Terminal H-reflexmätningar hos möss

Summary

Den kliniska utvärderingen av spasticitet baserad på Hoffmannreflexen (H-reflexen) och användning av elektrisk stimulering av perifera nerver är en etablerad metod. Här tillhandahåller vi ett protokoll för en terminal och direkt nervstimulering för H-reflexkvantifiering i musens framtass.

Abstract

Hoffmannreflexen (H-reflexen), som en elektrisk analog till sträckreflexen, möjliggör elektrofysiologisk validering av integriteten hos neurala kretsar efter skador som ryggmärgsskada eller stroke. En ökning av H-reflexsvaret, tillsammans med symtom som icke-frivilliga muskelsammandragningar, patologiskt förstärkt stretchreflex och hypertoni i motsvarande muskel, är en indikator på spasticitet efter stroke (PSS).

I motsats till ganska nervospecifika transkutana mätningar presenterar vi här ett protokoll för att kvantifiera H-reflexen direkt vid framtassens ulnara och mediannerver, vilket är tillämpligt, med mindre modifieringar, på bakpotens tibial- och ischiasnerv. Baserat på direkt stimulering och anpassning till olika nerver representerar metoden ett pålitligt och mångsidigt verktyg för att validera elektrofysiologiska förändringar i spasticitetsrelaterade sjukdomsmodeller.

Introduction

Hoffmannreflexen (H-reflex), uppkallad efter fysiologen Paul Hoffmann, kan framkallas genom elektrisk stimulering av perifera nerver, som bär axoner av sensoriska och motoriska neuroner som härrör från och leder till samma muskler. Det är den elektriskt inducerade analogen av den monosynaptiska sträckreflexen och delar samma väg¹. Till skillnad från muskelsträckningen är H-reflexen resultatet av elektrisk stimulering. När perifera nerver stimuleras elektriskt vid låg strömintensitet depolariseras Ia-afferenta fibrer typiskt först på grund av deras stora axondiameter². Deras aktionspotentialer exciterar alfamotorneuroner (αMN) i ryggmärgen, vilket i sin tur framkallar åtgärdspotentialer som färdas ner αMN-axonerna mot muskeln (figur 1). Denna kaskad genererar ett muskulärt svar med liten amplitud, reflekterad i den så kallade H-vågen. Genom att gradvis öka stimulansintensiteten ökar amplituden för H-vågen på grund av rekryteringen av ytterligare motorenheter. Från en viss stimulansintensitet framkallas åtgärdspotentialer i de tunnare axonerna hos αMN direkt, vilket registreras som M-vågen. Denna M-våg visas med kortare latens än H-vågen (figur 2). Om stimuleringsintensiteten ökas ytterligare blir amplituden för M-vågen större på grund av rekryteringen av fler αMN-axoner, medan H-vågen gradvis blir mindre. H-vågen kan undertryckas vid höga stimulansintensiteter på grund av antidromisk backpropagation av åtgärdspotentialer i αMN-axonerna. Dessa utlösta åtgärdspotentialer kolliderar med dem från Ia-stimuleringen och kan därmed ta ut varandra. Vid supramaximal stimulansintensitet förekommer ortodromiska (mot muskeln) och antidromic (mot ryggmärgen) åtgärdspotentialer i alla MN-axoner; den förra ger upphov till den maximala M-vågamplituden (Mmax), medan den senare resulterar i fullständigt avskaffande av H-reflexen³.

För utvärdering av spasticitet efter stroke (PSS) eller ryggmärgsskada (SCI) har H-reflexen använts för att bedöma den neurala grunden för rörelse och spasticitet hos människa¹. En förbättrad kvantifiering av förändringen i H-reflexen mellan mätningar och mellan försökspersoner uppnås genom att använda förhållandet mellan H- och M-vågen (H/M-förhållandet). Alternativt mäts den hastighetsberoende depressionen (RDD) med hjälp av en uppsättning stigande frekvenser (t.ex. 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 och 5,0 Hz). RDD återspeglar integriteten hos hämmande kretsar som kan störas av stroke eller SCI. När alla neurala kretsar är intakta finns det en enhetlig, frekvensoberoende undertryckning av H-reflexen. Men om det finns minskad neural hämning som ett resultat av stroke eller SCI minskar undertryckandet av H-reflexen med ökande stimuleringsfrekvens⁴.

Korrekt elektrofysiologisk registrering med ytelektroder kan vara utmanande och kan påverkas av motoriska uppgifter, hämmande mekanismer och αMN-retbarhet⁵. I den transkutana inspelningen hos gnagare placeras en stimulanselektrod nära tibialnerven och en inspelningselektrod placeras nära de relaterade musklerna i frampoten. Enligt vår erfarenhet är dock den korrekta placeringen av de transkutana elektroderna (figur 1A) ännu mer komplex och variabel hos gnagare än ytelektrodplacering hos människor. Detta kan leda till skillnader i längd, frekvens och stimuleringsintensitet som är nödvändig för att framkalla H-reflexen. Dessa metodologiska utmaningar kan förklara varför det endast finns ett mycket begränsat antal H-reflexmätningsstudier (t.ex. i experimentella strokemodeller ^3,4 och andra spasticitetsmodeller⁶. En exakt (långsiktig) stimulering och registrering av H-reflexen på enskilda nerver kan i princip uppnås med hjälp av implanterbara elektroder som omger målnerven ^7,8. På grund av den utmanande operationen med potentiella biverkningar för djuret och potentiell instabilitet hos sonden har detta tillvägagångssätt inte blivit en standard inom området. Metoden som presenteras här kräver också viss kirurgisk expertis. Det möjliggör emellertid en ny, exakt stimulering och inspelning av isolerade nerver in vivo med låga stimuleringsintensiteter, vilket undviker samtidig stimulering av närliggande nerver.

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med europeiska och nationella djurvårdslagar och institutionella riktlinjer och godkändes av Landesamt für Natur-, Umwelt-, und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az: 81-02.04.2019.A309). Protokollet är optimerat för vuxna möss (ca 8-16 veckor gamla C57Bl/6J-möss) och frambensregistreringen. Det kan enkelt anpassas genom att stimulera respektive nerver i bakbenet och registrera bakpotmusklerna (figur 1B). En beskrivning av inspelnings- och stimuleringselektroderna läggs till i materialtabellen. Observera att protokollet endast används för en terminalmätning.

1. Förberedelse

1. Väg djuret och starta anestesin genom att via i.p. injicera en blandning av ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg).
2. Håll musen i värmeboxen tills kirurgisk tolerans uppnås. Vänta några minuter tills musen är lugn, andningen är stabil och reflexer saknas. Kontrollera anestesidjupet genom att mäta bristen på respons på tånypan.
3. Vrid musen på ryggen och placera den på en värmedyna (optimalt skulle vara återkopplingsstyrd uppvärmning med en rektal temperatursond). Fixa frampotarna med tejp. Se här till att tejpen är placerad på ett sådant sätt att mätelektroderna lätt sätts in i frampoten.
4. Sätt i en rektal sond för att mäta djurets temperatur och fixa den med tejp. Applicera ögonsalva för att förhindra att ögonen torkar ut.

2. Kirurgi

OBS: Det sövda djurets stabila tillstånd, dvs andning, temperatur och förlust av reflexer, bör övervakas regelbundet under hela proceduren. Mätproceduren för H-våg av den direkta nerven visas för framtassens radiella/ulnara/mediannerv (figur 3A). Mätningen kan också anpassas till bakpoten (ischias/tibialnerven) med modifieringar.

1. För en bättre översikt över det kirurgiska området, ta bort håret med en elektrisk rakhyvel eller en sax på en separat plats i förväg. För mer erfarna kirurger är detta endast valfritt.
   OBS: Desinfektion är inte nödvändig här, eftersom detta är ett slutexperiment. Djuret kommer att avlivas senare.
2. Lyft huden med pincett och gör ett snitt på ca 1 cm i huden längs framtassens ventro-bakre axel (området ovanför armhålan och bröstkorgen) med en fin rundad sax.
3. Ta försiktigt bort bindväven och exponera muskeln och nerven under. Ta bort den exponerade pectoralis profundus-muskeln med pincett för att komma åt mediannerven (figur 3E,F). Ta bort små mängder blod och vävnadsvätska med mjukvävnad.
4. I nästa steg, skär försiktigt bröstet eller axillära muskeln från toppen till botten för att exponera nervbunten under. Frigör nervbunten från bindväv och muskelvävnad över en längd av cirka 1,5 cm.
   OBS: Här bör särskild försiktighet vidtas för att inte skada blodkärlen som löper parallellt med mediannerven. När du skär vävnaden, skär alltid längs nerven för att undvika att skada den. Om detta händer, ta bort läckande vätska och blod med en vattpinne. Astereomikroskop är inte nödvändigt för hela experimentet, men det kan vara användbart för beredning av nerverna.
5. Separera framtassens ulnara och mediannerv försiktigt med en böjd glaspipett (figur 3E). Den övre av de två nerverna är ulnarnerven, och den nedre är mediannerven.
   OBS: När du separerar nerverna från varandra, se till att blodkärlet under inte är skadat.

3. Elektrodplacering

1. Ordna stimuleringskrokelektroderna parallellt på ett avstånd av 0,5-1,0 mm och använd en mikromanipulator för att placera dubbelkroken i närheten av nerven.
2. Använd glaskroken som ett verktyg för att lyfta ulnarnerven på stimuleringskrokelektroderna. Dra tillbaka elektroden med nerven och separera den från andra nerver med cirka 1-2 mm med hjälp av mikromanipulatorn (figur 3D, F).
3. Placera elektroderna längs tassens långa axel för att minska överhörningen mellan musklerna.
   OBS: Placeringen av elektroderna är mycket viktig men svår att standardisera på grund av den individuella anatomin. Det kräver en erfaren kirurg för att placera elektroderna korrekt. Ledningarna kan också flyttas om signalamplituden är otillfredsställande.
4. Torka ytligt elektrodkrokarna som är fästa vid nerven och applicera vaselin med en spruta för att ge elektrisk isolering från den intilliggande vävnaden.
   OBS: Försiktighet bör vidtas för att applicera tillräckligt med vaselin på elektroden och även mellan de två krokarna för att säkerställa elektrisk isolering och förhindra att nerverna torkar ut.

4. Placering av registrerings- och referenselektroderna

1. För att mäta H-reflexen, placera EMG-elektroderna intramuskulärt i framtassen. Placera dessutom referenselektroden subkutant i bakbenet (t.ex. med hjälp av en minutnål) som hålls av en miniatyralligatorklämma (figur 3B).
2. När stimulatorn är påslagen, observera en framgångsrik stimulering som små ryckningar i frampoten. Den minsta stimuleringsströmmen för att framkalla M-vågen och små synliga ryckningar i framtassen bör ligga i intervallet 10-50 μA.
   OBS: Om inga ryckningar är synliga vid 50 μA, justera stimuleringselektroderna och applicera vaselin igen. Hos möss är det inte ovanligt att M-vågen uppträder vid lägre stimuleringsintensiteter än H-våg⁵.

5. Mätning

1. Upprepa stimuleringen av nerven 15 gånger med 0,2 ms långa pulser vardera. Med pauser på 2 minuter mellan uppsättningar stimuli ökas frekvensen från 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 till 5 Hz.
   OBS: Dessa frekvenser är nödvändiga om RDD beräknas efteråt. All EMG-data registreras, digitaliseras och analyseras med hjälp av programvara, t.ex. Spike2-programvara (CED, version 7.19). Den största H-vågamplituden förväntas vid 0,1 Hz. Ju högre frekvens, desto mindre blir amplituden för H-vågen på grund av RDD.
2. Efter experimentet, offra djuret enligt institutets IACUC-protokoll. I detta experiment utfördes mustranskardiell perfusion med PBS och 4% PFA under djup anestesi.

Representative Results

Från n = 15 stimuleringsförsök per stimuleringsfrekvens och tass, välj minst n = 10 framgångsrika registreringar för analysen. Försök med mätfel (t.ex. M-våg saknas) exkluderas från analysen. Analysera varje prövning separat och generera ett genomsnitt för grupp-/tidsjämförelser senare. Latensen mellan stimulering och utseende av M-vågen och H-vågen registreras för varje försök. Enligt vår erfarenhet inträffar M-vågen ungefär 2 ms efter stimulering och H-vågen efter 6-8 ms på grund av den längre transittiden genom ryggmärgen (figur 1A och figur 2B). Mät amplituden för M- och H-vågorna som topp-till-topp.

För att utvärdera de fysiologiska förändringar som uppstår vid ryggmärgsskada eller stroke är förhållandet mellan H- och M-vågamplituden (H / M-förhållandet, figur 2) mindre benäget för experimentell variabilitet, vilket exempelvis skulle återspeglas i amplitudskillnader. Kvoten ger därmed en mer tillförlitlig utvärdering av sjukdomsrelaterade elektrofysiologiska förändringar. Till exempel, hos möss med stroke i den primära och sekundära motorcortexen, ökar H-vågen, medan M-vågen förblir oförändrad (figur 2), vilket tyder på en ökad excitabilitet av αMN. Dessutom finns det en minskad RDD (dvs en minskad minskning av undertryckandet av H-vågen med ökande stimuleringsfrekvens). Den minskade RDD är resultatet av minskad ryggmärgshämning⁴. Således kan RDD validera aktiveringen av ryggradshämmande kretsar, vars avbrott kan leda till spasticitet. För att beräkna RDD för H-reflexen rekommenderas metoden som beskrivs av Lee et al.⁴. Kortfattat är H-reflexstimuleringen vid 0,1 Hz i genomsnitt och inställd på 100%. H-reflexen erhållen för de andra stimuleringsfrekvenserna uttrycks som relativa värden till 0,1 Hz. Från varje stimuleringståg kasseras de tre första stimuleringarna.

Figur 1: Illustration av inspelningsinställningen och vägar för att mäta Hoffman-reflexen (H-reflex) och muskelresponsen (M-vågen). (A) H-reflexen induceras genom stimulering av Ia-afferenter, som aktiverar motsvarande alfa-motoneuroner i ryggmärgen och därefter framkallar muskelsammandragningar i de innerverade framtassmusklerna. B) Placeringen av de elektriskt stimulerade radiella/ulnara/mediana nerverna i framtassen och ischias-/tibialnerverna i baktassen. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Schematiska och representativa elektriska registreringsresultat. (A) Schematisk bild av en registrering. Stimulus och respektive stimuleringsartefakt är inställda på 0 ms, vilket följs av det direkta muskulära svaret (M-vågen) och den efterföljande mindre toppen som representerar H-vågen. I spasticitetsmodeller kommer H-reflexen att vara större jämfört med den friska kontrollen. (B) Skärmdumpar från en representativ inspelning med programvaran som visar originaldata med en stimulusartefakt (nedre spår) och utseendet på M-vågen ensam jämfört med ett exempel där både M- och H-vågorna är synliga i inspelningen (övre spår, mitten respektive höger panel). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: Placering av elektroderna för terminal elektrofysiologisk mätning. (A,B) Översikt över den terminala H-reflexmätningen med krokstimuleringselektroderna, registreringselektroderna i framtassen och referenselektroden som sätts in i bakbenet. (C,D) I bakbenet, efter hud- och muskelavlägsnande, blir ischiasnerven synlig och kan delas in i ischias- och tibialnerverna. (E) I frambenen blir de radiella, median- och ulnarnerverna synliga. (F) Ulnarnerven kan stimuleras med krokelektroden utan stimulering av närliggande nerver. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

Till skillnad från tidigare beskrivna transkutana H-reflexmätningar i mus⁶ ger vi en mer direkt och nervspecifik mätning. Detta nya tillvägagångssätt kan tillämpas på nerverna i fram- och bakbenet (t.ex. median-, ulnar- och radialnerverna respektive tibial- respektive ischiasnerverna), vilket gör denna metod anpassningsbar som ett diagnostiskt verktyg till många sjukdomsmodeller (t.ex. stroke, multipel skleros, amyotrofisk lateralskleros, traumatisk hjärnskada och ryggmärgsskada). Beroende på den valda nerven rekommenderas validering av H-vågens amplitud som en funktion av stimuleringsintensiteten. Amplituden kan variera beroende på nervdiametern och motoneuron excitabilitet, såväl som elektrisk kontakt. Genom att mäta H/M-förhållandet och RDD kan experimentell påverkan såsom nålens positionering minskas, vilket avsevärt ökar tillförlitligheten hos de erhållna värdena.

Huvudbegränsningen för protokollet som presenteras här är terminalapplikationen utan möjlighet till longitudinella mätningar. Vidare bör flera metodologiska detaljer beaktas. Konstant anestesi med minimal muskelavslappning är avgörande för tillförlitlig mätning och bör valideras för varje specifik modell/applikation. Till skillnad från isoflurananestesi som orsakar en stark undertryckning av muskelreflexer (dvs H-reflexen 9,10,11^, ger kombinationen ketamin-xylazin en säker anestesi och används ofta för EMG-inspelningar ¹². I linje med mätningar av motoriska framkallade potentialer hos råtta¹³, enligt vår erfarenhet ger 100 mg / kg ketamin och 10 mg / kg xylazin det bästa protokollet för stabila och tillförlitliga registreringar. För en skicklig experimentator är det möjligt att utföra för- och baktassmätningar i ett sista experiment. Proceduren som beskrivs här för framtassen, inklusive djurberedning och mätning av alla frekvenser för hastighetsberoende depression, kan utföras på cirka 30-40 minuter. Det rekommenderas starkt att öva nervdissektionstekniken innan du utför in vivo-experiment. I ensidiga sjukdomsmodeller (t.ex. kortikal stroke) rekommenderar vi att stimuleringen upprepas 15 gånger på båda kontralaterala tassarna för att inkludera den icke-drabbade tassen som en intern kontroll. Eftersom endast en nerv ska stimuleras med den metod som visas här, måste särskild försiktighet iakttas för att fördela tillräckligt med vaselin runt stimuleringselektroderna så att ingen stimulering av närliggande nerver uppstår.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent underpad	VWR	115-0684
AD converter	Cambridge Electronic Design, UK	CED 1401micro
Amplifier	Workshop Zoological Institute, UoC	-
Digital stimulator	Workshop Zoological Institute, UoC	MS 501
EMG electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC		Two twisted, insulated copper wires (50 µm outer diameter) were soldered to a male plug and connected to a differential amplifier.
Eye ointment	Bayer	Bepanthen
Glass pipette	Workshop Zoological Institute, UoC	-	Prepare a glass pipette bent into a simple glass hook in the flame of a Bunsen burner.
Heating box	MediHeat	MediHeat V1200
Heating pad	WPI	61840 Heating pad
Hook electrodes	Workshop Zoological Institute, UoC	-	To produce the electrodes, bend stainless steel miniature pins into hooks at one end and insert into blunt cannulas to create direct mechanical contact. Solder the end of the cannula to copper wires (length approx. 50 cm), which are connected to either stimulation or recording device.
Ketamine	Pfizer	Ketavet
Rectal probe	WPI	RET-3
Stimulator isolation unit	Workshop Zoological Institute, UoC	MI 401
Sterilizer	CellPoint Scientific	Germinator 500	Routine pre- and post-operative disinfection of the surgical equipment should be done by heat sterilization. Decontaminate instruments for 15 s in the heated glass bead bath (260°C).
Temperature controller	WPI	ATC200
Vaseline	Bayer	-
Xylazine	Bayer	Rompun