Summary
Aqui, entregamos miRNA exógeno sintetizado artificialmente ao rim via injeção na veia caudal de um vetor não viral e nanopartículas de polietilenimina em vários modelos de camundongos com doença renal. Isso levou a uma superexpressão significativa de miRNA-alvo no rim, resultando em progressão inibida da doença renal em vários modelos de camundongos.
Abstract
microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem lotes de RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando e inibindo sua tradução em várias doenças renais. Portanto, a alternância da expressão de miRNA por miRNAs exógenos sintetizados artificialmente é uma opção de tratamento potencialmente útil para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais. No entanto, como a RNAase sérica degrada imediatamente os miRNAs exógenos administrados sistematicamente in vivo, a entrega de miRNA ao rim permanece um desafio. Portanto, vetores que possam proteger miRNA exógeno imita da degradação por RNAase e entregá-los significativamente ao rim são necessários. Muitos estudos têm usado vetores virais para entregar miRNA exógeno imita ou inibidores para o rim. No entanto, vetores virais podem causar uma resposta de interferon e/ou instabilidade genética. Portanto, o desenvolvimento de vetores virais também é um obstáculo para o uso clínico de miRNAs exógenos ou inibidores. Para superar essas preocupações em relação aos vetores virais, desenvolvemos um método de vetor não viral para entregar miRNA miméticos ao rim usando injeção na veia caudal de nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), o que levou à superexpressão significativa de miRNAs alvo em vários modelos de doença renal em camundongos.
Introduction
Os miRNAs, pequenos RNAs não codificantes (21-25 bases) que não são traduzidos em proteínas, inibem muitos RNAs mensageiros alvo (mRNAs), desestabilizando-os e inibindo sua tradução em várias doenças renais 1,2. Portanto, a terapia gênica empregando miRNAs exógenos sintetizados artificialmente ou inibidores é uma nova opção potencial para inibir o desenvolvimento de muitas doenças renais 3,4,5.
Apesar da promessa de miRNA imita ou inibidores para terapia gênica, a entrega a órgãos-alvo continua sendo um grande obstáculo para experimentos in vivo desenvolverem seu potencial clínico. Como os miRNAs sintetizados artificialmente imitam ou inibem a degradação imediata pela RNase sérica, sua meia-vida é encurtada após administração sistêmica in vivo6. Além disso, a eficiência dos miRNAs miméticos ou inibidores para atravessar a membrana plasmática e o citoplasma transfecto é geralmente muito menor sem vetores apropriados 7,8. Essas linhas de evidência sugerem que o desenvolvimento do sistema de liberação de miRNA imita ou inibidores para o rim é necessário, para permitir seu uso em ambientes clínicos e torná-los uma nova opção de tratamento para pacientes com várias doenças renais.
Vetores virais têm sido utilizados como carreadores para liberar miRNAs exógenos miméticos ou inibidores para o rim 9,10. Embora tenham sido desenvolvidos para biossegurança e eficácia transfectiva, vetores virais ainda podem causar resposta ao interferon e/ou instabilidade genética11,12. Para superar essas preocupações, desenvolvemos um sistema de liberação de miRNA miRNA para o rim usando nanopartículas de polietilenimina (PEI-NPs), um vetor não viral, em vários modelos de doença renal em camundongos13,14,15.
As NP-PEIs são NPs lineares baseadas em polímeros que podem efetivamente entregar oligonucleotídeos, incluindo miRNA miméticos, ao rim, e são consideradas preferíveis para a preparação de vetores não virais devido à sua segurança e biocompatibilidade a longo prazo13,16,17.
Este estudo demonstra os efeitos do miRNA exógeno sistemático mimetizando a liberação com PEI-NPs via injeção na veia caudal em camundongos modelo de fibrose renal produzidos por obstrução unilateral do ureter (UUO). Adicionalmente, demonstramos os efeitos da entrega sistemática de miRNA exógeno mimetizada com PEI-NPs via injeção na veia caudal em camundongos modelo de doença renal diabética (camundongos db/db: C57BLKS/J Iar -+Lepr db/+Leprdb) e camundongos modelo de lesão renal aguda produzidos por lesão de isquemia-reperfusão renal (IRI).
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Protocol
Todos os protocolos experimentais em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Jichi Medical University e realizados de acordo com as diretrizes de Uso e Cuidado de Animais Experimentais do Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals. Aqui, demonstramos a entrega de miRNA mimetiza o rim, resultando em sua superexpressão usando camundongos UUO. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Jichi Medical University [Aprovação nºs 19-12 para fibrose renal, 17-024 para infecção renal aguda (IRA) e 19-11 para nefropatia diabética].
1. Preparação do complexo PEI-NPs-miRNA-mimic
NOTA: Aqui, a preparação de PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 e PEI-NPs-control-miRNA (como um controle negativo) são descritas para um camundongo.
- Prepare os seguintes itens:
- Preparar 10 μL de PEI-NPs lineares.
- Preparar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente dissolvidos em água livre de nucleases a uma concentração de 100 μM (5 nmol de miRNA dissolvidos em 50 μL de água livre de nucleases).
- Preparar 50 μL de miRNAs de controle (não-alvo) sintetizados artificialmente dissolvidos em água livre de nucleases a uma concentração de 100 μM (5 nmol miRNA dissolvidos em 50 μL de água livre de nucleases).
- Preparar soluções de glicose a 5% e 10%. Garanta a disponibilidade de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e um misturador de vórtices.
- Dissolver 10 μL de PEI-NPs em 90 μL de solução glicosada a 5% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Misturar 50 μL de miRNAs sintetizados artificialmente (5 nmol) dissolvidos em água livre de nucleases (concentração de 100 μM) com 50 μM de solução de glicose a 10% em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo. Este processo produz miRNA dissolvido em solução de glicose a 5%.
- Misturar 100 μL de PEI-NPs em solução glicosada a 5% e 100 μL de miRNA mimic (5 nmol) em solução glicosada a 5%. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Incubar a mistura por 15 min à temperatura ambiente (TR) para preparar um complexo estável de PEI-NPs-miRNA-mimic. Esta solução contém PEI-NPs e miRNA mimic (5 nmol) na proporção de nitrogênios (N) no polímero para fosfato (P) em ácidos nucléicos (relação N/P) = 6 (Figura 1).
NOTA: O complexo PEI-NPs-controle-miRNA pode ser preparado usando o mesmo processo descrito nas etapas 1.1-1.5 para todos os modelos de camundongos com doença renal descritos neste manuscrito (UUO, nefropatia diabética e IRA). Um volume de injeção de PEI-NP-miRNAs-mimic é o mesmo que 5 nmol de miRNAs-mimic conjugados com PEI-NPs na relação N/P = 6. A duração e a frequência de cada mimetismo de PEI-NP-miRNAs dependem do modelo de doença em que é aplicado.
2. Confirmação da entrega significativa de miRNA mimic ao rim em camundongos UUO por PEI-NP via injeção na veia caudal usando microscopia fluorescente
NOTA: Aqui, o método de entrega de miRNA purificado artificialmente mimetizar para o rim é elaborado, indicando o estabelecimento de métodos terapêuticos para várias doenças renais. Em resumo, camundongos UUO receberam miRNA marcado com ácido carboxílico cianine3 (Cy3) adicionado a 100 μL de PEI-NPs através da veia caudal. O parto nos rins foi confirmado com microscopia de fluorescência. É descrito o mimico de miRNA marcado com ácido carboxílico (Cy3) (Cy3) de PEI-NPs-cianina 3 para um camundongo. Este método pode entregar significativamente miRNA mimic para o rim em vários modelos de camundongo, tais como camundongos UUO, camundongos diabéticos com doença renal, e camundongos AKI produzidos por IRI. Aqui, usamos um modelo de mouse UUO para a demonstração em vídeo. O método de indução da UUO foi descrito anteriormente em outro artigo13. Siga estes protocolos dentro de seis dias após a cirurgia UUO.
- Prepare os seguintes itens:
- Preparar 2 μL de PEI-NPs e 100 μL de oligonucleotídeos de fita dupla marcados com Cy3 [Cy3-labeled miRNA mimic (1 nmol; 10 μM)].
- Preparar soluções de glicose a 5% e 10%. Garanta a disponibilidade de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e um misturador de vórtices.
- Use um tubo de centrífuga de plástico de 50 mL com um pequeno orifício na tampa para isolar as veias da cauda de camundongos UUO.
- Para microscopia de fluorescência, prepare um composto de temperatura de corte ideal (OCT), um criostato, nitrogênio líquido, solução salina tamponada com fosfato (PBS), seringas de 1,0 mL com uma agulha de 27 G e vidro revestido com silano.
NOTA: A lectina tetragonolobus Lotus marcada com fluoresceína (um marcador tubular proximal) e o 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) podem ser preparados para coloração opcional de túbulos proximais e núcleos celulares.
- Dissolver 2 μL de PEI-NPs em 98 μL de solução glicosada a 10% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Adicionar 100 μL de miRNA marcado com Cy3 mimic a 100 μL de PEI-NPs em solução de glicose a 10% (preparada na etapa 2.2). Em seguida, vórtice o tubo suavemente e gire para baixo.
- Incubar a mistura por 15 min em RT para preparar um complexo estável de PEI-NPs-Cy3-labeled-miRNA-mimic.
- Coloque o rato UUO de cabeça num tubo de centrífuga de 50 ml sem anestesia e, em seguida, coloque a cauda através do orifício preparado na tampa.
- Encher uma seringa de 1,0 mL com uma agulha de 27 G com 200 μL do complexo PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimic.
- Injetar PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) através da veia caudal do rato, utilizando a seringa de 1,0 ml com agulha 27 G.
NOTA: Limpe a veia da cauda com algodão saturado em etanol (70%-80%) para dilatar a veia da cauda e desinfetar a área de injeção. - Uma hora após 200 μL da injeção do complexo PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimetiza o camundongo, anestesiar o camundongo com isoflurano (4%-5%) usando um dispositivo anestésico apropriado para pequenos animais. Confirme a profundidade da anestesia com a ausência do reflexo de pinça dos dedos. Manter a anestesia com isoflurano (3%) durante toda a cirurgia.
- Em seguida, faça uma incisão na pele, músculos e costelas com tesoura cirúrgica e pinça para expor o coração. Depois de fazer uma incisão no átrio direito, injete PBS no ventrículo esquerdo para extrair sangue por todo o corpo até que a cor do rim mude para amarelo pálido (indicando que todo o corpo do rato é perfundido com PBS).
NOTA: A perfusão cardíaca é realizada para remover eficientemente o sangue por todo o corpo. - Pare o isoflurano e remova os rins dos ratos e lave-os com PBS. Depois disso, remova as cápsulas renais dos rins e lave os rins duas vezes com PBS.
- Incorporar as amostras de tecido renal em composto OCT e congelar em nitrogênio líquido.
- Use um criostato para preparar seções (5 μm de espessura). Monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano e fixe-as com paraformaldeído a 4%.
NOTA: Os tecidos renais podem opcionalmente ser corados com lectina tetragonolobus Lotus marcada com fluoresceína (2 mg/mL) na RT por 2 h para os túbulos proximais, seguida por DAPI (30 nM em PBS) na RT por 15 min para os núcleos celulares. - Lave suavemente as lâminas duas vezes com PBS.
- Visualize a coloração de fluorescência por microscopia de fluorescência em aumentos de 100x e 400x e software de imagem apropriado.
3. Confirmação de alterações de miRNA alvo após a entrega de miRNA mimico ao rim por PEI-NP via injeção na veia caudal
- Realizar reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) para confirmar as alterações de miRNA alvo.
NOTA: Consulte o artigo publicado anteriormente para obter os detalhes do qRT-PCR18,19,20. O sistema qRT-PCR usado para gerar os resultados representativos fornecidos abaixo foi alterado pelo fabricante. qRT-PCR deve ser realizado de acordo com o protocolo mais recente do fabricante.
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Representative Results
Os miRNAs alvo para fibrose renal, nefropatia diabética e LRA descritos abaixo foram selecionados com base no microarray, qRT-PCR e/ou pesquisa em banco de dados para aplicações em terapia gênica. Para mais detalhes, consultar as publicações anteriores13,14,15.
Liberação e efeitos do miRNA-146a-5p-mimetismo usando PEI-NPs em camundongos com fibrose renal13
A análise por microscopia fluorescente mostrou que a injeção de PEI-NPs na veia caudal pode entregar o miRNA mimático ao espaço túbulo-intersticial. Em camundongos com fibrose renal produzida por UUO, isso incluiu células tubulares renais, que não têm uma forma regular no rim (seta da Figura 2A), e o glomérulo (Figura 2A). A análise de qRT-PCR mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic induziu uma superexpressão significativa de miRNA-146a-5p no rim (Figura 2B). Além disso, a injeção inibiu a progressão da fibrose renal nos camundongos modelo produzidos por UUO, como estimado com a coloração vermelho Sirius (vermelho indica áreas fibróticas) in vivo. A injeção de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic foi realizada 1 dia antes, 1 dia após e 3 dias após o tratamento com UUO (estimado 6 dias após o tratamento com UUO) (Figura 2C). A injeção de miRNA controle de NPs-IPE não mostrou efeitos preventivos sobre a fibrose renal (Figura 2B,C). A administração de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic e PEI-NPs-miRNA-control-miRNAs não causou resposta de IFN, como aumento da expressão de 5-oligoadenilato sintase e transdução de sinal e ativador da transcrição 1 em camundongos (Figura 2D).
Liberação e efeitos do miRNA-181b-5p-mimetizam usando PEI-NPs em camundongos modelo de doença renal diabética14
Para avaliar o potencial terapêutico do miRNA-181b-5p para doença renal diabética, injetamos miRNA-181b-5p-PIE-NPs ou controlamos miRNA-PIE-NPs em camundongos db/db de 10 semanas de idade semanalmente por 10 semanas. A análise por microscopia fluorescente mostrou que a injeção de PEI-NPs na veia caudal pode entregar miRNA mimético ao glomérulo e ao espaço túbulo-intersticial em rins de camundongos modelo de rim diabético (db/db) in vivo (Figura 3A). Além disso, a análise de qRT-PCR mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic induziu superexpressão significativa de miRNA-181b-5p no rim (Figura 3B). A análise histológica com coloração de ácido periódico-Schiff mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimetizam uma vez por semana a partir de 10-20 semanas de idade inibiu a progressão da doença renal diabética em camundongos db/db in vivo (Figura 3C). Em contraste, a injeção de miRNA controle de PEI-NPs não produziu efeitos preventivos sobre a fibrose renal (Figura 3B,C).
Liberação e efeitos do mimetismo de PEI-NPs-miRNA-5100 em camundongos modelo de lesão renal aguda produzidos por IRI15
A análise por microscopia fluorescente mostrou que a injeção na veia caudal de PEI-NPs pode entregar miRNA mimico ao glomérulo e ao espaço túbulo-intersticial de rins de camundongos modelo de LRA in vivo (Figura 4A). A análise de qRT-PCR mostrou que a injeção de PEI-NPs-miRNA-5100-5p-mimic induziu significativa superexpressão de miRNA-5100 em rins de camundongos com IRA produzida por IRI (Figura 3B). A análise histológica pela coloração hematoxilina-eosina mostrou que uma única injeção de PEI-NPs-miRNA-5100 reduziu a apoptose de células tubulares (seta preta), o que impediu o desenvolvimento de LRA no modelo de LRA produzido por IRI. PEI-NPs-miRNA-5100-mimic foi injetado via veia caudal 2 dias antes do procedimento de IRI (Figura 4B). A injeção de PEI-NPs - controle de miRNA - não mostrou efeitos preventivos sobre a fibrose renal (Figura 4B,C).
Figura 1: Estrutura do complexo PEI-NPs-miRNA-mimetismo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Liberação e efeitos de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimetismo em camundongos com fibrose renal . (A) Análise por microscopia fluorescente. Barra de escala = 200 μm. (B) análise qRT-PCR dos níveis de expressão de miRNA-146a-5p em cada grupo (n = 6 por grupo). (C) Análise histológica com coloração Sirius red (vermelho indica área fibrótica, barra de escala = 100 μm). A injeção de PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic 1 dia antes, 1 dia após e 3 dias após o tratamento com UUO inibiu o desenvolvimento de fibrose renal em camundongos in vivo. (D) análise de qRT-PCR do rim para investigar potenciais efeitos da resposta do IFN ao PEI-NPs-miRNA-146a-5p em camundongos UUO (n = 6 por grupo). Abreviaturas: DAPI, 4,6-diamidino-2-fenilindol; FITC, isotiocianato de fluoresceína; qRT-PCR, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; NS, não significante; PEI-NPs, nanopartículas de polietilenimina; miRNA, microRNA; UUO, obstrução unilateral do ureter; OEA1, 5′-oligoadenilato sintase; STAT1, transdução de sinal e ativador de transcrição 1. Os valores representam a média ± o erro padrão (barras de erro). *P < 0,05. (International Journal of Nanomedicine, 2015, 10, 3475-3488. Publicado originalmente e usado com permissão da Dove Medical Press Ltd). 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Liberação e efeitos do PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimetismo em camundongos modelo de doença renal diabética14. (A) Análise por microscopia fluorescente. Barra de escala = 200 μm. (B) análise de qRT-PCR para avaliar os efeitos de superexpressão de miRNA-181b-5p após injeção de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic (n = 3 por grupo). (C) Alterações fenotípicas foram observadas à microscopia óptica. A injeção de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic uma vez por semana a partir de 12-20 semanas de idade inibiu a progressão da doença renal diabética em camundongos db/db in vivo. Barra de escala = 50 μm. Utilizou-se análise de variância (ANOVA) para análise de comparações múltiplas entre os grupos. Caso fosse detectada significância estatística pela ANOVA, foi realizado o teste de Turquia para comparar as médias dos dois grupos como análise post hoc. Abreviações: PEI-NPs, nanopartículas de polietilenimina; qRT-PCR, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; miRNA, microRNA. *P < 0,05. Este valor foi modificado de Ishii et al. 14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Liberação e efeitos do PEI-NPs-miRNA-5100-mimic em camundongos modelo de lesão renal aguda produzidos por IRI . (A) Análise por microscopia fluorescente. Barra de escala = 100 μm. (B) análise de qRT-PCR para avaliar os efeitos de superexpressão de miRNA-5100 após injeção de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic. (C) Análise histológica do rim corado com hematoxilina-eosina. Barra de escala = 100 μm. NP-IPE injetados através da veia caudal 2 dias antes do procedimento de IRI previnem a progressão da LRA induzida pela IRI. Abreviações: PEI-NPs, nanopartículas de polietilenimina; qRT-PCR, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real; miRNA, microRNA; LRA, lesão renal aguda; IRI, lesão de isquemia-reperfusão. **P < 0,01,*P < 0,05. Esse valor foi modificado de Aomatsu et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Usando o protocolo apresentado neste manuscrito, PEI-NPs podem entregar miRNA imita ao rim para induzir a superexpressão de miRNAs alvo, resultando em efeitos de tratamento em modelos de camundongos in vivo de várias doenças renais, incluindo fibrose renal, doença renal diabética e IRA.
O método para preparar o complexo de PEI-NPs e miRNA mimic é muito simples. A superfície carregada positivamente dos NP-PEI aprisiona os miRNAs quando eles são apenas misturados13,14,15,16,17 (Figura 1). Além disso, como vetor não viral linear à base de polietileniminas, os NP-PEI evitam problemas associados ao uso de vetores virais, como resposta de IFN e oncogênese induzida por instabilidade genética11,15,16.
A injeção de PEI-NPs-mimic via veia caudal pode exigir treinamento, uma vez que as veias caudais de camundongos com doença renal às vezes são difíceis de puncionar devido à desidratação, especialmente em camundongos com IRA e obesos db/db. Além disso, a injeção repetida de PEI-NPs-miRNA-mimic pode ser necessária para vários modelos de camundongos. Os intervalos de injeção devem ser determinados pela pré-experiência de como a superexpressão por PEI-NPs-miRNA-mimic ocorre no contexto de cada modelo de camundongo com doença renal.
Vetores virais são frequentemente utilizados para transfecção de miRNAs miméticos em rins e podem levar à transfecção significativa de miRNAs 9,10. No entanto, os vetores virais apresentam potenciais problemas, como causar resposta interferon e/ou instabilidade genética11,12. Assim, vários métodos alternativos de liberação utilizando vetores não virais, como Gelatina-NPs 21,22, eletroporação23, injeção hidrodinâmica 24,25 e transfecção por ultrassom 26, têm sido desenvolvidos. Neste manuscrito, introduzimos os NP-PEIs como vetor não viral para o rim. Alguns vetores não virais são altamente invasivos (eletroporação e injeção hidrodinâmica) e, portanto, podem ser de difícil aplicação para uso clínico. No entanto, a comparação de NPs-PEI com outros vetores não virais, como nanopartículas lipídicas e NPs-gelatina, deve ser avaliada em estudos futuros.
Este protocolo tem as seguintes limitações. Primeiro, embora PEI-NPs-miRNAs sejam adequados para modelos de camundongos (pelo menos como um primeiro estágio), grandes quantidades de PEI-NPs-miRNAs são necessárias para modelos animais de grande porte (como ratos, coelhos, macacos e cães) usados para pesquisa pré-clínica. Além disso, deve-se notar que os PEI-NPs não entregaram miRNA miRNA especificamente ao rim porque os PEI-NPs, como os vetores virais, não são um sistema de entrega direcionado. Portanto, o fenótipo de outros órgãos pode precisar ser investigado.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente apoiado por JSPS KAKENHI (Processo nº 21K08233). Agradecemos a Edanz (https://jp.edanz.com/ac) pela edição dos rascunhos deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole for staining to nucleus | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Buffer RPE | Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 |
| Control-miRNA-mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3’ (sense) 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (antisense) |
| Cy3-labeled double-strand oligonucleotides | Takara Bio Inc. | MIR7900 | |
| Fluorescein-labeled Lotus tetragonolobus lectin | Vector Laboratories Inc | FL-1321 | |
| In vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate |
| miRNA-146a-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Not assigned | 5’-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3′ (sense) 5’-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (antisense) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-181b-5p mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3’ |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNA-5100-mimic (artificially synthesized miRNA) | Gene design | Not assigned | 5’-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3′ |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0-mL collection tube |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0-mL collection tube |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software |
| RNase-free water | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Not available because Qiagen has changed qRT-PCR kits (from miScript miRNA PCR system to miRCURY LNA miRNA PCR System from May 2021) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Not assigned |
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