Summary
Клиническая оценка спастичности на основе рефлекса Гофмана (Н-рефлекса) и с использованием электростимуляции периферических нервов является установленным методом. Здесь мы предлагаем протокол терминальной и прямой стимуляции нерва для количественной оценки H-рефлекса в передней лапе мыши.
Abstract
Рефлекс Гофмана (H-рефлекс), как электрический аналог рефлекса растяжения, позволяет проводить электрофизиологическую проверку целостности нейронных цепей после травм, таких как повреждение спинного мозга или инсульт. Увеличение Н-рефлекторной реакции вместе с такими симптомами, как непроизвольные мышечные сокращения, патологически усиленный рефлекс растяжения и гипертонус в соответствующей мышце, является показателем постинсультной спастичности (PSS).
В отличие от довольно нервно-неспецифических чрескожных измерений, здесь мы представляем протокол количественной оценки Н-рефлекса непосредственно на локтевом и срединном нервах передней лапы, который применим, с небольшими изменениями, к большеберцовому и седалищному нервам задней лапы. Основанный на прямой стимуляции и адаптации к различным нервам, метод представляет собой надежный и универсальный инструмент для проверки электрофизиологических изменений в моделях заболеваний, связанных со спастичностью.
Introduction
Рефлекс Гофмана (H-рефлекс), названный в честь физиолога Пауля Гофмана, может быть вызван электрической стимуляцией периферических нервов, которые несут аксоны сенсорных и двигательных нейронов, возникающих из одних и тех же мышц и ведущих к ним. Он является электрически индуцированным аналогом моносинаптического рефлекса растяжения и имеет тот же путь1. В отличие от растяжения мышц, Н-рефлекс возникает в результате электрической стимуляции. Когда периферические нервы электрически стимулируются при низкой интенсивности тока, афферентные волокна Ia обычно сначала деполяризуются из-за их большого диаметрааксона 2. Их потенциалы действия возбуждают альфа-мотонейроны (αMN) в спинном мозге, которые, в свою очередь, вызывают потенциалы действия, которые перемещаются вниз по аксонам αMN к мышце (рис. 1). Этот каскад генерирует мышечную реакцию с небольшой амплитудой, отраженную в так называемой Н-волне. При постепенном увеличении интенсивности стимула амплитуда зубца Н увеличивается за счет привлечения дополнительных двигательных единиц. От определенной интенсивности стимула потенциалы действия в более тонких аксонах αMN вызываются напрямую, что регистрируется как М-волна. Эта М-волна появляется с меньшей задержкой, чем Н-волна (рис. 2). Если интенсивность стимуляции еще больше увеличивается, амплитуда М-волны становится больше из-за привлечения большего количества аксонов αMN, тогда как зубец Н постепенно уменьшается. Зубец Н может быть подавлен при высокой интенсивности стимула из-за антидромного обратного распространения потенциалов действия в аксонах αMN. Эти триггерные потенциалы действия сталкиваются с потенциалами стимуляции Ia и, таким образом, могут компенсировать друг друга. При супрамаксимальных интенсивностях стимула ортодромные (по направлению к мышцам) и антидромные (по отношению к спинному мозгу) потенциалы действия возникают во всех аксонах MN; первый приводит к максимальной амплитуде М-волны (Mmax), тогда как второй приводит к полной отмене Н-рефлекса3.
Для оценки постинсультной спастичности (PSS) или травмы спинного мозга (SCI) H-рефлекс использовался для оценки нейронной основы движения и спастичности у людей1. Улучшенная количественная оценка изменения Н-рефлекса между измерениями и между испытуемыми достигается за счет использования соотношения Н- и М-волны (отношение Н/М). В качестве альтернативы измеряется депрессия, зависящая от скорости (RDD), с использованием набора восходящих частот (например, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 и 5,0 Гц). RDD отражает целостность тормозных цепей, которые могут быть нарушены инсультом или ТСМ. Когда все нейронные цепи целы, происходит равномерное, частотно-независимое подавление Н-рефлекса. Однако, если в результате инсульта или ТСМ снижается нервное торможение, подавление Н-рефлекса уменьшается с увеличением частоты стимуляции4.
Правильная электрофизиологическая запись с использованием поверхностных электродов может быть сложной задачей и может зависеть от двигательных задач, тормозных механизмов и возбудимостиαMN 5. При чрескожной записи у грызунов стимулирующий электрод помещают рядом с большеберцовым нервом, а записывающий электрод помещают рядом с соответствующими мышцами передней лапы. Однако, согласно нашему опыту, правильное размещение чрескожных электродов (рис. 1А) у грызунов еще более сложное и изменчивое, чем размещение поверхностных электродов у людей. Это может привести к различиям в длине, частоте и интенсивности стимуляции, необходимых для возникновения Н-рефлекса. Эти методологические проблемы могут объяснить, почему существует лишь очень ограниченное число исследований измерения Н-рефлекса (например, в экспериментальных моделяхинсульта 3,4 и других моделях спастичности6). Точная (долгосрочная) стимуляция и регистрация Н-рефлекса на отдельных нервах в принципе может быть достигнута с помощью имплантируемых электродов, окружающих целевой нерв 7,8. Из-за сложной операции с потенциальными побочными эффектами для животного и потенциальной нестабильностью зонда этот подход не стал стандартом в полевых условиях. Метод, представленный здесь, также требует некоторого хирургического опыта. Тем не менее, он позволяет по-новому, точно стимулировать и регистрировать изолированные нервы in vivo с использованием низкой интенсивности стимуляции, что позволяет избежать одновременной стимуляции соседних нервов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с европейскими и национальными законами об уходе за животными и институциональными рекомендациями и были одобрены Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Северный Рейн-Вестфалия (Az: 81-02.04.2019.A309). Протокол оптимизирован для взрослых мышей (примерно 8-16-недельных мышей C57Bl / 6J) и записи передних конечностей. Его можно легко адаптировать, стимулируя соответствующие нервы задних конечностей и записывая мышцы задних лап (рис. 1B). Описание регистрирующих и стимулирующих электродов добавлено в Таблицу материалов. Обратите внимание, что протокол используется только для терминального измерения.
1. Подготовка
- Взвесьте животное и начните анестезию, введя внутримышечно смесь кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг).
- Держите мышь в согревающем ящике до тех пор, пока не будет достигнута хирургическая переносимость. Подождите несколько минут, пока мышь успокоится, дыхание станет стабильным, а рефлексы отсутствуют. Проверьте глубину анестезии, измерив отсутствие реакции на защемление пальца ноги.
- Переверните мышь на спину и положите ее на грелку (оптимальным будет нагрев с обратной связью с помощью ректального датчика температуры). Зафиксируйте передние лапы скотчем. Здесь убедитесь, что лента расположена таким образом, чтобы измерительные электроды легко вставлялись в передние лапы.
- Вставьте ректальный зонд для измерения температуры животного и зафиксируйте его скотчем. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз.
2. Хирургия
ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильное состояние животного, находящегося под наркозом, т.е. дыхание, температура и потеря рефлексов, следует регулярно контролировать на протяжении всей процедуры. Процедура измерения H-волны прямого нерва показана для лучевого/локтевого/срединного нерва передней лапы (рис. 3A). Измерение также может быть адаптировано к задней лапе (седалищному/большеберцовому нерву) с модификациями.
- Для лучшего обзора операционной области предварительно удалите волосы электрической бритвой или ножницами в отдельном месте. Для более опытных хирургов это необязательно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дезинфекция здесь не нужна, так как это конечный эксперимент. Позже животное будет усыплено. - Поднимите кожу пинцетом и сделайте надрез примерно 1 см на коже вдоль вентро-задней оси передней лапы (область над подмышкой и грудной клеткой) парой тонких закругленных ножниц.
- Осторожно удалите соединительную ткань и обнаживите мышцу и нерв под ней. Удалите обнаженную грудную мышцу с помощью щипцов, чтобы получить доступ к срединному нерву (рис. 3E, F). Удаляют небольшое количество крови и тканевой жидкости с помощью мягких тканей.
- На следующем этапе осторожно разрежьте грудь или подмышечную мышцу сверху вниз, чтобы обнажить нервный пучок под ним. Освободите нервный пучок от соединительной и мышечной ткани на длине примерно 1,5 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь следует соблюдать особую осторожность, чтобы не повредить кровеносные сосуды, которые проходят параллельно срединному нерву. При разрезании ткани всегда разрезайте вдоль нерва, чтобы не травмировать его. Если это произошло, удалите вытекающую жидкость и кровь с помощью тампона. Астереомикроскоп не нужен для всего эксперимента, однако он может быть полезен для подготовки нервов. - Аккуратно отделите локтевой и срединный нервы передней лапы с помощью изогнутой стеклянной пипетки (рис. 3E). Верхний из двух нервов - локтевой нерв, а нижний - срединный нерв.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отделяя нервы друг от друга, убедитесь, что кровеносный сосуд под ними не поврежден.
3. Размещение электродов
- Расположите электроды крючка для стимуляции параллельно на расстоянии 0,5-1,0 мм и с помощью микроманипулятора расположите двойной крючок в непосредственной близости от нерва.
- Используйте стеклянный крючок в качестве инструмента для подъема локтевого нерва на электроды крючка для стимуляции. Оттяните электрод от нерва и отделите его от других нервов примерно на 1-2 мм с помощью микроманипулятора (рис. 3D, F).
- Разместите электроды вдоль длинной оси лапы, чтобы уменьшить перекрестные помехи между мышцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размещение электродов очень важно, но его трудно стандартизировать из-за индивидуальной анатомии. Для правильного размещения электродов требуется опытный хирург. Провода также могут быть перемещены, если амплитуда сигнала неудовлетворительна. - Поверхностно высушите электродные крючки, прикрепленные к нерву, и нанесите вазелин с помощью шприца, чтобы обеспечить электрическую изоляцию от прилегающих тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует позаботиться о нанесении достаточного количества вазелина на электрод, а также между двумя крючками, чтобы обеспечить электрическую изоляцию и предотвратить высыхание нервов.
4. Размещение регистрирующего и опорного электродов
- Чтобы измерить Н-рефлекс, поместите электроды ЭМГ внутримышечно в переднюю лапу. Кроме того, поместите электрод сравнения подкожно в заднюю конечность (например, с помощью минутного штифта), удерживаемого миниатюрным зажимом типа «крокодил» (рис. 3B).
- Когда стимулятор включен, наблюдайте за успешной стимуляцией в виде крошечных подергиваний передней лапы. Минимальный ток стимуляции для вызова М-волны и крошечных видимых подергиваний в передней лапе должен быть в диапазоне 10-50 мкА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если при 50 мкА подергиваний не видно, отрегулируйте стимулирующие электроды и повторно нанесите вазелин. Кроме того, у мышей нередко М-волна появляется при более низкой интенсивности стимуляции, чемН-волна 5.
5. Измерение
- Повторите стимуляцию нерва 15 раз импульсами длиной 0,2 мс каждый. С паузами в 2 мин между наборами стимулов частоту увеличивают с 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 до 5 Гц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти частоты необходимы при последующем расчете RDD. Все данные ЭМГ записываются, оцифровываются и анализируются с помощью программного обеспечения, например, программного обеспечения Spike2 (CED, версия 7.19). Наибольшая амплитуда H-волны ожидается на уровне 0,1 Гц. Чем выше частота, тем меньше становится амплитуда зубца Н из-за RDD. - После эксперимента принесите животное в жертву в соответствии с протоколом IACUC института. В этом эксперименте транскардиальная перфузия мышей проводилась с использованием PBS и 4% PFA под глубоким наркозом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Из n = 15 испытаний стимуляции по частоте стимуляции и лапе выберите не менее n = 10 успешных записей для анализа. Испытания с погрешностями измерений (например, отсутствующая М-волна) исключаются из анализа. Проанализируйте каждое испытание отдельно и сгенерируйте среднее значение для сравнения групп/времени позже. Латентность между стимуляцией и появлением М-волны и Н-волны регистрируется для каждого испытания. По нашему опыту, зубец М возникает примерно через 2 мс после стимуляции, а зубец Н - через 6-8 мс из-за более длительного времени прохождения через спинной мозг (рис. 1А и рис. 2Б). Измерьте амплитуду M- и H-волн от пика до пика.
Для оценки физиологических изменений, происходящих при повреждении спинного мозга или инсульте, соотношение между амплитудой зубца Н и М (соотношение Н/М, рис. 2) менее подвержено экспериментальной вариабельности, которая отражается, например, в разнице амплитуд. Таким образом, соотношение обеспечивает более надежную оценку электрофизиологических изменений, связанных с заболеванием. Например, у мышей с инсультом в первичной и вторичной моторной коре зубец Н увеличивается, тогда как зубец М остается неизменным (рис. 2), что свидетельствует о повышенной возбудимости αMN. Кроме того, наблюдается снижение RDD (т.е. уменьшение подавления зубца H с увеличением частоты стимуляции). Снижение RDD является результатом снижения торможения спинного мозга4. Таким образом, RDD может подтвердить активацию спинальных тормозных цепей, прерывание которых может привести к спастичности. Для расчета RDD Н-рефлекса рекомендуется метод, описанный Lee et al.4. Вкратце, Н-рефлекторная стимуляция на частоте 0,1 Гц усредняется и устанавливается на 100%. Н-рефлекс, полученный для других частот стимуляции, выражается в виде относительных значений к 0,1 Гц. Из каждой линии стимуляции первые три стимуляции отбрасываются.
Рисунок 1: Иллюстрация настройки записи и путей измерения рефлекса Хоффмана (H-рефлекса) и мышечной реакции (M-волна). (A) H-рефлекс индуцируется стимуляцией афферентов Ia, которые активируют соответствующие альфа-мотонейроны в спинном мозге и впоследствии вызывают мышечные сокращения в иннервируемых мышцах передней лапы. (B) Расположение электрически стимулируемых лучевых/локтевых/срединных нервов в передней лапе и седалищного/большеберцового нервов в задней лапе. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематические и репрезентативные результаты электрической записи. (А) Схема записи. Стимул и соответствующий артефакт стимуляции установлены на 0 мс, за которым следует прямая мышечная реакция (М-волна) и последующий меньший пик, представляющий Н-волну. В моделях спастичности H-рефлекс будет больше по сравнению со здоровым контролем. (B) Скриншоты из репрезентативной записи с программным обеспечением, показывающие исходные данные с артефактом стимула (нижние следы) и внешний вид только М-волны по сравнению с примером, где на записи видны как М-, так и Н-волны (верхняя трасса, средняя и правая панель соответственно). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Расположение электродов для конечного электрофизиологического измерения. (А,Б) Обзор терминального измерения H-рефлекса с помощью электродов стимуляции крючков, регистрирующих электродов в передней лапе и электрода сравнения, вставленного в заднюю конечность. (С,Д) В задней конечности после удаления кожи и мышц седалищный нерв становится видимым и может быть разделен на седалищный и большеберцовый нервы. (E) В передней конечности становятся видимыми лучевой, срединный и локтевой нервы. (F) Локтевой нерв можно стимулировать крючковым электродом без стимуляции соседних нервов. Создано с помощью BioRender.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В отличие от ранее описанных чрескожных измерений Н-рефлекса у мыши6, мы обеспечиваем более прямое и специфическое для нерва измерение. Этот новый подход может быть применен к нервам передних и задних конечностей (например, срединному, локтевому и лучевому нервам, большеберцовому и седалищному нервам соответственно), что делает этот метод адаптируемым в качестве диагностического инструмента ко многим моделям заболеваний (например, инсульт, рассеянный склероз, боковой амиотрофический склероз, черепно-мозговая травма и повреждение спинного мозга). В зависимости от выбранного нерва рекомендуется проверка амплитуды зубца H в зависимости от интенсивности стимуляции. Амплитуда может варьироваться в зависимости от диаметра нерва и возбудимости мотонейрона, а также электрического контакта. Измеряя соотношение H/M и RDD, можно уменьшить экспериментальные воздействия, такие как позиционирование иглы, что значительно повышает надежность полученных значений.
Основным ограничением представленного здесь протокола является терминальное применение без возможности продольных измерений. Кроме того, следует рассмотреть несколько методологических деталей. Постоянная анестезия с минимальной мышечной релаксацией имеет решающее значение для надежного измерения и должна быть проверена для каждой конкретной модели/применения. В отличие от изофлурановой анестезии, которая вызывает сильное подавление мышечных рефлексов (т.е. Н-рефлекс 9,10,11), комбинация кетамин-ксилазин обеспечивает безопасную анестезию и широко используется для записи ЭМГ 12. В соответствии с измерениями моторных вызванных потенциалов у крыс 13, по нашему опыту, 100 мг / кг кетамина и10 мг / кг ксилазина обеспечивают лучший протокол для стабильной и надежной записи. Опытный экспериментатор может выполнить измерения передней и задней лап в одном заключительном эксперименте. Процедура, описанная здесь для передней лапы, включая подготовку животных и измерение всех частот депрессии, зависящей от скорости, может быть выполнена примерно за 30-40 минут. Настоятельно рекомендуется практиковать технику рассечения нерва перед проведением экспериментов in vivo. В односторонних моделях заболевания (например, кортикальный инсульт) мы рекомендуем повторить стимуляцию 15 раз на обеих контралатеральных лапах, чтобы включить непораженную лапу в качестве внутреннего контроля. Поскольку в способе, показанном здесь, должен быть стимулирован только один нерв, необходимо проявлять особую осторожность, чтобы распределить достаточное количество вазелина вокруг стимулирующих электродов, чтобы не происходило стимуляции соседних нервов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Т. Акаю из Университета Далхаузи во время визита М.Г. в его лабораторию. Эта работа была поддержана финансированием Фонда Фрибе (T0498/28960/16) и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкое научно-исследовательское общество) - Project-ID 431549029 - SFB 1451.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbent underpad | VWR | 115-0684 | |
| AD converter | Cambridge Electronic Design, UK | CED 1401micro | |
| Amplifier | Workshop Zoological Institute, UoC | - | |
| Digital stimulator | Workshop Zoological Institute, UoC | MS 501 | |
| EMG electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier. | |
| Eye ointment | Bayer | Bepanthen | |
| Glass pipette | Workshop Zoological Institute, UoC | - | Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner. |
| Heating box | MediHeat | MediHeat V1200 | |
| Heating pad | WPI | 61840 Heating pad | |
| Hook electrodes | Workshop Zoological Institute, UoC | - | To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device. |
| Ketamine | Pfizer | Ketavet | |
| Rectal probe | WPI | RET-3 | |
| Stimulator isolation unit | Workshop Zoological Institute, UoC | MI 401 | |
| Sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C). |
| Temperature controller | WPI | ATC200 | |
| Vaseline | Bayer | - | |
| Xylazine | Bayer | Rompun |
References
- Palmieri, R. M., Ingersoll, C. D., Hoffman, M. A. The Hoffmann reflex: methodologic considerations and applications for use in sports medicine and athletic training research. Journal of Athletic Training. 39 (3), 268-277 (2004).
- Henneman, E., Somjen, G., Carpenter, D. O. Excitability and inhibitibility of motoneurons of different sizes. Journal of Neurophysiology. 28 (3), 599-620 (1965).
- Toda, T., Ishida, K., Kiyama, H., Yamashita, T., Lee, S. Down-regulation of KCC2 expression and phosphorylation in motoneurons, and increases the number of in primary afferent projections to motoneurons in mice with post-stroke spasticity. PLoS ONE. 9 (12), 114328 (2014).
- Lee, S., Toda, T., Kiyama, H., Yamashita, T. Weakened rate-dependent depression of Hoffmann’s reflex and increased motoneuron hyperactivity after motor cortical infarction in mice. Cell Death & Disease. 5 (1), 1007 (2014).
- Knikou, M. The H-reflex as a probe: Pathways and pitfalls. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 1-12 (2008).
- Wieters, F., et al. Introduction to spasticity and related mouse models. Experimental Neurology. 335, 113491 (2020).
- Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 36-42 (2005).
- Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. Journal of Neurophysiology. 111 (3), 694-703 (2014).
- Haghighi, S. S., Green, D. K., Oro, J. J., Drake, R. K., Kracke, G. R. Depressive effect of isoflurane anesthesia on motor evoked potentials. Neurosurgery. 26 (6), 993 (1990).
- Chang, H. -Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 295 (4), 1248-1253 (2008).
- Nolan, J. P. Section 4: Nervous system (Br. J. Pharmacol). Clinical pharmacology. , 295-310 (2012).
- Struck, M. B., Andrutis, K. A., Ramirez, H. E., Battles, A. H. Effect of a short-term fast on ketamine-xylazine anesthesia in rats. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (3), 344-348 (2011).
- Zandieh, S., Hopf, R., Redl, H., Schlag, M. G. The effect of ketamine/xylazine anesthesia on sensory and motor evoked potentials in the rat. Spinal Cord. 41 (1), 16-22 (2003).
