Summary
该协议概述了一种从现场天然底物中有效提取活线虫的方法。
Abstract
除了是强大的实验模式生物外， 秀丽隐杆线虫 及其亲戚也是生活在自然界中的真实动物。研究野生线虫在自然环境中对于理解生物学的许多方面都很有价值，包括独特的基因组和表型特征进化的选择性制度，复杂性状变异的遗传基础以及所有动物种群的基本自然遗传多样性。这份手稿描述了一种从其天然基质中提取线虫的简单而有效的方法，包括腐烂的水果，花朵，真菌，落叶和土壤。Baermann漏斗法是一种经典的线虫学技术，可选择性地将活性线虫与其底物分离出来。由于Baermann漏斗技术可以从样品中回收几乎所有的活性蠕虫，因此可以回收与丰富且快速生长的基因型同时发生的稀有和缓慢生长的基因型，这在涉及多代繁殖的提取方法中可能会被遗漏。该技术也非常适合解决元遗传，种群遗传和生态问题。它同时在样本中捕获整个群体，允许对年龄，性别和基因型的自然分布进行公正的观察。该协议允许在现场大规模部署，快速将底物转化为蠕虫板，作者已经通过在多个大洲的实地考察对其进行了验证。
Introduction
随着在实验室中研究秀丽隐杆线虫 的研究人员将他们的重点扩展到野生秀 丽隐杆线虫 和相关横纹线虫，有价值的生物学见解正在出现。对野生线虫的研究将基因和基因组置于其自然环境中，揭示了可能被实验室条件掩盖的功能1，2，3，4，5。这些研究揭示了进化本身的先决条件，即遗传变异6，7，8，9，10。野生样本捕获的自然遗传变异也为许多复杂性状的遗传基础提供了途径11，12，13。
在设计需要隔离线虫自然种群的研究时，特别是在进行远程野外工作时，实际考虑因素脱颖而出。该协议旨在将可在OP50上培养的整个活性线虫种群与诱饵或野生基质干净地隔离开来。该方法非常适合提取自由生活的横纹线虫和双星线虫，包括 Caenorhabditis， Oscheius和 Pristionchus。
有许多技术可以将线虫与其基质隔离14，15。最基本的方法是将基质直接放在线虫介质板上，在动物爬出时挑选它们8，15。如果目标是从样品中分离出所有线虫，则该方法需要大量的时间和人力。更复杂的技术利用了动物的体重，大小，移动性或这些的某种组合14。每种方法在设置和吞吐量方面都有其优点和缺点。它们在采样偏差方面也不同，如果样品中的动物沿着方法分离原理的轴线变化，则可以选择某些线虫。
Baermann漏斗方法于1917年由荷兰医生G. K. T. F. Baermann首次描述，他在研究土壤中居住的线虫（包括寄生钩虫）时在Java上发明了该装置16。贝尔曼漏斗基于移动性原理发挥作用。将基材放置在衬有布或纸质过滤器的漏斗中（本研究使用"Kimwipe"，在当前方案中称为"无绒擦拭"），并在底部密封关闭。然后，漏斗充满水，浸没样品，同时过滤器将其与密封的出口分开。样品中的活性线虫将自己释放到水中并通过过滤器游动，最终沉降在漏斗的底部。打开漏斗出口，并将一滴线虫排出到板上（图1）。
图1：Baermann漏斗技术摘要 （A）从感兴趣的部位收集富含细菌的样品。（B）将样品浸入Baermann漏斗中，等待蠕虫扭动并下沉。（C） 从漏斗中释放一滴。（D）将单个雌雄同体或交配的雌性移动到单独的板块。插图由Ramin Rahni创作。 请点击此处查看此图的放大版本。
Baermann漏斗不适用于每种线虫（参见讨论部分了解具体的替代方案），并且最适合那些在Caenorhabditis或较小大小范围内的活性形式14。但是，如果研究可以使用Baermann漏斗，则有很多优点。该方法在现场是可行的，需要有限的设置，动手时间和成本。研究人员留下干净的样品，没有板上基质的障碍物，这使得拣选变得容易。使用过滤器还可以防止昆虫幼虫或螨虫污染板，这些幼虫或螨虫会咀嚼板或捕食样品中的线虫。最重要的是，Baermann漏斗有效地从底物中提取几乎整个群体14，根据研究的设计，这可能是必需的。例如，对计算野生种群的阶段或性别分布，发现生长缓慢或稀有的基因型或对未被OP50吸引的线虫进行采样感兴趣的研究人员可能会从这种方法中受益。这适用于研究生态17，群体遗传18或元遗传学19问题的研究人员，因为采样方案在采样时拍摄了种群的快照。
本手稿描述了使用Baermann漏斗分离线虫种群并在现场建立异方体和等雌雄同体线虫群的完整方案，使用为便于运输而选择的设备。对于在实验室附近进行实地考察的研究人员来说，可以省略或简化其中的许多步骤。
Protocol
1. 在田间制备种子NGM板
- 旅行前，称取 23.005 克线虫生长培养基 （NGM）粉末（见 材料表），并预先装在可密封的塑料袋中。为每升所需介质制作一个袋子。
注：旅行前预先包装，无需在现场进行功能平衡。 - 旅行前，为每升所需培养基准备 1 mL 1M MgSO4、1 mL 1M CaCl2 和 25 mL 1M 磷酸钾缓冲液。要制作1L磷酸钾缓冲液，请将108.3gKH2PO4和35.6gK2HPO4溶解在水中，如WormBook20中所述。
- 在旅行之前，按照WormBook20中所述，在37°C的LB中生长OP50（见材料表）进行过夜培养。将培养物等分到50mL锥形管中，并用石蜡膜包裹顶部以防止泄漏。
- 在现场，将NGM包的内容物溶解到973毫升双蒸馏水（ddH20）或1升烧瓶或瓶中最纯净，最无菌的水中。
- 将带有松散盖子或铝箔盖的培养基瓶或瓶子放在热板或炉子上的沸腾热水浴中。偶尔搅拌，直到所有粉末溶解并变清（这需要约30分钟）。
注意：如果有磁性热板可用，搅拌棒是限制手动搅拌量的绝佳选择。 - 从水浴中取出介质，冷却至~58°C，偶尔摇晃或搅拌棒。一旦培养基冷却至58°C，使用血清学或标准移液管加入25mL磷酸钾缓冲液，1mL1M MgSO4和1mL1M CaCl2，在每个步骤之间充分混合。
- 在最无菌的环境中，将培养基移液或倒入所需尺寸的板中，并冷却并固化过夜。为每个底物样品倒入一个60 mm板（约10 mL）。为每条等离子管路倒入一块35毫米板（~3.5毫升）;所需的小板的数量很难提前预测。
- 将50μL OP50培养物移入每个板上，并在使用前使其干燥并生长过夜。
2. 线虫基质的收集
- 在现场识别富含细菌的底物。一些例子包括腐烂的水果，花朵，真菌和草本植物的茎。土壤和落叶也是合适的，尽管它们很少含有 Caenorhabditis。
- 用戴手套的手，将该基质的样品（1-15 cm3）放入标有唯一样品ID的可密封塑料袋（见 材料表）中（图1A）。
- 记录样品ID，纬度，经度，日期，底物的描述以及与实验相关的任何其他局部环境测量，包括环境和底物温度，收集时间，底物状况，底物相关大型无脊椎动物的存在等。智能手机应用程序可用于简化此过程21。
3. 准备一系列贝尔曼漏斗
- 对于每个漏斗，使用剪刀切割一段长约3厘米的橡胶管（见 材料表）。
- 将管段安装在塑料漏斗的末端（请参见 材料表）。这可能需要一些努力，因为配合非常紧密。
- 将卡套管夹滑过橡胶管并将其夹紧。
- 要制作漏斗架，请使用手术刀在纸板飞瓶托盘（见 材料表）的底部切割直径为35毫米的圆孔，该托盘尚未从其平坦的运输方向折叠在一起。标准托盘可容纳 3 x 4 阵列中的 12 个此类孔。
- 倒置纸板，将侧面向下折叠一次（而不是两次，就像制作飞瓶托盘那样），然后将侧面粘在一起以抬高倒置的纸板托盘（图2）。
- 在孔中放置漏斗，首先确保卡套管夹处于关闭位置。
图 2：重新利用的纸板飞碟托盘，折叠和切割以支撑每个 12 个 Baermann 漏斗。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 将样品转移到漏斗中
- 将水（尽可能无菌）倒入每个漏斗中，将其填充到边缘以下约3厘米处。如果气泡被困在管道中，请点击漏斗以释放它们。
- 用戴手套的手，在漏斗上放一个不起毛的湿巾或特别是一个Kimwipe（折叠成两半做成一个正方形），然后向下按压中心，使其浸入水中。
- 手动将大型固体天然基质（水果，花朵，土壤，落叶等）破碎成较小的碎片，以最大限度地减少蠕虫必须从基质中脱落的距离。
注意：落叶和形状笨拙的样品可以在食品加工机或搅拌机中进行预处理。 - 将天然基质（1-15 cm3）样品轻轻地放在漏斗中的组织/无绒擦拭布上，而不刺穿组织，也不要样品突出边缘上方。
- 在漏斗或漏斗旁边的纸板上贴上标签，并使用与现场收集注释相对应的样品 ID。
- 将组织的角/无绒擦拭布折叠在样品上（图1B）。小心将样品保持在组织/无绒擦拭内，以免污垢或碎屑进入漏斗底部。
注意：此步骤是为了防止角落覆盖在漏斗的边缘，在那里它们会从漏斗中排出两侧的水。 - 用手、刮刀或移液器吸头，挑出任何活跃的昆虫、千足虫或其他动物，这些动物可能从一个漏斗移动到另一个漏斗，交叉污染样品。将组织/无绒擦拭巾完全包裹在样品周围，或在样品顶部放置第二个组织，以防止交叉污染。
- 向漏斗中加入更多的水，使整个样品被淹没（图3）。
图 3：组装好的贝尔曼漏斗。 将每个样品包裹在无组织/无绒擦拭物中，并浸没在漏斗中的水下，漏斗被夹紧。在约12小时的时间内，线虫将通过组织迁移到漏斗的底部。 请点击此处查看此图的放大版本。
5. 从漏斗中提取线虫
- 等待约12小时或过夜。在此期间，活跃的蠕虫会从基质中蠕动出来，通过组织/无绒擦拭物，并下降到夹紧漏斗的底部。
注意：等待时间超过12小时有蠕虫死亡的风险，因为缺氧或致病性感染，对于特别拥挤蠕虫和细菌的样品，在较短的持续时间内也可能是一种风险。 - 将漏斗的样品ID写在60毫米NGM蠕虫板的底部，该虫板接种了OP50 大肠杆菌 的斑点。从盘子上取下盖子。
- 从漏斗支架中取出包含该样品的漏斗。用一只手将漏斗直立在打开的蜗杆板上方，另一只手释放管夹上的压力，让一滴水从管子落到蜗杆板上（图1C）。一旦水从漏斗中滴落，请迅速将其再次夹紧，以防止淹没NGM板。
注意：要选择被OP50吸引的蠕虫，包括 Caenorhabditis 物种，请从细菌草坪上释放液滴。当水渗入板中或蒸发时， 线 虫会爬进细菌草坪。 - 清理：丢弃漏斗的内容。用热水清洗漏斗，以便随后重复使用。
6. 建立文化
- 在立体显微镜下以5x-50x的放大倍率观察孤立的线虫。板应包括线虫，并且在低得多的频率下，小寡毛纲动物annelyids，缓步动物，轮虫和小型甲壳类动物（图4）。
注意：如果漏斗设置正确，则没有螨虫，昆虫或可见的非生物物质会通过漏斗。
图 4：从 Baermann 漏斗释放到 NGM 板上的第一个液滴的内容。请单击此处查看此图的放大图。
- 要建立等雌雄同体或异雌雄同体系，使用蠕虫镐将每个L4雌雄同体或交配的成年雌性（通过其较大的体型和缺乏独特的雄性尾巴22可识别）转移到带有OP50播种的单独的35 mm NGM板中（图1D）。在转移蠕虫之前和之后，使用打火机对蠕虫进行消毒。
- 使用石蜡膜彻底包裹板材以方便旅行。
Representative Results
该协议用于在2018年8月在史密森尼热带研究所野外站从巴拿马巴罗科罗拉多岛的水果，花卉，真菌，土壤和茎中分离线虫。在一名研究人员在四天内处理的131个底物中，有130个底物（99.2%）产生了线虫。44个底物（33.6%）产生 线虫Caenorhabditis （图5）。随后通过PCR和交配试验对从这44个底物建立的培养物进行分析23，揭示了六种不同的 Caenorhabditis 物种的存在 - C. becei， C. tropicalis， C. briggsae， C. sp. 24， C. sp. 57和 C. panamensis。
该协议在2019年8月的四天内再次用于从乌克兰切尔诺贝利禁区的各种基质中分离线虫。从63个土壤样本中的62个，17个无脊椎动物样本中的1个，75个水果样本中的31个，12个诱饵样本中的1个（见讨论部分）中回收活蠕虫，并且没有从蘑菇，河簧或狼粪样本中回收蠕虫（每个样本收集一个样本）。随后对18S核糖体DNA15 的测序将这些线虫鉴定为 Oscheius， Panagrolaimus， Acrobeloides， Mesorhabditis， Panagrellus， Pristionchus和 Pelodera，但没有发现 Caenorhabditis （图5）。
图 5：两次收集旅行的成功率。 2018年的巴拿马（左）和2019年的乌克兰（右）。 请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
这种方法的核心原理是线虫会穿过淹没在水中的组织，而它们的底物和较大的无脊椎动物污染物则不会。该协议的关键步骤是（1）收集适当的基质，（2）将基质浸没在过滤材料中，（3）收集通过过滤器并沉入水底的蠕虫，以及（4）隔离单个蠕虫以产生异方体或异雌雄同体线。该方法的所有其他部分都可以根据可用资源，基质的性质或实地工作目标进行必要的修改。一些值得考虑的修改如下。
通过种植水果来诱捕蠕虫
如果在野外没有充足的富含细菌的腐烂材料，人们可能希望携带样品，如一块苹果或西红柿，任其腐烂。用几个木桩将诱饵固定好，这样较大的动物就不会将它们移走，这样以后可以很容易地找到它进行收集。避免阳光直射，因为诱饵在腐烂之前可能会变干。
用任何可用的材料构建漏斗装置
任何具有足够大的孔以容纳卡套管并足够稳定以支撑头重脚轻的漏斗的结构都可以工作。对于单个漏斗，水杯是合适的支架。可以使用任何类型的纸巾 - 面巾纸，卫生纸或纸巾。
减少漏斗中的材料，或调整等待时间，以防止缺氧或感染
如果样品中含有非常高浓度的蠕虫或细菌，线虫可能会在12小时孵育完成之前开始死于缺氧或感染。如果这是一个问题，研究人员可以更早地检查漏斗，或者用高度填充的底物的非常小的子样本准备一个额外的漏斗。
根据实验需求和约束调整NGM板制备
NGM板可以用适合实验的任何介质和食物来源制备。上述现场协议旨在最大限度地减少行李重量。根据行李限制和现场工作时间，携带已经浇注的NGM板 - 无论是在实验室中制备还是在商业上购买 - 可能比在现场浇注板更可取。
在实验室中执行漏斗隔离
该协议描述了在野外条件下执行完整的程序，以捕获自然界中发生的线虫种群。对于某些研究目标，在将样品装在密封袋中返回实验室后，稍后分离线虫可能就足够了。即便如此，贝尔曼漏斗法也提供了比其他分离方法更干净、更完整的存活线虫样本。然而，密封袋中的样品在旅行过程中可能会被选中，因为它们暴露在潜在的极端温度和缺氧中。通过在样品收集后尽快进行隔离，可以最大限度地减少这种情况。
Baermann漏斗的常见替代方法是将底物直接放在NGM板上并等待蠕虫爬出，这要么是高度劳动密集型的，要么导致种群的收集不完整。它还会产生被螨虫和昆虫幼虫污染的板块。Baermann漏斗法是一种低成本、低技术、低劳动力的策略，用于快速将整个活性蠕虫种群与其基质分离。
Baermann漏斗方法并不普遍适用于收集所有类型的野生线虫。一些植物性线虫需要超过12小时的时间才能从其基质中出来，并且过早释放的液滴中会消失，而一些昆虫寄生虫会爬到漏斗的顶部而不是底部，也逃避收集14。Baermann漏斗的替代品要么需要更专业的设备，要么需要更多的劳动力来恢复蠕虫。但是，如果上述警告是实验的问题，则它们可能仍然是首选。van Bezooijen14审查的替代选择包括漏斗喷雾方法，该方法为漏斗提供恒定的水雾，添加氧气并允许悬浮液中的细菌溢出。这允许从植物中更延长线虫的提取期。搅拌机离心浮选法通过按比重分离缓慢移动、非活动或向上爬行的线虫来回收它们，Oostenbrink洗脱器应用暗流将沉降沉积物与悬浮线虫分离，Cobb的方法使用一系列筛子通过其大小、形状和沉降率来分离线虫14。然而，为了收集横纹肌，Baermann漏斗有效地快速，轻松地生产出干净的样品。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH拨款R35GM141906和R21ES031364以及Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 - vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 - worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 - part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 - worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 - part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 - a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 - worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 - for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 - to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 - to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 - filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 - for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 - sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 - worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 - worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 - pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 - worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 - cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 - cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 - tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 - part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 - for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 - to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. Methods and techniques for nematology. , Wageningen University. (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , wormbook.1.115.2 (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T.
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
