Summary
La valutazione clinica della spasticità basata sul riflesso di Hoffmann (H-reflex) e utilizzando la stimolazione elettrica dei nervi periferici è un metodo consolidato. Qui, forniamo un protocollo per una stimolazione nervosa terminale e diretta per la quantificazione del riflesso H nella zampa anteriore del topo.
Abstract
Il riflesso di Hoffmann (H-reflex), come analogo elettrico del riflesso di allungamento, consente la convalida elettrofisiologica dell'integrità dei circuiti neurali dopo lesioni come danni al midollo spinale o ictus. Un aumento della risposta H-riflessa, insieme a sintomi come contrazioni muscolari non volontarie, riflesso di allungamento patologicamente aumentato e ipertonia nel muscolo corrispondente, è un indicatore di spasticità post-ictus (PSS).
In contrasto con le misurazioni transcutanee piuttosto aspecifiche del nervo, qui, presentiamo un protocollo per quantificare il riflesso H direttamente ai nervi ulnare e mediano della zampa anteriore, che è applicabile, con piccole modifiche, al nervo tibiale e sciatico della zampa posteriore. Basato sulla stimolazione diretta e l'adattamento a diversi nervi, il metodo rappresenta uno strumento affidabile e versatile per convalidare i cambiamenti elettrofisiologici nei modelli di malattia correlati alla spasticità.
Introduction
Il riflesso di Hoffmann (riflesso H), dal nome del fisiologo Paul Hoffmann, può essere evocato dalla stimolazione elettrica dei nervi periferici, che trasportano assoni di neuroni sensoriali e motori che derivano e portano agli stessi muscoli. È l'analogo indotto elettricamente del riflesso di allungamento monosinaptico e condivide lo stesso percorso1. A differenza dell'allungamento muscolare, il riflesso H deriva dalla stimolazione elettrica. Quando i nervi periferici sono stimolati elettricamente a bassa intensità di corrente, le fibre afferenti Ia sono tipicamente depolarizzate prima a causa del loro grande diametro assone2. I loro potenziali d'azione eccitano i motoneuroni alfa (αMN) nel midollo spinale, che a loro volta suscitano potenziali d'azione che viaggiano lungo gli assoni αMN verso il muscolo (Figura 1). Questa cascata genera una risposta muscolare con piccola ampiezza, riflessa nella cosiddetta onda H. Aumentando gradualmente l'intensità dello stimolo, l'ampiezza dell'onda H aumenta a causa del reclutamento di unità motorie aggiuntive. Da una certa intensità di stimolo, i potenziali d'azione negli assoni più sottili degli αMN vengono suscitati direttamente, che viene registrata come onda M. Questa onda M appare con una latenza più breve rispetto all'onda H (Figura 2). Se l'intensità della stimolazione aumenta ulteriormente, l'ampiezza dell'onda M diventa maggiore a causa del reclutamento di più assoni αMN, mentre l'onda H diventa gradualmente più piccola. L'onda H può essere soppressa ad alte intensità di stimolo a causa della retropropagazione antidromica dei potenziali d'azione negli assoni αMN. Questi potenziali d'azione innescati si scontrano con quelli della stimolazione Ia e possono quindi annullarsi a vicenda. A intensità di stimolo sovramassimali, i potenziali d'azione ortodromici (verso il muscolo) e antidromici (verso il midollo spinale) si verificano in tutti gli assoni MN; il primo dà origine all'ampiezza massima dell'onda M (Mmax), mentre il secondo comporta la completa abolizione del riflesso H3.
Per la valutazione della spasticità post-ictus (PSS) o della lesione del midollo spinale (SCI), il riflesso H è stato utilizzato per valutare le basi neurali del movimento e della spasticità nell'uomo1. Una migliore quantificazione della variazione del riflesso H tra le misurazioni e tra i soggetti si ottiene utilizzando il rapporto tra l'onda H e l'onda M (rapporto H/M). In alternativa, viene misurata la depressione dipendente dalla velocità (RDD), utilizzando un insieme di frequenze ascendenti (ad esempio, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 e 5,0 Hz). L'RDD riflette l'integrità dei circuiti inibitori che possono essere disturbati da ictus o SCI. Quando tutti i circuiti neurali sono intatti, c'è una soppressione uniforme e indipendente dalla frequenza del riflesso H. Tuttavia, se vi è una ridotta inibizione neurale a causa di ictus o SCI, la soppressione del riflesso H diminuisce con l'aumentare della frequenza di stimolazione4.
La corretta registrazione elettrofisiologica mediante elettrodi di superficie può essere difficile e può essere influenzata da compiti motori, meccanismi inibitori ed eccitabilità αMN5. Nella registrazione transcutanea nei roditori, un elettrodo di stimolo viene posizionato vicino al nervo tibiale e un elettrodo di registrazione viene posizionato vicino ai muscoli correlati nella zampa anteriore. Secondo la nostra esperienza, tuttavia, il corretto posizionamento degli elettrodi transcutanei (Figura 1A) è ancora più complesso e variabile nei roditori rispetto al posizionamento degli elettrodi di superficie nell'uomo. Ciò può portare a differenze di lunghezza, frequenza e intensità di stimolazione necessarie per suscitare il riflesso H. Queste sfide metodologiche potrebbero spiegare perché ci sono solo un numero molto limitato di studi di misurazione del riflesso H (ad esempio, nei modelli sperimentali di ictus 3,4 e in altri modelli di spasticità6. Una stimolazione precisa (a lungo termine) e la registrazione del riflesso H sui singoli nervi potrebbero, in linea di principio, essere ottenute utilizzando elettrodi impiantabili che circondano il nervo bersaglio 7,8. A causa dell'impegnativo intervento chirurgico con potenziali effetti collaterali per l'animale e la potenziale instabilità della sonda, questo approccio non è diventato uno standard nel campo. Il metodo qui presentato richiede anche alcune competenze chirurgiche. Tuttavia, consente una stimolazione e una registrazione nuove e precise di nervi isolati in vivo utilizzando basse intensità di stimolazione, che evita la stimolazione simultanea dei nervi vicini.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le leggi europee e nazionali sulla cura degli animali e le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz North Rhine-Westfalia (Az: 81-02.04.2019.A309). Il protocollo è ottimizzato per topi adulti (topi C57Bl/6J di circa 8-16 settimane) e per la registrazione degli arti anteriori. Può essere facilmente adattato stimolando i rispettivi nervi dell'arto posteriore e registrando i muscoli della zampa posteriore (Figura 1B). Una descrizione degli elettrodi di registrazione e stimolazione è aggiunta nella tabella dei materiali. Si noti che il protocollo viene utilizzato solo per una misurazione terminale.
1. Preparazione
- Pesare l'animale e iniziare l'anestesia iniettando tramite i.p. una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
- Tenere il mouse nella scatola riscaldante fino al raggiungimento della tolleranza chirurgica. Attendere alcuni minuti fino a quando il mouse è calmo, la respirazione è stabile e i riflessi sono assenti. Controllare la profondità dell'anestesia misurando la mancanza di risposta al pizzico del piede.
- Ruotare il mouse sul dorso e posizionarlo su una piastra riscaldante (ottimale sarebbe il riscaldamento controllato dal feedback utilizzando una sonda di temperatura rettale). Fissare le zampe anteriori con del nastro adesivo. Qui, assicurarsi che il nastro sia posizionato in modo tale che gli elettrodi di misurazione siano facilmente inseriti nelle zampe anteriori.
- Inserire una sonda rettale per misurare la temperatura dell'animale e fissarla con del nastro adesivo. Applicare un unguento per gli occhi per evitare che gli occhi si secchino.
2. Chirurgia
NOTA: Le condizioni stabili dell'animale anestetizzato, cioè respirazione, temperatura e perdita di riflessi, devono essere monitorate regolarmente durante tutta la procedura. La procedura di misurazione diretta dell'onda H del nervo è mostrata per il nervo radiale/ulnare/mediano della zampa anteriore (Figura 3A). La misurazione può anche essere adattata alla zampa posteriore (nervo sciatico/tibiale) con modifiche.
- Per una migliore panoramica dell'area chirurgica, rimuovere i capelli con un rasoio elettrico o un paio di forbici in un luogo separato in anticipo. Per i chirurghi più esperti questo è solo facoltativo.
NOTA: la disinfezione non è necessaria qui, in quanto si tratta di un esperimento finale. L'animale verrà eutanasia in seguito. - Sollevare la pelle con una pinzetta e praticare un'incisione di circa 1 cm nella pelle lungo l'asse ventro-posteriore della zampa anteriore (area sopra l'ascella e il torace) con un paio di sottili forbici arrotondate.
- Rimuovere con attenzione il tessuto connettivo ed esporre il muscolo e il nervo sottostante. Rimuovere il muscolo pettorale profondo esposto usando una pinza, per accedere al nervo mediano (Figura 3E,F). Rimuovere piccole quantità di sangue e fluido tissutale con tessuti molli.
- Nella fase successiva, tagliare con cura il seno o il muscolo ascellare dall'alto verso il basso per esporre il fascio nervoso sottostante. Liberare il fascio nervoso dal tessuto connettivo e muscolare per una lunghezza di circa 1,5 cm.
NOTA: Qui, è necessario prestare particolare attenzione a non danneggiare i vasi sanguigni che corrono parallelamente al nervo mediano. Quando si taglia il tessuto, tagliare sempre lungo il nervo per evitare di ferirlo. Se ciò accade, rimuovere il liquido e il sangue che fuoriescono con un tampone. Il microscopio stereo non è necessario per l'intero esperimento, tuttavia può essere utile per la preparazione dei nervi. - Separare accuratamente il nervo ulnare e il nervo mediano della zampa anteriore usando una pipetta di vetro piegata (Figura 3E). La parte superiore dei due nervi è il nervo ulnare e la parte inferiore è il nervo mediano.
NOTA: Quando si separano i nervi l'uno dall'altro, assicurarsi che il vaso sanguigno sottostante non sia ferito.
3. Posizionamento dell'elettrodo
- Disporre gli elettrodi del gancio di stimolazione in parallelo a una distanza di 0,5-1,0 mm e utilizzare un micromanipolatore per posizionare il doppio gancio in prossimità del nervo.
- Utilizzare il gancio di vetro come strumento per sollevare il nervo ulnare sugli elettrodi del gancio di stimolazione. Tirare indietro l'elettrodo con il nervo e separarlo dagli altri nervi di circa 1-2 mm usando il micromanipolatore (Figura 3D,F).
- Posizionare gli elettrodi lungo l'asse lungo della zampa per ridurre la diafonia tra i muscoli.
NOTA: Il posizionamento degli elettrodi è molto importante ma difficile da standardizzare a causa dell'anatomia individuale. Richiede un chirurgo esperto per posizionare correttamente gli elettrodi. I fili possono anche essere riposizionati nel caso in cui l'ampiezza del segnale non sia soddisfacente. - Asciugare superficialmente i ganci degli elettrodi attaccati al nervo e applicare vaselina usando una siringa per fornire isolamento elettrico dal tessuto adiacente.
NOTA: Prestare attenzione ad applicare abbastanza vaselina all'elettrodo e anche tra i due ganci per garantire l'isolamento elettrico e impedire che i nervi si secchino.
4. Posizionamento degli elettrodi di registrazione e di riferimento
- Per misurare il riflesso H, posizionare gli elettrodi EMG per via intramuscolare nella zampa anteriore. Inoltre, posizionare l'elettrodo di riferimento per via sottocutanea nell'arto posteriore (ad esempio, utilizzando un perno minuti), tenuto da una clip a coccodrillo in miniatura (Figura 3B).
- Quando lo stimolatore è acceso, osservare una stimolazione riuscita come piccole contrazioni della zampa anteriore. La corrente minima di stimolazione per suscitare l'onda M e piccole contrazioni visibili nella zampa anteriore dovrebbe essere compresa tra 10 e 50 μA.
NOTA: Se non sono visibili contrazioni a 50 μA, regolare gli elettrodi di stimolazione e riapplicare la vaselina. Inoltre, nei topi, non è raro che l'onda M appaia a intensità di stimolazione inferiori rispetto all'onda H5.
5. Misurazione
- Ripeti la stimolazione del nervo 15 volte con impulsi lunghi 0,2 ms ciascuno. Con pause di 2 minuti tra i set di stimoli, la frequenza viene aumentata da 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 a 5 Hz.
NOTA: Queste frequenze sono necessarie se si calcola l'RDD in seguito. Tutti i dati EMG vengono registrati, digitalizzati e analizzati utilizzando software, ad esempio il software Spike2 (CED, versione 7.19). La massima ampiezza dell'onda H è prevista a 0,1 Hz. Maggiore è la frequenza, minore è l'ampiezza dell'onda H dovuta all'RDD. - Dopo l'esperimento, sacrificare l'animale secondo il protocollo IACUC dell'istituto. In questo esperimento la perfusione transcardica del topo è stata eseguita utilizzando PBS e PFA al 4% in anestesia profonda.
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Representative Results
Da n = 15 prove di stimolazione per frequenza di stimolazione e zampa, selezionare almeno n = 10 registrazioni di successo per l'analisi. Le prove con errori di misurazione (ad esempio, onda M mancante) sono escluse dall'analisi. Analizza ogni prova separatamente e genera una media per i confronti di gruppo / tempo in seguito. La latenza tra la stimolazione e la comparsa dell'onda M e dell'onda H viene registrata per ogni prova. Nella nostra esperienza, l'onda M si verifica circa 2 ms dopo la stimolazione e l'onda H dopo 6-8 ms, a causa del tempo di transito più lungo attraverso il midollo spinale (Figura 1A e Figura 2B). Misura l'ampiezza delle onde M e H da picco a picco.
Per valutare i cambiamenti fisiologici che si verificano nella lesione del midollo spinale o nell'ictus, il rapporto tra l'ampiezza dell'onda H e M (rapporto H / M, Figura 2) è meno incline alla variabilità sperimentale, che si rifletterebbe, ad esempio, nelle differenze di ampiezza. Il rapporto fornisce quindi una valutazione più affidabile dei cambiamenti elettrofisiologici correlati alla malattia. Ad esempio, nei topi con un ictus nella corteccia motoria primaria e secondaria, l'onda H è aumentata, mentre l'onda M rimane invariata (Figura 2), suggerendo una maggiore eccitabilità di αMN. Inoltre, c'è una RDD ridotta (cioè una ridotta diminuzione della soppressione dell'onda H con l'aumentare della frequenza di stimolazione). La diminuzione della RDD è il risultato di una ridotta inibizione del midollo spinale4. Pertanto, RDD può convalidare l'attivazione dei circuiti inibitori spinali, la cui interruzione può causare spasticità. Per calcolare l'RDD del riflesso H, si raccomanda il metodo descritto da Lee et al.4. In breve, la stimolazione H-reflex a 0,1 Hz viene mediata e impostata al 100%. Il riflesso H ottenuto per le altre frequenze di stimolazione è espresso come valori relativi a 0,1 Hz. Da ogni treno di stimolazione, le prime tre stimolazioni vengono scartate.
Figura 1: Illustrazione della configurazione della registrazione e dei percorsi per misurare il riflesso di Hoffman (riflesso H) e la risposta muscolare (onda M). (A) Il riflesso H è indotto dalla stimolazione delle afferenze Ia, che attivano i corrispondenti motoneuroni alfa nel midollo spinale e successivamente evocano contrazioni muscolari nei muscoli della zampa anteriore innervati. (B) Posizioni dei nervi radiali/ulnari/mediani stimolati elettricamente nella zampa anteriore e dei nervi sciatico/tibiale nella zampa posteriore. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Risultati della registrazione elettrica schematica e rappresentativa. (A) Schema di una registrazione. Lo stimolo e il rispettivo artefatto di stimolazione sono impostati a 0 ms, seguito dalla risposta muscolare diretta (onda M) e dal successivo picco più piccolo che rappresenta l'onda H. Nei modelli di spasticità, il riflesso H sarà più grande rispetto al controllo sano. (B) Schermate da una registrazione rappresentativa con il software che mostra i dati originali con un artefatto di stimolo (tracce inferiori) e l'aspetto della sola onda M rispetto a un esempio in cui entrambe le onde M e H sono visibili nella registrazione (traccia superiore, pannello centrale e destro, rispettivamente). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Posizionamento degli elettrodi per la misura elettrofisiologica terminale. (A,B) Panoramica della misurazione del riflesso H terminale con gli elettrodi di stimolazione a gancio, gli elettrodi di registrazione all'interno della zampa anteriore e l'elettrodo di riferimento inserito nell'arto posteriore. (C,D) Nell'arto posteriore, dopo la rimozione della pelle e dei muscoli, il nervo sciatico diventa visibile e può essere diviso nei nervi sciatico e tibiale. (E) Nell'arto anteriore, i nervi radiale, mediano e ulnare diventano visibili. (F) Il nervo ulnare può essere stimolato con l'elettrodo a gancio senza stimolazione dei nervi vicini. Creato con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
A differenza delle misurazioni del riflesso H transcutaneo precedentemente descritte nel topo6, forniamo una misurazione più diretta e specifica per il nervo. Questo nuovo approccio può essere applicato ai nervi dell'arto anteriore e posteriore (ad esempio, i nervi mediano, ulnare e radiale, e i nervi tibiale e sciatico, rispettivamente), rendendo questo metodo adattabile come strumento diagnostico a molti modelli di malattia (ad esempio, ictus, sclerosi multipla, sclerosi laterale amiotrofica, trauma cranico e lesione del midollo spinale). A seconda del nervo selezionato, si raccomanda la convalida dell'ampiezza dell'onda H in funzione dell'intensità della stimolazione. L'ampiezza può variare a causa del diametro del nervo e dell'eccitabilità del motoneurone, nonché del contatto elettrico. Misurando il rapporto H/M e RDD, è possibile ridurre le influenze sperimentali come il posizionamento dell'ago, il che aumenta significativamente l'affidabilità dei valori ottenuti.
La principale limitazione del protocollo qui presentato è l'applicazione terminale senza possibilità di misurazioni longitudinali. Inoltre, dovrebbero essere considerati diversi dettagli metodologici. L'anestesia costante con rilassamento muscolare minimo è fondamentale per una misurazione affidabile e deve essere convalidata per ogni modello/applicazione specifica. In contrasto con l'anestesia isoflurana che causa una forte soppressione dei riflessi muscolari (cioè il riflesso H 9,10,11, la combinazione di ketamina-xilazina fornisce un'anestesia sicura ed è ampiamente utilizzata per le registrazioni EMG 12. In linea con le misurazioni dei potenziali evocati dal motore nel ratto 13, nella nostra esperienza 100 mg / kg di ketamina e10 mg / kg di xilazina forniscono il miglior protocollo per registrazioni stabili e affidabili. Per uno sperimentatore esperto è possibile eseguire misurazioni anteriori e posteriori in un esperimento finale. La procedura descritta qui per la zampa anteriore, compresa la preparazione degli animali e la misurazione di tutte le frequenze per la depressione dipendente dalla velocità, può essere eseguita in circa 30-40 minuti. Si consiglia vivamente di praticare la tecnica di dissezione nervosa prima di eseguire esperimenti in vivo. Nei modelli di malattia unilaterale (ad esempio, ictus corticale), si consiglia di ripetere la stimolazione 15 volte su entrambe le zampe controlaterali per includere la zampa non interessata come controllo interno. Poiché solo un nervo deve essere stimolato nel metodo mostrato qui, è necessario prestare particolare attenzione a distribuire una quantità sufficiente di vaselina attorno agli elettrodi di stimolazione in modo che non si verifichi alcuna stimolazione dei nervi vicini.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono con gratitudine il sostegno di T. Akay, Dalhousie University, durante una visita di MG al suo laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione Friebe (T0498/28960/16) e della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | - | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | - | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | - | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | - | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
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