Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att effektivt extrahera levande nematoder från naturliga substrat i fältet.
Abstract
Förutom att vara robusta experimentella modellorganismer är Caenorhabditis elegans och dess släktingar också riktiga djur som lever i naturen. Studier av vilda nematoder i deras naturliga miljöer är värdefulla för att förstå många aspekter av biologi, inklusive de selektiva regimer där distinkta genomiska och fenotypiska tecken utvecklas, den genetiska grunden för komplex dragvariation och den naturliga genetiska mångfalden som är grundläggande för alla djurpopulationer. Detta manuskript beskriver en enkel och effektiv metod för att extrahera nematoder från deras naturliga substrat, inklusive ruttande frukter, blommor, svampar, lövskräp och jord. Baermann-trattmetoden, en klassisk nematologiteknik, isolerar selektivt aktiva nematoder från sina substrat. Eftersom det återvinner nästan alla aktiva maskar från provet, möjliggör Baermann trattteknik återhämtning av sällsynta och långsamt växande genotyper som samexisterar med rikliga och snabbväxande genotyper, som kan missas i extraktionsmetoder som involverar flera generationer av reproduktion. Tekniken är också väl lämpad för att ta itu med metagenetiska, populationsgenetiska och ekologiska frågor. Det fångar hela befolkningen i ett prov samtidigt, vilket möjliggör en opartisk bild av den naturliga fördelningen av åldrar, kön och genotyper. Protokollet möjliggör distribution i stor skala på fältet, vilket snabbt omvandlar substrat till maskplattor, och författarna har validerat det genom fältarbete på flera kontinenter.
Introduction
Värdefulla biologiska insikter växer fram när forskare som studerar C. elegans i labbet utökar sitt fokus till C. elegans och relaterade rabditid nematoder i naturen. Studier av vilda nematoder placerar gener och genom i sitt naturliga sammanhang, vilket avslöjar funktioner som potentiellt skyms av laboratorieförhållanden1,2,3,4,5. Dessa studier genererar insikter om förutsättningarna för själva evolutionen, genetisk variation6,7,8,9,10. Den naturliga genetiska variationen som fångas av vilda prover ger också inbrytningar i den genetiska grunden för många komplexa egenskaper11,12,13.
Vid utformning av studier som kräver isolering av naturliga populationer av nematoder, särskilt när man utför distansarbete, kommer praktiska överväganden fram. Detta protokoll syftar till att rent isolera hela populationer av aktiva nematoder som kan odlas på OP50 från bete eller vilda substrat. Metoden är väl lämpad för att extrahera frilevande rabditid och diplogasterid nematoder, inklusive Caenorhabditis, Oscheius och Pristionchus.
Det finns många tekniker för att isolera nematoder från deras substrat14,15. Det mest grundläggande tillvägagångssättet är att placera substratet direkt på en nematod-mediumplatta och plocka djur när de kryper ut8,15. Den här metoden kräver stora mängder tid och arbete om målet är att isolera alla nematoder från ett prov. Mer sofistikerade tekniker drar nytta av djurens vikt, storlek, rörlighet eller någon kombination av dessa14. Varje metod har sina fördelar och nackdelar när det gäller installation och dataflöde. De skiljer sig också åt i sina provtagningsförskjutningar och kan välja för vissa nematoder om djuren i provet varierar längs axeln i metodens separationsprincip.
Baermann-trattmetoden beskrevs först 1917 av den holländska läkaren G. K. T. F. Baermann, som uppfann enheten på Java medan han studerade jordlevande nematoder, inklusive den parasitiska hakmasken16. Baermanntratten fungerar som bygger på principen om rörlighet. Substratet placeras i en tratt fodrad med ett tyg- eller pappersfilter (en "Kimwipe" används för denna studie, kallad "luddfri våtservett" i det aktuella protokollet) och förseglas i botten. Tratten fylls sedan med vatten och dränks i provet medan filtret separerar det från det förseglade utloppet. Aktiva nematoder i provet släpper sig i vattnet och simmar genom filtret och sätter sig så småningom längst ner i tratten. Trattutloppet öppnas och en droppe nematoder utvisas på en tallrik (figur 1).
Figur 1: Sammanfattning av Baermanntratttekniken. B) Dränka provet i en Baermanntratt och vänta på att maskar ska slingra sig ut och sjunka. (C) Släppa en enda droppe från tratten. D) Flytta enstaka hermafroditer eller parade honor till separata plattor. Illustration skapad av Ramin Rahni. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Baermann-tratten fungerar inte för alla typer av nematod (se diskussionsavsnitt för specifika alternativ) och passar bäst för dem som är aktiva former i storleksintervallet caenorhabditis eller mindre14. Men om en studie kan använda Baermann-tratten finns det många fördelar. Metoden är praktisk på fältet och kräver begränsad installation, praktisk tid och kostnad. Forskaren lämnas med ett rent prov utan obstruktion av substratet på plattan, vilket gör det enkelt att plocka. Användning av ett filter förhindrar också förorening av plattan av insektslarver eller kvalster, som tuggar upp plattor eller byte på nematoder i provet. Viktigast av allt är att Baermann-tratten effektivt extraherar nästan hela populationen från substratet14, vilket kan krävas beroende på studiens design. Till exempel kan forskare som är intresserade av att räkna vilda populationers stadium eller könsfördelning, hitta långsamt växande eller sällsynta genotyper eller provtagning av nematoder som inte lockas till OP50 dra nytta av denna metod. Detta är lämpligt för forskare som studerar ekologiska17-, populationsgenetiska18- eller metagenetiska19-frågor eftersom provtagningssystemet tar en ögonblicksbild av populationen vid provtagningstiden.
Det nuvarande manuskriptet beskriver ett komplett protokoll för att isolera populationer av nematoder med hjälp av Baermann-tratten och upprätta isofemale- och isohermafroditlinjer i fältet, med hjälp av utrustning som valts för enkel transport. För forskare som utför fältarbete nära sina laboratorier kan många av dessa steg utelämnas eller förenklas.
Protocol
1. Beredning av sådda NGM-plattor i fält
- Väg 23 005 g Nematode Growth Medium (NGM) (se Tabell över material) pulver före resan och förpacka i en förseglingsbar plastpåse. Gör en påse för varje liter media som önskas.
OBS: Förförpackning före resa kringgår behovet av en funktionell balans på fältet. - Före resan, förbered 1 ml 1M MgSO4, 1 ml 1M CaCl2 och 25 ml 1 M kaliumfosfatbuffert för varje liter media som önskas. För att göra 1 L kaliumfosfatbuffert, lös upp 108,3 g KH2PO4 och 35,6 g K2HPO4 i vatten, enligt beskrivningen i WormBook20.
- Innan du reser, gör en övernattningskultur av OP50 (se Tabell över material) odlad i LB vid 37 °C, enligt beskrivningen i WormBook20. Aliquot kulturen i 50 mL koniska rör och linda topparna med paraffinfilm för att förhindra läckage.
- Lös upp innehållet i NGM-paketet i 973 ml dubbeldestillerat vatten (ddH20) eller det renaste, mest sterila vattnet som finns i en 1 L-kolv eller flaska.
- Placera mediekolven eller flaskan, med ett löst lock eller aluminiumfolieskydd, i ett kokande varmvattenbad på en kokplatta eller spis. Rör om då och då tills allt pulver är upplöst och klart (detta tar ~30 min).
OBS: Om en magnetisk värmeplatta finns tillgänglig är en omrörningsstång ett utmärkt alternativ för att begränsa mängden manuell omrörning. - Ta bort mediet från vattenbadet och svalna till ~58 °C med enstaka skakningar eller med en omrörbar. När mediet har svalnat till 58 ° C, använd serologiska eller standard pipetter för att lägga till 25 ml 1M kaliumfosfatbuffert, 1 ml 1 M MgSO4 och 1 ml 1 M CaCl2, blanda väl mellan varje steg.
- I den mest sterila miljön som finns, pipettera eller häll mediet i plattor av önskad storlek och låt svalna och stelna över natten. Häll en 60 mm platta (~ 10 ml) för varje substratprov. Häll en 35 mm platta (~ 3,5 ml) för varje isofemalelinje; antalet små plattor som behövs är svårt att förutsäga i förväg.
- Pipetter 50 μL OP50-odling på varje platta och låt den torka och växa över natten före användning.
2. Insamling av nematodersubstrat
- Identifiera ett bakterierikt substrat i fältet. Några exempel inkluderar ruttande frukt, blommor, svampar och stjälkar av örtartade växter. Jord och bladskräp är också lämpliga, även om de sällan innehåller caenorhabditis.
- Placera med handske ett prov av detta substrat (1-15 cm3) i en förseglingsbar plastpåse (se Materialförteckning) märkt med ett unikt prov-ID (figur 1A).
- Registrera prov-ID, latitud, longitud, datum, beskrivning av substratet och alla andra lokala miljömätningar som är relevanta för försöket, inklusive omgivnings- och substrattemperatur, insamlingstid, substratförhållanden, förekomst av substratassocierade makroinverteber och så vidare. En smartphone-app är tillgänglig för att effektivisera denna process21.
3. Förberedelse av en rad Baermann-trattar
- För varje tratt, använd sax för att skära ett segment av gummirör (se Materialtabell) ~ 3 cm lång.
- Montera slangsegmentet över änden av en plasttratt (se Materialtabell). Detta kan ta lite ansträngning eftersom passformen är mycket snäv.
- Skjut en slangklämma över gummislangen och kläm fast den.
- För att göra en tratthållare, använd en skalpell för att skära cirkulära hål med 35 mm diameter i botten av en pappflugflaskabricka (se Materialtabell) som inte har vikts ihop från sin platta leveransorientering. Ett standardfack rymmer 12 av dessa hål i en 3 x 4-matris.
- Vänd kartongen, vik ner sidorna en gång (inte två gånger, som man skulle göra en flugflaskabricka) och tejpa ihop sidorna för att höja den inverterade kartongbrickan (figur 2).
- Placera trattar i hålen och se först till att slangklämmorna är i stängt läge.
Figur 2: Återanvända pappflugplåtar, vikta och skurna för att stödja 12 Baermann-trattar vardera. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
4. Överföring av prover till trattarna
- Häll vatten (så sterilt som möjligt) i varje tratt och fyll det ca 3 cm under kanten. Om luftbubblor fastnar i slangen, tryck på tratten för att släppa dem.
- Med handskar, placera en luddfri våtservett eller specifikt en Kimwipe (vikt i hälften för att göra en kvadrat) över tratten och tryck ner på mitten så att den är nedsänkt i vattnet.
- Bryt manuellt stora fasta bitar av naturliga substrat (frukt, blomma, jord, lövskräp etc.) i mindre fragment för att minimera avståndet maskar måste resa för att falla ut ur substratet.
OBS: Bladskräp och obekvämt formade prover kan förbehandlas i en matberedare eller mixer. - Placera försiktigt ett prov av det naturliga substratet (1-15 cm3) på vävnads-/luddfri våtservett i en tratt utan att punktera vävnaden och utan att provet sticker ut ovanför kanten.
- Märk tratten, eller kartongen bredvid tratten, med prov-ID som motsvarar fältsamlingsanteckningar.
- Vik hörnen på vävnaden/luddfri torka över provet (bild 1B). Var noga med att hålla provet i vävnads-/luddfri våtservett så att ingen jord eller skräp kan passera till botten av tratten.
OBS: Detta steg är för att förhindra att hörnen draperar över kanten av tratten, där de skulle transportera vattnet från tratten över sidorna. - Med händer, en spatel eller en pipettspets, plocka ut alla aktiva insekter, millipeder eller andra djur som kan resa från tratt till tratt, korsförorenande prover. Linda vävnads-/luddfri torka helt runt provet eller lägg en andra vävnad över toppen av provet för att förhindra korskontaminering.
- Tillsätt mer vatten i trattar så att hela provet är nedsänkt (bild 3).
Figur 3: Monterade Baermanntrattar. Varje prov är insvept i vävnads-/luddfri våtservett och nedsänkt under vatten i tratten, som är fastspänt. Under en period av ~ 12 h kommer nematoderna att migrera genom vävnaden och till botten av tratten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
5. Utvinning av nematoder från trattarna
- Vänta i ~12 h eller över natten. Under denna tid kommer aktiva maskar att slingra sig ut ur substratet, genom vävnaden / luddfri torka och ner till botten av den klämda tratten.
OBS: Att vänta mycket längre än 12 timmar riskerar maskdödlighet på grund av hypoxi eller patogen infektion, vilket också kan vara en risk med kortare varaktigheter för prover som är särskilt trångt med maskar och bakterier. - Skriv prov-ID för en tratt på botten av en 60 mm NGM maskplatta sådd med en fläck av OP50 E. coli-bakterier . Ta bort locket från plattan.
- Ta bort tratten som innehåller exemplet från trattstället. Använd ena handen för att hålla tratten upprätt ovanför den öppna maskplattan, använd den andra handen för att släppa trycket på slangklämman, så att en droppe vatten kan falla från slangen på maskplattan (bild 1C). Så snart vatten faller från tratten, kläm snabbt fast den igen för att förhindra översvämning av NGM-plattan.
OBS: För att välja maskar som lockas till OP50, inklusive caenorhabditis arter, släpp droppen bort från bakteriegräsmattan. När vattnet suger in i plattan eller avdunstar, kommer Caenorhabditis nematoder att krypa in i bakteriegräsmattan. - Städa upp: Kasta ut innehållet i trattarna. Tvätta trattarna med varmt vatten för efterföljande återanvändning.
6. Upprättande av kulturerna
- Observera de isolerade nematoderna under stereomikroskopet vid en förstoring av 5x-50x. Plattorna bör innehålla nematoder, och vid mycket lägre frekvenser, små oligochaete annelider, tardigrades, rotifers och små kräftdjur (figur 4).
OBS: Om tratten har ställts in korrekt, kommer inga kvalster, insekter eller synligt icke-levande material att ha tagit sig igenom tratten.
Bild 4: Innehållet i den första droppen som frigörs från en Baermanntratt på en NGM-platta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- För att fastställa isohermafrodite- eller isofemalelinjer, använd en maskplockning för att överföra varje L4 hermafrodit eller parad vuxen hona (igenkännlig av deras större kroppsstorlek och brist på den distinkta manliga svansen22) till en separat 35 mm NGM-platta sådd med OP50 (figur 1D). Använd en tändare för att sterilisera maskplockningen före och efter överföring av maskar.
- Använd paraffinfilm för att linda plattor noggrant för resor.
Representative Results
Detta protokoll användes för att isolera nematoder från frukt, blommor, svampar, jord och stjälkar på Barro Colorado Island, Panamá, vid Smithsonian Tropical Research Institute fältstation i augusti 2018. Av 131 substrat som bearbetats av en enda prövare under fyra dagar gav 130 substrat (99,2%) nematoder. Fyrtiofyra av substraten (33,6%) gav Caenorhabditis nematoder (figur 5). Efterföljande analys av kulturer etablerade från dessa fyrtiofyra substrat, genom PCR och parning tester23, visade förekomsten av sex olika Caenorhabditis arter - C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 och C. panamensis.
Detta protokoll användes igen för att isolera nematoder från olika substrat i Tjernobyl-uteslutningszonen i Ukraina under fyra dagar i augusti 2019. Levande maskar återfanns från 62 av 63 jordprover, 1 av 17 ryggradslösa prover, 31 av 75 fruktprover, 1 av 12 beteprover (se diskussionsavsnittet) och inga maskar återfanns från svamp-, flodavgifts- eller vargavföringsprover (ett prov som samlats in av varje). Efterföljande sekvensering av 18S ribosomal DNA15 identifierade dessa nematoder som Oscheius, Panagrolaimus, Akrotrooider, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus och Pelodera, men ingen Caenorhabditis identifierades (figur 5).
Figur 5: Framgångsgrader för två upphämtningsresor. Panama 2018 (vänster) och Ukraina 2019 (höger). Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Discussion
Den centrala principen för denna metod är att nematoder kommer att passera genom vävnaden nedsänkt i vatten, medan deras substrat och större ryggradslösa föroreningar inte kommer att göra det. De kritiska stegen i protokollet är (1) insamling av ett lämpligt substrat, (2) nedsänkning av substratet, insvept i ett filtreringsmaterial, i vatten, (3) samla maskar som har passerat genom filtret och sjunkit till botten av vattnet och (4) isolera enskilda maskar för att skapa isofemale- eller isohermafroditelinjer. Alla andra delar av metoden är mottagliga för modifiering vid behov beroende på tillgängliga resurser, substratens art eller fältarbetesmålen. Vissa ändringar som är värda att överväga är följande.
Bete maskarna genom att plantera frukt
Om det inte finns gott om bakterierikt ruttande material på fältområdet, kan man vilja ta med ett prov, till exempel en bit äpple eller tomat, för att lämna att ruttna. Fäst betet bra med några insatser så att större djur inte tar bort dem och så att det lätt kan hittas senare för insamling. Undvik direkt solljus, där betet kan torka innan det ruttnar.
Konstruera trattapparat av alla tillgängliga material
Alla strukturer med hål som är tillräckligt stora för att rymma slangklämman och tillräckligt stabil för att stödja en topptung tratt fungerar. För en enda tratt är ett dricksglas en lämplig hållare. Alla typer av vävnader – ansiktsvävnad, toalettpapper eller pappershanddukar – kan användas.
Att lägga mindre material i trattar, eller justera väntetiden, för att förhindra hypoxi eller infektion
Om provet har en mycket hög koncentration av maskar eller bakterier kan nematoder börja dö av hypoxi eller infektion innan inkubationen på 12 timmar är klar. Om detta är ett problem kan forskaren kontrollera trattar tidigare eller förbereda en extra tratt med ett mycket litet delprov av det mycket befolkade substratet.
Anpassning av NGM-plåtpreparatet till experimentella behov och begränsningar
NGM-plattor kan beredas med vilken media och livsmedelskälla som helst som är lämplig för experimentet. Fältprotokollet som beskrivs ovan är utformat för att minimera bagagevikten. Beroende på bagagebegränsningar och fältarbetestid kan det vara att föredra att ta med redan hällda NGM-plattor – antingen förberedda i labbet eller köpta kommersiellt – än att hälla tallrikar på fältet.
Utföra trattisoleringen i laboratoriet
Protokollet beskriver genomförandet av hela proceduren under fältförhållanden för att fånga nematodpopulationen så som den förekommer i naturen. För vissa forskningsmål kan det vara tillräckligt att isolera nematoder senare, efter att ha rest tillbaka till labbet med prover i förseglade påsar. Även då ger Baermann-trattmetoden ett renare och komplett prov av de överlevande nematoderna än andra isoleringsmetoder. Prover i förseglade påsar kan dock uppleva urval under resan, eftersom de utsätts för potentiella extrema temperaturer och hypoxi. Detta kan minimeras genom att utföra isoleringar så snart som möjligt efter provsamling.
En vanlig alternativ metod till Baermann-tratten innebär att placera substratet direkt på en NGM-platta och vänta på att maskar ska krypa ut, vilket antingen är mycket arbetsintensivt eller resulterar i ofullständig insamling av befolkningen. Det ger också plattor förorenade med kvalster och insektslarver. Baermann-trattmetoden är en billig, lågteknologisk strategi med låg arbetskraft för att snabbt separera hela populationen av aktiva maskar från deras substrat.
Baermann-trattmetoden är inte allmänt tillämplig för insamling av alla typer av vilda nematoder. Vissa växtlevande nematoder tar mycket längre tid än 12 timmar att komma ut från sitt substrat och kommer att vara frånvarande från en droppe som släpps för tidigt, medan vissa insektsparasiter kommer att krypa till toppen av tratten snarare än botten, vilket också undviker insamling14. Alternativ till Baermann-tratten kräver antingen mer specialiserad utrustning eller mer arbete för att återställa maskarna. De kan dock fortfarande föredras om förbehållen ovan är ett problem för experimentet. Alternativa alternativ, som granskats av van Bezooijen14, inkluderar trattspraymetoden, som ger en konstant dimma av vatten till trattar, tillsätter syre och tillåter överflöd av bakterier i suspension. Detta möjliggör en mer förlängd extraktionsperiod av nematoder från växter. Mixercentrifufustens flotationsmetod återvinner långsamma, inaktiva eller uppåtkrypande nematoder genom att separera dem med deras specifika gravitation, Oostenbrink elutriator applicerar en underström på separat sediment från suspenderade nematoder, och Cobbs metod använder en serie siktar för att isolera nematoder efter deras storlek, form och sedimenteringshastighet14. För att samla rabditider producerar Baermann-tratten effektivt rena prover snabbt och med minimal ansträngning.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag R35GM141906 och R21ES031364 och Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 - vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 - dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 - worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 - part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 - worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 - part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 - a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 - worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 - for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 - to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 - to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 - filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 - for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 - sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 - worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 - worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 - pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 - worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 - worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 - cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 - cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 - tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 - part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 - for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 - to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. Methods and techniques for nematology. , Wageningen University. (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , wormbook.1.115.2 (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T.
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
