Visualizando o tráfico dependente de citoesqueleto de organelas contendo lipídios em embriões Drosophila

Summary

No embrião drosophila primitivo, muitas organelas são motile. Em princípio, eles podem ser imagens ao vivo através de sondas fluorescentes específicas, mas a casca de ovo impede a aplicação direta ao embrião. Este protocolo descreve como introduzir tais sondas através de microinjeção e, em seguida, analisar o movimento da organela em massa através da velocimetria de imagem de partículas.

Abstract

Os embriões drosophila primitivos são grandes células contendo uma vasta gama de organelas convencionais e específicas de embriões. Durante as primeiras três horas de embriogênese, essas organelas sofrem movimentos dramáticos alimentados pelo streaming citoplasmica baseado em actina e tráfico motorizado ao longo de microtúbulos. O desenvolvimento de uma infinidade de pequenas sondas fluorescentes específicas de organela (FPs) torna possível visualizar uma ampla gama de diferentes estruturas contendo lipídios em qualquer genótipo, permitindo imagens vivas sem exigir um fluoróforo geneticamente codificado. Este protocolo mostra como injetar corantes vitais e sondas moleculares em embriões de Drosophila para monitorar o tráfico de organelas específicas por imagens vivas. Essa abordagem é demonstrada pela rotulagem de gotículas lipídicas (LDs) e seguindo seu movimento em massa por velocimetria de imagem de partículas (PIV). Este protocolo fornece uma estratégia favorável ao estudo de outras organelas, incluindo lisosomos, mitocôndrias, vesículas de gema e er, e para o rastreamento do movimento de LDs individuais ao longo de microtúbulos. O uso de corantes disponíveis comercialmente traz os benefícios da separação para as regiões violeta/azul e vermelha do espectro. Pela co-rotulagem multiplex de organelas e/ou elementos citoesqueléticos via microinjeção, todos os recursos genéticos em Drosophila estão disponíveis para estudos de tráfico sem a necessidade de introduzir proteínas fluorescentes marcadas. Ao contrário dos fluoroforos geneticamente codificados, que têm baixos rendimentos quânticos e alvejante facilmente, muitos dos corantes disponíveis permitem uma captura rápida e simultânea de vários canais com alto rendimento de fótons.

Introduction

Corantes vitais e sondas moleculares são ferramentas poderosas para imaginar estruturas celulares específicas e organelas ao vivo. No embrião de Drosophila, muitas organelas diferentes exibem localização orientada por citoesqueleto 1,2,3,4, mas a aplicação dessas pequenas moléculas é desafiadora porque a casca de ovo é impermeável para muitas delas. Este protocolo descreve um método para usar sondas fluorescentes (FPs) em embriões vivos via microinjeção, a fim de detectar o tráfico em larga escala de organelas. O procedimento abrange a preparação da solução de injeção, coleta de óvulos e preparação de embriões, microinjeção, imagem e análise de imagem.

Rearranjos espaciais dramáticos de organelas são comuns em muitos oócitos animais, ovos e embriões, em parte devido ao grande tamanho dessas células. No embrião de Drosophila , por exemplo, gotículas lipídicas (LDs) e vesículas de gema se movem em direção ao centro do embrião pouco antes da cellularização⁵. Este movimento depende de microtúbulos e deixa uma região de ~40 μm em toda a periferia do embrião esgotado das duas organelas. Durante os estágios anteriores de decote, muitas organelas são transportadas por fluxos citoplasmados que são impulsionados por contrações baseadas em actina-miose na superfície do embrião⁶. Embora os embriões de muitas espécies apresentem rearranjos semelhantes, o embrião Drosophila é particularmente adequado para seguir esses processos por imagem, porque se desenvolve externamente a "temperatura ambiente" padrão de laboratório, é relativamente transparente, pequeno o suficiente para caber na maioria das configurações de microscópio, e pode ser manipulado usando poderosas ferramentas genéticas.

Para algumas organelas, estão disponíveis proteínas fluorescentes que rotulam especificamente essas estruturas. Por exemplo, lSD-2 (também conhecido como dPLIN2) é uma proteína que em embriões tem como alvo especificamente os LDs⁷. Linhas de mosca estão disponíveis que carregam transgenes indutíveis codificando uma fusão entre proteína fluorescente verde (GFP) e LSD-2⁸ ou uma armadilha genética na qual a proteína fluorescente amarela (YFP) é inserida na região de codificação do gene LSD-2 endógeno ^9,10. No entanto, essa abordagem tem limitações, incluindo que essas proteínas de fusão têm baixos rendimentos quânticos e tendem a branquear facilmente. Além disso, rotular várias estruturas diferentes simultaneamente pode ser um desafio: para muitas organelas, apenas um tipo de tag fluorescente (muitas vezes GFP ou mCherry) está atualmente disponível, de modo que a imagem de duas organelas ao mesmo tempo pode exigir novos transgenes ou inserções; também, mesmo que as tags compatíveis estejam disponíveis, introduzi-las em uma única cepa pode exigir cruzes demoradas. Também torna o uso dos muitos recursos genéticos poderosos menos convenientes, por exemplo, se dois marcadores de organela, um motorista gal4, e uma construção RNAi indutível todos têm que estar presentes na mesma mãe.

Em princípio, essas limitações podem ser superadas com o uso de FPs, incluindo corantes vitais (por exemplo, LysoTracker para marcar lisosomos), sondas moleculares (por exemplo, SiR-tubulin para rotular microtúbulos) e moléculas biológicas fluorescentes rotuladas (por exemplo, C12 BODIPY para sondar o metabolismo de ácidos graxos¹¹). A partir do uso em células cultivadas, elas são tipicamente bem validadas como ferramentas poderosas para sondar a biologia celular. Os FPs são versáteis, possuem propriedades fotográficas superiores e são compatíveis com proteínas fluorescentes. Múltiplos corantes podem ser misturados e aplicados simultaneamente, muitas vezes com os benefícios da separação nas áreas violeta/azul e vermelho distante do espectro e pequenas mudanças de Stokes, impedindo a sangria do canal. Pequenas mudanças de Stokes permitem a captura simultânea de múltiplos canais de imagem, permitindo o rastreamento de várias organelas ao mesmo tempo. Finalmente, eles podem ser igualmente aplicados à rotulagem de organelas nos embriões de outras espécies de Drosophila ou mesmo outros insetos onde não podem estar disponíveis proteínas fluorescentes.

No entanto, a maioria desses FPs não pode atravessar a casca de ovo elaborada do embrião Drosophila . Consiste em cinco camadas: três camadas coriônicas externas (chorão) que previnem danos mecânicos mais uma camada cerada ao redor da membrana vitelline que cria uma barreira química¹². Para simplificar, a combinação da camada cerada e da membrana vitelline será referida como a "membrana vitelline" abaixo. Para contornar a casca de ovo, este protocolo adapta uma abordagem estabelecida de microinjeção de embriões para introduzir FPs no embrião de Drosophila . O protocolo descreve como monitorar o fluxo citoplasmado de LDs em embriões estágio de decote. Inclui a preparação de agulhas de injeção e gaiolas de coleta de ovos, o processo de coleta de ovos e a remoção mecânica do acorde. Ele analisa como microinjetar e imaginar os embriões e como analisar o fluxo a granel de LDs usando velocimetria de imagem de partículas (PIV, adaptada a partir de⁶). Ele fornece conselhos sobre solução de problemas para garantir a sobrevivência de embriões e criar o melhor sistema de imagem. Também é discutido como o protocolo pode ser modificado para imagem simultânea de LDs e microtúbulos ou para aplicá-lo ao estudo de outras organelas, incluindo lisosomos, mitocôndrias, vesículas de gema e o tiquelto endoplasmático (ER).

Protocol

1. Prepare os materiais necessários

NOTA: Estes preparativos são melhores feitos dias ou semanas antes do tempo.

1. Prepare agulhas de injeção.
   NOTA: As agulhas podem ser armazenadas indefinidamente em um recipiente coberto. As agulhas devem ser finas o suficiente para entregar ~700 fL enquanto são fortes o suficiente para perfurar a membrana vitelline.
   1. Coloque um capilar no suporte capilar no puxador de agulha. Segure o capilar com os wingnuts. Alinhe o centro do capilar com o elemento de aquecimento para que duas agulhas simétricas sejam geradas.
   2. Escolha as configurações apropriadas no puxador de agulha de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Realize o controle de qualidade usando um escopo de dissecação.
      NOTA: As pontas da agulha devem ser as melhores possíveis. Pontas de agulha rachadas, irregulares ou furadas grandes são descartadas.
   4. Prepare lotes de 10 agulhas (5 capilares no valor) de cada vez.
   5. Coloque uma massa deformada, que foi enrolada em um cilindro, no centro do fundo de um recipiente com uma tampa. Pressione cuidadosamente as agulhas na massa de tal forma que as segure horizontalmente com as pontas da agulha suspensas com segurança no ar para evitar danos. Cubra com a tampa e guarde até usar.
2. Prepare pratos de coleta de ovos. Armazenar a 4 °C.
   NOTA: As placas de coleta de ovos são pequenas placas de ágar suplementadas com suco de fruta para incentivar a colocação de ovos. Como prepará-los é descrito em muitos protocolos, incluindo¹³.
3. Prepare cola heptana.
   NOTA: Esta cola é extraída de fita dupla face e é usada para fixar os embriões com segurança a um deslizamento de tampa. Impede que o embrião flutua fora de foco durante a injeção e a imagem. A cola pode ser preparada dias ou semanas antes do tempo.
   1. Coloque-a em fita dupla face para um tamanho maior que uma bola de golfe e coloque-a no fundo de um recipiente de vidro de ~50 mL com uma tampa de vedação apertada. Embalar a fita firmemente para que o adesivo suficiente esteja presente.
   2. Em um capô de fumaça, encha o recipiente de vidro com heptane para cobrir toda a fita. Mantenha o recipiente bem fechado quando não estiver em uso.
      ATENÇÃO: O heptano é inflamável como líquido e vapor. Pode causar irritação nos olhos, pele e trato respiratório. Vapores respiratórios podem causar sonolência, tontura e danos pulmonares. Mantenha o heptano longe das fontes de ignição e armazene-o em uma área bem ventilada destinada a inflamáveis e longe de substâncias incompatíveis.
   3. Deixe a cola heptana sentar durante a noite ou mais. Para obter melhores resultados, coloque o recipiente em um agitador ou outro agitador durante a noite para ajudar a dissolver o adesivo.
      NOTA: A fita em si permanecerá, mas o adesivo será dissolvido no heptano. Na etapa 5.1.2, a cola é aplicada a um deslizamento de cobertura; heptano evapora, deixando a cola para trás.
   4. Teste a preparação da cola de heptano colocando uma gota dela em um slide de vidro e certificando-se de que um resíduo pegajoso permaneça uma vez que o heptano tenha evaporado. Se o resíduo adesivo não estiver visível depois, adicione mais fita ao recipiente de vidro e repita a etapa anterior.
      NOTA: Uma vez preparada, a cola pode ser usada por meses ou até anos.
4. Prepare uma solução de estoque BODIPY493/503 de 1 mg/mL, diluindo a preparação obtida comercialmente em DMSO puro anidro. Mantenha-o coberto para protegê-lo da luz e da água. Armazene indefinidamente a -20 °C ou a curto prazo a 4 °C.

2. Prepare gaiolas de coleta de ovos

NOTA: Faça isso pelo menos um dia (de preferência 2 ou 3 dias) antes da injeção planejada.

1. Prepare pasta de levedura.
   NOTA: Pasta de levedura suplementa proteína e outros nutrientes vitais não fornecidos nas placas de suco de maçã. Promove a produção de ovos e a colocação de ovos.
   1. Adicione 2-10 g de levedura seca do padeiro e, em seguida, 1 mL de água da torneira a um pequeno béquer. Misture usando uma espátula.
   2. Continue adicionando água da torneira em incrementos de 1 mL até que a consistência desejada, semelhante à pasta de dente seja alcançada.
   3. Cubra a mistura e armazene a 4 °C.
2. Montar gaiolas de moscas para coleta de ovos.
   NOTA: São necessárias moscas masculinas e femininas do genótipo desejado: 10-50 fêmeas com menos de 2 semanas de idade e um número semelhante de machos. Uma série de opções diferentes para gaiolas voadoras estão disponíveis, incluindo opções caseiras^14,13. É importante que o tamanho dos pratos de suco de maçã seja compatível com o tamanho das gaiolas de mosca.
   1. Coloque uma pequena mancha de pasta de levedura em um prato de suco de maçã. Mantenha-o coberto e deixe-o chegar à temperatura ambiente porque as moscas não colocarão ovos no prato se estiver muito frio.
   2. Transfira moscas para uma gaiola de coleta de embriões, selar com a placa de suco de maçã leveasted, e fixar a placa na gaiola de coleta de embriões.
   3. Permita que moscas recém-transferidas se aclimatem na gaiola por 1-2 dias, substituindo a placa por uma nova diariamente. Se toda a levedura tiver sido comida até o dia seguinte, aumente a quantidade de pasta de levedura para futuras coleções.
      NOTA: Este é um passo importante para aumentar a produção de ovos, uma vez que as fêmeas bem alimentadas colocam mais ovos.

3. No dia da injeção, prepare a solução de injeção e carregue-a na agulha

1. Use a solução de estoque do BODIPY 493/503 (3,8 mM em DMSO) como solução de injeção.
2. Carregue uma única agulha com 1 μL da solução de injeção usando pontas de carregamento de agulha.
   NOTA: Esforce-se para levar o líquido até a ponta sem prender bolhas de ar. Esteja pronto para substituir rapidamente a agulha carregada em caso de quebra acidental.
   1. Coloque uma ponta de carregamento em uma micropipette e desenhe 1 μL da solução de injeção na ponta. Usando luvas, segure a agulha em uma mão com a ponta apontada para minimizar o risco de quebra.
   2. Insira cuidadosamente a ponta de carregamento na agulha e empurre-a para perto da ponta da agulha. Dispense o líquido perto da ponta da agulha. Depois de remover a pipeta, segure a agulha verticalmente com a ponta para baixo até que o líquido flua para a ponta.
3. Guarde as agulhas carregadas em um recipiente separado com massa conforme acima (ver passo 1.1.5).
   NOTA: As agulhas devem ser preparadas com antecedência (até várias horas) de injeção, mas não devem ser usadas após mais de um dia.
4. Mantenha as agulhas fora da luz ambiente para evitar o branqueamento dos corantes. Cubra o recipiente de armazenamento com papel alumínio sem danificar as pontas da agulha. Certifique-se de que toda a luz está obscurecida.

4. Coleta de embriões para injeção

NOTA: O tempo de coleta depende de qual estágio dos embriões a injeção precisa ser realizada. Com o esquema de tempo abaixo, os embriões no momento da preparação para a injeção terão de 0 a 90 min de idade, o que corresponde aos estágios^{de decote 15}.

1. No dia da injeção, prepare pratos de suco de maçã com levedura, como na etapa 2.2.1. Se n rodadas de injeções forem planejadas, prepare as placas N + 2. Mantenha essas placas em temperatura ambiente.
   NOTA: Além das placas N para coletar embriões para injeção, uma placa é necessária como placa de pré-coleta e outra para alimentar as moscas na gaiola assim que as coletas forem concluídas.
2. Substitua a placa na gaiola por uma placa levedura fresca (placa de pré-coleta) e deixe-a na gaiola por 1-2 h.
3. Substitua a placa na gaiola por uma placa fresca (placa de coleta). Descarte a placa de pré-coleta, pois conterá embriões mais antigos do que o desejado. Em seguida, deixe as moscas colocarem ovos por 1,5 h.
   NOTA: Como moscas bem alimentadas normalmente colocam seus ovos logo após a fertilização dos ovos, um tempo de coleta de 1,5 h garante que no final da coleta, a maioria dos embriões na placa têm 0-90 min de idade, ou seja, estão em estágios de decote. Moscas fêmeas que não foram alimentadas com levedura fresca desde o dia anterior tenderão a reter óvulos fertilizados por algum tempo indeterminado antes de colocar. Assim, a placa de pré-coleta pode ter embriões que foram fertilizados antes do início da coleta e, portanto, têm mais de 60 minutos, às vezes muito mais velhos.
4. Substitua a placa na gaiola por uma placa levedura fresca. Cubra a placa de coleta para que as moscas perdidas não coloquem ovos sobre elas.

5. Prepare embriões para microinjeção

1. Monte os materiais necessários.
   1. Coloque um pedaço de fita dupla face em um slide de vidro. Evite tocar a fita com os dedos, pois isso reduz sua pegajosa.
      NOTA: Este slide será usado para remover o acorde e não para imagens.
   2. Usando uma pipeta de transferência ou uma micropipette (p200 ou p1000), coloque uma pequena gota (200 μL ou menos) de cola de heptano aproximadamente no centro de um deslizamento retangular (60 x 25 mm). Deixe o heptano evaporar (isso leva menos de um minuto).
      NOTA: Este deslizamento será usado para montar os embriões para injeção e imagem. As dimensões são escolhidas para caber em um suporte de metal ajustável no microscópio confocal.
   3. Monte uma câmara de proficação, uma câmara selada (por exemplo, uma caixa de sanduíches Tupperware) contendo contas de dissocção. Use apenas contas de dessecação que não tenham se hidratado.
      NOTA: Para garantir que os embriões tomem a solução de injeção, o embrião deve ser ligeiramente dessecado para reduzir a pressão interna. Isso é feito colocando o deslizamento com os embriões descoresados e expostos ao ar na câmara de dessecação.
2. Remova mecanicamente o acorde.
   1. Cubra a placa de embrião apropriadamente envelhecida com uma fina camada de óleo de halocarboneto 27 para tornar a casca de ovo transparente.
      NOTA: Os embriões tornam-se translúcidos dentro de dezenas de segundos¹⁵. Se esta etapa não ocorrer de forma eficiente, as placas de suco de maçã podem estar muito molhadas e precisam ser secas antes do uso.
   2. Veja a placa sob um escopo de disseminação com transilluminação (ou seja, a luz que passa pela placa para as oculares) para confirmar o estágio dos embriões.
   3. Selecione embriões em estágios de decote.
      NOTA: Os embriões do estágio de decote são totalmente opacos; os estágios de blastoderm subsequentes podem ser reconhecidos por uma faixa de citoplasma transparente ao redor do centro opaco¹⁵. Uma boa introdução sobre como reconhecer vários estágios embrionários está disponível no site (dado na referência¹⁶) mantido pela Sociedade de Biologia do Desenvolvimento.
   4. Usando pinças finas, pegue um embrião do estágio desejado por seus apêndices dorsais e transfira-o para o slide de vidro preparado coberto com um pedaço de fita dupla face. Coloque o embrião na fita. Minimizar a transferência de óleo.
   5. O mais suave possível, role o embrião através da superfície da fita, cutucando suavemente o embrião com o lado da ponta da pinça. Não cutuque o embrião diretamente com as pontas afiadas da pinça.
      NOTA: Se a força aplicada estiver muito baixa, o embrião não rolou. Se estiver muito alto, vai estourar. Encontrar a força intermediária adequada requer experiência e, portanto, esta etapa deve ser praticada com antecedência.
   6. Continue rolando o embrião até que a chorion adere transitóriamente à fita e rachaduras.
   7. Uma vez que o acorde racha, continue rolando para separar o embrião (ainda dentro da membrana vitelline) do acorde enquanto o acorde permanece preso à fita.
   8. Confirme se o acorde é completamente removido observando a perda dos apêndices dorsais do embrião.
   9. Role o embrião de volta para o acorde, que é menos adesivo do que a fita. Esfregue suavemente o embrião com a pinça até que se conecte à pinça para transferência.
   10. Transfira o embrião para o deslizamento com a cola heptane e traga-o em contato com a cola, que normalmente o tira da pinça.
   11. Ajuste a orientação do embrião no deslizamento de tampas.
       1. Incorpore a superfície lateral do embrião na cola.
          NOTA: A superfície do embrião embutido na cola é a que será imageada. Incorporar a superfície lateral é o mais simples, mas isso pode ser ajustado dependendo da preferência pessoal ou da pergunta biológica a ser respondida.
       2. Oriente o longo eixo do embrião perpendicular ao longo eixo da tampa.
       3. Se o embrião não estiver na orientação preferida, limpe a pinça para remover qualquer óleo que desprendesse o embrião da cola. Em seguida, tente gentilmente enrolar o embrião em posição.
   12. Prepare o número desejado de embriões para injeção da maneira descrita acima.
       NOTA: Com o passar do tempo após a remoção do acorde, o ar ambiente começará a dessecar os embriões e, assim, o efeito da etapa 5.3 será desigual para os embriões no deslizamento de cobertura, que foram descorrioados em diferentes momentos. Normalmente, 1-3 embriões são os mais gerenciáveis.
3. Dessicuar embriões.
   1. Coloque o deslizamento com embriões na câmara de proficação preparada e sele-o.
   2. Deixe os embriões se dessarcarem por 5-12 min.
      NOTA: O tempo desta etapa depende da temperatura ambiente e da umidade e, portanto, precisa ser determinado empiricamente.
   3. Remova a mancha de cobertura da câmara e coloque uma gota de óleo de halocarboneto 700 sobre ele, cobrindo totalmente os embriões, para evitar uma dessecação adicional.
   4. Inspecione os embriões em um escopo de dissecação para julgar a desiccação adequada.
   5. Se os embriões estiverem ligeiramente enrugados, mas não esvaziados, proceda à microinjeção (passo 6).
   6. Se os embriões não forem suficientes ou excessivamente dessecados, retorne à etapa 5.2 e prepare um novo lote de embriões, pois o Óleo de Halocarboneto 700 não pode ser removido. Se os embriões foram excessivamente dessecados, encurte o tempo de dessecação para o próximo lote de embriões em 3 minutos; se eles foram sub-dessecados, aumentar o tempo de dessecação em 3 minutos.

6. Embriões microinjetos

NOTA: Certifique-se de que a configuração de microinjeção inclui um microscópio invertido, um micromanipulador para segurar e posicionar a agulha de injeção e um microinjetor comercial para fornecer volumes controlados.

1. Ligue o microinjetor e insira as configurações preferidas.
   NOTA: Para este protocolo, recomenda-se usar a saída de movimento linear e a configuração rápida, mas muitos outros funcionarão. O operador deve determinar a preferência pessoal.
2. Coloque a agulha no micromanipulador. Para evitar que a agulha seja danificada enquanto carrega o deslizamento contendo os embriões, mova-a para fora do caminho para uma posição segura.
3. Coloque a mancha no palco, com embriões em cima, em direção à agulha. Em seguida, mova cuidadosamente a agulha de volta para a posição para injeção, com sua ponta ainda bem acima do palco.
4. Coloque o objetivo 4x no caminho da luz. Usando o botão de foco no microscópio, leve os embriões ao foco.
   NOTA: Este será o plano focal usado para injeção e será ajustado apenas minimamente daqui para frente.
5. Usando os controles de palco, mova os embriões horizontalmente para o centro do campo de visão.
   1. Afaste-se dos embriões, mantendo-os na borda do campo de visão, em preparação para baixar a agulha. Fique no mesmo plano focal para garantir que a agulha seja abaixada para a posição correta.
6. Abaixe a ponta da agulha no plano focal correto e certifique-se de que ela seja visível no campo de visão juntamente com os embriões.
   1. Usando os controles micromanipuladores e olhando de cima (ainda não através das oculares), lentamente derrube a ponta da agulha no óleo, visando a área onde o objetivo aponta. Como o óleo é bastante viscoso, vá lentamente para evitar danificar a agulha.
   2. Uma vez que a agulha seja visível através das oculares, continue usando os controles do micromanipulador até que a ponta da agulha esteja em foco e no centro do campo de visão.
   3. Ao mover o palco, traga os embriões de volta ao centro do campo de visão. Use o controle de palco, os controles do micromanipulador e o botão de foco para ajustar a posição do embrião e da ponta da agulha em relação um ao outro enquanto ambos estão em foco. Procure realizar injeções o mais próximo possível do deslizamento de tampas.
7. Realize o controle de qualidade da agulha.
   1. Para garantir que a agulha esteja funcional, dispense parte da solução de injeção no Óleo de Halocarbon 700 em torno do embrião, visível como uma bolha no óleo.
   2. Se nada está fluindo para fora da agulha, gradualmente aumentar a pressão no injetor. Se isso não funcionar, pegue uma agulha nova.
8. Injete o embrião.
   NOTA: Os volumes de injeção aceitáveis variam de ~0,06-1 pL. O limite inferior é definido pelo que pode ser visualizado entrando no embrião. O limite superior é definido pelo trauma que a injeção exerce sobre o embrião.
   1. Injete ao longo das bordas laterais do embrião, pois este é o menos invasivo.
   2. Usando os controles de estágio, mova o embrião em direção à ponta da agulha até que este perfure suavemente o embrião e entre nele.
   3. Ao mesmo tempo, inicie o fluxo da solução de injeção e observe o aparecimento de um ponto livre transitório no local da ponta da agulha, o que indica uma transferência bem sucedida de líquido para o embrião.
   4. Monitore o embrião. Se o embrião resistir à agulha e romper (citoplasma esguicha) na entrada, retorne ao passo 5 e aumente o tempo de proficação. Se o embrião estiver plano contra o deslizamento de tampas e aparecer disquete durante a injeção, retorne ao passo 5 e encurte o tempo de dissocição.
   5. Se nenhum corante entrou no embrião, confirme que o corante ainda pode fluir livremente da agulha como na etapa 6.7. Se o corante não fluir, substitua a agulha. Se o corante fluir, injete um novo embrião e comece a liberar o corante pouco antes da agulha perfurar o embrião.
      NOTA: As injeções repetidas do mesmo embrião não são recomendadas, pois rompe o local anterior da ferida/injeção.
9. Repita até que todos os embriões sejam injetados.

7. Embriões de imagem

NOTA: Este protocolo utiliza um microscópio confocal de varredura a laser.

1. Coloque o deslizamento no suporte metálico no microscópio confocal para que os embriões sejam imagens diretamente de baixo através do deslizamento de cobertura; acima da mancha de cobertura, há apenas óleo e nenhuma outra barreira.
2. Como um passo de controle de qualidade, imagem primeiro usando a função de epifluorescência no microscópio confocal, com um objetivo de 40x. Certifique-se de que o fluorforeiro esteja visível no embrião antes de prosseguir.
3. Se o plano de imagem desejado for diferente do local da injeção, permita tempo suficiente para o corante se difundir para a área alvo.
   NOTA: Para BOPIPY 493/503, desta vez normalmente varia de 30-60 min. Como o tempo de difusão depende muito do corante, outros corantes podem exigir a otimização do local de injeção e tempo de espera.
4. Use objetivos diferentes para imagem em diferentes escalas. Use um objetivo de 40x para imagem de todo o embrião e um objetivo de 63x para subseções de imagem para escalas menores.
5. Para imagens ao vivo durante os estágios sincicial antes da cellularização, use as seguintes condições para começar: tamanho de imagem de 512 x 512 pixels, média de linha de 3, taxa de quadros de 0,1 quadros por segundo (ou seja, 1 quadro adquirido a cada 10 s). Ajuste as condições de acordo com as capacidades do microscópio empregado.
   NOTA: Essas condições permitem adquirir ~500+ imagens do BOPIPY 493/503 e capturar a maior parte do movimento.

8. Analise o fluxo LD primeiro usando FIJI para preparar uma série de imagens temporidas e, em seguida, python para análise piv

1. Otimizar a aquisição de imagens.
   1. Realize injeções do corante desejado na fase apropriada. Repita esta etapa até que a variação do dia-a-dia seja insignificante.
   2. Otimize as configurações de aquisição de imagens, incluindo ampliação, zoom, resolução e taxa de quadros.
      NOTA: Há uma troca entre imagens de alta qualidade (resolução + média de linha) e velocidade de aquisição (taxa de quadros).
2. Prepare os dados em FIJI.
   1. Adquira uma série temporal de alta qualidade a ser analisada.
   2. Abra um quadro da série temporal para gerar uma máscara com FIJI. Duplicar a imagem. Converta o tipo da imagem em 8 bits.
   3. Defina o limite do embrião usando a Ferramenta de Seleção Polígono ou Freehand. Use Clear Outside para definir os valores dos pixels fora da seleção para 0. Limpe e, em seguida, inverta dentro da seleção para definir o valor dos pixels dentro da seleção para o valor máximo (255).
   4. Deselecione, em seguida, use o comando Histograma para garantir que apenas os valores de pixels de 0 e 255 estejam presentes.
   5. Salve esta nova máscara de imagem para a série de tempo específica.
   6. Abra a série de interesses. Escolha quais dez quadros melhor captam o tempo de interesse, por exemplo, o ciclo nuclear 9 no início da contração cortical. Duplique os dez quadros de interesse, formando um subsarem.
   7. Use a função Stack to Images para gerar 10 imagens para analisar com PIV.
   8. Salve os arquivos individuais de uma maneira que preserve sua ordem (SeriesX_1, SeriesX_2, SeriesX_3...).
3. Use a máscara preparada e os quadros individuais para análise de PIV, empregando o script python de amostra fornecido (dados suplementares) ou um script personalizado gerado pelo usuário.
   NOTA: O script fornecido é baseado na aplicação python do OpenPIV¹⁷. Ele produz distância em pixels que podem ser convertidos usando a largura do pixel e a taxa de quadros para gerar velocidades ou velocidades.
4. Gerar réplicas completando as etapas anteriores para embriões adicionais e compilando os valores de saída.

Representative Results

Após a injeção, o corante será localizado apenas no local onde a ponta da agulha foi inserida. O corante, então, se difundirá do local da injeção, dependendo de suas características difusivas. A Figura 1 mostra injeção de BODIPY 493/503, logo após a injeção (painel A) e 24 minutos depois (painel B). Depois de 24 min, o corante chegou ao ponto médio do eixo longo do embrião.

A análise da motilidade organela pode ser alcançada através de injeções de corante e imagens de lapso de tempo. Na Figura 2, um embrião foi co-injetado com BODIPY 493/503 (Figura 2A) e LysoTracker Red (Figura 2B) e imageado usando excitação a laser em 488 e 596 nm, respectivamente. Este embrião foi então imaged time-lapse (um quadro a cada 30 s por 30 min, 5 min analisado). A série temporal foi então executada através da análise PIV, a saída da qual é mostrada via simplificação na Figura 2A,B. Note que as aerodinâmicas não representam a trajetória das partículas individuais, mas o fluxo citoplasmômico é inferido a partir da análise de todas as partículas naquela região do citoplasma. Através da rotulagem de duas estruturas celulares independentes (LDs e organelas ácidas), a análise do PIV encontra fluxos semelhantes, com ambos os rótulos convergindo para a região central do embrião onde o citoplasma está fluindo para o interior do embrião⁶.

Atualmente, os FPs disponíveis permitem a rotulagem de muitas outras organelas e estruturas celulares. A Figura 3 mostra a rotulagem do ER via rastreador ER Green. O rastreador ER fornece uma boa resolução do envelope nuclear, permitindo a visualização dos principais estágios do ciclo celular. Rastreador ER Green é imaged usando excitação de 488 nm.

A rotulagem das mitocôndrias é complicada, pois a maioria dos corantes testados parecem estar presos na primeira mitocôndria que entram. Por outro lado, não foi detectado nenhum sinal de toxicidade do corante, possibilitando o seguimento de mitocôndrias rotuladas através da celularização e do ciclo nuclear ectodérmico 15. A Figura 4 mostra uma célula ectodérmica várias horas após a injeção com Mitoview 633 (comprimento de onda de excitação 633 nm).

BODIPY, Lysotracker e LipidSpot são robustos e podem ser usados para adquirir ~500+ imagens em 512 x 512, linha média 3, taxas de quadros de 1/s a 0,1/s. Rastreador ER Green, SiR-tubulin, e os corantes mitocondriais mencionados são menos robustos e produzem ~50-200 imagens sob as mesmas condições.

Começando em estágios de blastoderm, os LDs se movem bidirecionalmente ao longo de microtúbulos, alimentados pelos motores de polaridade oposta kinesin-1 e dynein citoplasmica⁵. Este movimento pode ser visualizado co-rotulando LDs e microtúbulos através da injeção tanto BODIPY 493/503 quanto SiR-Tubulin (Figura 5). À medida que os LDs frequentemente invertem sua direção de movimento (à medida que alternam entre a cinesina-1 e a dynein citoplasmática), taxas de quadros mais altas durante a aquisição capturam melhor detalhes críticos da motilidade LD.

Imagens vivas de vesículas autofluorescentes de gema são possíveis sem qualquer forma de injeção de corante (Figura 6). No entanto, a autofluorescência é fraca, e o laser de excitação é fototóxico. Assim, a imagem viva da gema autofluorescente tem uma baixa relação sinal-ruído em relação à injeção de corante.

Figura 1: Difusão do BODIPY 493/503 através do embrião. O corante foi injetado ao longo da borda lateral em direção à extremidade anterior (superior direita) e difusa deste local de injeção para o embrião, rotulando LDs. (A) O corante difundiu através de porções do embrião adjacente ao local da injeção. (B) Cerca de 24 min/2 ciclos nucleares depois, o corante difundiu além do ponto médio do embrião. Barra de escala: 100 μm. Um quadro 1024 x 1024 (média da linha 4) foi adquirido a cada 30 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Velocimetria de imagem de partículas (PIV) para LDs e organelas ácidas. Um embrião foi injetado com bodipy 493/503 e LysoTracker Red. (A) canal BODIPY. (B) Canal LysoTracker Red. (A',B') Simplifique os diagramas gerados pela análise piv dos dois canais gerados a partir de 10 quadros sequenciais, incluindo os mostrados em A e B. A ' corresponde ao fluxo de LDs, e B' corresponde ao fluxo de organelas ácidas. Note que tanto A' quanto B' mostram uma confluência à esquerda do centro onde o conteúdo embrionário está fluindo para fora do plano de visão, para o centro do embrião. Além disso, note que o BODIPY difundiu mais do que o LysoTracker, pois diferentes corantes têm propriedades difusivas diferentes. Barra de escala: 100 μm. Um quadro 1024 x 1024 (média da linha 4) foi adquirido a cada 30 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Rastreador de ER rotula divisões nucleares sinintítidas. Um embrião de blastoderm sinintita foi microinjetado com rastreador ER e uma parte de sua superfície foi imagens ao longo do tempo. (A) Montagem de eixos durante uma divisão nuclear. (B) Abscisão do envelope nuclear durante a mesma divisão. (C) Interfase subsequente. (D) O início da próxima divisão é indicado pela aparência central (ocorrência de regiões circulares livres de ER, marcadas por pontas de flecha). Note o branqueamento gradual de corante. Comprimento de onda de excitação: 488 nm. Barra de escala: 5 μm. A: quadro inicial, B: 3 min decorrido, C: 10 min decorridos, D: 13 min decorridos. Um quadro 1024 x 1024 (média da linha 4) foi adquirido a cada 30 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Rotulagem mitoview 633 de mitocôndrias. Um embrião foi injetado com Mitoview 633 durante o estágio de blastoderm sinintítial e imagem 4h depois, após a cellularização. A imagem mostra uma célula neuroectodérmica de um embrião na extensão da banda de germes. Barra de escala: 5 μm. Um quadro 1024 x 1024 (média da linha 4) foi adquirido a cada 30 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Co-rotulagem de LDs e microtúbulos. Um embrião celularizador foi injetado com uma mistura de BODIPY 493/503 ( amarelo A,B,C) e SiR Tubulin (magenta A',B',C'). A'', B'', C'' mostram os canais mesclados. Os painéis A, A', e A'' mostram o quadro inicial, os painéis B, B' e B'' mostram o quadro após os 5 s, e os painéis C, C' e C'' mostram o quadro após os 10 s. Barra de escala: 5 μm. Um quadro 512 x 512 (média da linha 3) foi adquirido a cada 2,5 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Autofluorescência de vesícula de gema de imagem durante os estágios de decote siníntial. (A) No início da aquisição. (B) Após 8 min. (C) Após 16 min. Comprimento de onda de excitação: 405 nm. Baixa intensidade de excitação foi usada para manter o embrião vivo. Barra de escala: 100 μm. Um quadro 1024 x 1024 (média da linha 4) foi adquirido a cada 30 s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O embrião de Drosophila é um modelo poderoso e conveniente para estudar questões fundamentais na biologia celular e organismo. Sua relativa simplicidade, genética poderosa e tamanho pequeno fazem dele um excelente sistema para imagens, tanto processos celulares quanto desenvolvimento. Aqui, um protocolo padrão de microinjeção é adaptado para permitir o uso de FP em embriões. Esta abordagem permite imagens fluorescentes de estruturas celulares específicas sem a necessidade de fluoroforos geneticamente codificados, abrindo muitas origens genéticas para a imagem. A combinação de múltiplos corantes e proteínas marcadas fluorescentes estrategicamente escolhidas podem abrir imagens ao vivo multicanais abrangendo todo o espectro de luz visível.

Passos críticos no protocolo:
Este protocolo usa o BODIPY 493/503 para rotular LDs. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para marcar outras estruturas celulares. Para análise de imagem subsequente, um dos fatores mais importantes é a relação sinal-ruído, ou seja, o brilho do corante em comparação com o sinal de fundo. Lysosomes foram com sucesso imagens (LysoTracker Red, 1 mM), bem como mitocôndrias (Mitoview 633, 200 μM), o ER (ER tracker Green, 10 μM) e microtúbulos (SiR tubulin, 200 nM em DMSO), como mostrado na Figura 2, Figura 3, Figura 4, Figura 5. Além disso, as vesículas de gema são autofluorescentes e emissam luz azul sobre a excitação UV (imagem usando 405 nm como o comprimento de onda de excitação (Figura 6)). Para outros corantes, a meta é que a concentração de corante seja de 100 a 1.000x do que seria necessário para a coloração de células cultivadas ao vivo; isso é semelhante à concentração de uma solução de estoque que seria diluída em meios de cultura celular. Como este protocolo exige uma injeção de 100 fL e o embrião de Drosophila é de aproximadamente 9 nL no volume¹⁸, essas concentrações de corante saem em média para uma concentração embrionária interna de menos de 1/100 do que está presente na mídia da cultura celular. Temporariamente, a concentração local será maior no local da injeção, o que é mais relevante para os FPs que não difundem bem (ou seja, corantes mitocondriais e SiR-tubulin). Para estes FPs, comece pelas altas concentrações recomendadas; se for observada uma morte inesperada, dilui sucessivamente duas vezes até que um compromisso aceitável entre sobrevivência e força de sinal seja alcançado.

Ao co-injetar vários corantes, ambos os corantes devem estar no mesmo solvente, ou tanto os solventes quanto os corantes devem ser compatíveis com a mistura (concentrações de álcool superiores a ~10% não são recomendadas).

A qualidade das agulhas é essencial para o sucesso deste procedimento, pois a ponta precisa ser a melhor possível. Caso contrário, danos causados pela ferida de injeção podem comprometer o desenvolvimento subsequente do embrião. Como os puxadores de agulha comercial diferem, é importante seguir as sugestões do fabricante e experimentar vários parâmetros de puxar até que a forma desejada seja alcançada. É fundamental realizar o controle de qualidade passo 1.1.3, pois trabalhar com uma ponta de agulha rachada, irregular ou grande furo tornará a injeção bem sucedida mais difícil ou até mesmo impossível.

O embrião precisa ser parcialmente dessecado para que volumes adicionais de líquido possam ser adicionados durante a injeção. Se o embrião estiver sub-dessecado, a agulha não entrará facilmente, e o citoplasma irá esguichar à medida que a agulha penetra ou à medida que a solução é injetada. Se o embrião estiver super dessecado, ele parecerá esvaziado e não se desenvolverá adequadamente. O tempo exato de secagem depende das condições locais, por exemplo, da umidade do ar, e pode mudar de dia para dia. Tem que ser determinado empiricamente para cada sessão.

A capacidade do embrião de sobreviver após a microinjeção depende criticamente da qualidade da agulha, da dessecação adequada e da limitação do volume de injeção a menos de 1 pL (idealmente 100 fL). Enquanto esses parâmetros forem otimizados, nenhuma toxicidade significativa é aparente quando os corantes descritos são injetados nas concentrações recomendadas. Se os embriões sobrevivem aos passos de dessecação e injeção, eles normalmente se desenvolvem com sucesso na extensão da banda germinal, uma exceção sendo as sondas microtúbula e ER que causaram defeitos de celularização em altos níveis (injeção de 100 fL da concentração de estoque de cada um). Os testes não encontraram defeitos óbvios de desenvolvimento quando dMSO, água e misturas dos dois foram injetados nos volumes recomendados, com uma taxa de sobrevivência embrionária através de extensão de banda germinal de ~75% ou mais. Volumes de injeção acima de 1 pL causaram defeitos e embriões injetados com ~4 pL de volumes desenvolvidos por menos de 1h. Portanto, os volumes de injeção precisam ser mantidos baixos, o que significa que as concentrações de corante devem ser altas.

Geralmente, as injeções ao longo da borda lateral do embrião são recomendadas como resultado do menor dano. No entanto, o local de injeção pode precisar ser ajustado dependendo das propriedades difusivas dos FPs empregados. BODIPY 493/503 e LysoTracker difundem mais rápido em todo o embrião do que lipídio Spot 610 (outro corante para marcar LDs), enquanto SiR-Tubulin e Mitoview 633 nunca se difundem totalmente através do embrião (imagens até 7h após a injeção). Assim, pode ser necessária a injeção dentro ou perto do local de interesse. Ao injetar nas regiões anterior ou posterior, recomenda-se uma agulha particularmente fina.

A aquisição de imagens conta com microscopia confocal para seção óptica e resolução de pequenas organelas e todos os componentes citoesqueléticos. Técnicas que requerem análise de muitas imagens (por exemplo, STORM ou PALM) não funcionarão porque os conteúdos embrionários estão em movimento e os fluoroforos não são otimizados para fotossaritching. A microscopia de epifluorescência carece da resolução lateral e axial para fazer a maioria das organelas e estruturas celulares menores. Por essas razões, é fortemente recomendado usar um microscópio confocal ou empregar tecnologia de folha de luz.

A reprodutibilidade da análise de imagem depende muito de dados de imagem consistentes. Para a maior chance de sucesso, é necessária a otimização da técnica de injeção e aquisição de imagem. Estabelecer e praticar uma técnica onde o corante(s) de interesse, local de injeção, idade do embrião, volume de injeção e configuração de aquisição são todos consistentes irá gerar os dados mais robustos para análise de imagem.

Modificações e solução de problemas do método
Este protocolo demonstra um método para analisar o fluxo a granel de LDs em embriões estágio de decote usando velocimetria de imagem de partículas. A mesma abordagem pode ser usada para outras organelas, outros estágios de desenvolvimento e outros métodos de análise. Por exemplo, a Figura 2 mostra a análise de LDs e organelas ácidas fluindo nos estágios siníntiicos da embriogênese, visualizadas pela co-injeção BODIPY 493/503 e LysoTracker Red. Mais imagens bem sucedidas do movimento LD em embriões até 7 h pós-fertilização foram obtidas; esses embriões retêm a ferida de injeção, mas são capazes de se desenvolver por várias horas.

Os dados coletados usando este protocolo têm sido usados para velocimetria de imagem de partículas, mas muitas outras técnicas de análise estão disponíveis. Por exemplo, programas de rastreamento de partículas como os encontrados no ImageJ, Imaris ou rastreamento manual podem ser usados para obter velocidades e direcionais de estruturas móveis. Observe que a maioria desses softwares de rastreamento são construídos para trabalhar com dados de sistemas de cultura de células planar e nem sempre se adaptam bem a estruturas 3D como o embrião Drosophila . Além disso, para a geração dos dados de rastreamento de partículas de melhor qualidade, vários planos Z precisariam ser imagens; isso deve ser viável se os tempos de aquisição da pilha de imagens estiverem abaixo de ~2 s. Este benchmark deve ser alcançável em disco giratório confocal, folha de luz de rede e sistemas confocal de varredura a laser recentes. No entanto, a viabilidade do rastreamento de partículas para organelas abundantes, como LDs, mitocôndrias e lysosomes é baixa, pois a quantidade de sinal positivo em um campo de visão é muito alta para os métodos de rastreamento atuais. O rastreamento de estruturas menos abundantes como nuclei ou vesículas de gema pode ser possível. PIV para análise de fluxo funciona bem para LDs e organelas ácidas em estágios de decote porque ambas as organelas se movem livremente. Organelas como núcleos, ER e mitocôndrias estão amarradas a outras estruturas celulares e, portanto, não se movem livremente e não são adequadas à análise de software que assume o movimento livre. O investigador deve escolher as técnicas mais adequadas à organela de interesse.

Durante os estágios de blastoderm siníntial e celular, os LDs (bem como algumas outras organelas) se movem ao longo de microtúbulos radialmente orientados⁵. Portanto, é possível encontrar visões transversais (como na Figura 5) onde microtúbulos únicos estão em foco para longas distâncias, permitindo o rastreamento de partículas em 2D. Uma vez que esses planos ópticos estão dentro do embrião, a força geral do sinal é diminuída, e a relação sinal-ruído é reduzida.

Para análise de rastreamento, imagens o mais rápido possível podem revelar detalhes cruciais do movimento e, portanto, do maquinário motile. Por exemplo, o movimento de gotícula lipídica é uma mistura de dois estados motile, câmera lenta (~200 nm/s; distância média de viagem ~100 nm) e movimento rápido (~450 nm/s; distância média de viagem ~1.000 nm)¹⁹; assim, se as imagens são tiradas a cada segundo ou até menos com menos frequência, o estado lento-curto torna-se indetectável. No entanto, imagens frequentes também induz branqueamento fluorohore e fototoxicidade. As condições de imagem, portanto, devem ser ajustadas dependendo da pergunta exata a ser abordada.

Limitações do método
Dependendo do corante desejado, o método pode ser limitado pela compatibilidade entre a solubilidade do corante e a toxicidade da solução de injeção. Álcoois como isopropanol e etanol são difíceis de manusear dentro de uma agulha devido à sua viscosidade mais baixa e parecem danificar componentes celulares e matar o embrião.

O método também não é adequado para visualizar os primeiros passos da embriogênese porque leva mais de 30 minutos para preparar os embriões para injeção. À temperatura ambiente, os ciclos celulares iniciais do embrião têm apenas ~10 min de comprimento cada; assim, mesmo que se escolhesse um óvulo recém-fertilizado na etapa 5.2.3, os primeiros ciclos celulares já estariam concluídos quando o embrião estiver pronto para a imagem.

A iluminação com luz na faixa UV/azul é consideravelmente mais fototóxica do que para comprimentos de onda mais longos. Sob tais condições (por exemplo, para seguir vesículas de gema autofluorescentes; Figura 6), é preciso limitar o tempo de imagem (levando a séries de tempo mais curtas) ou usar menor potência laser (resultando em uma redução da relação sinal-ruído).

Após a celularização, os corantes injetados em um local específico tendem a difundir mal, pois devem atravessar muitas membranas celulares. Isso limita a região de observação em estágios posteriores de desenvolvimento.

A significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos
O movimento de LDs e outras organelas contendo lipídios em embriões primitivos pode ser visualizado com fluoroforos geneticamente codificados, técnicas livres de rótulos e pela introdução de FPs. Este último pode ser alcançado por permeabilização da membrana vitelline¹² ou pela abordagem de microinjeção aqui discutida.

Fluoroforos geneticamente codificados são marcadores versáteis cujos níveis são tipicamente altamente reprodutíveis de embrião para embrião. No entanto, eles têm rendimentos quânticos mais baixos e branqueamento mais facilmente do que os FPs. Normalmente, eles só estão disponíveis em uma ou duas versões marcadas (por exemplo, GFP ou mCherry), limitando a escolha de quais estruturas podem ser imagens simultaneamente. Os FPs, por outro lado, muitas vezes existem em uma grande variedade; por exemplo, vários corantes específicos de gotículas lipídicas estão disponíveis com espectro de emissão de Autodot no espectro UV/azul para Lipidtox e LipidSpot 610 no espectro vermelho distante. Os FPs também podem ser diretamente aplicados a qualquer tensão de interesse e, portanto, não requerem a construção de tensão para, por exemplo, introduzir o marcador de organela desejado em uma variedade mutante de interesse. Essa vantagem é particularmente pronunciada quando múltiplas estruturas devem ser rotuladas simultaneamente; em vez de cruzes demoradas que abrangem várias gerações, isso pode ser alcançado em um único dia, misturando os corantes relevantes e introduzindo-os ao mesmo tempo. Finalmente, se os processos celulares forem sondados com inibição farmacológica, drogas e corantes podem ser introduzidos juntos.

Métodos sem rótulos são abordagens muito poderosas para detectar estruturas celulares específicas. Por exemplo, LDs podem ser especificamente detectados em embriões precoces por microscopia de terceira geração harmônica²⁰ ou por microscopia estimulada de Perda de Raman²¹. Como os FPs, essas abordagens podem ser aplicadas em qualquer fundo genético, e por não causar branqueamento, elas potencialmente permitem uma aquisição mais rápida de imagens. No entanto, elas são tipicamente limitadas a organelas específicas e, portanto, não suportam por si só a imagem multiplex; eles também requerem microscópios especializados.

Existem duas estratégias gerais para introduzir pequenas moléculas em embriões. Uma delas é a abordagem de microinjeção empregada aqui; o outro é o tratamento químico (terpeno) para permeabiliizar a membrana vitelline. Esta última abordagem¹² é menos envolvida do que a microinjeção, mas também mais variável de embrião para embrião. Além disso, após a permeabilização, a proteção fornecida pela membrana vitelline é comprometida e o embrião adequado é acessível ao meio externo, tornando mais desafiador mantê-lo vivo. Microinjeção é muito menos provável de descarrilar o desenvolvimento embrionário do que a permeabilização. No entanto, a permeabilização é recomendada se muitos embriões precisam ser monitorados simultaneamente, por exemplo, para fins de rastreamento de medicamentos. Para acompanhar o movimento das estruturas celulares e obter séries de imagens reprodutíveis adequadas para análise de imagens, microinjeção é o método de escolha.

Importância e aplicações potenciais do método em áreas específicas de pesquisa
O embrião de Drosophila é um importante sistema modelo para o estudo de muitos processos célula-biológicos e de desenvolvimento ^1,5,6. A marcação de organelas com proteínas fluorescentes contribuiu muito para a compreensão de como o embrião precoce se desenvolve, como várias organelas traficam e como esse tráfico é modulado de forma desenvolviária e geneticamente. No entanto, sua propensão ao alvejante e os desafios de gerar cepas nas quais múltiplas organelas são rotuladas com cores diferentes limitam a aplicação dessa abordagem. O uso de FPs introduzidos pela microinjeção resolve muitos desses desafios e pode até ser combinado com proteínas fluorescentes marcadas. Esta técnica permite a imagem de múltiplas organelas, estruturas celulares e componentes citoesqueléticos em qualquer fundo genético. Como resultado, vários genótipos podem ser comparados via imagem ao vivo, possibilitando determinar o efeito de mutações no tráfico de múltiplas organelas.

Este protocolo demonstra a abordagem de injeção de FP para embriões de Drosophila melanogaster, mas, em princípio, essa abordagem se aplica a quaisquer ovos de insetos para os quais foram estabelecidas técnicas de microinjeção, incluindo outras espécies de Drosophila, grilos²² e pulgões²³.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AUTODO	abcepta	SM1000a	Stains lipid droplets in violet/blue
BODIPY 493/503	ThermoFisher	D3922	Stains lipid droplets in green
Desiccant Beads –Desiccant-Anhydrous Indicating Drierite	W.A. Hammond Drierite Company	21001
Dissecting microscope SteREO DiscoveryV20 with transillumination base	Zeiss	4350030000000000
Double sided tape-Permanent Double-Sided Tape	Scotch (3M)	-	Sold by many vendors
ER-Tracker Green (BODIPY FL Glibenclamide)	ThermoFisher	E34251	Stains the ER/nuclear envelope
Femptotip II	Eppendorf	H129354N	Ready to use
Glass capillaries -Glass Thinw w/fil 1.0mm 4in	World Precision Instruments	TW100F-4	Must be pulled
Glass coverslip	-	-	Buy the appropriate refractive index for your objective lens
Glass slides -Double Frosted Microscope Slides precleaned	FisherBrand	12-550-343
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML
Heptane greener alternative anhydrous, 99%	Sigma-Aldrich	246654-1L	Heptane is considered toxic by the USA's OSHA
Confocal microscope	Leica	Sp5	Many different types of confocal microscopes will work.
LipidSpot 610	Biotium	#70069	Stains lipid droplets in far red
LysoTracker Red	ThermoFisher	L7528	Stains lysosomes in red
MitoView 633	Biotium	#70055	Stains mitochondria
Needle loading pipette tips - 20uL microloader tips	Eppendorf	# 5242956.003
P-1000, Next Generation Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000	The settings used are heat-470, pull-70, velocity-60, delay-90, pressure-200, ramp-479 at 1x1. They refer to the intensity and length of the heating, the timing of pulling force and whether the force is applied linearly. Using these conditions, one capillary generates two usable needles with fine openings at the tip.
SiR-Tubulin	Cytosketon Inc	CY-SC014	Made by Spirochrome; Cytoskeleton Inc. is the North American distributor. Stains microtubules in far red
TransferMan	Eppendorf	5178 NK
ViaFluor 405	Biotium	#70064	Stains microtubules in violet/blue