипротеины между слоями. Синие полосы в Syn6803 (фиолетовые полосы, показанные в JSC-1) наблюдались в интерфейсах (рисунок 1D).
- Медленно соберите фракции пипеткой с вершины градиентов сахарозы. Удаляют сахарозу путем многократной концентрирования (3 500 х г в течение 20 мин) и разбавления фракций буфером 0,75 М К-фосфата в мембранных центробежных фильтрующих установках (отсечка молекулярной массы 10 К, см. Таблицу материалов).
4. Измерение флуоресценции PBS при 77K
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуориметр, оснащенный контейнером для жидкого азота (см. Таблицу материалов), используется для измерения спектров флуоресценции при 77K.
- Разбавляют концентрированный образец PBS буфером 0,75 М К-фосфата, чтобы получить не менее 500 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации фикоцианина в образцах составляли ~4,2 мкг мл-1 на основе формулы: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [мг/мл]34. - Добавьте 500 мкл образца PBS в прозрачную стеклянную трубку и заморозьте трубку в жидком азоте до полного замораживания. Переместите замороженную трубку в прозрачный контейнер Дьюара (см. Таблицу материалов), предварительно заполненный жидким азотом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний диаметр стеклянной трубки в этом протоколе составляет 3 мм. Тонкие стеклянные трубки использовались для минимизации повторного поглощения коротковолнового излучения в образце. - Выберите длины волн возбуждения для фикоэритрина и фикоцианина 550 нм и 580 нм соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентные излучения регистрировались от 560-800 нм (для возбуждения 550 нм) или 600-800 нм (для возбуждения 580 нм).
5. SDS-PAGE анализ PBS
- Буферный обмен концентрированных образцов PBS в 0,75 М К-фосфата с 50 мМ буфера Триса (рН 8,0) в мембранных центробежных фильтрующих установках (отсечка молекулярной массы 3К, см. Таблицу материалов).
- Смешайте 50 мкл раствора PBS с 10 мкл 6x SDS нагрузочного буфера [300 мМ Tris pH 6,8, 12% (мас./об.) Додецилсульфата натрия, 0,06% (мас./об.) Бромфенола синего, 50% (v/v) глицерина, 6% (v/v) β-меркаптоэтанола] (см. Таблицу материалов) в микроцентрифужной трубке и инкубируют при 95 °C в течение 10 мин в тепловом блоке.
- Отделите образцы белка С помощью SDS-PAGE (8%-20% (мас./об.) полиакриламидного геля) и продолжите окрашивание цинком и Кумасси. Подробная процедура описана в ссылке 8.
- Для окрашивания цинком инкубируют гель в растворе ZnSO4 50 мМ в течение 10 мин при комнатной температуре, промывают гель дистиллированной водой и визуализируют вызванную цинком флуоресценцию под УФ-облучением (312 нм).
- Для синего окрашивания Coomassie инкубируют гель в буфере окрашивания Coomassie Blue [0,25% (мас./об.) Coomassie R-250, 10% (v/v) уксусной кислоты, 50% (v/v) метанола, см. Таблицу материалов] в течение 1 ч при комнатной температуре. Дважды промыть гель дистиллированной водой, чтобы удалить остаточный буфер окрашивания, и инкубировать гель с буфером очистки [10% (v/v) уксусной кислоты, 30% (v/v) метанола] на качающем шейкере (40 об/мин) при комнатной температуре в течение ночи. Визуализируйте полностью очищенный гель с помощью цифровой камеры или сканера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки Syn6803 и JSC-1 культивировали в конических колбах с постоянным перемешиванием в среде B-HEPES при 30 °C, под светодиодным белым светом (фотоны 50 мкмоль m-2s-1) в камере роста, заполненной 1% (v/v) CO2. В фазе экспоненциального роста (OD750 = ~0,5) клетки субкультивировали в свежую среду с конечной оптической плотностью OD750 = ~0,2. После достижения поздней фазы экспоненциального роста (OD750 = 0,6-0,8) культуры собирали и центрифугировали (10 000 х г при комнатной температуре в течение 20 мин). Супернатант выбрасывали, а гранулы клеток хранили при -80 °C до следующего этапа.
Чтобы разбить клетки, клетки сначала размораживали при комнатной температуре. Клетки были нарушены бисером с 0,1 мм стеклянными шариками в буфере 0,75 М К-фосфата. Полный лизис клеток показывает супернатант в темно-сине-зеленом цвете перед центрифугированием (рисунок 1B). После солюбилизации тритоном Х-100 и центрифугирования для удаления нерастворимых мембран и клеточного мусора супернатант загружали поверх раствора градиента сахарозы в центрифужную трубку объемом 40 мл (рисунок 1С). После 18 ч центрифугирования неповрежденный PBS переместился в центр градиента в виде прозрачной синей полосы для Syn6803 и фиолетовой полосы для JSC-1. Разница в их цвете обусловлена различными составами PBS в Syn6803 и JSC-1. PBS от Syn6803 несет фикоцианин35, тогда как PBS АО-1 несет фикоцианин и фикоэритрин7. В результате разделения плотности и градиента сахарозы изолированного PBS показано несколько фракций диссоциированных фикобилипротеинов, а самая низкая фракция представляет собой интактную PBS (рисунок 1D).
Спектры поглощения различных фракций ПБС, выделенных из АО-1 и Syn6803, сравниваются на рисунке 2А. Подробная процедура спектров поглощения описана в статьях7,8. Спектры поглощения от диссоциированного PBS и интактного PBS JSC-1 и Syn6803 имеют одинаковый пик при 622 нм, соответствующий фикоцианину. А пик абсорбции фикоэритрина при 571 нм обнаружен как в диссоциированных PBS, так и в интактных PBS JSC-1. Аллофикоцианин показывает малый пик с плечом при 670 нм в интактных фракциях PBS JSC-1 и Syn6803. Спектральные различия указывают на то, что отношение стержня (фикоцианина) к ядру (аллофикоцианину) выше в диссоциированной PBS, чем в интактной фракции PBS, так как спектральные свойства фикобилипротеинов были определены ранее5. Поскольку диссоциированные PBS и неповрежденные фракции PBS демонстрируют сходные спектры поглощения и флуоресцентные характеристики излучения при комнатной температуре, флуоресцентная спектроскопия 77K затем использовалась для анализа различных фракций, выделенных из градиента сахарозы. Спектры флуоресцентного излучения 77K диссоциированного PBS и неповрежденных фракций PBS возбуждались на 580 нм. Спектры излучения диссоциированного PBS имеют один сильный пик при ~650 нм в Syn6803 и JSC-1, представляющий излучение от фикоцианина (рисунок 2B). Флуоресцентные спектры излучения неповрежденного PBS показывают два максимальных пика флуоресцентного излучения: слабый при 651 нм и сильный при 684 нм, показывая, что энергия, собранная фикоцианином, эффективно передавалась аллофикоцианину и концевым излучателям (ApcD и ApcE) в ядре9 (рисунок 2C). Эти особенности демонстрируют, что самые низкие фракции в градиенте сахарозы содержат неповрежденный PBS.
Диссоциированный PBS и неповрежденный PBS были разделены SDS-PAGE на 8%-20% (мас./v) полиакриламидном линейном градиентном геле SDS. На геле были видны α и β субъединицы фикоцианина и аллофикоцианина без окрашивания (рисунок 3А). Впоследствии гель окрашивали 10 мМ ZnSO4 в течение 10 мин. Хромофорсодержащие фикобилипротеины наблюдались цинковым окрашиванием во время УФ-облучения8. Фикобилипротеиновые субъединицы (14-21 кДа) сильно флуоресцентны, а ApcE (стрелка) показала слабую флуоресценцию (рисунок 3B). Кроме того, окрашивание Coomassie Blue показывает различный белковый состав между диссоциированными фракциями PBS и неповрежденными фракциями PBS (рисунок 3C). Верхние фракции содержат другие нерастворимые в воде белки PBS, поскольку окрашивается больше белков, чем в неповрежденных фракциях PBS. Неповрежденная PBS в Syn6803 показывает заметную полосу ApcE (стрелку), отсутствующую в диссоциированных фракциях PBS (рисунок 3C).
Объемное соотношение между экстрактом PBS и градиентом сахарозы имеет решающее значение для получения резких полос в градиенте сахарозы после ультрацентрифугирования. Предлагаемое соотношение солюбилизированных экстрактов PBS к раствору градиента сахарозы составляет 1:10. Основываясь на предыдущем опыте, создание градиента сахарозы в 40 мл центрифужных трубок показывает более высокое разрешение, чем градиент сахарозы, сделанный в трубках объемом 13 мл. Прерывистый градиент сахарозы со временем диффундирует из-за вибрации на скамейке. Поэтому центрифужная трубка объемом 13 мл может быть хорошим выбором для одновременной обработки большого количества образцов. Чтобы продемонстрировать это, градиенты сахарозы в 13 мл центрифужных трубок в соотношениях 1:3 и 1:10 были получены между сырыми экстрактами Syn6803 или JSC-1 и раствором градиента сахарозы (рисунок 4A). После ультрацентрифугирования градиент сахарозы, полученный в соотношении 1:3, отображает более широкие полосы, чем градиент, полученный в соотношении 1:10 (рисунок 4B). Самые низкие фракции каждого градиента содержат неповрежденный PBS, подтвержденный флуоресцентной эмиссионной спектроскопией 77K.
Рисунок 1: Разрушение клеток Syn6803 и JSC-1 и ультрацентрифугирование градиента сахарозы. (А) Схематическая иллюстрация получения прекращенного градиента сахарозы в трубке центрифуги объемом 40 мл. (B) Флаконы с винтовой крышкой заполняли 0,4 г стеклянных шариков и 1 мл клеточной суспензии Syn6803 или JSC-1, а затем ячейки лисовали бисером. (C) Супернатант солюбилизированного экстракта Triton X-100 наслаивали поверх градиента плотности сахарозы. (D) После центрифугирования в течение 18 ч фракции PBS визуализировались как прозрачные синие полосы в градиенте в Syn6803 и как фиолетовые полосы в JSC-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Спектроскопическая характеристика различных фракций градиентов сахарозы. (А) Спектры поглощения диссоциированных PBS и интактных фракций PBS от JSC-1 и Syn6803. Спектры флуоресцентного излучения измеряли при 77 К с использованием длины волны возбуждения при 580 нм для (В) диссоциированных фракций PBS и (C) неповрежденных фракций PBS Syn6803 и JSC-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: SDS-PAGE анализ PBS, выделенный из градиентов сахарозы. Диссоциированные и интактные фракции PBS количественно оценивали (20 мкг белка на полосу) и загружали на 8%-20% (мас./об.) градиентный полиакриламидный гель. После гелевого электрофореза гель визуализировали цинковым окрашиванием и окрашиванием Coomassie Blue, впоследствии. (А) Цвет фикобилипротеинов виден на геле без окрашивания. (B) Окрашенный цинком гель показывает флуоресценцию фикобилипротеинов. (C) Гель, окрашенный Coomassie Blue, содержит фикобилипротеины и другие белки. Стрелки указывают позиции ApcE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Градиент сахарозы, изготовленный в центрифужных трубках объемом 13 мл. Соотношения между сырым экстрактом и раствором градиента сахарозы отмечены в верхней части изображений. (A) Супернатант солюбилизированных экстрактов Triton X-100 Syn6803 и JSC-1 наслаивали на градиенты плотности сахарозы с различным соотношением солюбилизированных экстрактов к раствору градиента сахарозы. (B) После центрифугирования в течение 18 ч фракции PBS в Syn6803 и JSC-1 наблюдались в градиентах сахарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Данный протокол описывает простой и стандартный способ выделения интактной ПБС у двух типов цианобактерий: одноклеточной модели Syn6803 и нитевидной немодельной АО-1. Критическими этапами протокола являются гомогенизация клеток и ультрацентрифугирование на прерывистом градиенте плотности сахарозы. Как правило, разрушение нитевидных клеток более сложное, чем одноклеточных. Увеличение количества исходного материала (влажный вес клеточной гранулы) и повторение биения шариков были полезны для увеличения выхода PBS из нитевидных цианобактериальных клеток. Для нитевидной цианобактерии, JSC-1, было использовано в три раза больше клеток, чем для одноклеточной Syn6803. Кроме того, чтобы полностью разрушить нитевидную цианобактерию, требуется биение шариков больше раз, чем одноклеточным цианобактериям, чтобы наблюдать темный голубовато-фиолетовый цвет в буфере экстракции.
Продолжительность биения бисера не рекомендуется превышать 30 с, так как образцы нагреваются во время каждого цикла биения бусин. Трубки рекомендуется охлаждать при комнатной температуре на скамейке (или на водяной бане) между каждым циклом, так как неповрежденный PBS легко диссоциируется при низкой температуре25. Поэтому каждую процедуру в этом протоколе предлагается выполнять при комнатной температуре. Во многих исследовательских статьях описываются различные методы разрушения клеток, в том числе гомогенизатор высокого давления (French-Press) или ультразвук 6,8,20. Предлагается гомогенизатор бисерной мельницы, потому что он дешевле, безопаснее, проще в обращении, быстрее, доступнее и эффективнее при обработке нескольких образцов одновременно.
Фикобилисомы имеют три различные формы: гемидискоидальную, пучкообразную и палочковидную5. Интактные фикобилисомы, выделенные на рисунке 2, принадлежат к гемидискоидальной форме, как обсуждалось в более ранних публикациях7,13,36. Однако верхняя дробь, представляющая диссоциированную PBS, также может содержать стержневую PBS. Syn6803 и JSC-1 кодируют специфический стержневой линкер CpcL, что говорит о наличии стержневой PBS в дополнение к гемидискоидальному PBS6,37. Стержневая ПБС была непосредственно идентифицирована в Syn6803, но не в АО-17,13,37. С другой стороны, АО-1 реконструирует свою ПБС, выполняя хроматическую акклиматизацию III типа в зеленом/красном свете и фотоакклиматизацию дальнего красного света в красном/дальнем красном свете6,7. Все эти различия указывают на то, что в градиентах сахарозы могут быть и другие типы PBS, в дополнение к самой низкой интактной гемидискоидальной фракции PBS. Например, два типа PBS присутствуют одновременно, когда Synechococcus sp. PCC 7335 и JSC-1 акклиматизируются к дальнему красному свету8,13. Предполагается, что человек, изолирующий PBS от нехарактеризованного цианобактериального штамма, должен быть более осторожным при анализе каждой фракции в градиенте сахарозы для выявления любых возможных типов PBS.
В целом, этот протокол обеспечивает дешевый, простой и быстрый метод разрушения клеток. Также было продемонстрировано, что этот метод является надежным для выделения PBS из различных цианобактерий с различными типами клеток и композициями PBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University за удобное использование ультрацентрифуги. Цианобактериальные штаммы Synechocystis sp. PCC 6803 и Leptolyngbya sp. JSC-1 были подарены доктором Чу, Сю-Аном из Academia Sinica, Тайвань, и доктором Дональдом А. Брайантом из Университета штата Пенсильвания, США, соответственно. Эта работа финансировалась Министерством науки и технологий (Тайвань) (109-2636-B-002-013- и 110-2628-B-002-065-) и Министерством образования (Тайвань) Yushan Young Scholar Program (109V1102 и 110V1102).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | for PBS extraction |
| 13 mL centrifugation tube | Hitachi | 13PA | ultracentrifugation |
| 40 mL centrifugation tube | Hitachi | 40PA | ultracentrifugation |
| Acetic acid | Merck | 8.1875.2500 | for Coomassie Blue staining |
| B-HEPES medium | A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium | ||
| Brilliant Blue R-250 | Sigma | B-0149 | for Coomassie Blue staining |
| Bromophenol blue | Wako pure chemical industries | 2-291 | protein loading buffer |
| Electronic balance | Radwag | WLC 2/A2/C/2 | for the wet weight measurement of cell pellets |
| Fluorescence spectrophotometer | Hitachi | F-7000 | Spectrophotometer |
| Glycerol | BioShop | Gly001.500 | protein loading buffer |
| High-Speed refrigerated centrifuge | Hitachi | CR22N | for buffer exchange |
| Leptolyngbya sp. JSC-1 | from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA. | ||
| Low temperature measurement accessory | Hitachi | 5J0-0112 | The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy. |
| Methanol | Merck | 1.07018,2511 | for Coomassie Blue staining |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher | Pico 21 | for PBS extraction |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | Model 607 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate dibasic | PanReac AppliChem | 121512.121 | for PBS extraction |
| Potassium phosphate monobasic | PanReac AppliChem | 141509.121 | for PBS extraction |
| Screw cap vial | BioSpec | 10832 | for PBS extraction |
| SmartView Pro Imager | Major Science | UVCI-2300 | for Znic staining signal detection |
| Sodium dodecyl sulfate | Zymeset | BSD101 | protein loading buffer |
| Sucrose | Zymeset | BSU101 | for PBS isolation |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan | ||
| Tris | BioShop | TRS 011.1 | protein loading buffer |
| Triton X-100 | BioShop | TRX 506.500 | for PBS extraction |
| Ultra 10 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC901024 | for buffer exchange |
| Ultra 3 K membrane centrifugal filter | Millipore | UFC500324 | for buffer exchange |
| Ultracentrifuge | Hitachi | CP80WX | ultracentrifugation |
| UV/Vis spectrophotometer | Agilent | Cary 60 | Spectrophotometer |
| Zinc sulfate | PanReac AppliChem | 131787.121 | for Znic staining |
| β-Mercaptoethanol | BioBasic | MB0338 | protein loading buffer |
References
- Bryant, D. A., Guglielmi, G., de Marsac, N. T., Castets, A. M., Cohen-Bazire, G. The structure of cyanobacterial phycobilisomes: A model. Archives of Microbiology. 123 (2), 113-127 (1979).
- Glazer, A. N.
- Glazer, A. N.
- Liu, H., et al. Phycobilisomes supply excitations to both photosystems in a megacomplex in cyanobacteria. Science. 342 (6162), 1104 (2013).
- Bryant, D. A., Canniffe, D. P. How nature designs light-harvesting antenna systems: Design principles and functional realization in chlorophototrophic prokaryotes. Journal of Physics B: Atomic, Molecular and Optical Physics. 51 (3), 033001 (2018).
- Hirose, Y., et al. Diverse chromatic acclimation processes regulating phycoerythrocyanin and rod-shaped phycobilisome in cyanobacteria. Molecular Plant. 12 (5), 715-725 (2019).
- Gan, F., et al. Extensive remodeling of a cyanobacterial photosynthetic apparatus in far-red light. Science. 345 (6202), 1312-1317 (2014).
- Ho, M. Y., Gan, F., Shen, G., Bryant, D. A. Far-red light photoacclimation (FaRLiP) in Synechococcus sp. PCC 7335. II. Characterization of phycobiliproteins produced during acclimation to far-red light. Photosynthesis Research. 131 (2), 187-202 (2017).
- Ho, M. Y., et al. Extensive remodeling of the photosynthetic apparatus alters energy transfer among photosynthetic complexes when cyanobacteria acclimate to far-red light. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1861 (4), 148064 (2020).
- Sanfilippo, J. E., Garczarek, L., Partensky, F., Kehoe, D. M. Chromatic Acclimation in Cyanobacteria: A diverse and widespread process for optimizing photosynthesis. Annual Review of Microbiology. 73, 407-433 (2019).
- Grossman, A. R., Schaefer, M. R., Chiang, G. G., Collier, J. L. The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions. Microbiological Reviews. 57 (3), 725-749 (1993).
- Bryant, D. A., Glazer, A. N., Eiserling, F. A. Characterization and structural properties of the major biliproteins of Anabaena sp. Archives of Microbiology. 110 (1), 61-75 (1976).
- Soulier, N., Laremore, T. N., Bryant, D. A. Characterization of cyanobacterial allophycocyanins absorbing far-red light. Photosynthesis Research. 145 (3), 189-207 (2020).
- Guglielmi, G., Cohen-Bazire, G., Bryant, D. A. The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Archives of Microbiology. 129 (3), 181-189 (1981).
- Zhang, J., et al. Structure of phycobilisome from the red alga Griffithsia pacifica. Nature. 551 (7678), 57-63 (2017).
- Li, Y., et al. Characterization of red-shifted phycobilisomes isolated from the chlorophyll f-containing cyanobacterium Halomicronema hongdechloris. Biochimica et Biophysica Acta. 1857 (1), 107-114 (2016).
- Herrera-Salgado, P., Leyva-Castillo, L. E., Rios-Castro, E., Gomez-Lojero, C. Complementary chromatic and far-red photoacclimations in Synechococcus ATCC 29403 (PCC 7335). I: The phycobilisomes, a proteomic approach. Photosynthesis Research. 138 (1), 39-56 (2018).
- Yamanaka, G., Glazer, A. N., Williams, R. C. Cyanobacterial phycobilisomes. Characterization of the phycobilisomes of Synechococcus sp. 6301. Journal of Biological Chemistry. 253 (22), 8303-8310 (1978).
- Gantt, E., Lipschultz, C. A., Grabowski, J., Zimmerman, B. K. Phycobilisomes from blue-green and red algae: Isolation criteria and dissociation characteristics. Plant Physiology. 63 (4), 615-620 (1979).
- Patel, A., Mishra, S., Pawar, R., Ghosh, P. K. Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein Expression and Purification. 40 (2), 248-255 (2005).
- Zolla, L., Bianchetti, M. High-performance liquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry for the simultaneous separation and identification of the Synechocystis PCC 6803 phycobilisome proteins. Journal of Chromatography A. 912 (2), 269-279 (2001).
- Soni, B., Kalavadia, B., Trivedi, U., Madamwar, D. Extraction, purification and characterization of phycocyanin from Oscillatoria quadripunctulata-Isolated from the rocky shores of Bet-Dwarka, Gujarat, India. Process Biochemistry. 41 (9), 2017-2023 (2006).
- Williams, J. G. K. Methods in Enzymology. , Academic Press. 766-778 (1988).
- Brown Igor, I., et al. Polyphasic characterization of a thermotolerant siderophilic filamentous cyanobacterium that produces intracellular iron deposits. Applied and Environmental Microbiology. 76 (19), 6664-6672 (2010).
- Wang, L., et al. Isolation, purification and properties of an R-phycocyanin from the phycobilisomes of a marine red macroalga Polysiphonia urceolata. PLoS One. 9 (2), 87833 (2014).
- Berkelman, T. R., Lagarias, J. C. Visualization of bilin-linked peptides and proteins in polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 156 (1), 194-201 (1986).
- Rigbi, M., Rosinski, J., Siegelman, H. W., Sutherland, J. C. Cyanobacterial phycobilisomes: Selective dissociation monitored by fluorescence and circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 77 (4), 1961-1965 (1980).
- Dubbs, J. M., Bryant, D. A. Molecular cloning and transcriptional analysis of the cpeBA operon of the cyanobacterium Pseudanabaena species PCC 7409. Molecular Microbiology. 5 (12), 3073-3085 (1991).
- Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6 (1), 38828 (2016).
- Zhang, S., Shen, G., Li, Z., Golbeck, J. H., Bryant, D. A. Vipp1 is essential for the biogenesis of Photosystem I but not thylakoid membranes in Synechococcus sp. PCC 7002. Journal Biological Chemistry. 289 (23), 15904-15914 (2014).
- Zhang, S., Bryant, D. A. Biochemical validation of the glyoxylate cycle in the cyanobacterium Chlorogloeopsis fritschii Strain PCC 9212. Journal Biological Chemistry. 290 (22), 14019-14030 (2015).
- Huang, J. Y., et al. Mutations of cytochrome b559 and Psbj on and near the QC site in photosystem II influence the regulation of short-term light response and photosynthetic growth of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Biochemistry. 55 (15), 2214-2226 (2016).
- Li, Y., Lin, Y., Loughlin, P., Chen, M. Optimization and effects of different culture conditions on growth of Halomicronema hongdechloris - A filamentous cyanobacterium containing chlorophyll f. Frontiers in Plant Science. 5, 67 (2014).
- Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. Journal of Cell Biology. 58 (2), 419-435 (1973).
- Su, X., Fraenkel, P. G., Bogorad, L. Excitation energy transfer from phycocyanin to chlorophyll in an apcA-defective mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry. 267 (32), 22944-22950 (1992).
- Arteni, A. A., Ajlani, G., Boekema, E. J. Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (4), 272-279 (2009).
- Kondo, K., Ochiai, Y., Katayama, M., Ikeuchi, M. The Membrane-associated CpcG2-phycobilisome in Synechocystis: A new photosystem I antenna. Plant Physiology. 144 (2), 1200-1210 (2007).
