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Bioengineering

Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels

Published: November 15, 2021 doi: 10.3791/63282
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Texas A&M University-College Station

Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Fluoreszenzbildgebung und Analyse der endogenen metabolischen Coenzyme, des reduzierten Nicotinamidadenins (Phosphat) -Dinukleotids (NAD (P) H) und des oxidierten Flavinadenindinukleotids (FAD). Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD bietet eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Beurteilung des Zellstoffwechsels.

Abstract

Der Zellstoffwechsel ist der Prozess, durch den Zellen Energie erzeugen, und viele Krankheiten, einschließlich Krebs, sind durch einen abnormalen Stoffwechsel gekennzeichnet. Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen. NAD(P)H und FAD weisen Autofluoreszenz auf und können spektral durch Anregung und Emissionswellenlängen isoliert werden. Beide Coenzyme, NAD (P) H und FAD, können entweder in einer freien oder proteingebundenen Konfiguration vorliegen, von denen jedes eine ausgeprägte Fluoreszenzlebensdauer hat - die Zeit, für die das Fluorophor im angeregten Zustand verbleibt. Die Fluoreszenz-Lebensdauerbildgebung (FLIM) ermöglicht die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität und Lebensdauer von NAD(P)H und FAD für eine markierungsfreie Analyse des Zellstoffwechsels. Fluoreszenzintensitäts- und Lebensdauermikroskope können für die Bildgebung von NAD(P)H und FAD optimiert werden, indem die geeigneten Anregungs- und Emissionswellenlängen ausgewählt werden. Metabolische Störungen durch Cyanid verifizieren Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokolle, um metabolische Veränderungen in Zellen zu erkennen. Dieser Artikel demonstriert die Technik der Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD zur Messung des Zellstoffwechsels.

Introduction

Stoffwechsel ist der zelluläre Prozess der Energieerzeugung. Der Zellstoffwechsel umfasst mehrere Wege, einschließlich Glykolyse, oxidative Phosphorylierung und Glutaminolyse. Gesunde Zellen nutzen diese Stoffwechselwege, um Energie für die Proliferation und Funktion zu erzeugen, wie zum Beispiel die Produktion von Zytokinen durch Immunzellen. Viele Krankheiten, einschließlich Stoffwechselstörungen, Krebs und Neurodegeneration, sind durch einen veränderten Zellstoffwechsel gekennzeichnet1. Zum Beispiel haben einige Krebszelltypen erhöhte Glykolyseraten, selbst in Gegenwart von Sauerstoff, um Moleküle für die Synthese von Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden zu erzeugen2,3. Dieses Phänomen, das als Warburg-Effekt bekannt ist, ist ein Kennzeichen vieler Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs und Glioblastome4. Aufgrund der Veränderungen des Zellstoffwechsels, die mit dem Fortschreiten der Krebserkrankung verbunden sind, kann der Zellstoffwechsel ein Surrogat-Biomarker für die Arzneimittelreaktion sein5,6. Darüber hinaus ist das Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit auf zellulärer Ebene von entscheidender Bedeutung, da die Zellheterogenität bei Individuen zu unterschiedlichen Arzneimittelreaktionen führen kann7,8.

Technologien, die Veränderungen im Zellstoffwechsel identifizieren und quantifizieren, sind für Studien zu Krebs und Medikamentenreaktion unerlässlich. Chemische und Proteinanalysen werden verwendet, um den Stoffwechsel von Zellen oder Geweben zu bewerten, aber es fehlen Einzelzellauflösungen und räumliche Informationen. Metabolische Plattenleser-basierte Assays können den pH- und Sauerstoffverbrauch in der Probe im Laufe der Zeit und die anschließende metabolische Störung durch Chemikalien messen. Über den pH-Wert kann die extrazelluläre Versauerungsrate (ECAR) berechnet werden, die einen Einblick in die glykolytische Aktivität der Zellen gibt9. Bildgebende Ganzkörpermethoden, einschließlich 2-[Fluor-18] Fluor-D-Glucose-Positronen-Emissions-Tomographie (FDG PET) und Magnetresonanzspektroskopie (MRS), sind nichtinvasive Bildgebungsmodalitäten, die klinisch verwendet werden, um Tumorrezidive und Arzneimittelwirksamkeit durch metabolische Messungen zu identifizieren10,11,12,13,14.

FDG-PET bildet die Gewebeaufnahme von FDG, einem radioaktiv markierten Glukoseanalogon, ab. Die erhöhte Aufnahme von FDG-PET durch Tumore im Verhältnis zum umgebenden Gewebe ist auf den Warburg-Effekt zurückzuführen12,13. MRS bildet gemeinsame Kerne von Molekülen ab, die für den Stoffwechsel verwendet werden, wie 13C und 31P, und kann dynamische Informationen darüber erhalten, wie sich der Stoffwechsel als Reaktion auf Reize wie Bewegung oder Essen verändert14. Obwohl FDG-PET und MRS klinisch eingesetzt werden können, fehlt diesen Technologien die räumliche Auflösung, um die intratumorale Heterogenität aufzulösen. Ebenso werden Sauerstoffverbrauchsmessungen an einer Massenpopulation von Zellen durchgeführt. Die Autofluoreszenzbildgebung überwindet das räumliche Auflösungshindernis dieser Technologien und bietet eine nichtinvasive Methode zur Quantifizierung des Zellstoffwechsels.

Figure 1
Abbildung 1: NADH und FAD in gemeinsamen Stoffwechselwegen. NADH und FAD sind Coenzyme, die in der Glykolyse, im Krebszyklus und in der Elektronentransportkette verwendet werden. Die Autofluoreszenzbildgebung dieser Moleküle liefert Informationen über den Zellstoffwechsel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Reduziertes Nicotinamidadenin (Phosphat) Dinukleotid (NAD(P)H) und oxidiertes Flavinadenindinukleotid (FAD) sind Coenzyme von Stoffwechselreaktionen, einschließlich Glykolyse, oxidativer Phosphorylierung und Glutaminolyse (Abbildung 1). Sowohl NAD(P)H als auch FAD sind autofluoreszierend und bieten einen endogenen Kontrast für die Fluoreszenzbildgebung1,15. NADPH hat ähnliche fluoreszierende Eigenschaften wie NADH. Aus diesem Grund wird NAD(P)H häufig verwendet, um das kombinierte Signal von NADH und NADPH2,16 darzustellen.

Die Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FLIM) quantifiziert die Fluoreszenzlebensdauer oder die Zeit, für die sich ein Fluorophor im angeregten Zustand befindet. Fluoreszenzlebensdauern reagieren auf die Mikroumgebung der Fluorophore und liefern Informationen über den Zellstoffwechsel17. NAD(P)H und FAD können in Zellen entweder in proteingebundenen oder freien Konformationen existieren, von denen jede eine andere Lebensdauer hat. Freies NAD(P)H hat eine kürzere Lebensdauer als proteingebundenes NAD(P)H; Umgekehrt hat die freie FAD eine längere Lebensdauer als die gebundenen FAD18,19. Die Lebensdauern und Lebensdauerkomponentengewichte können aus Fluoreszenz-Lebensdauerzerfallsdaten durch Gl. (1)20 quantifiziert werden:

I(t) = α 1e-t/τ1 + α 2e-t/τ2 + C (1)

Eq (1) stellt die normierte Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit dar. Die α 1 und α 2 in dieser Gleichung stellen die proportionalen Komponenten der kurzen und langen Lebensdauer (α 1+ α 2=1) dar, τ1 und τ2 die kurze bzw. lange Lebensdauer und C das Hintergrundlicht7,20. Die amplitudengewichtete Lebensdauer, hier dargestellt als τm, wird mit Gleichung (2) berechnet.

τm= α 1τ1+ α 2τ2 (2)

Eine mittlere Lebensdauer kann durch Mittelung von "t" über den Intensitätszerfall des Fluorophors berechnet werden, was für einen zweiexponentiellen Zerfall durch Gl. (3)17,21 dargestellt wird.

τ*m= (α 1τ12+ α 2τ22)/ (α 1τ1+ α 2τ2) (3)

Ein Fluoreszenzintensitätsbild kann aus dem Lebensdauerbild berechnet werden, indem der Fluoreszenzlebensdauerzerfall integriert wird. Die Autofluoreszenzbildgebung ist eine zerstörungsfreie und markierungsfreie Methode, mit der der Stoffwechsel lebender Zellen mit subzellulärer Auflösung charakterisiert werden kann. Das optische Redoxverhältnis liefert eine optische Analogmetrik des chemischen Redoxzustands der Zelle und wird als Verhältnis von NAD(P)H- und FAD-Intensitäten berechnet. Obwohl die Formel zur Berechnung des optischen Redoxverhältnisses nicht standardisiert ist22,23,24,25, wird sie hier als die Intensität von FAD über die kombinierten Intensitäten von NAD(P)H und FAD definiert. Diese Definition wird verwendet, weil die summierte Intensität im Nenner die Metrik zwischen 0 und 1 normalisiert und das erwartete Ergebnis der Cyanidhemmung eine Abnahme des Redoxverhältnisses ist. Die Fluoreszenzlebensdauern von freiem NAD(P)H und FAD liefern Einblicke in Veränderungen in der metabolischen Lösungsmittelmikroumgebung, einschließlich pH-Wert, Temperatur, Nähe zu Sauerstoff und Osmolarität17.

Veränderungen in der Fluoreszenzlebensdauer der gebundenen Fraktionen von NAD(P)H und FAD können auf die Nutzung des Stoffwechselwegs und den substratspezifischen Stoffwechsel hinweisen26. Komponentengewichte können für Änderungen der freien zur gebundenen Fraktion der Coenzyme interpretiert werden18,19. Insgesamt ermöglichen diese quantitativen Autofluoreszenz-Lebenszeitmetriken die Analyse des Zellstoffwechsels, und die Autofluoreszenz-Bildgebung wurde zur Identifizierung von Neoplasmen aus normalem Gewebe verwendet27,28, zur Charakterisierung von Stammzellen29,30, zur Bewertung der Immunzellfunktion31,32,33,34,35, zur Messung der neurologischen Aktivität36, 37,38, und Verständnis der Arzneimittelwirksamkeit bei Krebsarten wie Brustkrebs und Kopf-Hals-Krebs21,39,40,41,42. Hochauflösende Autofluoreszenzbildgebung kann mit Bildsegmentierung für die Einzelzellanalyse und Quantifizierung der intrapopulationären Heterogenität kombiniert werden43,44,45,46,47.

NAD(P)H und FAD können auf Einzelphotonen- oder Multiphotonen-Fluoreszenzmikroskopen abgebildet werden, die für die Intensitäts- oder Lebensdauerbildgebung konfiguriert sind. Bei Einzelphotonenmikroskopen werden NAD(P)H und FAD aufgrund üblicher Laserquellen bei diesen Wellenlängen typischerweise bei Wellenlängen von 375-405 nm bzw. 488 nm angeregt48. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung werden NAD(P)H und FAD bei Wellenlängen von etwa 700 bis 750 nm bzw. 700 bis 900 nm bzw. 15,49 anregen. Sobald die Fluorophore angeregt sind, emittieren NAD(P)H und FAD Photonen bei Wellenlängen zwischen ~410 nm bis ~490 nm bzw. ~510 nm bis ~640 nm15. Die maximalen Emissionswellenlängen NAD(P)H und FAD betragen etwa 450 nm bzw. 535 nm48.

Aufgrund ihrer unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen kann die Fluoreszenz der beiden metabolischen Coenzyme spektral isoliert werden. Ein Verständnis der spektralen Eigenschaften von NAD(P)H und FAD ist für das Design und die Optimierung von Autofluoreszenz-Bildgebungsprotokollen notwendig. Cyanid ist ein Elektrontransportkette (ETC) -Komplex-IV-Inhibitor. Die Auswirkungen von Cyanid auf den Zellstoffwechsel und die Autofluoreszenzintensitäten und Lebensdauern von NAD(P)H und FAD in Zellen sind gut charakterisiert27,40. Daher ist ein Cyanid-Störungsexperiment ein wirksames Mittel zur Validierung von NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokollen. Ein erfolgreiches Cyanidexperiment gibt die Gewissheit, dass das NAD(P)H- und FAD-Bildgebungsprotokoll verwendet werden kann, um den Stoffwechsel unbekannter Gruppen oder Störungen zu beurteilen.

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Protocol

1. Zellbeschichtung für die Bildgebung

  1. Saugen Sie das Medium aus einem 80-90% igen konfluierenden T-75-Kolben von MCF-7-Zellen ab, spülen Sie die Zellen mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie 2 ml 0,25% Trypsin (1x) hinzu, um die Zellen vom Kolbenboden zu lösen.
  2. Den Kolben bei 37 °C für ~4 min inkubieren. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um die Ablösung zu bestätigen.
  3. Fügen Sie sofort 8 ml Kulturmedium hinzu, um das Trypsin zu deaktivieren.
  4. Sammeln Sie die Zellen in einem konischen Schlauch (15 ml oder 50 ml). Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen 200 × g für 5 min.
  6. Nach der Zentrifugation den Überstand aspirieren. Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml Kulturmedium und sät 4 × 105 Zellen auf eine 35 mm Glasboden-Bildgebungsschale (oder den entsprechenden Probenhalter für das verwendete Mikroskop).
  7. Geben Sie 2 ml Kulturmedium in die bildgebende Schale, um den Zellstoffwechsel aufrechtzuerhalten.
  8. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C mit 5% CO2 für 24-48 h vor der Bildgebung, damit die Zellen haften bleiben und die logarithmische Wachstumsphase erreichen.
    HINWEIS: Die Wachstumsphase wurde durch vorherige Erfahrungen mit diesen Zellen bestimmt und mit dem Zelldatenblatt bestätigt.

2. Multiphotonen-FLIM-Bildgebung von NAD(P)H und FAD

  1. Schalten Sie alle Komponenten des Multiphotonenfluoreszenz-Lebensdauermikroskops ein, einschließlich des Mikroskops, der Laserquelle und der verwendeten Detektoren.
  2. Platzierung der Proben
    1. Schalten Sie die Hellfeldlampe ein. Stellen Sie sicher, dass Licht in das Okular gelangt. Wählen Sie ein Objektiv, normalerweise 20x, 40x oder 100x für die Zellbildgebung. Tragen Sie 1 Tropfen des entsprechenden Tauchmediums auf das Objektiv auf [überspringen, wenn Sie ein Luftobjektiv verwenden].
    2. Bewegen Sie das Objektiv nach unten, um die Probe richtig zu platzieren, ohne das Objektiv zu berühren. Legen Sie die Glasbodenschale auf den Probenhalter auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie sicher, dass die Probe sicher ist und sich während der Bildgebung nicht bewegt.
    3. Zentrieren Sie die Probe mit dem Objektiv mit der X-Y-Stufensteuerung. Sobald dies erledigt ist, schauen Sie in das Okular und bewegen Sie das Objektiv nach oben, um sich auf die Zellen zu konzentrieren.
    4. Wenn sich das Mikroskop in einem Gehäuse befindet, schließen Sie die Leuchtkastentür. Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware, klicken Sie auf die Registerkarte Multiphotonen-Bildgebung und legen Sie die folgenden Multiphotonen-Bildgebungsparameter fest: Bildgröße = 256 x 256 Pixel; Pixelverweilzeit = 4-25 μs; Gesamtbildaufnahmezeit = ~60 s; Optimierte Detektorverstärkung für Einzelphotonenzählung = 85% (spezifisch für das verwendete System).
  3. Bildgebung der Instrument Response Function (IRF) und des Fluorescent Lifetime Standard
    1. Legen Sie Harnstoffkristalle auf eine Glasbodenschale und befestigen Sie den Geschirrdeckel mit Klebeband oder Parafilm.
      HINWEIS: Harnstoffkristalle bleiben monatelang bei Raumtemperatur stabil.
    2. Stellen Sie sich die Harnstoffkristalle vor.
      1. Legen Sie die Harnstoffschale auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich auf einen Harnstoffkristall.
      2. Stellen Sie die Wellenlänge des Anregungslasers auf 900 nm ein.
      3. Verwenden Sie einen Emissionsfilter, der 450 nm Wellenlängen erfasst.
      4. Erhalten Sie ein Fluoreszenz-Lebensdauerbild des Harnstoffkristalls mit Laserleistung an der Probe <1 mW und verwenden Sie die in Schritt 2.2.4 genannten empfohlenen Bildgebungsparameter.
    3. Stellen Sie sich die gelb-grünen (YG) Perlen als Fluoreszenzlebensdauerstandard vor.
      1. Erstellen Sie eine YG-Perlenfolie, indem Sie die YG-Perlenlösung 1:1.000 in sterilem Wasser verdünnen. Legen Sie ein kleines Volumen (~ 30 μL) auf einen Objektträger oder eine Glasbodenschüssel. Mit einem Deckglas abdecken und die Ränder des Deckglases mit klarem Nagellack versiegeln.
      2. Platzieren Sie den YG-Perlenträger auf dem Mikroskoptisch mit der Deckglasseite des Objektträgers in Richtung Objektiv.
      3. Stellen Sie die Wellenlänge des Anregungslasers auf 890 nm ein
      4. Verwenden Sie einen Emissionsfilter, der Wellenlängen von ~ 500-600 nm erfasst.
      5. Erhalten Sie ein Fluoreszenz-Lebensdauerbild der YG-Perle mit einer Laserleistung an der Probe <1 mW und den empfohlenen Bildparametern [Schritt 2.2.4].
      6. Überprüfen Sie die Lebensdauer der Perle mit dem IRF des Harnstoffs. Wenn die Lebensdauer nicht ~ 2,1 ns beträgt, überprüfen Sie, ob die Perle mit einer anderen Perle in Kontakt kommt, die zur Fluoreszenzlöschung beiträgt, die Perlenlösung getrocknet ist, die Perle unscharf ist, IRF nicht genau ist oder die Verschiebung zwischen IRF und Fluoreszenzzerfall nicht optimiert ist [siehe Schritt 4.2.4].
        HINWEIS: Die Lebensdauer von ~ 2,1 ns ist im Laufe der Zeit stabil.
  4. NAD(P)H-Bildgebung
    1. Legen Sie die Glasbodenschale mit den Zellen auf den Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich auf die Zellen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen in einer Umgebungskammer zu platzieren, um den Wärme-, Feuchtigkeits- und CO2-Gehalt während der Bildaufnahme aufrechtzuerhalten, da diese Parameter den Zellstoffwechsel beeinflussen können.
    2. Stellen Sie die Verstärkung des Detektors auf den optimalen Wert für FLIM ein. Ändern Sie außerdem die gewünschte Verweilzeit - ein Parameter, der die Zeit angibt, die der Laser an jedem Pixel der Probe verbringt.
      HINWEIS: Diese Parameter sollten während des restlichen Vorgangs gleich bleiben. Dies soll die Konsistenz der Laserbeleuchtung und der Detektoreinstellungen sicherstellen, um die Gültigkeit der intensitätsbasierten Messungen sicherzustellen, die von Laserleistung, Scanparametern und Detektorverstärkung abhängen. Es gibt eine optimierte Detektorverstärkung für den Betrieb von Detektoren im Einzelphotonenzählmodus; Der Wert beträgt 85 % für das System, auf das verwiesen wird.
    3. Stellen Sie den Multiphotonenlaser auf 750 nm ein. Stellen Sie sicher, dass die Leistungsregelung für den Laser zunächst auf Null eingestellt ist, damit die Zellen beim Öffnen des Verschlusses am Laser nicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Für NAD(P)H wird eine Anregung bei 750 nm empfohlen, obwohl sie bei 700-750 nm eine breite Absorption aufweist. Eine Anregung bei 890 nm wird für FAD empfohlen, obwohl sie bei 700-900 nm eine breite Absorption aufweist.
    4. Stellen Sie einen Emissionsfilter ein oder wählen Sie ihn aus, um Emissionswellenlängen bei ~ 400-500 nm zu erfassen.
    5. Beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, um die Bildeinstellungen zu optimieren.
      HINWEIS: Der Laser ist jetzt in Betrieb. Öffnen Sie das Mikroskopgehäuse an dieser Stelle nicht. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
    6. Erhöhen Sie die Laserleistung langsam auf ~ 3-8 mW an der Probe und stellen Sie gleichzeitig sicher, dass die Zellen im Fokus sind. Zeichnen Sie nach der Anpassung die maximal verbrauchte Leistung auf. Verwenden Sie diese Energieeinstellung für die Bildgebung auf anderen Segmenten der Petrischale für die NAD(P)H-Bildgebung.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Laserleistung an der Probe oder einem Pick-off-Fenster zu messen und sich nicht auf die Spannung der Pockels-Zelle zu verlassen, da die Pockels-Zellen nicht stabil sind. Oft wird die Laserleistung während der Bildgebung mit einem Pick-off-Fenster statt an der Probe überwacht. Mit einem zweiten Leistungsmesser am Objektiv kann das Verhältnis zwischen der Leistung am Pick-off-Fenster und der Leistung an der Probe verwendet werden, um die ungefähre Leistung an der Probe aus den Pick-off-Fenstermessungen zu schätzen.
    7. Sammeln Sie ein NAD(P)H FLIM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 s.
    8. Überprüfen Sie, ob das Bild genügend Photonen (Peak von ~ 100 Photonen für ein Zytoplasmapixel) innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve aufweist. Wenn die Anzahl der Photonen zu gering ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme.
      HINWEIS: Die minimale Spitzenanzahl von Photonen innerhalb des exponentiellen Fluoreszenzzerfalls hängt von Systemparametern ab, einschließlich zeitlicher Auflösung, IRF und Hintergrundrauschen.
  5. FAD-Bildgebung
    1. Stellen Sie den Multiphotonenlaser auf 890 nm ein und warten Sie, bis er bei der neuen Wellenlänge im Modus gesperrt ist. Stellen Sie sicher, dass die Leistungsregelung für den Laser zunächst auf Null eingestellt ist, damit die Zellen beim Öffnen des Verschlusses am Laser nicht beschädigt werden.
      HINWEIS: Verschieben Sie die Stufe oder den objektiven Fokus nicht, wenn Sie diesen Schritt ausführen. Das FAD-Sichtfeld (FOV) sollte für dieses Bild direkt mit NAD(P)H FOV übereinstimmen.
    2. Stellen Sie einen Emissionsfilter ein oder wählen Sie ihn aus, um Emissionswellenlängen bei ~500-600 nm zu erfassen.
    3. Beginnen Sie mit der Fokussierung oder Live-Ansicht, um die Bildeinstellungen zu optimieren.
      HINWEIS: Der Laser ist jetzt in Betrieb. Öffnen Sie das Mikroskopgehäuse an dieser Stelle nicht.
    4. Erhöhen Sie die Laserleistung an der Probe langsam auf ~5-10 mW und zeichnen Sie die maximal verbrauchte Leistung auf. Verwenden Sie dies als Energieeinstellung für die Bildgebung auf anderen Segmenten der Petrischale für die FAD-Bildgebung.
    5. Sammeln Sie ein FAD FLIM-Bild mit einer Bildintegrationszeit von 60 s.
    6. Überprüfen Sie, ob das Bild genügend Photonen (Peak von ~ 100 Photonen für ein Zytoplasmapixel) innerhalb der Fluoreszenzlebensdauer-Zerfallskurve aufweist. Wenn die Anzahl der Photonen zu gering ist, erhöhen Sie die Laserleistung oder die Dauer der Bildaufnahme.
      HINWEIS: Die minimale Spitzenanzahl von Photonen innerhalb des exponentiellen Fluoreszenzzerfalls hängt von Systemparametern ab, einschließlich zeitlicher Auflösung, IRF und Hintergrundrauschen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.5 an weiteren vier bis fünf FOVs. Stellen Sie sicher, dass jedes Bild mindestens 2 FOVs von den abgebildeten Positionen entfernt ist.

3. Vorbereitung des Cyanid-Experiments

  1. Lösen Sie 130,24 mg Natriumcyanid in 25 ml PBS auf, um eine 80 mM (20x) Natriumcyanidlösung herzustellen.
    HINWEIS: Cyanid ist giftig. Tragen Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung.
  2. Aspirieren Sie 100 μL Kulturmedium aus der Schale. Ersetzen Sie dies durch 100 μL Natriumcyanidlösung, um eine Konzentration von 4 mM Cyanid in der Schale zu erhalten.
  3. Legen Sie die Zellen für 5 Minuten in einen Inkubator, damit die Zellen mit der Cyanidlösung reagieren können.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 2.4-2.6, um NAD(P)H- und FAD-Bilder der Zellen nach der Cyanid-Exposition aufzunehmen.
    HINWEIS: Längere Exposition gegenüber Zyanid tötet die Zellen ab. Postcyanid-Bilder werden innerhalb von 30 Minuten nach der Cyanid-Zugabe aufgenommen.

4. FLIM-Bildanalyse

  1. Öffnen Sie die FLIM-Lebensdaueranalysesoftware.
    1. Öffnen Sie das Harnstoffbild, um den gemessenen IRF zu erfassen.
    2. Importieren Sie das Harnstoffbild. Wählen Sie einen Punkt auf dem Bild des Harnstoffkristalls aus, der für die Bildanalyse verwendet werden soll. Erhöhen Sie den räumlichen Bin-Wert , um FLIM-Daten von mehreren Pixeln auf 1 oder höher für einen Zerfallspeak > 100 Photonen zu integrieren, indem Sie die Bin-Variable auf der Hauptoberfläche der Software ändern.
    3. Speichern Sie die Daten als IRF.
      1. Klicken Sie in der referenzierten Software auf das Dropdown-Menü mit dem Titel IRF und wählen Sie Aus Abklingdaten kopieren aus. Klicken Sie anschließend auf In Zwischenablage kopieren , um bei der Bildanalyse des während des Experiments aufgenommenen Bildes verwendet zu werden.
  2. Bildanalyse von NAD(P)H- und FAD-Lebensdauerbildern
    1. Importieren Sie die Bilddatei in eine Fluoreszenz-Lebensdaueranalyse-Software.
    2. Verbessern Sie die Bildvisualisierung, um die Zellen und subzellulären Kompartimente zu sehen, indem Sie bei Bedarf die Intensität und den Kontrast ändern.
      1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Optionen und wählen Sie Intensität aus. Ändern Sie hier die Intensität und den Kontrast nach Belieben und klicken Sie auf Ok.
    3. Importieren Sie den IRF aus dem Harnstoffbild.
      1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü IRF und wählen Sie Aus Zwischenablage einfügen aus.
    4. Legen Sie multiexponentielle Zerfallsparameter50 fest.
      1. Legen Sie einen Schwellenwert fest, um Zerfälle für Zytoplasmapixel auszuwerten.
        HINWEIS: Hier wurde ein Wert von 50 verwendet. Der Wert wurde durch Vergleich der Fluoreszenzspitzenwerte mehrerer repräsentativer Hintergrund- und Kernpixel mit dem Spitzenwert mehrerer Zytoplasmapixel ausgewählt. Für den Schwellenwert wurde ein Wert zwischen den Kernpixeln und den Zytoplasmapixeln ausgewählt.
    5. Überprüfen Sie, ob der Shift-Wert den IRF relativ zum steigenden Rand der Fluoreszenz ausrichtet. Passen Sie die Verschiebung bei Bedarf an einen Wert an, der den Chi-Quadrat-Wert minimiert.
    6. Erhöhen Sie den räumlichen Behälter, sodass Zytoplasmapixel Fluoreszenzspitzenwerte bei oder über 100 aufweisen.
      HINWEIS: Das Erhöhen des räumlichen Behälters führt zu einer verringerten räumlichen Auflösung.
    7. Berechnen Sie die Fluoreszenzlebensdauer für alle Pixel im Bild.
      1. Klicken Sie im referenzierten Programm auf das Dropdown-Menü Berechnen | Zerfallsmatrix.
        HINWEIS: Der Erfolg wird mit einem Bild angezeigt, das auf die amplitudengewichtete Fluoreszenzlebensdauer falsch gefärbt ist.
    8. Speichern Sie die Daten zur Fluoreszenzlebensdauer.
      1. Klicken Sie auf das Dropdown-Menü Datei | Ausfuhr. Wählen Sie die gewünschten Parameter für die Analyse aus und klicken Sie auf OK. Speichern Sie das Bild.
      2. Wählen Sie die Schaltfläche Farbe aus dem Dropdown-Menü Optionen, um die angezeigte Fluoreszenzlebensdauermetrik und die Farbkonfiguration auf B-G-R anzupassen und die spezifischen Mindest- und Höchstwerte für Farbbalken festzulegen, um die Farbskala des Fluoreszenzlebensdauerbildes anzupassen.

Figure 2
Abbildung 2: Gemessener IRF von Harnstoffkristall. (A) Intensitätsbild aus dem Harnstoff. Ein repräsentatives Pixel wurde ausgewählt, um die IRF-Zerfallskurve (B) für die anschließende Analyse von Fluoreszenzlebensdauerbildern von Zellen zu erstellen. Abkürzung: IRF = Instrument Response Function. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

  1. Zellsegmentierung
    HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll verwendet eine Bildanalysesoftware51. Repräsentative MCF-7-Bilder und Datenanalysecode werden bereitgestellt52.
    1. Laden Sie die Datei MCF7_Segmentation_Final.cpproj52 herunter.
    2. Importieren Sie die MCF7_Segmentation Pipeline, indem Sie auf Datei | klicken | importieren Pipeline aus Datei, wählen Sie die Datei MCF7_Segmentation_Final.cpproj aus.
    3. Klicken Sie auf das Modul Bilder und fügen Sie die zu segmentierenden NAD(P)H-Intensitätsbilder hinzu.
      HINWEIS: Bilder müssen im .tif-, .png- oder .jpg-Format vorliegen.
    4. Klicken Sie unten links auf die Schaltfläche Bilder analysieren .
      HINWEIS: Die Pipeline muss möglicherweise für Bilder optimiert werden, die auf verschiedenen Systemen erfasst wurden. Führen Sie zur Problembehandlung die folgenden Unterschritte aus
      1. Verwenden Sie den Testmodus , um verschiedene Parameter zu testen: Klicken Sie auf Testmodus starten und führen Sie jedes Modul aus, indem Sie auf die Wiedergabeschaltfläche neben dem Modulnamen klicken.
      2. Klicken Sie auf das erste IdentifyPrimaryObjects-Modul , und passen Sie den typischen Durchmesser von Objekten in Pixeleinheiten (Min, Max) an den Durchmesser der Zellen an.
        HINWEIS: Für MCF-7-Zellen wurden 10 bzw. 40 Pixel für das Minimum bzw. Maximum verwendet.
      3. Klicken Sie auf das Modul EnhanceOrSuppressFeatures , und passen Sie die KE-Größe an, um die Identifizierung des ausgewählten KE-Typs zu verbessern.
        HINWEIS: Für MCF-7-Zellen wurde eine Funktionsgröße von 10 Pixeln verwendet.
      4. Klicken Sie auf das zweite Modul EnhanceOrSuppressFeatures , und passen Sie den Bereich der Bohrungsgrößen an, um die Verbesserung der Kernbereiche zu optimieren.
        HINWEIS: Für MCF-7-Zellen wurde ein Bereich von 5-20 verwendet.
      5. Klicken Sie auf das zweite Modul IdentifyPrimaryObjects , und passen Sie die Parameter (Schwellenwertstrategie, Schwellenwertmethode, Schwellenwertglättungsskala und Schwellenwertkorrekturfaktor) an, um die Identifizierung von Kernen zu optimieren. Klicken Sie auf ? von jedem Parameter, um optimale Einstellungen zu identifizieren und auf das Modul IdentifySecondaryObjects anzuwenden.
      6. Klicken Sie auf das Modul FilterObjects und passen Sie die Flächenform an. Wählen Sie ein minimales und maximales Pixel der zu identifizierenden Flächenform aus.
        HINWEIS: Für die MCF-7-Zellen wurden 100 und 500 für das Maximum bzw. Minimum verwendet. Der Prozess der Zellsegmentierung durch Identifizierung des Zellkerns und die Ausbreitung auf die Zellgrenzen wird von Walsh und Skala47 ausführlich erläutert.
    5. Verwenden Sie die Zellzytoplasmamasken, um die Fluoreszenzlebensdauer-Ausgangsvariablen für jede Zelle im Bild zu mitteln.

Figure 3
Abbildung 3: Identifizierung und Segmentierung einzelner Zellen. Das NAD(P)H-Intensitätsbild von MCF7-Zellen (A), das durch die Integration eines Fluoreszenzlebensdauerbildes erhalten wurde. Die Zellen wurden mit einer Anregung von 750 nm bei 5 mW für 60 s abgebildet. Die x- und y-Achsen stellen die Pixelposition des Bildes dar. (A) Einzelne Zellen wurden identifiziert. Die Zellen wurden maskiert (B), um Hintergrundgeräusche aus dem Datensatz zu entfernen. Der Zellkern wurde dann identifiziert (C) und auf die Zellmaske (D) projiziert. Die Zellen wurden dann gefiltert (E), um maskierte Bereiche zu entfernen, die nicht zur Größe typischer Zellen passen. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

5. Alternative Methode: Fluoreszenzintensitätsbildgebung

  1. Schalten Sie die Geräte ein, die während des Experiments verwendet werden.
    HINWEIS: Fluoreszenzintensitätsbilder können mit Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopen, konfokalen Fluoreszenzmikroskopen oder Multiphotonenmikroskopen aufgenommen werden.
    1. Stellen Sie sicher, dass das zu verwendende Mikroskop über eine geeignete Anregungsquelle für NAD(P)H (Einzelphotonenwellenlänge ~370-405 nm: Zwei-Photonen-Wellenlänge ~700-750 nm) und FAD (Einzelphotonenwellenlänge ~488 nm, Zwei-Photonen-Wellenlänge ~890 nm) verfügt.
    2. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop über einen Filter zur Isolierung der NAD(P)H-Emission (~400-500 nm) verfügt.
      HINWEIS: 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Einstellungen funktionieren oft für NAD(P)H.
    3. Stellen Sie sicher, dass das Mikroskop über einen Filter zur Isolierung der FAD-Emission (~ 500-600 nm) verfügt.
      HINWEIS: Die Einstellungen für grün fluoreszierendes Protein (GFP) funktionieren häufig für FAD.
  2. Bereiten Sie das Mikroskop vor.
    1. Schalten Sie die Hellfeldlampe ein. Stellen Sie sicher, dass Licht in das Okular gelangt. Tragen Sie bei Bedarf 1 Tropfen des entsprechenden Tauchmediums auf das entsprechende Objektiv auf.
    2. Bewegen Sie das Objektiv nach unten, um die Proben ohne Interferenzen richtig zu platzieren. Stellen Sie die Petrischale richtig auf die Bühne. Stellen Sie sicher, dass die Probe sicher ist und sich während der Bildgebung nicht bewegt.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Zellen in einer Umgebungskammer zu platzieren, um den Wärme-, Feuchtigkeits- und CO2-Gehalt während der Bildaufnahme aufrechtzuerhalten, da diese Parameter den Zellstoffwechsel beeinflussen können.
    3. Zentriere die Probe mit dem Objektiv. Sobald dies erledigt ist, schauen Sie in das Okular und bewegen Sie das Objektiv, bis die Zellen im Fokus zu sein scheinen.
  3. Beginnen Sie mit der Intensitätsbildgebung.
    1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware und stellen Sie die Anregungs- und Emissionskonfiguration so ein, dass NAD(P)H erfasst wird, indem Sie in der Bildaufnahmesoftware auf die Registerkarte Erfassung klicken und den NAD(P)H-Anregungs- und Emissionsfilter im Mikroskoprevolver positionieren.
      HINWEIS: Für die NAD(P)H-Bildgebung wurden ein 357/44-Anregungsfilter, ein dichroitischer 409-Langpass- und ein 447/60-Emissionsfilter verwendet.
    2. Optimieren Sie die Anregungsbeleuchtung und die Detektorparameter. Wenn das Bleichen ein Problem darstellt, reduzieren Sie die Beleuchtungsintensität und erhöhen Sie die Bildintegrationszeit.
      HINWEIS: NAD(P)H ist ein schwaches Signal; Achten Sie auf das Bleichen, wenn zu viel Strom verbraucht wird.
    3. Erfassen Sie ein NAD(P)H-Bild der gewünschten Bildgröße. Stellen Sie sicher, dass das Bild gespeichert ist.
    4. Stellen Sie die Anregungs- und Emissionskonfiguration ein, um FAD zu erfassen. Optimieren Sie die Anregungsbeleuchtung und die Detektorparameter.
      HINWEIS: Für die FAD-Bildgebung wurden ein 458/64-Anregungsfilter, ein 495-Longpass-dichroitischer und ein 550/88-Emissionsfilter verwendet.
    5. Erwerben Sie ein FAD-Bild. Stellen Sie sicher, dass das Bild gespeichert ist.
      HINWEIS: NAD(P)H- und FAD-Bilderfassungsparameter (Beleuchtungsintensität, Bildgröße, Detektorverstärkung) sollten während des gesamten Bildgebungsexperiments gleich bleiben.
    6. Wiederholen Sie den Vorgang an weiteren fünf Standorten, die mindestens 2 FOVs von den abgebildeten Positionen entfernt sind.
  4. Redox-Ratio-Datenanalyse auf Bildebene
    1. Öffnen Sie die NAD(P)H- und FAD-Intensitätsbilder in einem Bildverarbeitungsprogramm.
    2. Legen Sie einen Schwellenwert für die NAD(P)H fest, um Zytoplasmapixel beizubehalten, und legen Sie Hintergrund- und Kernpixel auf 0 fest.
    3. Berechnen Sie das Redoxverhältnisbild, indem Sie die Gleichung FAD/(NAD(P)H+FAD) an jedem Pixel mit dem geschwellenden NAD(P)H-Bild auswerten.
    4. Berechnen Sie den Mittelwert der Nicht-0-Pixel.
      HINWEIS: Diese Schritte können in Bildanalysesoftware ausgeführt oder direkt mit Skripten codiert werden.
  5. Analyse des Redoxverhältnisses auf Zellebene
    1. Führen Sie die Schritte 4.3.1-4.3.5 aus, um ein Maskenbild der Zellen in jedem NAD(P)H-Bild zu erhalten.
    2. Berechnen Sie das Redoxverhältnisbild, indem Sie die Gleichung FAD/(NAD(P)H+FAD) an jedem Pixel auswerten.
    3. Verwenden Sie die Zellzytoplasmamaske, um das Redoxverhältnis für alle Pixel für jede Zelle im Bild zu mitteln.

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Representative Results

Die epitheliale Brustkrebs-Zelllinie, MCF-7, wurde in DMEM kultiviert, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin. Für die Fluoreszenzbildgebung wurden die Zellen mit einer Dichte von 4 × 105 Zellen pro 35 mm Glasboden-Bildgebungsschale 48 h vor der Bildgebung ausgesät. Die Zellen wurden vor und nach der Cyanidbehandlung unter Verwendung der oben genannten Protokolle abgebildet. Ziel des Cyanidexperiments ist es, die spektrale Isolierung von NAD(P)H- und FAD-Fluoreszenz zu bestätigen und das Bildgebungssystem und das Analyseprotokoll zum Nachweis metabolischer Veränderungen in Zellen zu validieren. Gepaarte NAD(P)H- und FAD-Fluoreszenz-Lebenszeitbilder wurden an fünf verschiedenen Orten vor Cyanid und fünf verschiedenen Orten nach der Zugabe von Cyanid zum Medium aufgenommen. Fluoreszenzlebensdauerparameter (optisches Redoxverhältnis, NAD(P)H α 1, NAD(P)H τ1, NAD(P)H τ2, NAD(P)H τm, FAD τ1, FAD τ2, FAD α 1, FAD τ1, FAD τ2 und FAD τm) wurden unter Verwendung des gemessenen IRF aus Harnstoff berechnet (Abbildung 2) und über die Pixel des Zytoplasmas jeder Zelle, die für die Segmentierung verwendet wird, gemittelt (Abbildung 3).

Die Multiphotonenfluoreszenz-Lebensdauerbildgebung von NAD(P)H und FAD ermöglicht die Visualisierung der Zellmorphologie und des Zellstoffwechsels (Abbildung 4). Die hohe Auflösung, die mit der Multiphotonenmikroskopie erreicht wird, ermöglicht die Identifizierung einzelner Zellen. NAD(P)H und FAD befinden sich hauptsächlich in den Mitochondrien und im Zytoplasma, während der Kern, dem metabolische NAD(P)H und FAD fehlen, im Vergleich dunkel ist23,53. Die Lebensdauerbilder bieten eine Visualisierung der amplitudengewichteten Lebensdauer von NAD(P)H und FAD in der gesamten Zelle und als Ergebnis der Cyanidexposition (Abbildung 4).

Figure 4
Abbildung 4: Repräsentative Fluoreszenzlebensdauerbilder von MCF7-Zellen vor und nach der Cyanidbehandlung. (A) NAD(P)H-Amplitudengewichtetes Fluoreszenz-Lebensdauerbild und (B) FAD-Amplitudengewichtetes Fluoreszenz-Lebensdauerbild vor der Cyanidbehandlung. (C) NAD(P)H amplitudengewichtetes Fluoreszenz-Lebensdauerbild und (D) FAD-Amplitudengewichtetes Fluoreszenz-Lebensdauerbild nach Cyanidbehandlung. Die amplitudengewichtete Fluoreszenzlebensdauer (angezeigt durch den Farbbalken) misst die Zeit, für die sich ein Fluorophor, in diesen Fällen NAD(P)H und FAD, in einem angeregten Zustand befindet. Die Lebensdauer von NAD(P)H nimmt mit der Cyanidbehandlung ab, während die FAD-Lebensdauer nach der Cyanidbehandlung zunimmt. Das NADH-Signal wurde mit einer Anregung von 750 nm bei 5 mW für 60 s abgebildet, und das FAD-Signal wurde mit einer Anregung von 890 nm bei 7 mW für 60 s abgebildet. Bilder, die mit einem 40-fachen Wassertauchobjektiv aufgenommen wurden, numerische Blende = 1,1. Maßstabsleiste = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Cyanid hemmt den Komplex IV der Elektronentransportkette, der die oxidative Phosphorylierung hemmt2,15. Nach Cyanid-Exposition und vor dem Zelltod reichert sich NAD(P)H in den Mitochondrien an und FAD nimmt ab1,15. Aufgrund dieser wohldefinierten Veränderungen der NAD(P)H- und FAD-Intensität aufgrund der Cyanidhemmung des Stoffwechsels ist die Störung ein Standardtest zur Überprüfung der Autofluoreszenzbildgebungs- und Analyseprotokolle2,54. Erwartungsgemäß nahm das optische Redoxverhältnis (FAD/(FAD+NAD(P)H)) der MCF-7-Zellen nach der Cyanidbehandlung ab (Abbildung 5, p = 0,044, Welchs t-Test). Das optische Redoxverhältnis ist keine standardisierte Formel, dennoch haben sich alle Intensitätsformeln als gleichwertig erwiesen20. FAD/(NAD(P)H+FAD) wurde gewählt, um das optische Redoxverhältnis zu definieren, da die kombinierte Summe von NAD(P)H und FAD im Nenner einen normalisierten Wert zwischen 0 und 120,55 ergibt. Der gegenteilige Effekt - eine Erhöhung des optischen Redoxverhältnisses - wird für Cyanidstörungen mit optischen Redoxverhältnissen erwartet, die mit NAD (P) H im Zähler berechnet werden.

Figure 5
Abbildung 5: Das optische Redoxverhältnis von MCF7-Zellen nimmt mit der Cyanidbehandlung ab. Die Boxplots zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil, die aus den Zelldaten berechnet wurden. Der Mittelwert wird durch das schwarze Punktsymbol dargestellt, und der Median wird durch die schwarze Linie innerhalb des Feldes dargestellt. Die grauen Datenpunkte, die auf jedem Boxplot überlagert sind, stellen den gemittelten Wert aller Zytoplasmapixel in jeder Zelle dar. Die Kontrollgruppe bestand aus 91 Zellen aus fünf verschiedenen Bildern und die Cyanidgruppe aus 95 Zellen aus fünf verschiedenen Bildern. p < 0.01, Welchs t-Test. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die amplitudengewichtete NAD(P)H-Lebensdauer (τm) von MCF7-Zellen nahm mit der Cyanid-Exposition ab (Abbildung 6A, p < 2.2 × 10-16, Welchs t-Test). Sowohl die kurze als auch die lange Lebensdauer nahmen für NAD(P)H ab (Abbildung 6B,C), stiegen aber für NAD(P)H α 1 an (Abbildung 6D). Diese Änderungen der Fluoreszenzlebensdauer von NAD(P)H, die Abnahme der τm, die Zunahme der α 1 und die Abnahme der τ2 stimmten mit den veröffentlichten Werten der Cyanidstörungen überein40,56. Die Abnahme der amplitudengewichteten Fluoreszenzlebensdauer von NAD(P)H bei Cyanid-Exposition deutet auf eine erhöhte Abschreckung in der Mikroumgebung von NAD(P)H hin. Ein Anstieg der α 1 deutet auf mehr freies NAD(P)H hin, wie aus dem Anstieg von NAD(P)H aufgrund der Auswirkungen von Cyanid auf den Zellstoffwechsel erwartet21.

Figure 6
Abbildung 6: NAD(P)H-Fluoreszenzlebensdauer von MCF7-Zellen vor und nach der Cyanidbehandlung. Die Boxplots in den Panels A-D zeigen den Median sowie das erste und dritte Quartil, die aus den Daten auf Zellebene berechnet wurden. Der Mittelwert wird durch das schwarze Punktsymbol dargestellt, und der Median wird durch die schwarze Linie innerhalb des Feldes dargestellt. Die grauen Datenpunkte, die auf jedem Boxplot überlagert sind, stellen den gemittelten Wert aller Zytoplasmapixel innerhalb einer Zelle dar. Die Kontrollgruppe bestand aus 91 Zellen aus fünf verschiedenen Bildern und die Cyanidgruppe aus 95 Zellen aus fünf verschiedenen Bildern. (A-D) zeigen die Änderungen der amplitudengewichteten Lebensdauer (τm), der kurzen Lebensdauer von NAD(P)H (τ1), der langen Lebensdauer von NAD(P)H (τ2) und der NAD(P)H-proportionalen Komponente der kurzen Lebensdauer (α 1) aufgrund der Cyanidbehandlung. p-Werte wurden mit Welchs t-Test berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die amplitudengewichtete FAD-Lebensdauer (τm) von MCF7-Zellen nahm nach Cyanid-Exposition zu (Abbildung 7A, p = 3,688 × 10-12, Welchs t-Test). Sowohl die kurze als auch die lange Lebensdauer nahmen bei FAD zu (Abbildung 7B,C), nahmen aber für FAD α 1 ab (Abbildung 7D). Änderungen der FAD-Fluoreszenzlebensdauer, eine Zunahme von τm und τ2 und eine Abnahme der α 1 stimmen mit den veröffentlichten FAD-Fluoreszenzlebensdauerdaten der Cyanidstörung überein57. Die Veränderung der Lebenszeitwerte und der α 1 deutet auf metabolische Veränderungen innerhalb der Zellen hin, einschließlich einer erhöhten Menge an freiem FAD21.

Figure 7
Abbildung 7: Lebensdauer der FAD-Fluoreszenz vor und nach der Cyanidbehandlung. Die Boxplots in A-D zeigen den Median, das erste und dritte Quartil und den Mittelwert, die aus den Daten auf Zellebene berechnet wurden. Der Mittelwert wird durch das schwarze Punktsymbol dargestellt, und der Median wird durch die schwarze Linie innerhalb des Feldes dargestellt. Die grauen Datenpunkte, die auf jedem Boxplot überlagert sind, stellen den gemittelten Wert aller Zytoplasmapixel innerhalb einer Zelle dar. Die Kontrollgruppe bestand aus 91 Zellen aus fünf verschiedenen Bildern und die Cyanidgruppe aus 95 Zellen aus fünf verschiedenen Bildern. (A-D) zeigen die Änderungen der amplitudengewichteten FAD-Lebensdauer (τm), der kurzen FAD-Lebensdauer (τ1), der langen Lebensdauer der FAD (τ2) und der FAD-proportionalen Komponente der kurzen Lebensdauer (α 1) aus der Cyanidbehandlung. p-Werte wurden mit Welchs t-Test berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Die Autofluoreszenzintensität und die lebenslange Bildgebung wurden häufig zur Beurteilung des Stoffwechsels in Zellen eingesetzt21,55. FLIM ist hochauflösend und löst daher einzelne Zellen auf, was für Krebsstudien wichtig ist, da die zelluläre Heterogenität zur Tumoraggression und Arzneimittelresistenz beiträgt7,39,41,44,45,46,58. Ebenso ist die Autofluoreszenzbildgebung des Zellstoffwechsels nützlich für die Abbildung von Immunzellen, da die Funktion von Immunzellen mit dem Zellstoffwechsel verbunden ist und Immunzellpopulationen oft heterogen sind20,31. Biochemische Standardassays bewerten typischerweise Immunzellen auf Populationsebene oder erfordern eine intrazelluläre Markierung nach Zellpermeabilisierung34,59,60. Die Autofluoreszenzbildgebung eignet sich auch gut für hochauflösende In-vivo- und dynamische Messungen des Stoffwechsels aufgrund der zerstörungsfreien Natur des Lichts und des Fehlens chemischer oder genetisch kodierter Markierungen36,37,38,41,48,55 . Zu den kritischen Schritten für die Bildgebung der Fluoreszenzintensität und -lebensdauer von NAD(P)H und FAD gehören die Auswahl geeigneter Wellenlängen für Anregung und Emission, der Nachweis, dass die Zellen keine synthetischen oder zusätzlichen endogenen Fluorophore enthalten, die zur überlappenden Fluoreszenz beitragen, und die Verwendung unschädlicher Laserleistungen.

Die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD füllt eine einzigartige Nische als markierungsfreie, hochauflösende, quantitative metabolische Bildgebungstechnologie. Andere bildgebende Verfahren wie FDG-PET und MRS bilden den Gewebestoffwechsel ab, haben jedoch keine Auflösung auf zellulärer Ebene und können daher die zelluläre Heterogenität nicht bewerten. Andere biochemische Techniken, wie Sauerstoffverbrauchstests, Messungen von Metaboliten in den Medien oder Proteinanalysen, erfordern teure Einwegreagenzien, Messungen von gepoolten Zellen und erfordern zellzerstörende Protokolle, die Zeitverlaufsstudien oder In-vivo-Analysen verhindern61,62.

Während die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD hochauflösende Bilder auf markierungsfreie und zerstörungsfreie Weise liefert, müssen bei der Gestaltung und Interpretation von Experimenten einige Einschränkungen der Autofluoreszenzbildgebung berücksichtigt werden. FLIM erfordert spezielle und teure Geräte, die nicht weit verbreitet sind. Die FLIM-Anregung erfordert eine gepulste Anregungsquelle mit Pikosekunden- oder Femtosekundenpulsen mit einer Wiederholrate zwischen 40 und 100 MHz mit einer Ausgangsleistung > 50 mW63. Darüber hinaus ist die Bilderfassung relativ langsam, mit einem Kompromiss zwischen der Anzahl der Pixel oder der Bildauflösung und der Bildaufnahmezeit. Die in diesem Protokoll empfohlenen Parameter von 256 x 256 Pixeln und 60 s Integrationszeit liefern ein Bild mit angemessener Auflösung innerhalb von etwa 1 mi. Der Benutzer kann kleinere Bereiche mit weniger Pixeln abbilden oder Zeilenscans durchführen, um die Bildgebungsgeschwindigkeit zu verbessern.

Alternativ können Bilder mit höheren Pixeln mit erhöhten Bildintegrationszeiten aufgenommen werden. Die Datenanalyse und Interpretation von Autofluoreszenz-Lebenszeitbildern kann eine Herausforderung darstellen, da FLIM spezifische biophysikalische Informationen über die metabolischen Coenzyme und ihre molekulare Umgebung und nicht spezifische Stoffwechselwege liefert. Die optische Mikroskopie ist auch durch die Tiefe des Lichteindringens in das Gewebe aufgrund der Lichtstreuung und -absorption begrenzt. In-vivo-Studien können in Tiefen von ~ 0,5 mm mit Multiphotonen-Bildgebungssystemen von Oberflächengeweben oder durch Fensterkammern durchgeführt werden2,20,21,64,65.

Während NAD(P)H und FAD die primären endogenen Fluorophore in isolierten Zellen sind, können zusätzliche Moleküle, einschließlich Kollagen und Elastin, Autofluoreszenzsignale in Geweben beitragen. Die hochauflösenden Bilder der Multiphotonenmikroskopie ermöglichen die Visualisierung zellulärer und nichtzellulärer Kompartimente zur Segmentierung von NAD(P)H- und FAD-Pixeln aus den extrazellulären Proteinen40. Einige Zellen enthalten endogene Moleküle mit überlappender Fluoreszenz, wie Lipofuscin, Retinol, Tryptophan und Melanin66. Daher können Autofluoreszenzbilder von NAD(P)H und FAD Hintergrundbeiträge von anderen endogenen Molekülen enthalten.

Während NAD(P)H und FAD mit exogenen Fluorophoren gemultiplext werden können, die bei Wellenlängen über 600 nm emittieren, überschneiden sich exogene Markierungen wie DAPI oder genetisch kodierte Proteine wie GFP spektral mit der Autofluoreszenzbildgebung. Das hier beschriebene Cyanid-Störungsexperiment hilft zu überprüfen, ob die Anregungs- und Emissionswellenlängen NAD (P) H und FAD ausreichend isolieren, um metabolische Veränderungen in Zellen zu erfassen. Andere Zelltypen können auf dieses Protokoll angewendet werden; Der Benutzer sollte jedoch die Bildgebungsparameter, einschließlich Laserleistung und Bildintegrationszeit für jeden Zelltyp, optimieren und experimentieren, um Photobleichen zu verhindern. Photobleaching kann minimiert werden, indem die Photonenzählrate oder die durchschnittliche Fluoreszenzintensität während der Bildgebung für die Dauer des lebenslangen Scans überwacht wird. Eine Zunahme oder Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigt an, dass die Laserleistung zu hoch ist. Wenn Laserleistungen Photobleaching induzieren, kann die Leistung reduziert und die Gesamtbildaufnahme erhöht werden, um eine ausreichende Photonensammlung für die Lebensdaueranalyse zu erreichen.

Obwohl die Fluoreszenzlebensdauer unabhängig von Bildgebungsparametern ist, einschließlich Laserleistung und Detektorverstärkung, hängt die Fluoreszenzintensität von diesen Parametern ab20. Daher ist es bei der Autofluoreszenzbildgebung zur Quantifizierung des optischen Redoxverhältnisses wichtig, konsistente Bildgebungsparameter zu verwenden. Das Protokoll empfiehlt, dass 5-6 Bilder von verschiedenen FOVs von jeder experimentellen Gruppe aufgenommen werden. Diese Stichprobengröße liefert sowohl auf Bild- als auch auf Zellebene ausreichende Daten, um die erwarteten Unterschiede in den Fluoreszenzlebensdauerparametern von konfluenten MCF7-Zellen aufgrund der Cyanidstörung aufzulösen. Die optimale Anzahl der pro Gruppe aufgenommenen Bilder hängt vom experimentellen Design und der Effektgröße ab. Beim Umschalten zwischen NAD(P)H- und FAD-Bildern sollte die Fokusebene aus Konsistenzgründen an jeder Stelle gleich bleiben. Obwohl die lebenslange Bildgebung in der Regel keine sättigende Anzahl von Photonen aufweist, können Intensitätsbilder, die mit Kameras oder Photomultiplierröhren aufgenommen wurden, gesättigt sein. Pixelsättigung sollte vermieden werden, um sicherzustellen, dass der gesamte Bereich der physiologischen Intensitäten in den Bildern erfasst wird.

Bei der Analyse von Fluoreszenz-Lebensdauerbildern kann entweder eine gemessene IRF oder eine simulierte IRF verwendet werden. Der simulierte IRF wird anhand des Ergebnisses der fluoreszierenden Lebensdauerkurve geschätzt; Der vom System erhaltene reale IRF kann jedoch je nach System breiter sein und somit zu genaueren Lebensdauerwerten führen. Während sich der IRF in der Regel nur mit Hardware- oder Softwareänderungen ändert, ist eine tägliche IRF-Messung eine gute Praxis, um sicherzustellen, dass das Fluoreszenz-Lifetime-System wie erwartet funktioniert.

Insgesamt bietet die Autofluoreszenzbildgebung von NAD(P)H und FAD eine markierungsfreie, zerstörungsfreie Methode zur Abbildung und Analyse des Zellstoffwechsels auf Einzelzellebene. Diese Methode bietet einen schrittweisen Ansatz zur Validierung der Bildgebung von NAD (P) H und FAD unter Verwendung von Cyanid, um eine gut charakterisierte metabolische Störung in Zellen zu induzieren.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Zu den Finanzierungsquellen gehören das Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP200668) und die Texas A & M University. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-deoxy-d-glucose (2-DG) Sigma AC111980000; AC111980010; AC111980050; AC111980250
Antibiotic Antimicrobial (pen-strep) Gibco 15240096
Cell Samples American Type Culture Collection N/A MCF-7 cancer line
CellProfiler Broad Institute N/A Image analysis software
Conical Tube VWR 89039-664 15 mL conical tube
DMEM ThermoFisher 11965092 Culture media
FAD dichroic mirror Semrock FF495-Di03-25x36 495 nm
FAD emission filter Semrock FF01-550/88-25 550/88 nm
FAD excitation filter Semrock FF01-458/64-25 458/64 nm
FBS ThermoFisher 16000036
Fluorescence Lifetime Microscope 3i N/A
Glass bottom dish MatTek Corp P35G-1.0-14-C
Multiphoton Laser Coherent N/A 2P Coherent Laser, Tunable 680 nm-1080 nm
NAD(P)H dichroic mirror Semrock FF409-Di03-25x36 409 nm
NAD(P)H emission filter Semrock FF02-447/60-25 447/60 nm
NAD(P)H excitation filter Semrock FF01-357/44-25 357/44 nm
PBS ThermoFisher 70011044
Potassium Cyanide Sigma-Aldrich 380970
SlideBooks 6 3i N/A Image acquisition software
SPCImage Becker & Hickl GmbH N/A Fluorescence lifetime analysis software
Stage Top Incubator okoLab N/A
Trypsin Biosciences 786-262
Urea Sigma-Aldrich U5128
YG beads Polysciences 19096-2 Yg microspheres (20.0 µm)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Bioengineering Ausgabe 177 FLIM Stoffwechsel NAD(P)H FAD Fluoreszenz Mikroskopie
Autofluoreszenzbildgebung zur Beurteilung des Zellstoffwechsels
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Theodossiou, A., Hu, L., Wang, N., Nguyen, U., Walsh, A. J. Autofluorescence Imaging to Evaluate Cellular Metabolism. J. Vis. Exp. (177), e63282, doi:10.3791/63282 (2021).

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