Terminale H-refleksmålinger hos mus

Summary

Klinisk evaluering av spastisitet basert på Hoffmann-refleksen (H-refleksen) og elektrostimulering av perifere nerver er en etablert metode. Her gir vi en protokoll for en terminal og direkte nervestimulering for H-reflekskvantifisering i museforpoten.

Abstract

Hoffmann-refleksen (H-refleksen), som en elektrisk analog til strekkrefleksen, tillater elektrofysiologisk validering av integriteten til nevrale kretser etter skader som ryggmargsskade eller slag. En økning av H-refleksresponsen, sammen med symptomer som ikke-frivillige muskelkontraksjoner, patologisk forstørret strekkrefleks og hypertoni i den tilsvarende muskelen, er en indikator på spastisitet etter hjerneslag (PSS).

I motsetning til ganske nerve-uspesifikke transkutane målinger, presenterer vi her en protokoll for å kvantifisere H-refleksen direkte på forpotens ulnar- og mediannerver, som med mindre modifikasjoner gjelder for bakpotens tibial- og isjiasnerve. Basert på direkte stimulering og tilpasning til ulike nerver representerer metoden et pålitelig og allsidig verktøy for å validere elektrofysiologiske endringer i spastisitetsrelaterte sykdomsmodeller.

Introduction

Hoffmann-refleksen (H-refleksen), oppkalt etter fysiologen Paul Hoffmann, kan fremkalles ved elektrisk stimulering av perifere nerver, som bærer aksoner av sensoriske og motoriske nevroner som oppstår fra og fører til de samme musklene. Det er den elektrisk induserte analogen til den monosynaptiske strekkrefleksen, og deler samme vei¹. I motsetning til muskelstrekk, er H-refleksen et resultat av elektrisk stimulering. Når perifere nerver stimuleres elektrisk ved lav strømintensitet, blir Ia-afferente fibre vanligvis depolarisert først på grunn av deres store aksondiameter². Deres aksjonspotensialer eksiterer alfa-motorneuroner (αMN) i ryggmargen, som igjen fremkaller aksjonspotensialer som beveger seg nedover αMN-aksonene mot muskelen (figur 1). Denne kaskaden genererer en muskulær respons med liten amplitude, reflektert i den såkalte H-bølgen. Ved gradvis å øke stimulusintensiteten øker amplituden til H-bølgen på grunn av rekruttering av flere motorenheter. Fra en viss stimulusintensitet fremkalles aksjonspotensialer i de tynnere aksonene til αMNene direkte, som registreres som M-bølgen. Denne M-bølgen vises med kortere ventetid enn H-bølgen (figur 2). Hvis stimuleringsintensiteten økes ytterligere, blir amplituden til M-bølgen større på grunn av rekrutteringen av flere αMN-aksoner, mens H-bølgen gradvis blir mindre. H-bølgen kan undertrykkes ved høy stimulusintensitet på grunn av antidromisk tilbakeutbredelse av aksjonspotensialer i αMN-aksonene. Disse utløste aksjonspotensialene kolliderer med de fra Ia-stimuleringen og kan dermed avbryte hverandre. Ved supramaksimal stimulusintensitet forekommer ortodokromiske (mot muskelen) og antidromiske (mot ryggmargen) aksjonspotensialer i alle MN-aksoner; førstnevnte gir opphav til maksimal M-bølgeamplitude (Mmax), mens sistnevnte resulterer i fullstendig avskaffelse av H-refleksen³.

For evaluering av post-stroke spastisitet (PSS) eller ryggmargsskade (SCI) har H-refleksen blitt brukt til å vurdere det nevrale grunnlaget for bevegelse og spastisitet hos mennesker¹. En forbedret kvantifisering av endringen i H-refleksen mellom målinger og mellom forsøkspersoner oppnås ved å bruke forholdet mellom H- og M-bølgen (H/M-forhold). Alternativt måles hastighetsavhengig depresjon (RDD) ved hjelp av et sett med stigende frekvenser (f.eks. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 og 5,0 Hz). RDD gjenspeiler integriteten til hemmende kretser som kan forstyrres av slag eller SCI. Når alle nevrale kretser er intakte, er det en jevn, frekvensuavhengig undertrykkelse av H-refleksen. Imidlertid, hvis det er redusert nevral inhibering som følge av slag eller SCI, reduseres undertrykkelsen av H-refleksen med økende stimuleringsfrekvens⁴.

Korrekt elektrofysiologisk registrering ved hjelp av overflateelektroder kan være utfordrende og kan påvirkes av motoriske oppgaver, hemmende mekanismer og αMN-eksitabilitet⁵. I det transkutane opptaket hos gnagere plasseres en stimuluselektrode nær tibialnerven, og en opptakselektrode plasseres nær de relaterte musklene i forpoten. Ifølge vår erfaring er imidlertid riktig plassering av de transkutane elektrodene (figur 1A) enda mer kompleks og variabel hos gnagere enn overflateelektrodeplassering hos mennesker. Dette kan føre til forskjeller i lengde, frekvens og stimuleringsintensitet som er nødvendig for å fremkalle H-refleksen. Disse metodiske utfordringene kan forklare hvorfor det bare er et svært begrenset antall H-refleksmålingsstudier (f.eks. i eksperimentelle slagmodeller ^3,4 og andre spastisitetsmodeller⁶. En presis (langvarig) stimulering og registrering av H-refleksen på individuelle nerver kan i prinsippet oppnås ved bruk av implanterbare elektroder rundt målnerven ^7,8. På grunn av den utfordrende operasjonen med potensielle bivirkninger for dyret og potensiell ustabilitet av sonden, har denne tilnærmingen ikke blitt en standard i feltet. Metoden som presenteres her krever også noe kirurgisk kompetanse. Det tillater imidlertid en ny, presis stimulering og registrering av isolerte nerver in vivo ved bruk av lave stimuleringsintensiteter, noe som unngår samtidig stimulering av nabonerver.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med europeiske og nasjonale dyrepleielover og institusjonelle retningslinjer, og ble godkjent av Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az: 81-02.04.2019.A309). Protokollen er optimalisert for voksne mus (ca. 8-16 uker gamle C57Bl/6J-mus) og forbensopptaket. Den kan enkelt tilpasses ved å stimulere baklemmens respektive nerver og registrere bakpotemuskulaturen (figur 1B). En beskrivelse av opptaks- og stimuleringselektrodene er lagt til i materialfortegnelsen. Merk at protokollen bare brukes til terminalmåling.

1. Forberedelse

1. Vei dyret og start anestesi ved å injisere via i.p. en blanding av ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg).
2. Hold musen i oppvarmingsboksen til kirurgisk toleranse er nådd. Vent noen minutter til musen er rolig, pusten er stabil og reflekser er fraværende. Sjekk dybden av anestesi ved å måle mangelen på respons på tåklemmen.
3. Snu musen på ryggen og legg den på en varmepute (optimal ville være tilbakemeldingsstyrt oppvarming ved hjelp av en rektal temperatursonde). Fest forpotene med tape. Her må du sørge for at båndet er plassert på en slik måte at måleelektrodene lett settes inn i forpotene.
4. Sett inn en rektal sonde for å måle temperaturen på dyret og fikse det med tape. Påfør øyesalve for å forhindre at øynene tørker ut.

2. Kirurgi

MERK: Den stabile tilstanden til det bedøvede dyret, dvs. respirasjon, temperatur og tap av reflekser, bør overvåkes regelmessig gjennom hele prosedyren. Direkte nerve H-bølgemåling er vist for forlabbens radiale/ulnare/median nerve (figur 3A). Målingen kan også tilpasses baklabben (isjias/tibialnerven) med modifikasjoner.

1. For bedre oversikt over operasjonsområdet, fjern håret med en elektrisk barberhøvel eller en saks på et eget sted på forhånd. For mer erfarne kirurger er dette kun valgfritt.
   MERK: Desinfeksjon er ikke nødvendig her, da dette er et slutteksperiment. Dyret vil bli avlivet senere.
2. Løft huden med pinsett og gjør et snitt på ca. 1 cm i huden langs forlabbens ventro-bakre akse (området over armhulen og thoraxen) med en fin avrundet saks.
3. Fjern forsiktig bindevevet og utsett muskelen og nerven under. Fjern den eksponerte pectoralis profundus-muskelen med tang for å få tilgang til mediannerven (figur 3E,F). Fjern små mengder blod og vevsvæske med bløtvev.
4. I neste trinn, kutt forsiktig brystet eller aksillærmuskelen fra topp til bunn for å avsløre nervebunten under. Frigjør nervebunten fra bindevev og muskelvev over en lengde på ca. 1,5 cm.
   MERK: Her bør det utvises spesiell forsiktighet for ikke å skade blodkarene som går parallelt med medianen. Når du kutter vevet, må du alltid kutte langs nerven for å unngå å skade det. Hvis dette skjer, fjern lekkende væske og blod med en vattpinne. Astereo mikroskop er ikke nødvendig for hele forsøket, men det kan være nyttig for forberedelsen av nerver.
5. Separer forpotens ulnar- og mediannerve forsiktig ved hjelp av en bøyd glasspipette (figur 3E). Den øvre av de to nerver er ulnarnerven, og den nedre er medianen.
   MERK: Når du skiller nervene fra hverandre, må du sørge for at blodkaret under ikke er skadet.

3. Plassering av elektrode

1. Ordne stimuleringskrokelektrodene parallelt i en avstand på 0,5-1,0 mm, og bruk en mikromanipulator til å plassere dobbeltkroken i nærheten av nerven.
2. Bruk glasskroken som et verktøy for å løfte ulnarnerven på stimuleringskrokelektrodene. Trekk tilbake elektroden med nerven og skill den fra andre nerver med ca. 1-2 mm ved hjelp av mikromanipulatoren (figur 3D,F).
3. Plasser elektrodene langs potens lange akse for å redusere tverrtalen mellom musklene.
   MERK: Plasseringen av elektrodene er svært viktig, men vanskelig å standardisere på grunn av den individuelle anatomien. Det krever en erfaren kirurg å plassere elektrodene riktig. Ledningene kan også flyttes dersom signalamplituden ikke er tilfredsstillende.
4. Overfladisk tørk elektrodekrokene festet til nerven og påfør petroleumjell ved hjelp av en sprøyte for å gi elektrisk isolasjon fra det tilstøtende vevet.
   MERK: Det må utvises forsiktighet for å påføre nok vaselin til elektroden og også mellom de to krokene for å sikre elektrisk isolasjon og forhindre at nervene tørker ut.

4. Plassering av opptaks- og referanseelektrodene

1. For å måle H-refleksen, plasser EMG-elektrodene intramuskulært i forpoten. I tillegg plasserer du referanseelektroden subkutant i bakbenet (f.eks. ved hjelp av en minuttpinne), holdt av en miniatyralligatorklips (figur 3B).
2. Når stimulatoren er slått på, observer en vellykket stimulering som små rykninger i forpoten. Minste stimuleringsstrøm for å fremkalle M-bølgen og små synlige rykninger i forpoten bør ligge i området 10-50 μA.
   MERK: Hvis ingen rykninger er synlige ved 50 μA, juster stimuleringselektrodene og påfør vaselin på nytt. Hos mus er det heller ikke uvanlig at M-bølgen opptrer ved lavere stimuleringsintensiteter enn H-bølgen⁵.

5. Måling

1. Gjenta stimuleringen av nerven 15 ganger med 0,2 ms lange pulser hver. Med pauser på 2 min mellom sett med stimuli, økes frekvensen fra 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 til 5 Hz.
   MERK: Disse frekvensene er nødvendige hvis du beregner RDD etterpå. Alle EMG-data registreres, digitaliseres og analyseres ved hjelp av programvare for eksempel Spike2-programvare (CED, versjon 7.19). Den største H-bølgeamplituden forventes ved 0,1 Hz. Jo høyere frekvensen er, desto mindre blir amplituden til H-bølgen på grunn av RDD.
2. Etter forsøket, ofre dyret i henhold til instituttets IACUC-protokoll. I dette eksperimentet ble transkardial perfusjon utført med PBS og 4% PFA under dyp anestesi.

Representative Results

Fra n = 15 stimuleringsforsøk per stimuleringsfrekvens og pote, velg minst n = 10 vellykkede opptak for analysen. Forsøk med målefeil (f.eks. manglende M-bølge) er ekskludert fra analysen. Analyser hvert forsøk separat og generer et gjennomsnitt for gruppe-/tidssammenligninger senere. Latensen mellom stimulering og utseende av M-bølgen og H-bølgen registreres for hvert forsøk. Vår erfaring er at M-bølgen inntreffer ca. 2 ms etter stimulering, og H-bølgen etter 6-8 ms, på grunn av lengre transittid gjennom ryggmargen (figur 1A og figur 2B). Mål amplituden til M- og H-bølgene som peak-to-peak.

For å evaluere de fysiologiske endringene som oppstår ved ryggmargsskade eller hjerneslag, er forholdet mellom H- og M-bølgeamplituden (H/M-forhold, figur 2) mindre utsatt for eksperimentell variabilitet, noe som for eksempel vil gjenspeiles i amplitudeforskjeller. Forholdet gir dermed en mer pålitelig vurdering av sykdomsrelaterte elektrofysiologiske endringer. For eksempel, hos mus med slag i primær og sekundær motorisk cortex, øker H-bølgen, mens M-bølgen forblir uendret (figur 2), noe som tyder på økt eksitabilitet av αMN. Videre er det en redusert RDD (dvs. en redusert reduksjon i undertrykkelsen av H-bølgen med økende stimuleringsfrekvens). Den reduserte RDD er et resultat av redusert ryggmargshemming⁴. Dermed kan RDD validere aktiveringen av spinalhemmende kretser, hvis avbrudd kan resultere i spastisitet. For å beregne H-refleksens RDD anbefales metoden beskrevet av Lee et al.⁴. Kort fortalt er H-refleksstimuleringen ved 0,1 Hz gjennomsnittet og satt til 100%. H-refleksen oppnådd for de andre stimuleringsfrekvensene uttrykkes som relative verdier til 0,1 Hz. Fra hvert stimuleringstog forkastes de tre første stimuleringene.

Figur 1 Illustrasjon av opptaksoppsett og måleveier for Hoffman-refleks (H-refleks) og muskelrespons (M-bølge). (A) H-refleksen induseres ved stimulering av Ia-afferenter, som aktiverer tilsvarende alfa-motoneuroner i ryggmargen og deretter fremkaller muskelkontraksjoner i de innerverte forpotemusklene. (B) Lokalisasjon av de elektrisk stimulerte radiale/ulnare/mediannervene i forlabben og isjias-/tibialnervene i bakpoten. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjematiske og representative elektriske registreringsresultater. (A) Skjematisk fremstilling av et opptak. Stimulansen og den respektive stimuleringsartefakten er satt til 0 ms, som etterfølges av den direkte muskulære responsen (M-bølgen) og den påfølgende mindre toppen som representerer H-bølgen. I spastisitetsmodeller vil H-refleksen være større sammenlignet med den friske kontrollen. (B) Skjermbilder fra et representativt opptak med programvaren som viser originale data med en stimulusartefakt (nedre spor) og utseendet til M-bølgen alene vs. et eksempel der både M- og H-bølgene er synlige i opptaket (henholdsvis øvre spor, midtre og høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Plassering av elektrodene for terminal elektrofysiologisk måling. (A,B) Oversikt over terminal H-refleksmåling med krokstimuleringselektrodene, opptakselektrodene i forpoten og referanseelektroden satt inn i bakbenet. (C,D) I bakbenet, etter hud- og muskelfjerning, blir isjiasnerven synlig og kan deles inn i nervesystemet og tibialnervene. (E) I forbenet blir radiale, median- og ulnarnerver synlige. (F) Ulnarnerven kan stimuleres med krokelektroden uten stimulering av nabonerver. Laget med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

I motsetning til tidligere beskrevne transkutane H-refleksmålinger i mus⁶, gir vi en mer direkte og nervespesifikk måling. Denne nye tilnærmingen kan brukes på nerver i for- og bakbenet (f.eks. median-, ulnar- og radialnervene, og henholdsvis tibial- og isjiasnervene), noe som gjør denne metoden tilpasningsdyktig som et diagnostisk verktøy for mange sykdomsmodeller (f.eks. Hjerneslag, multippel sklerose, amyotrofisk lateralsklerose, traumatisk hjerneskade og ryggmargsskade). Avhengig av valgt nerve anbefales validering av amplituden til H-bølgen som funksjon av stimuleringsintensiteten. Amplituden kan variere på grunn av nervediameteren og motoneuron excitability, samt elektrisk kontakt. Ved å måle H / M-forholdet og RDD, kan eksperimentelle påvirkninger som nålens posisjonering reduseres, noe som øker påliteligheten av de oppnådde verdiene betydelig.

Hovedbegrensningen i protokollen som presenteres her er terminalapplikasjonen uten mulighet for langsgående målinger. Videre bør flere metodologiske detaljer vurderes. Konstant anestesi med minimal muskelavslapping er avgjørende for pålitelig måling og bør valideres for hver enkelt modell / applikasjon. I motsetning til isoflurananestesi som forårsaker en sterk undertrykkelse av muskelreflekser (dvs. H-refleksen 9,10,11^, gir kombinasjonen av ketamin-xylazin en sikker anestesi og er mye brukt til EMG-opptak ¹². I tråd med målinger av motorisk fremkalt potensial hos rotte 13, gir vår erfaring 100 mg/kg ketamin og¹⁰ mg/kg xylazin den beste protokollen for stabile og pålitelige registreringer. For en dyktig eksperimentør er det mulig å utføre for- og bakpotemålinger i et siste eksperiment. Prosedyren som beskrevet her for forpoten, inkludert dyreforberedelse, og måling av alle frekvenser for hastighetsavhengig depresjon, kan utføres på ca. 30-40 minutter. Det anbefales sterkt å øve nervedisseksjonsteknikken før du utfører in vivo-eksperimenter. I modeller for ensidig sykdom (f.eks. kortikale hjerneslag) anbefaler vi å gjenta stimuleringen 15 ganger på begge kontralaterale poter for å inkludere den ikke-affiserte poten som internkontroll. Siden bare en nerve skal stimuleres i metoden vist her, må det utvises spesiell forsiktighet for å fordele tilstrekkelig vaselin rundt stimuleringselektrodene slik at ingen stimulering av nabonervene oppstår.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun