Summary
यह प्रोटोकॉल क्षेत्र में प्राकृतिक सब्सट्रेट से लाइव नेमाटोड को कुशलतापूर्वक निकालने के लिए एक विधि की रूपरेखा तैयार करता है।
Abstract
मजबूत प्रयोगात्मक मॉडल जीव होने से परे, Caenorhabditis elegans और इसके रिश्तेदार भी वास्तविक जानवर हैं जो प्रकृति में रहते हैं। उनके प्राकृतिक वातावरण में जंगली नेमाटोड का अध्ययन जीव विज्ञान के कई पहलुओं को समझने के लिए मूल्यवान है, जिसमें चयनात्मक शासन शामिल हैं जिनमें विशिष्ट जीनोमिक और फेनोटाइपिक पात्र विकसित होते हैं, जटिल विशेषता भिन्नता के लिए आनुवंशिक आधार, और सभी जानवरों की आबादी के लिए मौलिक प्राकृतिक आनुवंशिक विविधता। यह पांडुलिपि अपने प्राकृतिक सब्सट्रेट से नेमाटोड निकालने के लिए एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करती है, जिसमें सड़ने वाले फल, फूल, कवक, पत्ती कूड़े और मिट्टी शामिल हैं। बेयरमैन फ़नल विधि, एक शास्त्रीय नेमेटोलॉजी तकनीक, चुनिंदा रूप से सक्रिय नेमाटोड को उनके सब्सट्रेट से अलग करती है। क्योंकि यह नमूने से लगभग सभी सक्रिय कीड़े को ठीक करता है, बेयरमैन फ़नल तकनीक दुर्लभ और धीमी गति से बढ़ते जीनोटाइप की वसूली के लिए अनुमति देती है जो प्रचुर मात्रा में और तेजी से बढ़ते जीनोटाइप के साथ सह-घटित होती है, जिसे निष्कर्षण विधियों में याद किया जा सकता है जिसमें प्रजनन की कई पीढ़ियां शामिल होती हैं। तकनीक मेटाजेनेटिक, जनसंख्या-आनुवंशिक और पारिस्थितिक प्रश्नों को संबोधित करने के लिए भी अच्छी तरह से अनुकूल है। यह एक साथ एक नमूने में पूरी आबादी को कैप्चर करता है, जिससे उम्र, लिंगों और जीनोटाइप के प्राकृतिक वितरण का एक निष्पक्ष दृश्य होता है। प्रोटोकॉल क्षेत्र में पैमाने पर तैनाती के लिए अनुमति देता है, तेजी से सब्सट्रेट को वर्म प्लेटों में परिवर्तित करता है, और लेखकों ने इसे कई महाद्वीपों पर फील्डवर्क के माध्यम से मान्य किया है।
Introduction
मूल्यवान जैविक अंतर्दृष्टि शोधकर्ताओं के रूप में उभर रही है जो प्रयोगशाला में सी एलिगन्स का अध्ययन करते हैं, वे जंगली में सी एलिगन्स और संबंधित रैबडिटिड नेमाटोड पर अपना ध्यान केंद्रित करते हैं। जंगली नेमाटोड के अध्ययन जीन और जीनोम को अपने प्राकृतिक संदर्भ में रखते हैं, जिससे प्रयोगशाला की स्थिति 1,2,3,4,5 द्वारा संभावित रूप से अस्पष्ट कार्यों का खुलासा होता है। ये अध्ययन विकास के लिए पूर्वशर्त में अंतर्दृष्टि उत्पन्न करते हैं, आनुवंशिक भिन्नता 6,7,8,9,10। जंगली नमूनों द्वारा कैप्चर की गई प्राकृतिक आनुवंशिक भिन्नता भी कई जटिल लक्षणों के आनुवंशिक आधार में प्रवेश प्रदान करती है11,12,13।
उन अध्ययनों को डिजाइन करते समय जिन्हें नेमाटोड की प्राकृतिक आबादी के अलगाव की आवश्यकता होती है, खासकर जब दूरस्थ फील्डवर्क करते हैं, तो व्यावहारिक विचार सामने आते हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य सक्रिय नेमाटोड की पूरी आबादी को साफ-साफ अलग करना है जिसे चारा या जंगली सब्सट्रेट से OP50 पर सुसंस्कृत किया जा सकता है। विधि अच्छी तरह से मुक्त रहने वाले rhabditid और diplogasterid सूत्रकृमि, Caenorhabditis, Oscheius, और Pristionchus सहित निकालने के लिए उपयुक्त है।
उनके substrates14,15 से सूत्रकृमि को अलग करने के लिए कई तकनीकें हैं। सबसे बुनियादी दृष्टिकोण सब्सट्रेट को सीधे सूत्रकृमि-मध्यम प्लेट पर रखना है, जानवरों को चुनना क्योंकि वे 8,15 से बाहर निकलते हैं। इस विधि को बड़ी मात्रा में समय और श्रम की आवश्यकता होती है यदि लक्ष्य एक नमूने से सभी नेमाटोड को अलग करना है। अधिक परिष्कृत तकनीकें जानवरों के वजन, आकार, गतिशीलता, या इन 14 के कुछ संयोजन का लाभ उठाती हैं। सेटअप और थ्रूपुट के संदर्भ में प्रत्येक विधि के अपने फायदे और नुकसान हैं। वे अपने नमूना पूर्वाग्रहों में भी भिन्न होते हैं और कुछ नेमाटोड के लिए चयन कर सकते हैं यदि नमूने में जानवर विधि के अलगाव सिद्धांत की धुरी के साथ भिन्न होते हैं।
बेयरमैन फ़नल विधि को पहली बार 1917 में डच चिकित्सक जी. के. टी. एफ. बेयरमैन द्वारा वर्णित किया गया था, जिन्होंने परजीवी हुकवर्म 16 सहित मिट्टी में रहने वाले नेमाटोड का अध्ययन करते समय जावा पर डिवाइस का आविष्कार किया था। Baermann फ़नल गतिशीलता के सिद्धांत पर आधारित कार्य करता है। सब्सट्रेट को एक कपड़े या पेपर फिल्टर के साथ पंक्तिबद्ध एक फ़नल में रखा जाता है (इस अध्ययन के लिए एक "किमविप" का उपयोग किया जाता है, जिसे वर्तमान प्रोटोकॉल में "लिंट-फ्री वाइप" के रूप में संदर्भित किया जाता है) और नीचे बंद कर दिया जाता है। फ़नल तब पानी से भर जाता है, नमूने को डुबो देता है जबकि फ़िल्टर इसे सील किए गए आउटलेट से अलग करता है। नमूने में सक्रिय नेमाटोड खुद को पानी में छोड़ देते हैं और फिल्टर के माध्यम से तैरते हैं, अंततः फ़नल के तल पर बस जाते हैं। फ़नल आउटलेट खोला जाता है, और नेमाटोड की एक बूंद को एक प्लेट पर निष्कासित कर दिया जाता है (चित्रा 1)।
चित्रा 1: बेयरमैन फ़नल तकनीक का सारांश( A) ब्याज की साइट से एक बैक्टीरिया युक्त नमूना एकत्र करना। (बी) एक Baermann फ़नल में नमूने को डुबोना और कीड़े बाहर wriggle और सिंक के लिए इंतज़ार कर रहा है. (C) फ़नल से एक बूंद जारी करना। (d) एकल उभयलिंगी या संभोग ति मादाओं को अलग-अलग प्लेटों में ले जाना। रामिन रहनी द्वारा बनाया गया चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Baermann फ़नल हर प्रकार के सूत्रकृमि के लिए काम नहीं करेगा (विशिष्ट विकल्पों के लिए चर्चा अनुभाग देखें) और उन लोगों के लिए सबसे उपयुक्त है जो केनोरहाबडिटिस या छोटे 14 के आकार की सीमा में सक्रिय रूप हैं। हालांकि, यदि कोई अध्ययन बेयरमैन फ़नल का उपयोग कर सकता है, तो कई फायदे हैं। विधि क्षेत्र में व्यावहारिक है, जिसमें सीमित सेटअप, हाथों पर समय और लागत की आवश्यकता होती है। शोधकर्ता को प्लेट पर सब्सट्रेट की बाधा के बिना एक साफ नमूने के साथ छोड़ दिया जाता है, जो चुनना आसान बनाता है। एक फिल्टर का उपयोग करने से कीट लार्वा या घुन द्वारा प्लेट के संदूषण को भी रोका जाता है, जो नमूने में प्लेटों को चबाते हैं या नेमाटोड पर शिकार करते हैं। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि बेयरमैन फ़नल कुशलतापूर्वक सब्सट्रेट 14 से लगभग पूरी आबादी को निकालता है, जो अध्ययन के डिजाइन के आधार पर आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, जंगली आबादी के चरण या लिंग वितरण की गिनती करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं, धीमी गति से बढ़ते या दुर्लभ जीनोटाइप खोजने, या ओपी 50 के लिए आकर्षित नहीं होने वाले नेमाटोड का नमूना लेना इस विधि से लाभान्वित हो सकता है। यह पारिस्थितिक 17, जनसंख्या आनुवंशिक 18, या मेटाजेनेटिक 19 प्रश्नों का अध्ययन करने वाले शोधकर्ताओं के लिए उपयुक्त है क्योंकि नमूना योजना नमूना समय पर आबादी का एक स्नैपशॉट लेती है।
वर्तमान पांडुलिपि बेयरमैन फ़नल का उपयोग करके नेमाटोड की आबादी को अलग करने और क्षेत्र में आइसोफेमेल और आइसोहेर्माफ्रोडाइट लाइनों की स्थापना के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, आसान परिवहन के लिए चुने गए उपकरणों का उपयोग करके। अपनी प्रयोगशालाओं के पास फील्डवर्क करने वाले शोधकर्ताओं के लिए, इनमें से कई चरणों को छोड़ा या सरलीकृत किया जा सकता है।
Protocol
1. क्षेत्र में बीज एनजीएम प्लेटों की तैयारी
- यात्रा से पहले, 23.005 ग्राम नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) का वजन करें ( सामग्री की तालिका देखें) पाउडर और एक सील करने योग्य प्लास्टिक बैग में प्री-पैक करें। वांछित मीडिया के प्रत्येक लीटर के लिए एक बैग बनाओ।
नोट:: पूर्व पैकेजिंग यात्रा से पहले क्षेत्र में एक कार्यात्मक संतुलन की आवश्यकता को बाईपास करता है। - यात्रा करने से पहले, वांछित मीडिया के प्रत्येक लीटर के लिए 1M MgSO4 का 1 mL, 1M CaCl2 का 1 mL, और 1M पोटेशियम फॉस्फेट बफर का 25 mL तैयार करें। पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 1 एल बनाने के लिए, 108.3 ग्राम KH2PO4 और K2HPO4 के 35.6 ग्राम को पानी में भंग करें, जैसा कि WormBook20 में वर्णित है।
- यात्रा से पहले, OP50 की एक रात भर की संस्कृति बनाएं ( सामग्री की तालिका देखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी में उगाया जाता है, जैसा कि वर्मबुक 20 में वर्णित है। 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में संस्कृति को एलीकोट करें और रिसाव को रोकने के लिए पैराफिन फिल्म के साथ सबसे ऊपर लपेटें।
- क्षेत्र में, एनजीएम पैकेट की सामग्री को 973 मिलीलीटर डबल-आसुत पानी (डीडीएच 20) या 1 एल फ्लास्क या बोतल में उपलब्ध सबसे शुद्ध, सबसे बाँझ पानी में भंग करें।
- मीडिया फ्लास्क या बोतल, एक ढीली टोपी या एल्यूमीनियम पन्नी कवर के साथ, एक गर्म प्लेट या स्टोव पर एक उबलते गर्म पानी के स्नान में रखें। कभी-कभी हिलाएं जब तक कि सभी पाउडर भंग न हो जाएं और स्पष्ट न हो जाएं (इसमें ~ 30 मिनट लगते हैं)।
नोट: यदि एक चुंबकीय गर्म प्लेट उपलब्ध है, तो मैन्युअल सरगर्मी की मात्रा को सीमित करने के लिए एक हलचल पट्टी एक उत्कृष्ट विकल्प है। - पानी के स्नान से मीडिया को निकालें और कभी-कभी हिलाने के साथ या हलचल बार के साथ ~ 58 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। एक बार जब मीडिया को 58 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा कर दिया जाता है, तो 1M पोटेशियम फॉस्फेट बफर के 25 mL, 1M MgSO4 के 1 mL, और 1M CaCl2 के 1 mL जोड़ने के लिए सीरोलॉजिकल या मानक पिपेट्स का उपयोग करें, प्रत्येक चरण के बीच अच्छी तरह से मिश्रण करें।
- उपलब्ध सबसे बाँझ वातावरण में, पिपेट या वांछित आकार की प्लेटों में मीडिया डालना और रात भर ठंडा और ठोस करने की अनुमति देता है। प्रत्येक सब्सट्रेट नमूने के लिए एक 60 मिमी प्लेट (~ 10 मिलीलीटर) डालें। प्रत्येक आइसोफेमेल लाइन के लिए एक 35 मिमी प्लेट (~ 3.5 एमएल) डालें; आवश्यक छोटी प्लेटों की संख्या पहले से भविष्यवाणी करना मुश्किल है।
- प्रत्येक प्लेट पर OP50 संस्कृति के पिपेट 50 μL और इसे सूखने और उपयोग से पहले रात भर बढ़ने की अनुमति देते हैं।
2. सूत्रकृमि substrates का संग्रह
- क्षेत्र में एक बैक्टीरिया युक्त सब्सट्रेट की पहचान करें। कुछ उदाहरणों में सड़ने वाले फल, फूल, कवक और जड़ी-बूटियों के पौधों के तने शामिल हैं। मिट्टी और पत्ती के कूड़े भी उपयुक्त हैं, हालांकि उनमें शायद ही कभी केनोरहाबिडिटिस होता है।
- एक gloved हाथ के साथ, इस सब्सट्रेट (1-15 सेमी 3) का एक नमूना एक सील करने योग्य प्लास्टिक बैग में रखें ( सामग्री की तालिका देखें) एक अद्वितीय नमूना आईडी (चित्रा 1 ए) के साथ लेबल किया गया है।
- नमूना आईडी, अक्षांश, देशांतर, तिथि, सब्सट्रेट का विवरण, और प्रयोग के लिए प्रासंगिक किसी भी अन्य स्थानीय पर्यावरणीय माप को रिकॉर्ड करें, जिसमें परिवेश और सब्सट्रेट तापमान, संग्रह का समय, सब्सट्रेट की स्थिति, सब्सट्रेट से जुड़े मैक्रोइंशेरुकी की उपस्थिति, और इसी तरह शामिल हैं। इस प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करने के लिए एक स्मार्टफोन ऐप उपलब्ध है21।
3. Baermann फ़नल की एक सरणी की तैयारी
- प्रत्येक फ़नल के लिए, रबर टयूबिंग के एक खंड को काटने के लिए कैंची का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) ~ 3 सेमी लंबा।
- एक प्लास्टिक फ़नल के अंत में टयूबिंग सेगमेंट को फिट करें ( सामग्री की तालिका देखें)। यह कुछ प्रयास ले सकता है क्योंकि फिट बहुत तंग है।
- रबर टयूबिंग पर एक टयूबिंग क्लैंप स्लाइड करें और इसे बंद कर दें।
- एक फ़नल धारक बनाने के लिए, एक कार्डबोर्ड फ्लाई-शीशी ट्रे के तल में 35 मिमी व्यास के परिपत्र छेद को काटने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका देखें) जिसे इसके फ्लैट शिपिंग अभिविन्यास से एक साथ मोड़ा नहीं गया है। एक मानक ट्रे 3 x 4 सरणी में इन छेदों में से 12 को समायोजित कर सकती है।
- कार्डबोर्ड को उलटें, पक्षों को एक बार नीचे मोड़ें (दो बार नहीं, जैसा कि एक फ्लाई-शीशी ट्रे बनाना होगा), और उल्टे कार्डबोर्ड ट्रे (चित्रा 2) को ऊपर उठाने के लिए पक्षों को एक साथ टेप करें।
- छेद में फ़नल रखें, पहले यह सुनिश्चित करें कि टयूबिंग क्लैंप बंद स्थिति में हैं।
चित्रा 2: Repurposed कार्डबोर्ड फ्लाई शीशी ट्रे, तह और 12 Baermann फ़नल प्रत्येक का समर्थन करने के लिए कटौती. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
4. फ़नल में नमूनों का स्थानांतरण
- प्रत्येक फ़नल में पानी डालें (जैसा कि उपलब्ध के रूप में बाँझ है), इसे रिम के नीचे लगभग 3 सेमी भरें। यदि हवा के बुलबुले टयूबिंग में फंस गए हैं, तो उन्हें छोड़ने के लिए फ़नल को टैप करें।
- gloved हाथों के साथ, एक लिंट-मुक्त पोंछा या विशेष रूप से एक Kimwipe (एक वर्ग बनाने के लिए आधे में मुड़ा हुआ) फ़नल पर रखें, और केंद्र पर नीचे दबाएं ताकि यह पानी में डूब जाए।
- मैन्युअल रूप से प्राकृतिक substrates (फल, फूल, मिट्टी, पत्ती कूड़े, आदि) के बड़े ठोस टुकड़ों को छोटे टुकड़ों में तोड़ दें ताकि दूरी के कीड़े को कम किया जा सके, सब्सट्रेट से बाहर निकलने के लिए यात्रा करनी चाहिए।
नोट: पत्ती कूड़े और अजीब तरह से आकार के नमूने एक खाद्य प्रोसेसर या ब्लेंडर में preprocessed किया जा सकता है. - धीरे से प्राकृतिक सब्सट्रेट (1-15 सेमी 3) का एक नमूना ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछे पर ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछे पर रखें, ऊतक को पंचर किए बिना और रिम के ऊपर उभरे नमूने के बिना।
- फ़नल, या फ़नल के बगल में कार्डबोर्ड लेबल करें, जिसमें फ़ील्ड संग्रह नोट्स के अनुरूप नमूना ID है.
- नमूने पर ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछे के कोनों को मोड़ें (चित्रा 1 बी)। ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछे के भीतर निहित नमूने को रखने के लिए सावधान रहें ताकि कोई भी मिट्टी या मलबा फ़नल के नीचे से गुजर न सके।
नोट: यह कदम कोनों को फ़नल के किनारे पर ड्रेपिंग करने से रोकना है, जहां वे पक्षों पर फ़नल से पानी की बाती करेंगे। - हाथों, एक स्पैटुला, या एक पिपेट टिप के साथ, किसी भी सक्रिय कीड़े, मिलीपीड्स, या अन्य जानवरों को चुनें जो फ़नल से फ़नल, क्रॉस-दूषित नमूनों तक यात्रा कर सकते हैं। ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछे को पूरी तरह से नमूने के चारों ओर लपेटें या क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए नमूने के शीर्ष पर एक दूसरा ऊतक रखें।
- फ़नल में अधिक पानी जोड़ें ताकि पूरा नमूना जलमग्न हो जाए (चित्रा 3)।
चित्रा 3: इकट्ठा Baermann फ़नल. प्रत्येक नमूने को ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछे में लपेटा जाता है और फ़नल में पानी के नीचे डूब जाता है, जिसे बंद कर दिया जाता है। ~ 12 ज की अवधि में, नेमाटोड ऊतक के माध्यम से और फ़नल के नीचे स्थानांतरित हो जाएंगे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
5. फ़नल से नेमाटोड का निष्कर्षण
- ~ 12 घंटे या रात भर के लिए प्रतीक्षा करें। इस समय के दौरान, सक्रिय कीड़े सब्सट्रेट से बाहर निकलेंगे, ऊतक / लिंट-मुक्त पोंछने के माध्यम से और क्लैंप किए गए फ़नल के नीचे तक।
नोट: हाइपोक्सिया या रोगजनक संक्रमण के कारण 12 घंटे से अधिक समय तक प्रतीक्षा करने से कृमि मृत्यु दर का खतरा होता है, जो विशेष रूप से कीड़े और बैक्टीरिया के साथ भीड़ वाले नमूनों के लिए कम अवधि में जोखिम भी हो सकता है। - OP50 ई कोलाई बैक्टीरिया के एक स्थान के साथ seeded एक 60 मिमी NGM कृमि प्लेट के तल पर एक फ़नल का नमूना आईडी लिखें। ढक्कन को प्लेट से हटा दें।
- फ़नल स्टैंड से उस नमूने वाले फ़नल को हटा दें। खुले कृमि प्लेट के ऊपर कीप को सीधे पकड़ने के लिए एक हाथ का उपयोग करना, टयूबिंग क्लैंप पर दबाव छोड़ने के लिए दूसरे हाथ का उपयोग करें, जिससे पानी की एक बूंद को टयूबिंग से वर्म प्लेट (चित्रा 1 सी) पर गिरने की अनुमति मिलती है। जैसे ही फ़नल से पानी गिरता है, जल्दी से एनजीएम प्लेट में बाढ़ को रोकने के लिए इसे फिर से बंद कर दें।
नोट: Caenorhabditis प्रजातियों सहित OP50 के लिए आकर्षित कीड़े का चयन करने के लिए, जीवाणु लॉन से दूर ड्रॉप जारी करें। जब पानी प्लेट में सोखता है या वाष्पित हो जाता है, तो केनोरहाबडिटिस नेमाटोड जीवाणु लॉन में क्रॉल करेंगे। - साफ करें: फ़नल की सामग्री को बाहर फेंक दें। बाद के पुन: उपयोग के लिए गर्म पानी के साथ फ़नल धोएं।
6. संस्कृतियों की स्थापना
- 5x-50x के आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत अलग-थलग नेमाटोड का निरीक्षण करें। प्लेटों में नेमाटोड शामिल होना चाहिए, और बहुत कम आवृत्तियों पर, छोटे ओलिगोचेट एनेलिड्स, टार्डिग्रेड, रोटिफर्स और छोटे क्रस्टेशियन (चित्रा 4)।
नोट: यदि फ़नल को सही ढंग से सेट किया गया है, तो कोई घुन, कीड़े, या दृश्यमान गैर-जीवित सामग्री ने इसे फ़नल के माध्यम से नहीं बनाया होगा।
चित्र 4: एक BAermann फ़नल से एक NGM प्लेट पर जारी की गई पहली बूंद की सामग्री। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
- आइसोहर्माफ्रोडाइट या आइसोफेमेल लाइनों को स्थापित करने के लिए, प्रत्येक एल 4 उभयलिंगी या संभोग वयस्क मादा (उनके बड़े शरीर के आकार और अलग-अलग पुरुष पूंछ 22 की कमी से पहचानने योग्य) को ओपी 50 (चित्रा 1 डी) के साथ सीडेड एक अलग 35 मिमी एनजीएम प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए एक कृमि पिक का उपयोग करें। कीड़े को स्थानांतरित करने से पहले और बाद में कृमि पिक को निष्फल करने के लिए एक लाइटर का उपयोग करें।
- यात्रा के लिए प्लेटों को अच्छी तरह से लपेटने के लिए पैराफिन फिल्म का उपयोग करें।
Representative Results
इस प्रोटोकॉल का उपयोग फल, फूलों, कवक, मिट्टी और तने से नेमाटोड को अलग करने के लिए किया गया था बैरो कोलोराडो द्वीप, पैनामा, 2018 के अगस्त में स्मिथसोनियन ट्रॉपिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट फील्ड स्टेशन पर। चार दिनों में एक ही अन्वेषक द्वारा संसाधित 131 सब्सट्रेट्स में से, 130 सब्सट्रेट (99.2%) ने नेमाटोड उत्पन्न किए। सब्सट्रेट्स के चालीस-चार (33.6%) ने केनोरहाब्डिटिस नेमाटोड (चित्रा 5) उत्पन्न किया। पीसीआर और संभोग परीक्षण23 द्वारा इन चालीस-चार सब्सट्रेट्स से स्थापित संस्कृतियों के बाद के विश्लेषण से छह अलग-अलग केनोरहाबडिटिस प्रजातियों की उपस्थिति का पता चला - सी बेसेई, सी उष्णकटिबंधीय, सी ब्रिग्सा, सी एसपी 24, सी एसपी 57, और सी पैनामेंसिस।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग 2019 के अगस्त में चार दिनों में चेरनोबिल बहिष्करण क्षेत्र, यूक्रेन में विभिन्न सब्सट्रेट से नेमाटोड को अलग करने के लिए फिर से किया गया था। जीवित कीड़े 63 मिट्टी के नमूनों में से 62 से बरामद किए गए थे, 17 अकशेरुकी नमूनों में से 1, 75 फलों के नमूनों में से 31, 12 चारा नमूनों में से 1 (चर्चा अनुभाग देखें), और मशरूम, नदी के रीड, या भेड़िया मल के नमूनों (प्रत्येक का एक नमूना एकत्र किया गया) से कोई कीड़े बरामद नहीं किए गए थे। 18S राइबोसोमल DNA15 के बाद के अनुक्रमण ने इन नेमाटोड को Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus और Pelodera के रूप में पहचाना, लेकिन कोई Caenorhabditis की पहचान नहीं की गई थी (चित्रा 5)।
चित्रा 5: दो संग्रह यात्राओं की सफलता दर। 2018 में पनामा (बाएं) और 2019 में यूक्रेन (दाएं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
Discussion
इस विधि का केंद्रीय सिद्धांत यह है कि नेमाटोड पानी में डूबे ऊतक के माध्यम से गुजरेंगे, जबकि उनके सब्सट्रेट और बड़े अकशेरुकी संदूषक नहीं होंगे। प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरण (1) एक उपयुक्त सब्सट्रेट एकत्र कर रहे हैं, (2) सब्सट्रेट को डुबोना, एक फ़िल्टरिंग सामग्री में लपेटा गया है, पानी में, (3) कीड़े इकट्ठा करना जो फिल्टर के माध्यम से पारित हो गए हैं और पानी के तल पर डूब गए हैं, और (4) आइसोफेमेल या आइसोहेर्माफ्रोडाइट लाइनों को बनाने के लिए व्यक्तिगत कीड़े को अलग करना। विधि के अन्य सभी भाग उपलब्ध संसाधनों, सब्सट्रेट्स की प्रकृति, या फील्डवर्क लक्ष्यों के अनुसार आवश्यक के रूप में संशोधन करने के लिए उपयुक्त हैं। विचार करने योग्य कुछ संशोधन निम्नानुसार हैं।
फल लगाकर कीड़े को चारा डालना
यदि क्षेत्र स्थल में पाए जाने वाले बैक्टीरिया से भरपूर सड़ने वाली सामग्री की पर्याप्त आपूर्ति नहीं है, तो कोई भी एक नमूना लाने की इच्छा कर सकता है, जैसे कि सेब या टमाटर का एक टुकड़ा, सड़ने के लिए छोड़ने के लिए। कुछ दांव के साथ चारा को अच्छी तरह से पिन करें ताकि बड़े जानवर उन्हें न हटाएं और इसलिए इसे संग्रह के लिए बाद में आसानी से पाया जा सके। सीधे सूरज की रोशनी से बचें, जहां चारा सड़ने से पहले सूख सकता है।
जो भी सामग्री उपलब्ध हैं, उससे बाहर कीप उपकरण का निर्माण
टयूबिंग क्लैंप को समायोजित करने के लिए पर्याप्त छेद के साथ कोई भी संरचना और शीर्ष-भारी फ़नल का समर्थन करने के लिए पर्याप्त स्थिर काम करेगी। एक एकल फ़नल के लिए, एक पीने का गिलास एक उपयुक्त धारक है। किसी भी प्रकार के ऊतक - चेहरे के ऊतक, टॉयलेट पेपर, या पेपर तौलिए - का उपयोग किया जा सकता है।
हाइपोक्सिया या संक्रमण को रोकने के लिए फ़नल में कम सामग्री डालना, या प्रतीक्षा समय को समायोजित करना
यदि नमूने में कीड़े या बैक्टीरिया की बहुत अधिक सांद्रता है, तो नेमाटोड 12 घंटे की इनक्यूबेशन पूरी होने से पहले हाइपोक्सिया या संक्रमण से मरना शुरू कर सकते हैं। यदि यह एक चिंता का विषय है, तो शोधकर्ता पहले फ़नल की जांच कर सकता है या अत्यधिक आबादी वाले सब्सट्रेट के बहुत छोटे subsample के साथ एक अतिरिक्त फ़नल तैयार कर सकता है।
प्रयोगात्मक जरूरतों और बाधाओं के लिए NGM प्लेट तैयारी को समायोजित करना
एनजीएम प्लेटों को जो भी मीडिया और खाद्य स्रोत प्रयोग के लिए उपयुक्त है, उसके साथ तैयार किया जा सकता है। ऊपर वर्णित फ़ील्ड प्रोटोकॉल को सामान के वजन को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सामान की सीमाओं और फील्डवर्क के समय के आधार पर, पहले से ही डाली गई एनजीएम प्लेटों को लाना - या तो प्रयोगशाला में तैयार किया गया है या व्यावसायिक रूप से खरीदा गया है - क्षेत्र में प्लेटें डालने के बजाय बेहतर हो सकता है।
प्रयोगशाला में फ़नल अलगाव प्रदर्शन
प्रोटोकॉल नेमाटोड आबादी को पकड़ने के लिए क्षेत्र की स्थितियों के तहत पूरी प्रक्रिया को पूरा करने का वर्णन करता है क्योंकि यह प्रकृति में होता है। कुछ शोध लक्ष्यों के लिए, सील किए गए बैग में नमूनों के साथ प्रयोगशाला में वापस यात्रा करने के बाद बाद में नेमाटोड को अलग करना पर्याप्त हो सकता है। फिर भी, बेयरमैन फ़नल विधि अन्य अलगाव विधियों की तुलना में जीवित नेमाटोड का एक क्लीनर और पूरा नमूना प्रदान करती है। हालांकि, सील किए गए बैग में नमूने यात्रा के दौरान चयन का अनुभव कर सकते हैं, क्योंकि वे तापमान और हाइपोक्सिया के संभावित चरम सीमाओं के संपर्क में हैं। नमूना संग्रह के बाद जितनी जल्दी हो सके अलगाव करके इसे कम किया जा सकता है।
बेयरमैन फ़नल के लिए एक सामान्य वैकल्पिक विधि में सब्सट्रेट को सीधे एक एनजीएम प्लेट पर रखना और कीड़े को क्रॉल करने की प्रतीक्षा करना शामिल है, जो या तो अत्यधिक श्रम-गहन है या आबादी के अधूरे संग्रह में परिणाम देता है। यह घुन और कीट लार्वा से दूषित प्लेटों को भी उत्पन्न करता है। बेयरमैन फ़नल विधि सक्रिय कीड़े की पूरी आबादी को उनके सब्सट्रेट से जल्दी से अलग करने के लिए एक कम लागत, कम तकनीक, कम श्रम रणनीति है।
Baermann फ़नल विधि जंगली नेमाटोड के सभी प्रकार के एकत्र करने के लिए सार्वभौमिक रूप से लागू नहीं है। कुछ पौधों में रहने वाले नेमाटोड को अपने सब्सट्रेट से उभरने में 12 घंटे से अधिक समय लगता है और बहुत जल्दी जारी की गई बूंद से अनुपस्थित होंगे, जबकि कुछ कीट परजीवी नीचे के बजाय फ़नल के शीर्ष पर क्रॉल करेंगे, संग्रह 14 से भी बचेंगे। Baermann फ़नल के विकल्प या तो कीड़े को ठीक करने के लिए अधिक विशेष उपकरण या अधिक श्रम की आवश्यकता होती है। हालांकि, उन्हें अभी भी पसंद किया जा सकता है यदि उपरोक्त चेतावनी प्रयोग के लिए एक समस्या है। वैकल्पिक विकल्प, वैन Bezooijen14 द्वारा समीक्षा की, फ़नल स्प्रे विधि है, जो फ़नल के लिए पानी की एक निरंतर धुंध प्रदान करता है, ऑक्सीजन जोड़ने और निलंबन में बैक्टीरिया के अतिप्रवाह की अनुमति देता है शामिल हैं। यह पौधों से नेमाटोड की अधिक विस्तारित निष्कर्षण अवधि की अनुमति देता है। ब्लेंडर केन्द्रापसारक फ्लोटेशन विधि धीमी गति से चलने वाले, निष्क्रिय, या ऊपर की ओर रेंगने वाले नेमाटोड को उनके विशिष्ट गुरुत्वाकर्षण से अलग करके पुनर्प्राप्त करती है, ओस्टेंब्रिंक एलुट्रिएटर निलंबित नेमाटोड से बसने वाले तलछट को अलग करने के लिए एक अंडरकरंट लागू करता है, और कोब की विधि नेमाटोड को उनके आकार, आकार और अवसादन दर से अलग करने के लिए छलनी की एक श्रृंखला का उपयोग करती है। Rhabditids इकट्ठा करने के लिए, हालांकि, Baermann फ़नल प्रभावी ढंग से जल्दी से और न्यूनतम प्रयास के साथ साफ नमूनों का उत्पादन करता है।
Disclosures
लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को एनआईएच अनुदान R35GM141906 और R21ES031364 और डेमन Runyon फैलोशिप DRG-2371-19 द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 - vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 - worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 - part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 - worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 - part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 - a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 - worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 - for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 - to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 - to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 - filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 - for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 - sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 - worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 - worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 - pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 - worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 - cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 - cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 - tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 - part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 - for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 - to bag a substrate sample |
References
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