Summary
基于霍夫曼反射（H反射）和使用周围神经电刺激的痉挛状态的临床评估是一种既定的方法。在这里，我们提供了一种用于小鼠前爪H反射定量的终末和直接神经刺激的方案。
Abstract
霍夫曼反射（H反射）作为拉伸反射的电模拟，允许在脊髓损伤或中风等损伤后对神经回路的完整性进行电生理验证。H 反射反应增加，以及非自主肌肉收缩、病理性拉伸反射增强和相应肌肉肌张力亢进等症状，是卒中后痉挛 （PSS） 的指标。
与相当神经非特异性的经皮测量相反，在这里，我们提出了一种直接量化前爪尺神经和正中神经的H反射的方案，该协议适用于后爪的胫骨和坐骨神经。基于直接刺激和对不同神经的适应，该方法是验证痉挛相关疾病模型中电生理变化的可靠且通用的工具。
Introduction
以生理学家保罗·霍夫曼（Paul Hoffmann）命名的霍夫曼反射（H反射）可以通过对周围神经的电刺激来引起，周围神经携带来自并导致相同肌肉的感觉和运动神经元的轴突。它是单突触拉伸反射的电诱导类似物，并且共享相同的通路1。与肌肉拉伸不同，H反射是由电刺激引起的。当周围神经以低电流强度受到电刺激时，由于其轴突直径大，Ia传入纤维通常首先去极化2。它们的动作电位激发脊髓中的α运动神经元（αMN），进而引发沿着αMN轴突向肌肉移动的动作电位（图1）。这种级联产生小振幅的肌肉反应，反映在所谓的H波中。通过逐渐增加刺激强度，由于招募额外的运动单元，H波的振幅增加。从一定的刺激强度，直接引出αMN较薄轴突中的动作电位，记录为M波。该 M 波的延迟比 H 波短（图 2）。如果刺激强度进一步增加，由于募集更多的αMN轴突，M波的振幅变大，而H波逐渐变小。由于αMN轴突中动作电位的逆向传播，H波可以在高刺激强度下受到抑制。这些触发的动作电位与来自Ia刺激的动作电位碰撞，因此可以相互抵消。在超最大刺激强度下，所有 MN 轴突中都发生顺向（朝向肌肉）和逆向（朝向脊髓）动作电位;前者产生最大M波振幅（Mmax），而后者导致H反射3完全消除。
为了评估中风后痉挛（PSS）或脊髓损伤（SCI），H反射已被用于评估人类运动和痉挛的神经基础1。通过使用 H 波和 M 波的比率（H/M 比率），可以改进测量之间和受试者之间 H 反射变化的量化。或者，使用一组升频（例如，0.1、0.5、1.0、2.0 和 5.0 Hz）测量速率依赖性抑制 （RDD）。RDD反映了可能受到中风或SCI干扰的抑制回路的完整性。当所有神经回路都完好无损时，H反射受到均匀的、频率无关的抑制。然而，如果由于卒中或SCI导致神经抑制减少，则H反射的抑制随着刺激频率的增加而降低4。
使用表面电极进行正确的电生理记录可能具有挑战性，并且可能受到运动任务、抑制机制和αMN兴奋性的影响5。在啮齿动物的经皮记录中，将刺激电极放置在胫神经附近，并将记录电极放置在前爪的相关肌肉附近。然而，根据我们的经验，啮齿动物中经皮电极的正确放置（图1A）比人类的表面电极放置更加复杂和多变。这可能导致引发 H 反射所需的长度、频率和刺激强度的差异。这些方法学挑战可以解释为什么只有非常有限的H反射测量研究（例如，在实验卒中模型3，4和其他痉挛模型中6。原则上，使用围绕目标神经的植入式电极可以实现对单个神经的精确（长期）刺激和记录H反射7，8。由于具有挑战性的手术对动物有潜在的副作用和探针的潜在不稳定性，这种方法尚未成为该领域的标准。这里介绍的方法还需要一些外科专业知识。然而，它允许使用低刺激强度对体内孤立的神经进行新颖、精确的刺激和记录，从而避免同时刺激邻近神经。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验均按照欧洲和国家动物护理法律和机构指南进行，并获得了北莱茵-威斯特法伦州自然、环境、北莱茵-威斯特法伦州和韦尔布劳赫舒茨州政府的批准（Az：81-02.04.2019.A309）。该方案针对成年小鼠（约8-16周龄C57Bl / 6J小鼠）和前肢记录进行了优化。它可以通过刺激后肢的相应神经和记录后爪肌肉来轻松适应（图1B）。记录电极和刺激电极的描述添加到 材料表中。请注意，该协议仅用于终端测量。
1. 准备
- 称量动物 并通过腹膜 注射氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）的混合物开始麻醉。
- 将鼠标放在加热盒中，直到达到手术耐受性。等待几分钟，直到鼠标平静，呼吸稳定，反射消失。通过测量对脚趾捏的无反应来检查麻醉深度。
- 将鼠标放在背面并将其放在加热垫上（最好是使用直肠温度探头进行反馈控制加热）。用胶带固定前爪。在这里，确保胶带的位置使测量电极易于插入前爪。
- 插入直肠探头以测量动物的温度并用胶带固定。涂抹眼膏以防止眼睛干燥。
2. 手术
注意：在整个过程中应定期监测麻醉动物的稳定状况，即呼吸、温度和反射丧失。显示了前爪桡神经/尺神经/正中神经的直接神经 H 波测量程序（图 3A）。测量也可以通过修改适应后爪（坐骨神经/胫神经）。
- 为了更好地了解手术区域，请事先在单独的位置用电动剃须刀或一把剪刀去除头发。对于更有经验的外科医生来说，这只是可选的。
注意：这里不需要消毒，因为这是一个最终实验。动物稍后将被安乐死。 - 用镊子提起皮肤，并用一把细圆剪刀沿着前爪的腹后轴（腋窝和胸部上方的区域）在皮肤上切开约1厘米的切口。
- 小心地去除结缔组织，露出下面的肌肉和神经。使用镊子去除暴露的胸大深肌，以进入正中神经（图3E，F）。用软组织去除少量血液和组织液。
- 下一步，小心地从上到下切开乳房或腋窝肌肉，露出下面的神经束。将神经束从结缔组织和肌肉组织中释放出来，长度约为 1.5 厘米。
注意：在这里，应特别注意不要损坏平行于正中神经的血管。切割组织时，始终沿着神经切割以避免伤害它。如果发生这种情况，请用拭子清除渗漏的液体和血液。立体显微镜对于整个实验不是必需的，但它可用于神经的制备。 - 使用弯曲的玻璃移液管小心地分离前爪的尺神经和正中神经（图3E）。两条神经的上部是尺神经，下部是正中神经。
注意：将神经彼此分开时，请确保下面的血管没有受伤。
3. 电极放置
- 将刺激钩电极平行排列在0.5-1.0mm的距离处，并使用显微操纵器将双钩放置在靠近神经的位置。
- 使用玻璃钩作为工具，将尺神经提升到刺激钩电极上。用神经拉回电极，并使用显微操纵器将其与其他神经分开约1-2毫米（图3D，F）。
- 将电极沿爪子的长轴放置，以减少肌肉之间的串扰。
注意：电极的位置非常重要，但由于个体解剖结构，难以标准化。它需要经验丰富的外科医生正确放置电极。如果信号幅度不理想，也可以重新定位导线。 - 表面干燥附着在神经上的电极钩，并使用注射器施用凡士林以提供与邻近组织的电绝缘。
注意：应注意在电极上以及两个钩子之间涂抹足够的凡士林，以确保电绝缘并防止神经干燥。
4. 记录电极和参比电极的放置
- 要测量 H 反射，请将肌电图电极肌内注射在前爪中。此外，将参比电极皮下放置在后肢（例如，使用微小针），由微型鳄鱼夹固定（图 3B）。
- 当刺激器打开时，观察前爪的微小抽搐等成功的刺激。引起前爪M波和微小可见抽搐的最小刺激电流应在10-50μA范围内。
注意：如果在 50 μA 时看不到抽搐，请调整刺激电极并重新涂抹凡士林。此外，在小鼠中，M波以低于H波5的刺激强度出现的情况并不少见。
5. 测量
- 重复刺激神经15次，每次0.2ms长脉冲。在两组刺激之间暂停 2 分钟时，频率从 0.1、0.5、1.0、2.0 增加到 5 Hz。
注意：如果之后计算RDD，这些频率是必需的。所有肌电图数据都使用软件进行记录、数字化和分析，例如 Spike2 软件（CED，7.19 版）。预计最大的H波振幅为0.1 Hz。频率越高，由于RDD引起的H波幅度越小。 - 实验结束后，按照研究所的IACUC协议牺牲动物。在该实验中，在深度麻醉下使用PBS和4%PFA进行小鼠经心灌注。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
从每个刺激频率和爪子的n = 15次刺激试验中，选择至少n = 10次成功的记录进行分析。有测量误差（例如，M波缺失）的试验被排除在分析之外。分别分析每个试验，并在以后生成组/时间比较的平均值。每次试验都记录刺激与M波和H波出现之间的潜伏期。根据我们的经验，由于通过脊髓的传输时间较长，M波在刺激后约2毫秒发生，H波在6-8毫秒后发生（图1A 和 图2B）。测量 M 波和 H 波的峰峰值振幅。
为了评估脊髓损伤或中风中发生的生理变化，H波和M波振幅之间的比值（H / M比值， 图2）不太容易出现实验变异性，例如，这将反映在振幅差异中。因此，该比率提供了与疾病相关的电生理变化的更可靠的评估。例如，在初级和次级运动皮层中风的小鼠中，H波增加，而M波保持不变（图2），表明αMN的兴奋性增加。此外，RDD降低（即，随着刺激频率的增加，H波抑制的减少）。RDD降低是脊髓抑制减少的结果4。因此，RDD可以验证脊柱抑制回路的激活，其中断可能导致痉挛。为了计算H反射的RDD，推荐使用Lee等人描述的方法4。简而言之，0.1 Hz 时的 H 反射刺激取平均值并设置为 100%。对于其他刺激频率获得的H反射表示为0.1 Hz的相对值。从每个刺激序列中，丢弃前三个刺激。
图 1：记录设置和测量霍夫曼反射（H 反射）和肌肉反应（M 波）的途径图示。 （A）H反射是由Ia传入的刺激引起的，Ia传入激活脊髓中相应的α运动神经元，随后引起神经支配的前爪肌肉的肌肉收缩。（B）电刺激的桡神经/尺神经/正中神经在前爪和坐骨神经/胫神经在后爪的位置。用 BioRender.com 创建。请点击此处查看此图的大图。
图 2：原理图和代表性电气记录结果。 （A） 录音示意图。刺激和相应的刺激伪影设置为0 ms，随后是直接肌肉反应（M波）和随后代表H波的较小峰值。在痉挛模型中，与健康对照相比，H反射会更大。（B） 来自具有代表性的记录的屏幕截图，该软件显示带有刺激伪影（下迹线）的原始数据，以及单独出现 M 波与记录中同时可见 M 波和 H 波的示例（分别为上迹线、中图和右图）。请点击此处查看此图的大图。
图 3：用于终端电生理测量的电极定位。 （一，二）使用钩刺激电极、前爪内的记录电极和插入后肢的参比电极进行终末 H 反射测量概述。（中，四）在后肢，皮肤和肌肉切除后，坐骨神经变得可见，可分为坐骨神经和胫神经。（E）在前肢，桡神经，正中神经和尺神经变得可见。（F）尺神经可以用钩电极刺激，而不会刺激邻近神经。用 BioRender.com 创建。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
与前面描述的小鼠6经皮H反射测量相比，我们提供了更直接和神经特异性的测量。这种新方法可以应用于前肢和后肢的神经（例如，正中神经、尺神经和桡神经，以及胫神经和坐骨神经），使该方法可作为许多疾病模型（例如卒中、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、创伤性脑损伤和脊髓损伤）的诊断工具。根据所选神经，建议验证 H 波的振幅作为刺激强度的函数。振幅可能因神经直径和运动神经元兴奋性以及电接触而异。通过测量H/M比和RDD，可以减少诸如针的定位之类的实验影响，从而显着提高了所获得值的可靠性。
这里介绍的协议的主要限制是终端应用，无法进行纵向测量。此外，还应考虑若干方法细节。持续麻醉和最小的肌肉松弛对于可靠的测量至关重要，应针对每个特定型号/应用进行验证。与引起强烈抑制肌肉反射（即H反射9，10，11）的异氟烷麻醉相反，氯胺酮-甲苯噻嗪的组合提供了安全的麻醉，并广泛用于肌电图记录12。根据大鼠13中电机诱发电位的测量，根据我们的经验，100mg / kg氯胺酮和10mg / kg甲苯噻嗪为稳定可靠的记录提供了最佳方案。对于熟练的实验者来说，可以在最后一个实验中进行前爪和后爪测量。此处描述的前爪程序，包括动物制备和速率依赖性抑郁症的所有频率的测量，可以在大约30-40分钟内完成。强烈建议在进行体内实验之前练习神经解剖技术。在单侧疾病模型（例如皮质卒中）中，我们建议在双侧爪上重复刺激15次，以将未受影响的爪子作为内部对照。由于此处所示的方法仅刺激一条神经，因此必须特别注意在刺激电极周围分布足够的凡士林，以免发生对邻近神经的刺激。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者感谢达尔豪斯大学的T. Akay在MG访问他的实验室期间给予的支持。这项工作得到了Friebe基金会（T0498/28960/16）和德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）-项目ID 431549029-SFB 1451的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | - | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | - | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | - | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | - | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
- Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
- Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).
- Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007 (2014).
- Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
- Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
- Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).
- Chang, H. -Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
- Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
- Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).
