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Maintenir les cultures de laboratoire de Gryllus bimaculatus, un modèle orthoptère polyvalent pour l’agriculture des insectes et la physiologie des invertébrés

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63277
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Entomology, University of Wisconsin-Madison, 2Global Health Institute, University of Wisconsin-Madison

Summary

Cet article décrit les méthodes de base pour normaliser des facteurs importants tels que la densité, la disponibilité des aliments, la source d’hydratation et les contrôles environnementaux pour l’élevage à long terme de cultures de laboratoire du grillon comestible, Gryllus bimaculatus.

Abstract

Gryllus bimaculatus (De Geer) est un grillon à gros corps distribué dans toute l’Afrique et le sud de l’Eurasie où il est souvent récolté à l’état sauvage comme nourriture humaine. En dehors de son aire de répartition naturelle, la culture de G. bimaculatus est possible en raison de sa plasticité alimentaire, de son cycle de reproduction rapide, de son absence d’exigences en diapause, de sa tolérance à l’élevage à haute densité et de sa robustesse contre les agents pathogènes. Ainsi, G. bimaculatus peut être un modèle polyvalent pour les études de la physiologie, du comportement, de l’embryologie ou de la génétique des insectes.

Les paramètres culturels, tels que la densité de peuplement, le refuge à l’intérieur de la cage, la photopériode, la température, l’humidité relative et le régime alimentaire, ont tous un impact sur la croissance, le comportement et l’expression des gènes du grillon et doivent être normalisés. Dans la littérature en plein essor sur l’élevage d’insectes destinés à la consommation humaine, ces grillons sont fréquemment utilisés pour évaluer les mélanges d’aliments candidats dérivés de résidus de culture, de sous-produits de transformation des aliments et d’autres flux de déchets à faible coût.

Pour soutenir les expériences en cours évaluant les performances de croissance et la qualité nutritionnelle de G. bimaculatus en réponse à des substrats alimentaires variables, un ensemble complet de protocoles standard pour la sélection, l’entretien, la manipulation, la mesure et l’euthanasie en laboratoire a été développé et est présenté ici. Un aliment de grillon standard de l’industrie s’est avéré nutritionnellement adéquat et fonctionnellement approprié pour le maintien à long terme des stocks reproducteurs de grillons, ainsi que pour une utilisation comme aliment de contrôle expérimental. L’élevage de ces grillons à une densité de 0,005 grillon/cm3 dans des cages en polyéthylène de 29,3 L surmontées d’un écran à une température moyenne de 27 °C sur une photopériode de 12 mi(L)/12 foncé (D), avec de la fibre de coco humidifiée servant à la fois de source d’hydratation et de milieu de ponte a permis de maintenir avec succès des grillons en bonne santé sur une période de 2 ans. En suivant ces méthodes, les grillons dans une expérience contrôlée ont donné une masse moyenne de 0,724 g 0,190 g à la récolte, avec 89% de survie et 68,2% de maturation sexuelle entre le stockage (22 jours) et la récolte (65 jours).

Introduction

Comme en témoigne l’insecte emblématique, la mouche des fruits Drosophila melanogaster, l’utilisation d’insectes comme organismes modèles de laboratoire offre des avantages distincts pour les études en génétique, toxicologie et physiologie1. La petite taille des insectes réduit l’espace nécessaire pour les cultures et la quantité d’aliments et de matériaux consommables nécessaires. De nombreux insectes se reproduisent rapidement, ce qui les rend particulièrement adaptés à la création de lignées génétiques spécialisées et à des études nécessitant l’évaluation de plusieurs générations successives.

De nombreuses études se concentrent sur les insectes holométaboloïdes tels que la drosophile, qui présentent une métamorphose et une nymphose complètes. Cependant, d’autres modèles sont disponibles, y compris Gryllus bimaculatus (De Geer), le grillon de terrain à deux points. G. bimaculatus est un insecte paurometabolous qui subit entre 7 et 11 instars nymphales avant d’atteindre la maturité sexuelle2. Ce cricket présente un large éventail de comportements liés à la sélection sexuelle, y compris la stridulation, les affichages territoriaux et la protection des partenaires3. Les grillons immatures sont différents des larves des espèces d’insectes holométaboles en ce sens qu’ils sont, comme de nombreux juvéniles paurométabolous, capables de régénérer les membres perdus et endommagés pendant l’ecdysis4. De plus, le génome entièrement séquencé de G. bimaculatus a été publié en 20215. Ces caractéristiques rendent ces grillons attrayants en tant que cible pour la recherche fondamentale.

Les grillons des champs à deux points sont largement élevés pour l’alimentation humaine et animale. L’ampleur de ces opérations est souvent beaucoup plus grande que pour la recherche en laboratoire 6,7. Malgré la différence d’échelle, les défis auxquels sont confrontés les chercheurs recoupent grandement ceux rencontrés par les producteurs commerciaux de cricket. Ces considérations convergent dans le contexte de la recherche en laboratoire visant à améliorer la production d’insectes comestibles. Alors que l’industrie des insectes comestibles continue d’évoluer et de croître, l’optimisation des intrants alimentaires et d’une myriade d’autres aspects de la production est un objectif principal8. Des études en laboratoire démontrant des améliorations mesurées de l’efficacité de l’élevage, de la survie ou du temps de génération chez ces grillons ont le potentiel d’aider à augmenter la rentabilité des exploitations agricoles de grillons à long terme.

Les protocoles d’élevage standardisés permettent une comparaison plus étroite entre les études portant sur l’optimisation de l’élevage. À ce jour, peu de protocoles détaillés pour l’élevage de G. bimaculatus en laboratoire ont été publiés. Un protocole idéal refléterait les conditions rencontrées dans les exploitations agricoles de cricket du monde réel, tout en maintenant les conditions strictement contrôlées nécessaires pour mesurer avec précision les changements dans la performance de croissance découlant des traitements expérimentaux et en mettant en évidence les stratégies d’atténuation des risques. Les méthodes décrites dans le présent article ont été développées sur la base de protocoles, de techniques et d’appareils publiés utilisés pour élever une variété d’espèces de grillons à un large éventail d’échelles de laboratoire et de production commerciale 2,9,10,11,12. Ces méthodes sont également éclairées par plusieurs sources non évaluées par des pairs, y compris des bulletins techniques non publiés et des communications personnelles avec des producteurs commerciaux de cricket en Amérique du Nord. Ce protocole a été élaboré dans le but de faciliter l’établissement de cultures en laboratoire de G. bimaculatus spécifiquement pour une utilisation dans des essais liés à l’élevage d’insectes.

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Protocol

1. Préparation du substrat de ponte

REMARQUE: La fibre de coco est un substrat de ponte idéal pour G. bimaculatus. Pour des méthodes détaillées sur la façon de séparer la fibre de coco de la fibre de coco comprimée et une note sur la sécurité respiratoire, voir Matériaux supplémentaires étape 1.1.

  1. Lavez-vous les mains à l’eau et au savon.
  2. Tare un récipient propre sur une balance et peser une masse de fibre de coco sèche d’environ la taille d’un poing humain.
  3. Placez la fibre de coco dans un récipient propre et scellable, qui peut accueillir une expansion jusqu’à 6 fois le volume d’origine.
  4. Avec des mains propres, séparez doucement les touffes de fibre de coco de la pièce retirée du plus grand bloc.
  5. À l’aide d’un cylindre gradué de 50 mL, mesurez le volume correct d’eau désionisée (DI) pour obtenir un rapport de 5:1 en masse de cinq parties d’eau pour une partie de fibre de coco sèche.
  6. Ajouter l’eau DI mesurée lentement, en hydratant uniformément toutes les particules de coco. Macérer manuellement les touffes pour assurer une hydratation uniforme.
  7. Reterrer le récipient dans lequel la fibre de coco a été pesée précédemment.
  8. Peser 75 g de fibre de coco mouillée.
  9. Transférer 75 g de la fibre de coco mouillée dans une boîte de Petri de 100 mm x 15 mm à l’aide d’une cuillère en plastique propre pour vous assurer que la fibre de coco est uniformément répartie autour du fond du plat et qu’il n’y a pas de touffes.
  10. Étiquetez le côté de la boîte de Pétri avec du ruban adhésif de laboratoire avec une étiquette indiquant la colonie natale et la date de l’événement de collecte des œufs.
  11. Mesurez 45 mL supplémentaires d’eau DI dans un cylindre gradué.
  12. Ajouter de l’eau uniformément sur la surface de la fibre de coco emballée dans la boîte de Pétri pour assurer une hydratation uniforme. Assurez-vous que la fibre de coco est saturée au point que l’eau s’accumule à environ 1/4 des côtés du récipient.
  13. Une fois la boîte de Pétri emballée, sceller la fibre de coco mouillée restante dans un récipient hermétique pour le stockage à -20 ° C.
    REMARQUE: En suivant les méthodes prescrites par cet article, les individus de G. bimaculatus atteindront la maturité sexuelle après une moyenne de 58 jours après la ponte.
  14. Collecte d’œufs
    1. Placez le substrat de ponte hydraté dans des cages contenant les stocks parentaux souhaités de grillons aussi loin que possible de l’aliment en raison de la possibilité pour les grillons de transférer mécaniquement des granules d’aliments sur le substrat de ponte.
    2. Documentez la date et l’heure.
      NOTE: La densité de travail normalisée pour les colonies de grillons reproducteurs élevées selon ces méthodes est de n = 150 individus adultes. À cette densité, une fenêtre de ponte de 24 heures produira entre 800 et 1 500 œufs selon l’âge de la colonie, l’effort de ponte antérieur et le rapport de masculinité de la cage parentale.
    3. Placez un petit récipient à ordures autoclavable sur la surface de travail pour tenir compte du risque de confinement posé par la manipulation et le nettoyage des substrats de ponte riches en œufs.
    4. Placez une cage en plastique propre et vide de 29,3 L sur le banc à côté du récipient à ordures pour servir de cage réceptrice pour le substrat de ponte riche en œufs.
    5. Placez la cage de 29,3 L contenant les souches de grillon mères et le substrat de ponte du côté opposé du récipient à ordures de la cage vide.
    6. Après 24 h, retirez le substrat de ponte de la cage de grillon mère et placez-le sur un récipient à déchets autoclavable.
    7. Inspectez le sommet du substrat de ponte à la recherche de particules de frass ou d’aliments que les grillons pourraient avoir frappés sur la surface de la fibre de coco.
      REMARQUE: Toute substance, qui n’est pas la masse d’œuf ou la fibre de coco, peut provoquer la formation de moisissures sur le substrat pendant l’incubation.
    8. Enlevez les contaminants de coco dans le récipient à déchets avec une cuillère propre ou une cuillère en plastique.
    9. Placez la cuillère en plastique dans le récipient à déchets.
    10. Placez le substrat de ponte nettoyé dans la cage propre de 29,3 L.
    11. Placer la cage dans un incubateur réglé à 27 °C à 60 % d’humidité relative sur une photopériode de 12 h D/12 h L.
    12. Remettez la cage contenant le reproducteur à l’emplacement d’origine et dégagez tous les éléments de la surface de travail.
    13. Placez le récipient à déchets dans un congélateur de l’installation dédié à l’entreposage des articles potentiellement contaminés par des œufs de grillon.
    14. Désinfectez la surface de travail avec une solution d’eau de Javel à 10% et laissez-la reposer pendant 60 s.
    15. Essuyez la surface de travail avec une serviette en papier propre. Ouvrez le congélateur et jetez l’essuie-tout dans le récipient à déchets.
  15. Brumisation et surveillance quotidienne des substrats d’œufs
    REMARQUE: Pour les méthodes utilisées pour calibrer le volume de brouillard délivré par un flacon pulvérisateur, voir Matériaux supplémentaires étape 1.2.
    1. Placez un flacon pulvérisateur sur le substrat de ponte de manière à ce que l’eau exprimée soit répartie uniformément sur la surface du substrat.
    2. Effectuer le nombre d’actionnements de pompe calculé à l’étape 1.2 Matériaux supplémentaires pour chaque substrat de ponte quotidiennement pendant 11 jours consécutifs.
    3. Vérifiez quotidiennement chaque substrat de ponte, en surveillant la croissance de moisissures filamenteuses à la surface de la fibre de coco.
    4. Si une croissance fongique est observée, utilisez une cuillère ou une cuillère propre pour éliminer les taches de moisissure de surface.
    5. Jetez l’outil et la fibre de coco enlevée dans le conteneur à déchets autoclavable stocké dans le congélateur de l’installation.
      REMARQUE: Il n’est pas clair si la moisissure a un impact négatif sur le développement du cricket.
    6. Au jour 11 après la ponte, commencez à regarder de près le substrat des grillons juvéniles.
      REMARQUE: À 27 ° C, les œufs de G. bimaculatus ont besoin de 11 à 13 jours pour éclore.
  16. Mise en place de cages natales
    1. Sélectionnez deux paniers d’œufs commerciaux inutilisés de 30,8 cm x 30,8 cm (12 pouces x 12 pouces). À l’aide d’un couteau utilitaire ou de cisailles fortes, coupez-les en six bandes séparées de 10,1 cm (4 po) de largeur de taille égale. Brossez les bords coupés avec les mains pour enlever les particules de carton pendantes.
    2. Placez les six morceaux de carton individuels de 10,1 cm x 30,8 cm (4 pouces x 12 pouces) verticalement dans le fond de la cage avec l’axe le plus long du carton couvrant l’axe horizontal plus étroit d’une cage de 29,3 L. Placez un septième morceau de carton à plat sur le dessus des six morceaux verticaux.
    3. Choisissez trois morceaux d’essuie-tout brun rugueux d’environ 25 cm x 25 cm. Pliez chacun en deux. Placez-en deux de manière à recouvrir le haut du côté proximal de la structure du carton. Placez-en un sur la pile de carton du côté distal.
    4. Au jour 11 après la ponte, déplacez le substrat de ponte dans le coin droit proximal de la cage.
  17. Prendre soin des jeunes enfants
    REMARQUE: Le jour 14 après la ponte, la plupart des œufs viables auront éclos et les nymphes de grillon à un stade précoce auront besoin de nourriture et d’eau. Les jeunes grillons sont incapables de briser la tension superficielle des gouttelettes d’eau et peuvent se noyer si de l’eau est accumulée dans leur environnement. Cependant, ils sont également sensibles à la dessiccation. Fournir une humidité relative constante d’environ 60% au cours de cette étape de développement est important pour assurer la survie.
    1. Lorsqu’une trappe est observée, vaporisez les serviettes en papier placées sur le dessus des cartons à l’étape 1.4.3 jusqu’à ce qu’elles soient mouillées mais ne perdent pas activement de l’eau.
    2. Essuyez soigneusement les deux côtés d’un couvercle de boîte de Petri de 100 mm avec 70% d’éthanol et laissez-le sécher. Utilisez-le comme réceptacle dans lequel les aliments de grillon seront livrés.
      REMARQUE: Les grillons du premier stade nécessitent des particules d’alimentation plus petites que les grillons aux stades de développement suivants. Cet aliment plus fin doit être administré aux grillons pendant les 20 premiers jours suivant l’émergence.
    3. Verser 50 g de l’aliment dans un mélangeur à portion unique de 60 watts et broyer à 10 000 tr/min pendant 1 min.
    4. Mesurez 1 g de l’aliment et secouez-le sur le couvercle de la boîte de Pétri dans la cage. À l’aide de l’extrémité propre d’une cuillère ou d’une cuillère, étalez la nourriture aussi uniformément que possible sur le fond du plat.
    5. Remplacez l’aliment tous les 2 jours. Utilisez l’extrémité de la cuillère pour brosser les grillons du plat d’alimentation avant de le retirer. Jetez l’ancien aliment dans le conteneur à déchets autoclavable.
    6. Surveillez la croissance de moisissures sur les aliments. Si l’aliment commence à apparaître blanc ou verdâtre, jetez la boîte de Petri et nourrissez-le immédiatement.
    7. 14 jours après la ponte, utilisez un pinceau de 2,54 cm (1 pouce) pour enlever les grillons accrochés au substrat de fibre de coco natal en brossant tous les grillons de la surface de la fibre de coco et des côtés de la boîte de Pétri dans la cage.
    8. Placez le substrat de ponte retiré dans le récipient à déchets autoclavable et conservez-le au congélateur jusqu’à l’autoclavage.
    9. Remplacez le substrat natal par un plat de fibre de coco fraîche pour l’hydratation préparé selon les étapes 1.1.5-1.1.9.
    10. Utilisez une bouteille de lavage d’eau DI pour ajouter de l’eau jusqu’à ce que la surface de la fibre de coco brille mais ne s’accumule pas.
      REMARQUE: La densité du grillon a un impact important sur les performances de croissance de G. bimaculatus13. Le maintien du cheptel reproducteur à une densité excessive risque d’introduire des effets épigénétiques indésirables induits par l’encombrement dans les expériences dans lesquelles leur progéniture est utilisée9. Les grillons doivent être « amincis » à partir des densités élevées qui émergent des substrats de ponte et répartis en densités qui adhèrent à la norme de 0,005 grillon/cm3 d’espace.

2. Prendre soin des enfants de trois à l’âge adulte

  1. Mise en place de cages
    REMARQUE: Pour plus de détails sur la technique de construction du couvercle grillagé, reportez-vous à l’étape 1.3.1 des matériaux supplémentaires.
    1. Répétez l’étape 1.4.1.
    2. Installez cinq morceaux de carton d’œufs coupés dans l’extrémité distale de la cage afin que les concavités en forme d’œuf soient tournées vers l’extérieur. Assurez-vous que les extrémités courtes sont sur les côtés de la cage, que le côté long se trouve à plat contre le fond et qu’il y a environ 3 cm d’espace entre chaque morceau de carton.
    3. Placez la dernière pièce de carton découpée sur les pièces de carton verticales telles que le toit d’une maison, comme illustré à la figure supplémentaire S1.
    4. Suivez les étapes 1.1.8-1.1.13 pour préparer les substrats d’hydratation.
    5. Placez le substrat d’hydratation dans le coin droit proximal de la cage de grillon comme illustré à la figure supplémentaire S2.
    6. Utilisez un flacon de lavage pour ajouter 6 à 10 mL d’eau DI jusqu’à ce que la surface de la fibre de coco semble humide et réfléchissante, mais que la fibre de coco ne soit pas complètement immergée.
      REMARQUE: La surface doit apparaître légèrement capitonnée, la tension superficielle faisant en sorte que l’eau suive les contours de la fibre de coco.
    7. Inverser le couvercle d’une boîte de Petri de 100 mm et le placer sur le côté gauche proximal de la cage. Ajouter 2 à 3 g d’aliment de grillon standard comme indiqué dans la figure supplémentaire S2.
  2. Modification de la densité des colonies
    REMARQUE: Effectuez cette étape 20 jours après l’éclosion ou lorsque les grillons atteignent une masse moyenne de 0,01 g.
    1. Sur la surface de travail, placez un grand conteneur pouvant accueillir le plan d’étage de trois cages de 29,3 L debout côte à côte.
      REMARQUE: Il s’agit d’un confinement secondaire et contrôlera les grillons qui s’échappent lors de leur transfert d’une colonie à une autre.
    2. Retirez la colonie d’origine du support d’élevage et placez-la sur la surface de travail.
    3. Sur le côté droit de la colonie d’origine, placez une cage vide de la même taille.
    4. Sur le côté droit de la cage vide, placez une cage qui a été mise en place conformément aux étapes 2.1.1-2.1.7.
    5. Vérifiez que les grillons ne s’accrochent pas au dessous du couvercle grillagé de la cage contenant les grillons. Si vous les observez, appuyez sur le haut de la cage pour les déloger.
    6. Ouvrez le couvercle grillagé de la cage contenant les grillons.
    7. En un seul mouvement doux et doux, transférez le carton « toit » et tous les grillons adhérant à ses contours dans la cage du milieu.
    8. Une fois que le carton est à l’intérieur de la cage du milieu, agitez doucement le carton contre les côtés pour déloger tous les grillons.
    9. Inspectez visuellement que tous les grillons ont été secoués librement avant de retourner le morceau de carton du côté proximal de la cage d’origine pour permettre aux grillons restants d’adhérer au carton.
    10. Répétez les étapes 2.2.8 à 2.2.9 avec tous les morceaux de carton dans la cage, en travaillant séquentiellement de l’avant à l’arrière de la cage d’origine jusqu’à ce que tous les grillons aient été transférés dans la cage du milieu.
    11. Inclinez doucement la cage du milieu contenant les grillons afin que tous les grillons contenus soient dirigés vers le coin inférieur.
    12. Soulevez la cage contenant les grillons au-dessus de la cage du destinataire.
    13. Inclinez lentement la cage du donneur afin que les grillons commencent à gagner de l’achat sur les côtés et puissent se déplacer de manière contrôlée hors de la masse dans le coin inférieur, comme le montre la figure supplémentaire S3.
    14. Si les grillons avancent trop rapidement, ajustez l’angle auquel la cage du milieu est maintenue, ce qui fait retomber les grillons.
    15. Lorsque la cage est inclinée, utilisez un pinceau de 2,54 cm (1 pouce) pour diriger les grillons dans la cage du destinataire, en comptant chacun jusqu’à ce que le nombre total soit égal à 150 individus. Utilisez la brosse pour dissuader ceux qui avancent trop rapidement pour un décompte précis.
    16. Étiquetez la cage de cricket nouvellement stockée avec la date, le stock parental et le nombre de grillons contenus.
    17. Euthanasier sans cruauté les grillons en excès encore au fond des contenants du milieu et d’origine en plaçant le contenant entier dans un congélateur à -20 °C pendant au moins 30 min.
    18. Inspectez la cage d’origine pour vous assurer que tous les grillons ont été transférés.
    19. Placez les cages de grillon sur des supports végétaux à 25 cm sous des hottes lumineuses contenant des lampes fluorescentes à spectre complet réglées sur une minuterie extérieure de qualité résidentielle programmée pour maintenir une photopériode de 12 h L/ D. Voir la figure supplémentaire S4.
    20. Transférer tous les frass, les plats de substrat d’hydratation usé et d’alimentation, l’essuie-tout, les exuvies et les grillons morts restant dans la cage d’origine dans le récipient à déchets autoclavable.
    21. À moins que les déchets ne soient autoclavés immédiatement, conservez-les dans un congélateur dans l’installation à -20 °C.
    22. Inspectez le sol, les vêtements des travailleurs, la cage de confinement secondaire et la surface de travail à la recherche de grillons échappés.
    23. Désinfectez la surface de travail et la cage de confinement secondaire avec une solution d’eau de Javel à 10 %, en jetant les serviettes en papier dans le récipient à déchets autoclavable.
  3. Alimentation et abreuvement
    1. Ouvrez le récipient de stockage d’aliments hermétique et remplissez une tasse d’échantillon vide de 100 ml avec de l’alimentation de grillon. Atteignez chaque colonie et déposez un quart de la nourriture contenue dans la tasse dans le couvercle de la boîte de Pétri contenant l’aliment.
    2. Pour arroser les grillons, préparez une boîte de Petri de fibre de coco en suivant les étapes 1.1.9-1.1.13.
    3. Augmentez le taux d’alimentation en fonction du taux de consommation pour assurer la disponibilité des aliments ad libitum .
      REMARQUE: La demande d’aliments pour grillons change tout au long du développement.
  4. Transfert de grillons dans des cages propres
    1. Transférez les grillons dans des cages propres toutes les 2 semaines. Reproduire la disposition des cages des étapes 2.2.1-2.2.4
      REMARQUE: Des quantités importantes de frass se seront accumulées dans les concavités des boîtes d’œufs.
    2. Transférer les grillons dans des cages propres, en suivant les étapes 2.2.5-2.2.23.
    3. Manœuvrez doucement les cartons de sorte que la majorité des frass tombent dans la cage d’origine tout en permettant aux grillons de s’accrocher au carton pendant la répétition des étapes 2.2.7-2.2.10.
    4. Utilisez une brosse ou une cuillère en plastique pour encourager les grillons piégés dans le frass à passer de la cage du milieu à une cage propre.
    5. Inspectez la cage d’origine pour vous assurer que tous les grillons ont été transférés.
    6. Transférer tous les frass, les plats de substrat d’hydratation usé et d’alimentation, l’essuie-tout, les exuvies et les grillons morts restant dans la cage d’origine dans le récipient à déchets autoclavable.
    7. À moins que les déchets ne soient autoclavés immédiatement, conservez-les dans un congélateur dans l’installation à -20 °C.
    8. Inspectez le sol, les vêtements des travailleurs, la cage de confinement secondaire et la surface de travail à la recherche de grillons échappés.
    9. Désinfectez la surface de travail et la cage de confinement secondaire avec une solution d’eau de Javel à 10%, en jetant les serviettes en papier dans un récipient à déchets autoclavable.
  5. Mise en place de cages expérimentales
    REMARQUE: Les cages expérimentales sont des récipients en plastique qui abritent moins de grillons. Leur configuration est identique aux cages de 29,3 L qui contiennent des reproducteurs, mais reposent sur des récipients de 7,1 L remplis d’eau, d’aliments pour animaux et contenant une surface réduite de carton d’œufs.
    1. Placez six morceaux de carton de 10,1 cm x 15,4 cm (4 pouces x 6 pouces) dans l’extrémité distale de chaque cage expérimentale avec les longs axes des cartons couvrant la largeur de la dimension étroite de la cage et les axes courts des cartons orientés vers le couvercle et le sol.
    2. Emballez 10 g du mélange de travail de la fibre de coco hydratée dans une boîte de Pétri.
    3. Utilisez un flacon de lavage contenant de l’eau DI pour ajouter environ 15 mL d’eau DI, ou jusqu’à ce qu’un ménisque se forme à la surface de la fibre de coco.
    4. Inverser le couvercle d’une boîte de Petri de 60 mm x 15 mm pour contenir l’aliment.
      REMARQUE: Le taux d’alimentation peut varier tout au long de la durée de l’essai. Pour la procédure expérimentale de randomisation et de stockage du grillon en cage, voir l’étape 1.4 des matériaux supplémentaires.
  6. Insectes terminants
    1. Lorsque les grillons ne sont plus nécessaires à la reproduction ou à un usage expérimental, suivez l’étape 2.2.17.
    2. Lorsque les grillons sont morts, retirez la cage du congélateur. Retirez le couvercle et transférez tous les matériaux contenus dans un récipient à déchets autoclavable. Transférer les déchets au congélateur jusqu’à l’autoclavage.
    3. Immergez la cage vide dans une solution d’eau de Javel à 10% et laissez-la reposer pendant au moins 5 min.
    4. Rincez trois fois la cage vide avec de l’eau froide du robinet pour éliminer les résidus d’eau de Javel, en accordant une attention particulière aux canaux situés au fond du récipient.

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Representative Results

Des données démontrant un élevage réussi de grillons de l’éclosion à l’âge de 65 jours ont été recueillies lors d’un essai d’alimentation en septembre 2021. Les grillons ont été élevés à partir d’œufs suivant les étapes 1.1.1 à 2.6.1 de ces protocoles, et six cages répliquées ont été remplies de 24 grillons aléatoires de 22 jours (troisième stade) suivant l’étape 2.7 ci-dessus. Les grillons ont ensuite été élevés dans des conditions ambiantes; toutefois, en raison d’un dysfonctionnement de l’unité de traitement de l’air de l’installation, la température ambiante moyenne était de 25 ± 1 °C à 20 % d’humidité relative plutôt que les 27 °C suggérés. La masse de grillon a été mesurée deux fois par semaine entre 22 et 65 jours après l’éclosion. Les résultats de cette expérience sont décrits ci-dessous et sont présentés comme des moyennes plus ou moins l’écart-type.

Les données illustrées à la figure 1 et à la figure 2 représentent les six cages répliquées administrées selon l’alimentation standard décrite dans ce protocole. Les grillons ont été stockés à partir d’une population d’une masse moyenne de 21 ± 9 mg. À la fin de l’expérience, la masse moyenne de tous les grillons juvéniles et adultes combinés était de 0,724 g ± 0,190 g (figure 1). Comme G. bimaculatus est sexuellement dimorphe, nous rapportons également la masse adulte par sexe. Le rapport de masculinité à la récolte était de 51 % de femmes. Sur 30 mâles adultes présents à l’âge de 65 jours à la fin de l’expérience, la masse moyenne était de 0,721 g ± 0,123 g. Sur les 58 femelles adultes présentes à l’âge de 65 jours, la masse moyenne était de 0,841 g ± de 0,112 g (figure 2). La survie entre l’ensemencement et la récolte était de 89 % et était mesurée chaque semaine par le nombre total de tous les grillons individuels dans toutes les cages. Au jour 65, 68,2 % de tous les grillons avaient atteint l’âge adulte (figure 2).

Figure 1
Figure 1 : Masse moyenne des grillons individuels 22 à 65 jours après l’éclosion. Les barres représentent les quartiles de la masse moyenne du grillon par cage, n = 6 cages. Tous les grillons ont été comptés et pesés 2x par semaine, sauf dans 1 semaine de l’expérience, au cours de laquelle ils n’ont été pesés qu’une seule fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Masse moyenne de cricket adulte par sexe à la fin de l’expérience. Grillons mâles n = 30, grillons femelles n = 58. Les barres représentent des quantiles de masse moyenne; 'x' représente la masse moyenne de cricket par sexe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Matériaux supplémentaires: (1) Fibre de coco et sécurité respiratoire, (2) Enlèvement de la fibre de coco, (3) Étalonnage de l’administration de brouillard, (4) Construction du couvercle grillagé, (5) Stockage expérimental en cage, (6) Randomisation des grillons dans les cages, (7) Méthodes utilisées pour l’analyse des aliments. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S1: Vue latérale de la cage de grillon contenant une disposition correcte du refuge en carton, de l’aliment et de la fibre de coco. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2: Vue de dessus des boîtes de Petri contenant de la fibre de coco et des aliments pour grillons positionnés au fond de la cage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S3 : Grillons transférés du fond d’une cage dans une nouvelle cage en s’inclinant lentement comme décrit aux étapes 2.2.11 à 2.2.13. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S4 : Cages contenant des grillons positionnées sur des supports d’élevage éclairés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S1 : (1) Analyses nutritionnelles des aliments commerciaux pour animaux, (2) Liste des ingrédients des aliments pour animaux du fabricant. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Discussion

La simplicité de cette approche de l’élevage du cricket peut bénéficier à une gamme de domaines de recherche et représente un modèle générique pour un élevage réussi du cricket, facilement adaptable à une variété de besoins expérimentaux. Par rapport à plusieurs autres études sur G. bimaculatus, la taille adulte individuelle du corps est plus petite et la maturation est plus lente14, ce que nous attribuons à la température d’élevage sous-optimale qui nous est imposée par les circonstances. Les méthodes décrites ci-dessus ont été utilisées et affinées au cours de 2 ans. Des cultures robustes ont été maintenues sans preuve de problèmes parfois observés dans l’élevage commercial de grillons, y compris la mortalité généralisée due à des agents pathogènes présentant des signes cliniques classiques (par exemple, la liquéfaction interne due aux densovirus chez Acheta domesticus) ou un cannibalisme excessif15. Il est probable que le manque d’introductions de grillons après l’établissement de colonies a considérablement réduit la probabilité de charge de morbidité.

Prévenir l’encombrement est important pour assurer la santé du cricket. Les G. bimaculatus sauvages sont solitaires et les mâles défendent leurs territoires par des démonstrations agressives et des combats16. Pour réussir les soins en captivité, il faut maintenir la densité des colonies dans une fourchette appropriée pour réduire le comportement antagoniste et les réponses globales au stress13. Ceci est accompli en fournissant aux grillons un refuge abondant dans la cage et en éclaircissant les stocks reproducteurs de grillons à 150 individus par cage de 29,3 L 20 jours après l’éclosion lorsqu’ils atteignent une taille moyenne de 0,01 g, au cours de la troisième ou quatrième période juvénile. Cette densité d’élevage est identique à celle utilisée dans les essais d’optimisation de l’alimentation de G. bimaculatus de Sorjonen et al.14. Une considération particulièrement pertinente lors du transfert de grillons d’un conteneur à un autre est le degré élevé de risque d’évasion. Le confinement secondaire, les mouvements contrôlés, la préparation pour appréhender les évadés et la vigilance sont des outils cruciaux pour empêcher l’évasion du grillon au cours de ce processus. Ces mesures reflètent la désignation de Gryllus spp par le département de l’Agriculture des États-Unis. les grillons en tant que ravageurs potentiels des cultures, nécessitant des permis fédéraux et étatiques pour l’élevage aux États-Unis17.

Les contrôles environnementaux et la qualité des aliments pendant les stades des œufs et des nymphes précoces sont importants pour la santé de toutes les cultures de grillons en captivité, y compris G. bimaculatus. Pour pondre des œufs viables, la femelle G. bimaculatus a besoin d’un substrat humide dans lequelovipositer 18. La fibre de coco est largement utilisée dans l’industrie commerciale de la production de grillons comme moyen de ponte. Ces méthodes reposent sur la fibre de coco humidifiée avec de l’eau DI comme substrat pour la ponte et l’hydratation des grillons tout au long de leur cycle de vie. De même, l’utilisation d’essuie-tout humides dans les cages juvéniles pour absorber l’excès de gouttelettes d’eau et fournir des gradients d’humidité dans l’environnement natal s’est avérée très efficace pour réduire le nombre de grillons âgés de <1 semaine succombant à la déshydratation ou à la noyade, comme l’indique la présence ou l’absence de grillons juvéniles décédés dans les fonds des cages. La nutrition juvénile est connue pour jouer un rôle démesuré dans la prédiction de la performance de croissance réussie chez les grillons. S’assurer que les aliments frais à nutrition complète sont d’une taille de particules adaptée aux grillons de <0,01 g entraînera une survie plus élevée, car les jeunes grillons seront plus sensibles aux impacts de la variabilité de la qualité des aliments19.

L’aliment de grillon disponible dans le commerce utilisé dans cette étude a été choisi en raison de son utilisation répandue dans l’industrie nord-américaine de l’élevage de grillons. Tout d’abord, d’après les communications personnelles avec trois producteurs commerciaux de grillons, deux dans le Haut-Midwest américain et un dans le sud des États-Unis, il est clair que cet aliment (Mazuri) est largement appliqué dans l’industrie des insectes comestibles à ce jour. Les producteurs de cricket le trouvent propice aux mesures souhaitables de performance de croissance, de fécondité, de développement et de gain de poids. Deuxièmement, pour les techniciens chargés d’administrer des aliments à un grand nombre de grillons en laboratoire, l’utilisation d’un aliment prémélangé en poudre tout au long de la durée de vie des insectes est pratique. Troisièmement, la demande en protéines est connue pour être un facteur important dans le développement du grillon et bien que de nombreux autres besoins nutritionnels spécifiques pour G. bimaculatus ne soient pas entièrement compris, ce mélange préformulé contient un pourcentage de protéines brutes, qui se situe dans la fourchette optimale rapportée de 22% à 30%14,20.

L’espace dans les incubateurs est souvent limité. Les fermes de grillons commencent généralement leurs grillons précoces dans des incubateurs et transfèrent des animaux plus matures dans des environnements en plein air, où les systèmes de traitement de l’air à l’échelle de l’installation régulent la température et l’humidité. Pour ces raisons, ces méthodes sont conçues pour imiter de tels arrangements à plus petite échelle. Après 20 jours à l’intérieur de l’incubateur, la densité est réduite et les grillons sont transférés soit dans des traitements expérimentaux, soit dans des conditions ambiantes pour être utilisés comme reproducteurs. Lorsque les systèmes de traitement de l’air fonctionnent correctement, la température de l’installation d’élevage doit être stable de 27 ± 1 °C avec une humidité relative comprise entre 20 % et 25 %. Les grillons ont accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. L’aliment référencé tout au long de ces méthodes est Mazuri Cricket Feed largement utilisé par les producteurs de grillon en Amérique du Nord. Pour une analyse nutritionnelle complète, voir le tableau supplémentaireS1.

Selon les méthodes de Donoughe et Extavour (2016), le coton peut être utilisé à la place de la fibre de coco comme milieu de ponte ou comme matériau de boyau au-dessus de la fibre de coco pour empêcher les particules de frass ou d’aliments pour animaux de contaminer la surface du milieu de ponte18. Ils recommandent de placer une fine couche de coton sur le substrat pendant la période de ponte et de l’enlever une fois la ponte terminée, ainsi que les frass et les détritus accumulés. Bien que les données mesurant l’impact de la contamination du substrat sur la viabilité des œufs ou le développement du grillon ne soient pas disponibles, les protocoles décrits ici donnent des résultats satisfaisants à la fois pour la production de grillons juvéniles et pour la croissance. Cela peut être attribuable aux qualités antimicrobiennes présumées de la fibre de coco et constitue un motif de recherche future dans le domaine de la production d’insectes comestibles21.

En raison d’un dysfonctionnement de l’unité régulant la température de l’installation d’élevage de grillons dans laquelle ces méthodes ont été développées, l’essai pour lequel nous rapportons des données a été mené à 25 ° C à 20% d’humidité relative, soit 2 ° de plus que ce que ces protocoles dictent. En outre, ces objectifs de recherche étroitement basés sur l’alimentation entraînent une disponibilité limitée de données sur certaines mesures d’intérêt telles que la fécondité, les réponses endocriniennes, la charge pathogène et l’expression des gènes. Une fois que les grillons reproducteurs produisaient constamment des œufs de grillons viables en abondance et que la mortalité juvénile était négligeable, les efforts se concentraient principalement sur l’expérimentation directement pertinente pour les questions de recherche. Ainsi, ce rapport ne propose que des comptes rendus anecdotiques des impacts de ces méthodes sur la performance sur la croissance à long terme sur >10 générations. Enfin, l’utilisation de matériaux d’origine végétale tels que la fibre de coco et le carton dans des cages expérimentales conduit probablement à une ingestion accidentelle par les grillons. Ceci est acceptable dans la conception de ces études, mais peut compromettre la validité des plans d’étude où les résultats reposent sur des mesures précises de la biomasse totale ingérée.

Le protocole décrit ici se veut à la fois basique et approfondi, avec des étapes claires et faciles à suivre pour élever des grillons dans un laboratoire nourri avec un aliment standard disponible dans le commerce. L’utilisation d’une telle procédure normalisée avec un nettoyage optimal, une densité de stockage et des contrôles environnementaux permet de maintenir des colonies de grillons uniformes et saines à long terme; en outre, il contribuera à la recherche croissante sur G. bimaculatus en tant qu’insecte comestible cultivable ayant des implications pour la santé humaine. Il peut également être utile pour les études sur la physiologie des insectes, l’optimisation de la croissance et la génétique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Le financement de ce projet a été rendu possible grâce à des subventions internes de l’Université du Wisconsin-Madison. Sincères remerciements à Kevin Bachhuber de Bachhuber Consulting Inc. pour l’accès à son guide inédit pour l’élevage commercial de cricket et à Michael Bartlett Smith pour son aide dans le raffinement et le dépannage de ces méthodes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
31-qt (29.3 L) Snap-lid tote bin with lid HOMZ 3430CLBL Used to house breeding stock
3-tier/12-tray Grow Light Stand Fischer Scientific NC1938548
50-gal (189.27L) tote bin with lid Sterilite #14796603 Used as secondary containment when handling crickets
50 mL polypropylene graduated cylinder Fischer Scientific S95171
7.5-qt (7.1 L) snap-lid tote bin with lid HOMZ 3410CLBL Used to house exprimental stock
Accuris 500 g x 0.01 g Balance Manufactured by Accuris, a subsidieary of Benchmark Scientific W3300-500 Purchased from Dot Scientific through University of Wisconsin system purchasing service "ShopUW+"
Ace Premier 1 Inch Flat Chip Brush Ace Hardware  #1803261
Bel-Art SP Scienceware deionized water wash bottle Fischer Scientific 03-421-160 
Bright aluminum window screen  Phifer UNSPSC# 11162108 Mesh size 18 x 16"
Clear Disposable Plastic Portion Cups 5.5 oz w/ lids Wal-Mart N/A
Deionized water
Diablo 4-4/8" x 13 TPI Ultra Fine Finish Bi-Metal Jigsaw Blade Home Depot #313114935
Egg Filler Flats-Paper, 12 x 12" Uline S-5189
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 100 x 15mm Fischer Scientific FB0875714
Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid 60 x 15mm Fischer Scientific FB0875713A
Georgia-Pacific Envision Brown Paper Towels Home Depot #205675843
Infinity Tough Guy high performance hot-melt glue sticks Infinity Bond Infinity IM-Tough-Guy-12
Mazuri Cricket Diet Land O' Lakes International SKU#  3002219-105
Stanley TimeIt Twin 2-outlet Grounded Mechanical 24 Hour Timer Wal-Mart N/A
Vermont Organics Reclamation Soil 11 lb Coir Block Home Depot #300679904

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  21. Mazaya, G., Karseno, K., Yanto, T. Antimicrobial and phytochemical activity of coconut shell extracts. Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology. 8 (5), 1090-1097 (2020).

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Biologie Numéro 184 Entomophagie Insecte comestible Grillon Gryllus Modèle Paurometabolous Méthodes Élevage Standard Alimentation Densité Orthoptères
Maintenir les cultures de laboratoire de <em>Gryllus bimaculatus</em>, un modèle orthoptère polyvalent pour l’agriculture des insectes et la physiologie des invertébrés
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Ventura, M. K., Stull, V. J.,… More

Ventura, M. K., Stull, V. J., Paskewitz, S. M. Maintaining Laboratory Cultures of Gryllus bimaculatus, a Versatile Orthopteran Model for Insect Agriculture and Invertebrate Physiology. J. Vis. Exp. (184), e63277, doi:10.3791/63277 (2022).

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