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Biology

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

Published: November 10, 2021 doi: 10.3791/63272
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Life Science, National Taiwan University, 2Institute of Plant Biology, National Taiwan University

Summary

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Abstract

En las cianobacterias, el ficobilisoma es un complejo de proteína de antena vital que cosecha luz y transfiere energía al fotosistema I y II para la fotoquímica. El estudio de la estructura y composición del ficobilisoma es de gran interés para los científicos porque revela la evolución y divergencia de la fotosíntesis en las cianobacterias. Este protocolo proporciona un método detallado y optimizado para romper las células de cianobacterias a bajo costo por un batidor de cuentas de manera eficiente. El ficobilisoma intacto se puede aislar del extracto celular mediante ultracentrifugación por gradiente de sacarosa. Este método ha demostrado ser adecuado tanto para cianobacterias modelo como no modelo con diferentes tipos de células. También se proporciona un procedimiento paso a paso para confirmar la integridad y la propiedad de las ficobiliproteínas mediante espectroscopia de fluorescencia 77K y SDS-PAGE teñido por sulfato de zinc y azul coomassie. El ficobilisoma aislado también puede ser sometido a análisis estructurales y compositivos adicionales. En general, este protocolo proporciona una guía de inicio útil que permite a los investigadores que no están familiarizados con las cianobacterias aislar y caracterizar rápidamente el ficobilisoma intacto.

Introduction

El ficobilisoma (PBS) es un enorme complejo pigmentario-proteico soluble en agua que se une al lado citoplasmático de los fotosistemas en las membranas tilacoides de las cianobacterias1. El PBS se compone principalmente de ficobiliproteínas coloreadas y proteínas enlazadoras incoloras1,2. Las ficobiliproteínas se pueden dividir en cuatro grupos principales: ficoeritrina, ficoeritrocianina, ficocianina y aloficocianina3. Los cuatro grupos principales absorben diferentes longitudes de onda de energía lumínica en el rango de 490-650 nm, que las clorofilas absorbieron de manera ineficiente3. El PBS puede servir como una antena de recolección de luz para recolectar energía de la luz y entregarla al Photosystem II e I4.

La estructura y composición de PBS varían de una especie a otra. En conjunto, se han identificado tres formas de ficobilisoma (hemidiscodial, en forma de haz y en forma de varilla) en diferentes especies de cianobacterias5. Incluso en la misma especie, la composición del PBS cambia en respuesta al medio ambiente, como la calidad de la luz y el agotamiento de nutrientes6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, el procedimiento experimental para aislar PBS de cianobacterias ha sido fundamental en el estudio de PBS12. Durante varias décadas, muchos protocolos diferentes han aislado PBS y analizado su estructura, composición y función6,7,8,12,13,14,15,16,17. La amplia variedad de métodos para el aislamiento de PBS proporciona flexibilidad para aislar el complejo en diferentes especies con diferentes reactivos e instrumentos. Sin embargo, también hace que la elección de un protocolo adecuado sea más difícil para los científicos que no están familiarizados con las cianobacterias y el PBS. Por lo tanto, se desarrolla un protocolo generalizado y sencillo en este trabajo para aquellos interesados en iniciar el aislamiento de PBS de cianobacterias.

Los métodos para aislar PBS de publicaciones anteriores se resumen aquí. Dado que pbS es un complejo de proteínas solubles en agua y se disocia fácilmente, se requiere un tampón de fosfato de alta fuerza iónica para estabilizar PBS durante la extracción18. Varios artículos de investigación que describen métodos para el aislamiento de PBS de cianobacterias se han publicado en el pasado. La mayoría de los métodos requieren una alta concentración de tampón de fosfato8,14,15,18,19. Sin embargo, los procedimientos para la alteración mecánica de las células varían, como la extracción asistida por perlas de vidrio, la sonicación20 y la prensa francesa6,8,14. Se pueden obtener diferentes ficobiliproteínas por precipitación con sulfato de amonio20 y purificadas por HPLC21 o una columna cromatográfica22. Por otro lado, el PBS intacto se puede aislar fácilmente mediante ultracentrifugación por gradiente de densidad de sacarosa6,8,15.

En este protocolo, se utilizaron un modelo de cianobacteria y un modelo de cianobacteria no modelo como materiales para el aislamiento de PBS. Son el modelo unicelular tolerante a la glucosa Synechocystis sp. PCC 6803 (en adelante Syn6803) y el no modelo filamentoso Leptolyngbya sp. JSC-1 (en adelante JSC-1), respectivamente7,23,24. El protocolo comienza por la interrupción de las cianobacterias unicelulares y filamentosas en un tampón de fosfato de alta resistencia iónica. Después de la lisis, los sobrenadantes se recogen por centrifugación y luego se tratan con un detergente no iónico (Tritón X-100) para solubilizar las proteínas solubles en agua de las membranas tilacoides. Las proteínas solubles en agua totales se aplican a un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo para fraccionar el PBS. El gradiente de sacarosa discontinua en este protocolo consiste en cuatro soluciones de sacarosa y particiona el PBS intacto en las fracciones más bajas de la capa de sacarosa25. La integridad de PBS se puede analizar mediante SDS-PAGE, tinción de zinc y espectroscopia de fluorescencia 77K6,7,8,26. Este método es adecuado para científicos que tienen como objetivo aislar PBS intacto de cianobacterias y estudiar sus propiedades espectrales, estructurales y de composición.

Hay varias ventajas de este protocolo. (1) Este método está estandarizado y se puede utilizar para aislar PBS intacto de cianobacterias unicelulares y filamentosas. La mayoría de los artículos describen el método que se aplicó en cualquiera de los dos tipos de cianobacterias4,7,8,12,13,14,16,18. (2) Este método se realiza a temperatura ambiente, ya que el PBS se disocia a baja temperatura19,27. (3) Este método describe el uso de un batidor de cuentas para interrumpir las células; por lo tanto, es más barato y más seguro que la prensa francesa de alta presión y el posible daño auditivo del sonicador en otros métodos8,13,14,20. (4) Este método aísla PBS intacto por ultracentruga de gradiente de sacarosa. De esta manera, el PBS intacto con diferentes tamaños y PBS parcialmente disociado se puede separar en función de la concentración de sacarosa.

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Protocol

La Synechocystis sp. PCC 6803, la cepa modelo tolerante a la glucosa, se obtuvo del Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán. Leptolyngbya sp. JSC-1, el filamentoso no modelo, se obtuvo del Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE. UU.

1. Cultivo celular y cosecha

  1. Inocular células Syn6803 o JSC-1 utilizando un bucle de inoculación metálico en un matraz cónico de 100 mL que contiene 50 mL de medio B-HEPES28. Cultive las células a 30 °C bajo fotones de 50 μmol m-2 s-1 (LED de luz blanca) en 1% (v/v) de CO2 con agitación constante mediante un agitador magnético (120 rpm) hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento exponencial medio (OD750 = 0,6-0,8).
    NOTA: Cosechar el cultivo celular cuando la densidad óptica del cultivo a 750 nm (OD750) alcanza 0.6-0.8 transfiriéndose a un nuevo matraz. La densidad óptica se utilizó rutinariamente para estimar la densidad celular microbiana en cultivos líquidos29. Las longitudes de onda de 720-750 nm se utilizaron en diversos estudios para medir el crecimiento de cianobacterias30,31,32. En este protocolo, OD750 se utiliza porque JSC-1 puede producir pigmentos que absorben la luz roja lejana7. Alternativamente, también se utilizó la concentración de clorofila para medir el crecimiento de cianobacterias33.
  2. Transfiera el cultivo celular (OD750 ~ 0.8) a un matraz cónico de 1L y diluirlo a OD750 = 0.2 en 500 mL de medio B-HEPES. Cultivar el cultivo hasta la fase de crecimiento exponencial tardío (OD750 = 0.8-1.0) en la misma condición mencionada anteriormente (paso 1.1) y luego cosechar el cultivo por centrifugación.
  3. Centrifugar el cultivo a 10.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente y desechar completamente el sobrenadante.
    NOTA: Los pellets de células se pueden almacenar a -80 °C durante un máximo de 6 meses.

2. Lisis celular

  1. Suspenda los gránulos celulares y lávelos dos veces con tampón de fosfato K de 0,75 M, pH 7.
    NOTA: Para hacer un tampón de fosfato de K de 0,75 M a pH 7, prepare 1,5 M de K2HPO4 y 1,5 M de KH2PO4 por separado. Mezclar 615 mL de 1,5 M K2HPO4 y 385 ml de 1,5M KH2PO4 para obtener 1,5 M K-fosfato tampón a pH 7. Simplemente diluirlo con la misma cantidad de ddH2O para hacer 0.75 M K-fosfato tampón a pH 7.
  2. Pellet las células en tubos centrífugos de 50 ml por centrifugación a 10.000 x g durante 20 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda las células con un tampón de fosfato K de 0,75 M. Mida el peso húmedo del pellet mediante una balanza electrónica y resuspenda 1 g de peso húmedo del pellet en 5 ml del tampón.
    NOTA: El peso húmedo de un pellet se midió restando el peso de un tubo de centrífuga vacío del peso del tubo de centrífuga que contiene el pellet celular.
  3. Agregue 1 ml de suspensión celular y 0.4-0.6 g de perlas de vidrio de 0.1 mm (consulte la Tabla de materiales) en un vial de tapa de rosca de 2 ml.
  4. Rompa las celdas durante 30 s con un batidor de cuentas (consulte la Tabla de materiales). Deje que los tubos se enfríen en un baño de agua a temperatura ambiente durante 2 minutos y repita el ciclo de rotura 5 veces.
  5. Después de la lisis, centrífuga los viales a 500 x g durante 10 s a temperatura ambiente. Recoge el sobrenadante con una pipeta en un tubo centrífugo de 15 ml. Lave las perlas con 0,5 ml de tampón de fosfato K de 0,75 M una vez, luego transfiéralas al mismo tubo de centrífuga.
  6. Agregue Triton X-100 (2% p/v, concentración final) a la suspensión celular lisada e incube en un agitador oscilante (40 rpm) a temperatura ambiente hasta que la solución se vuelva homogénea (~20 min).
  7. Centrifugar los tubos a 17.210 g durante 20 minutos para eliminar las células intactas y los restos de células grandes. Guarde el sobrenadante sin la capa superior de micela Tritón a temperatura ambiente durante un máximo de 1 h.
    NOTA: El sobrenadante contiene dos capas separadas. La capa hidrofóbica superior de Tritón X contiene proteínas de unión a la clorofila y ficobilisomas hidrofóbicos en forma de bastón6. La capa acuosa inferior contiene PBS soluble en agua.

3. Preparación de los tampones de gradiente de sacarosa y aislamiento de PBS

  1. Hacer cuatro concentraciones de sacarosa (2.0 M, 1.0 M, 0.75 M y 0.5 M) en tampón de 0.75 M K-fosfato a pH 7.
    NOTA: Se sugiere utilizar un tampón de fosfato K de 1,5 M a pH 7 para preparar el gradiente de sacarosa porque la adición de sacarosa diluye la concentración de tampón de K-fosfato. Después de que la sacarosa esté completamente disuelta, agregue ddH2O para ajustar la concentración a 0.75 M, pH 7.
  2. Coloque 2,8 ml de tampón de sacarosa de 2,0 M en la parte inferior del tubo centrífugo de 40 ml y colóquelo con tres capas de soluciones de sacarosa (8 ml de 1,0 M; 12 ml de 0,75 m y 11 ml de 0,5 m para el tubo centrífugo de 40 ml), y finalmente contenga PBS la fracción sobrenadante (3,0 ml) (Figura 1A).
    NOTA: Agregue con cuidado la solución de sacarosa y permita que la sacarosa caiga muy lentamente dentro del tubo. Sostenga la punta de la pipeta justo encima de la superficie de la solución en el tubo mientras carga la solución. Las capas de sacarosa se pueden observar cuando se superponen lentamente.
  3. Centrífuga los gradientes resultantes a 125.800 x g durante ~16h-20 h a 25 °C.NOTA: Se requiere una ultracentrífuga (ver Tabla de Materiales) para este paso.
  4. Tras la ultracentruga, condensar el PBS fraccionado y las ficobiliproteínas entre las capas. Se observaron bandas azules en Syn6803 (bandas púrpuras mostradas en JSC-1) en las interfaces (Figura 1D).
  5. Recoge lentamente las fracciones con una pipeta de la parte superior de los gradientes de sacarosa. Retire la sacarosa concentrando repetidamente (3.500 x g durante 20 min) y diluyendo las fracciones con un tampón de fosfato K de 0,75 M en unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular de 10 K, ver Tabla de Materiales).

4. Medición de la fluorescencia de PBS a 77K

NOTA: Un fluorímetro equipado con un contenedor de nitrógeno líquido (ver Tabla de Materiales) se utiliza para medir espectros de fluorescencia a 77K.

  1. Diluya la muestra concentrada de PBS con un tampón de fosfato K de 0,75 M para obtener al menos 500 μL.
    NOTA: Las concentraciones de ficocianina de las muestras fueron de ~4,2 μg mL-1 según la fórmula: (OD615 0,474 x OD652)/5,34 [mg/mL]34.
  2. Agregue 500 μL de la muestra de PBS a un tubo de vidrio transparente y congele el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado. Mueva el tubo congelado a un recipiente Transparente de Dewar (consulte la Tabla de materiales) prellenado con nitrógeno líquido.
    NOTA: El diámetro interior del tubo de vidrio es de 3 mm en este protocolo. Se utilizaron tubos de vidrio delgados para minimizar la reabsorción de la emisión de longitud de onda corta en la muestra.
  3. Elija las longitudes de onda de excitación para la ficoeritrina y la ficocianina para que sean 550 nm y 580 nm, respectivamente.
    NOTA: Las emisiones de fluorescencia se registraron de 560-800 nm (para excitación de 550 nm) o 600-800 nm (para excitación de 580 nm).

5. Análisis SDS-PAGE de PBS

  1. Intercambio tampón de las muestras concentradas de PBS en 0,75 M de K-fosfato con 50 mM de tampón Tris (pH 8,0) en unidades de filtro centrífugo de membrana (corte de peso molecular 3K, ver Tabla de Materiales).
  2. Mezclar 50 μL de solución de PBS con 10 μL de tampón de carga 6x SDS [300 mM Tris pH 6.8, 12% (p/v) dodecil sulfato de sodio, 0.06% (p/v) azul de bromfenol, 50% (v/v) glicerol, 6% (v/v) β-Mercaptoetanol] (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga e incubar a 95 °C durante 10 min en un bloque de calor.
  3. Separe las muestras de proteínas mediante SDS-PAGE (8%-20% (p/v) gel de poliacrilamida) y continúe con la tinción de zinc y Coomassie. El procedimiento detallado se ha descrito en la Referencia8.
  4. Para la tinción de zinc, incube el gel en una solución de ZnSO4 de 50 mM durante 10 min a temperatura ambiente, lave el gel con agua destilada y visualice la fluorescencia inducida por zinc bajo irradiación UV (312 nm).
  5. Para la tinción de azul coomassie, incube el gel en tampón de tinción Coomassie Blue [0.25% (p/v) de Coomassie R-250, 10% (v/v) de ácido acético, 50% (v/v) de metanol, ver Tabla de materiales] durante 1 h a temperatura ambiente. Lave el gel con agua destilada dos veces para eliminar el tampón de tinción residual e incube el gel con tampón de detención [10% (v / v) ácido acético, 30% (v / v) metanol] en un agitador de balanceo (40 rpm) a temperatura ambiente durante la noche. Visualice el gel completamente desmovido con una cámara digital o un escáner.

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Representative Results

Las células Syn6803 y JSC-1 se cultivaron en matraces cónicos con agitación constante en medio B-HEPES a 30 °C, bajo una luz blanca LED (50 fotones μmol m-2s-1) en una cámara de crecimiento llena de 1% (v/v) de CO2. En la fase de crecimiento exponencial (OD750 = ~0.5), las células se subcultivaron en medio fresco con una densidad óptica final OD750 = ~0.2. Después de alcanzar la fase de crecimiento exponencial tardío (OD750 = 0,6-0,8), los cultivos fueron recolectados y centrifugados (10.000 x g a temperatura ambiente durante 20 min). El sobrenadante se descartó y los gránulos celulares se almacenaron a -80 ° C hasta que el siguiente paso estuvo disponible.

Para romper las células, las células se descongelaron primero a temperatura ambiente. Las células fueron interrumpidas por lancha de perlas con perlas de vidrio de 0,1 mm dentro del tampón de 0,75 M de K-fosfato. La lisis celular completa muestra el sobrenadante en color azul verdoso oscuro antes de la centrifugación (Figura 1B). Después de la solubilización por Triton X-100 y la centrifugación para eliminar las membranas insolubles y los desechos celulares, el sobrenadante se cargó en la parte superior de la solución de gradiente de sacarosa en un tubo centrífugo de 40 ml (Figura 1C). Después de 18 h de centrifugación, el PBS intacto se movió al centro del gradiente como una banda azul clara para Syn6803 y una banda púrpura para JSC-1. La diferencia en su color resulta de las diferentes composiciones de PBS en Syn6803 y JSC-1. El PBS de Syn6803 lleva ficocianina35, mientras que el PBS de JSC-1 lleva ficocianina y ficoeritrina7. El resultado de la separación del gradiente de densidad de sacarosa de PBS aislados muestra varias fracciones de ficobiliproteínas disociadas, y la fracción más baja representa el PBS intacto (Figura 1D).

Los espectros de absorción de las diferentes fracciones de PBS aisladas de JSC-1 y Syn6803 se comparan en la Figura 2A. El procedimiento detallado de los espectros de absorción se ha descrito en los artículos7,8. Los espectros de absorción del PBS disociado y pbS intacto de JSC-1 y Syn6803 tienen el mismo pico a 622 nm, correspondiente a la ficocianina. Y el pico de absorción de ficoeritrina a 571 nm se encuentra tanto en PBS disociados como en PBS intactos de JSC-1. La aloficocianina muestra un pico menor con un hombro a 670 nm en las fracciones pbS intactas de JSC-1 y Syn6803. Las diferencias espectrales indican que la relación bastone (ficocianina) a núcleo (aloficocianina) es mayor en el PBS disociado que en la fracción PBS intacta, ya que las propiedades espectrales de las ficobiliproteínas se han determinado previamente5. Dado que el PBS disociado y las fracciones intactas de PBS muestran espectros de absorción similares y características de emisión fluorescente a temperatura ambiente, se utilizó la espectroscopia de fluorescencia de 77K para analizar las diferentes fracciones aisladas del gradiente de sacarosa. Los espectros de emisión fluorescente de 77K del PBS disociado y las fracciones intactas de PBS fueron excitados por 580 nm. Los espectros de emisión del PBS disociado tienen un pico fuerte a ~ 650 nm en Syn6803 y JSC-1, lo que representa la emisión de ficocianina (Figura 2B). Los espectros de emisión fluorescente del PBS intacto muestran dos picos máximos de emisión fluorescente: el débil a 651 nm y el fuerte a 684 nm, revelando que la energía recolectada por la ficocianina se transfirió eficientemente a la aloficocianina y a los emisores terminales (ApcD y ApcE) en el núcleo9 (Figura 2C). Estas características demuestran que las fracciones más bajas en el gradiente de sacarosa contienen PBS intacto.

El PBS disociado y el PBS intacto fueron separados por SDS-PAGE en un gel de gradiente lineal de poliacrilamida SDS de 8%-20% (p/v). Las α y β subunidades de ficocianina y aloficocianina fueron visibles en el gel sin tinción (Figura 3A). Posteriormente, el gel se tiñó con 10 mM de ZnSO4 durante 10 min. Las ficobiliproteínas que contienen cromóforos fueron observadas por la tinción de zinc durante la irradiación UV8. Las subunidades de ficobiliproteína (14-21 kDa) son fuertemente fluorescentes, y la ApcE (flecha) mostró una fluorescencia débil (Figura 3B). Además, la tinción de Coomassie Blue muestra la diferente composición de proteínas entre las fracciones de PBS disociadas y las fracciones de PBS intactas (Figura 3C). Las fracciones superiores contienen otras proteínas no solubles en agua pbS, ya que se tiñen más proteínas que en las fracciones pbs intactas. El PBS intacto en Syn6803 muestra una banda ApcE prominente (flecha) que carece de las fracciones disociadas de PBS (Figura 3C).

La relación de volumen entre el extracto de PBS y el gradiente de sacarosa es crítica para obtener bandas afiladas en el gradiente de sacarosa después de la ultracentrifugación. La proporción sugerida de extractos de PBS solubilizados a la solución de gradiente de sacarosa es de 1:10. Según la experiencia previa, la fabricación del gradiente de sacarosa en tubos centrífugos de 40 ml muestra una resolución más alta que el gradiente de sacarosa realizado en los tubos de 13 ml. El gradiente de sacarosa discontinuo se difunde con el tiempo debido a la vibración en el banco. Por lo tanto, el tubo centrífugo de 13 ml puede ser una buena opción para manejar muchas muestras simultáneamente. Para demostrarlo, los gradientes de sacarosa en tubos centrífugos de 13 ml en las proporciones de 1:3 y 1:10 se han preparado entre los extractos crudos de Syn6803 o JSC-1 a la solución de gradiente de sacarosa (Figura 4A). Después de la ultracentrifugación, el gradiente de sacarosa preparado en la relación 1:3 muestra bandas más anchas que el gradiente realizado en la relación 1:10 (Figura 4B). Las fracciones más bajas de cada gradiente contienen PBS intacto, confirmado por espectroscopia de emisión fluorescente de 77K.

Figure 1
Figura 1: Interrupción de las células Syn6803 y JSC-1 y ultracentrifugación del gradiente de sacarosa. (A) Ilustración esquemática de la preparación del gradiente de sacarosa descontinuado en un tubo centrífugo de 40 ml. (B) Los viales de tapón de rosca se llenaron con 0,4 g de perlas de vidrio y 1 ml de suspensión celular de Syn6803 o JSC-1, y luego las células fueron lisadas por un batidor de perlas. (C) El sobrenadante del extracto solubilizado tritón X-100 se colocó en capas en la parte superior de un gradiente de densidad de sacarosa. (D) Después de la centrifugación durante 18 h, las fracciones de PBS se visualizaron como bandas azules claras en el gradiente en Syn6803 y como bandas púrpuras en JSC-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización espectroscópica de diferentes fracciones de gradientes de sacarosa. (A) Espectros de absorción de PBS disociado y fracciones de PBS intactas de JSC-1 y Syn6803. Los espectros de emisión de fluorescencia se midieron a 77 K utilizando la longitud de onda de excitación a 580 nm para (B) las fracciones de PBS disociadas y (C) las fracciones de PBS intactas de Syn6803 y JSC-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis SDS-PAGE de PBS aislados de gradientes de sacarosa. Las fracciones de PBS disociadas e intactas se cuantificaron (20 μg de proteína por carril) y se cargaron en un gel de poliacrilamida de gradiente de 8% -20% (p/v). Después de la electroforesis en gel, el gel se visualizó mediante tinción de zinc y tinción de Coomassie Blue, posteriormente. (A) El color de las ficobiliproteínas es visible en el gel sin manchas. (B) El gel teñido de zinc muestra la fluorescencia de las ficobiliproteínas. (C) El gel teñido con Coomassie Blue muestra ficobiliproteínas y otras proteínas. Las flechas indican las posiciones del ApcE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: El gradiente de sacarosa realizado en tubos centrífugos de 13 mL. Las proporciones entre el extracto crudo y la solución de gradiente de sacarosa están marcadas en la parte superior de las imágenes. (A) El sobrenadante de los extractos solubilizados triton X-100 de Syn6803 y JSC-1 se superpuso en capas sobre gradientes de densidad de sacarosa con diferentes proporciones de los extractos solubilizados a la solución de gradiente de sacarosa. (B) Después de la centrifugación durante 18 h, las fracciones de PBS en Syn6803 y JSC-1 se observaron en los gradientes de sacarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un método simple y estándar para aislar PBS intacto en dos tipos de cianobacterias, el modelo unicelular Syn6803 y el filamentoso no modelo JSC-1. Los pasos críticos del protocolo son la homogeneización celular y la ultracentrifugación en un gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. En general, la interrupción de las células filamentosas es más complicada que las unicelulares. El aumento de la cantidad del material de partida (el peso húmedo del pellet celular) y la repetición del batido de perlas fueron útiles para aumentar el rendimiento de PBS de las células cianobacterianas filamentosas. Para la cianobacteria filamentosa, JSC-1, se utilizaron tres veces más células que una unicelular, Syn6803. Además, para romper completamente la cianobacteria filamentosa, se requiere la batir cuentas más veces que las cianobacterias unicelulares para observar el color azulado-púrpura oscuro en el tampón de extracción.

No se sugiere que la duración de la batida de perlas exceda los 30 s, ya que las muestras se calientan durante cada ciclo de batido de cuentas. Se recomienda que los tubos se enfríen a temperatura ambiente en un banco (o en un baño de agua) entre cada ciclo, ya que el PBS intacto se disocia fácilmente a baja temperatura25. Por lo tanto, se sugiere que cada procedimiento en este protocolo se realice a temperatura ambiente. Muchos artículos de investigación han descrito diferentes métodos de disrupción celular, incluyendo un homogeneizador de alta presión (French-Press) o un sonicator6,8,20. Se sugiere un homogeneizador de molino de cuentas porque es más barato, más seguro, más fácil de manejar, más rápido, más accesible y más eficiente en el procesamiento de múltiples muestras simultáneamente.

Los ficobilisomas muestran tres formas diferentes, hemidiscoidal, en forma de haz y en forma de varilla5. Los ficobilisomas intactos aislados en la Figura 2 pertenecen a la forma hemidiscoidal como se discutió en publicaciones anteriores7,13,36. La fracción superior que representa PBS disociado, sin embargo, también puede contener PBS en forma de varilla. Syn6803 y JSC-1 codifican un enlazador específico de núcleo de varilla CpcL, lo que sugiere la presencia de PBS en forma de varilla además del PBS hemidiscoidal6,37. El PBS en forma de varilla se ha identificado directamente en Syn6803, pero no en JSC-17,13,37. Por otro lado, JSC-1 remodela su PBS realizando aclimatación cromática tipo III en luz verde/roja y fotoaclimación de luz roja lejana en luz roja/roja lejana6,7. Todas estas diversidades indican que puede haber otros tipos de PBS en los gradientes de sacarosa, además de la fracción de PBS hemidiscoidal intacta más baja. Por ejemplo, dos tipos de PBS están presentes al mismo tiempo cuando Synechococcus sp. PCC 7335 y JSC-1 se aclimata a la luz roja lejana8,13. Se sugiere que la persona que aísla PBS de una cepa de cianobacterias no caracterizada debe ser más cautelosa al analizar cada fracción en el gradiente de sacarosa para identificar cualquier posible tipo de PBS.

En general, este protocolo proporciona un método barato, simple y rápido para la interrupción celular. También se ha demostrado que este método es confiable para aislar PBS de diferentes cianobacterias con diferentes tipos de células y composiciones de PBS.

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Disclosures

Los autores declaran no tener ningún interés en contra.

Acknowledgments

Los autores agradecen a Technology Commons, College of Life Science, National Taiwan University por el uso conveniente de la ultracentrífuga. Las cepas de cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 y Leptolyngbya sp. JSC-1 fueron donadas por el Dr. Chu, Hsiu-An en la Academia Sinica, Taiwán, y el Dr. Donald A. Bryant en la Universidad Estatal de Pensilvania, EE.UU., respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Ministerio de Ciencia y Tecnología (Taiwán) (109-2636-B-002-013- y 110-2628-B-002-065-) y el Programa de Jóvenes Becarios Yushan del Ministerio de Educación (Taiwán) (109V1102 y 110V1102).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 mm glass beads BioSpec 11079101 for PBS extraction
13 mL centrifugation tube Hitachi 13PA ultracentrifugation
40 mL centrifugation tube Hitachi 40PA ultracentrifugation
Acetic acid Merck 8.1875.2500 for Coomassie Blue staining
B-HEPES medium A modified cyanobacterial medium from BG-11 medium
Brilliant Blue R-250 Sigma B-0149 for Coomassie Blue staining
Bromophenol blue Wako pure chemical industries 2-291 protein loading buffer
Electronic balance Radwag WLC 2/A2/C/2 for the wet weight measurement of cell pellets
Fluorescence spectrophotometer Hitachi F-7000 Spectrophotometer
Glycerol BioShop Gly001.500 protein loading buffer
High-Speed refrigerated centrifuge Hitachi CR22N for buffer exchange
Leptolyngbya sp. JSC-1 from Dr. Donald A. Bryant at Pennsylvania State University, USA.
Low temperature measurement accessory Hitachi 5J0-0112 The accessory includes a transparent Dewar container for 77K fluorescence spectroscopy.
Methanol Merck 1.07018,2511 for Coomassie Blue staining
Microcentrifuge Thermo Fisher Pico 21 for PBS extraction
Mini-Beadbeater-16 BioSpec Model 607 for PBS extraction
Potassium phosphate dibasic PanReac AppliChem 121512.121 for PBS extraction
Potassium phosphate monobasic PanReac AppliChem 141509.121 for PBS extraction
Screw cap vial BioSpec 10832 for PBS extraction
SmartView Pro Imager Major Science UVCI-2300 for Znic staining signal detection
Sodium dodecyl sulfate Zymeset BSD101 protein loading buffer
Sucrose Zymeset BSU101 for PBS isolation
Synechocystis sp. PCC 6803 glucose-tolerant strain from Dr. Chu, Hsiu-An at Academia Sinica, Taiwan
Tris BioShop TRS 011.1 protein loading buffer
Triton X-100 BioShop TRX 506.500 for PBS extraction
Ultra 10 K membrane centrifugal filter Millipore UFC901024 for buffer exchange
Ultra 3 K membrane centrifugal filter Millipore UFC500324 for buffer exchange
Ultracentrifuge Hitachi CP80WX ultracentrifugation
UV/Vis spectrophotometer Agilent Cary 60 Spectrophotometer
Zinc sulfate PanReac AppliChem 131787.121 for Znic staining
β-Mercaptoethanol BioBasic MB0338 protein loading buffer

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References

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Biología Número 177 Cyanobacterium phycobilisome Synechocystis sp. PCC 6803 Leptolyngbya sp. JSC-1 homogeneizador batidor de cuentas gradiente de densidad de sacarosa discontinua espectro de emisión de fluorescencia de 77K
Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias
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Jiang, H. W., Ho, M. Y. Isolation… More

Jiang, H. W., Ho, M. Y. Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria. J. Vis. Exp. (177), e63272, doi:10.3791/63272 (2021).

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