Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于表达 非洲爪蟾 卵母细胞中的间隙连接蛋白，并使用商业放大器记录两个附着的卵母细胞之间的连接电流，该放大器设计用于在高压侧电流测量模式下记录双卵母细胞电压钳位记录。
Abstract
非洲爪蟾卵母细胞中连接蛋白和连接蛋白的异源表达是研究间隙连接（GJs）生物物理性质的有力方法。然而，这种方法在技术上具有挑战性，因为它需要两个对立的卵母细胞共享一个共同点的差分电压钳位。虽然少数实验室已经成功地执行了这种技术，但基本上他们都使用了自制放大器或专为单卵母细胞记录而设计的商业放大器。对于其他实验室来说，实施这种技术通常具有挑战性。尽管高边电流测量模式已被整合到用于双卵母细胞电压钳位记录的商用放大器中，但在我们最近的研究之前，还没有关于其应用的报告。我们通过引入一些技术修改，使高端电流测量方法更加实用和方便，包括构建基于磁性的记录平台，允许精确放置卵母细胞和各种电极，使用浴溶液作为电压差分电极中的导体，采用商用低泄漏KCl电极作为参比电极， 从薄壁玻璃毛细管制造电流和电压电极，并使用磁性器件定位所有电极。这里描述的方法允许方便和可靠地记录两个对立的非洲爪蟾卵母细胞之间的结电流（Ij）。
Introduction
GJ是细胞间通道，可能允许相邻细胞之间小细胞质分子的电流流动和交换。它们存在于许多细胞类型中，并执行不同的生理功能。脊椎动物中的GJ由连接蛋白形成，而无脊椎动物中的GJ由连接蛋白形成。每个GJ由两个并列的半透明细胞组成，每个半汉奈尔有6个或8个亚基，这取决于它们是连接蛋白还是连接蛋白1，2，3。人类有21个连接蛋白基因4个，而常用的无脊椎动物模型 秀丽隐杆线虫 和 黑腹果蝇 有25个和8个连接蛋白基因，分别为5，6个。基因转录本的替代剪接可能进一步增加GJ蛋白的多样性，至少对于连接蛋白7，8。
GJs可以根据分子组成分为三类：同型，异型和异构。同型GJ的所有亚基都是相同的。异型GJ具有两个同构半透明质，但两个半质由两种不同的GJ蛋白形成。异构体GJ含有至少一种异构半构体。GJ的分子多样性可能赋予对其生理功能很重要的独特生物物理特性。GJ生物物理性质也由调节蛋白9调节。要了解GJ如何执行其生理功能，重要的是要了解它们的分子组成，生物物理性质以及调节蛋白在其功能中的作用。
异源表达系统通常用于研究离子通道（包括GJ）的生物物理性质以及调节蛋白对它们的影响。由于异源表达系统允许特定蛋白质的表达，因此它们通常比天然组织更适合解剖蛋白质功能，其中具有冗余功能的蛋白质会使分析复杂化，并且可能无法实现Ij的记录。不幸的是，除了Neuro-2A细胞外，最常用的细胞系由于内源性连接蛋白的并发症而不适合研究GJ的生物物理特性。即使是Neuro-2A细胞也并不总是适合这种分析。例如，在不存在或存在UNC-1（未发表）的情况下，我们无法在转染有连接蛋白UNC-7和UNC-9的Neuro-2A细胞中检测到任何Ij，这是秀丽隐杆线虫9，10中UNC-9 GJs功能所必需的。另一方面，非洲爪蟾卵母细胞是GJs电生理学分析的有用替代系统。尽管它们表达内源性GJ蛋白Connexin 38（Cx38）11，但通过注射特定的反义寡核苷酸12可以很容易地避免潜在的并发症。然而，使用非洲爪蟾卵母细胞分析GJ需要两个并置细胞的差分电压钳位，这在技术上具有挑战性。青蛙爆破粒双电压钳的最早成功是在大约40年前的13，14。从那时起，许多研究使用这种技术来记录配对非洲爪蟾卵母细胞中的Ij。然而，基本上所有以前的研究都是使用自制放大器12，15，16或设计用于单个卵母细胞记录的商业放大器（GeneClamp 500，AxoClamp 2A或AxoClamp 2B，Axon Instruments，Union City，CA）8，17，18，19，20.由于即使是商用放大器也不提供双卵母细胞电压钳位的指令，因此对于新的或不太复杂的电生理学实验室来说，实施这种技术通常具有挑战性。
只有一种商用放大器是为双卵母细胞电压钳位开发的，即华纳仪器的OC-725C（材料表，图1A）。该放大器可以以标准模式（对于单个卵母细胞）或高侧电流测量模式（对于单或双卵母细胞）使用，具体取决于其电压探头中的两个插座是否连接（图1B，C）。然而，直到我们最近的研究7，还没有一份出版物描述该放大器在其高端电流测量模式下的使用。尽管该放大器已被另一个实验室用于双卵母细胞记录，但它用于标准而不是高边模式21，22。在高端电流测量模式下使用放大器缺乏报告可能是由于技术困难造成的。我们无法按照制造商的说明使用高边模式获得稳定的双卵母细胞记录。多年来，我们尝试了三种不同的双卵母细胞记录方法，包括在高压侧电流测量模式下使用两个OC-725C放大器，在标准模式下使用两个OC-725C放大器，以及两个来自其他制造商的放大器。经过广泛的反复试验，我们最终仅通过第一种方法成功获得了稳定的录音。本出版物描述并演示了我们用于表达非洲爪蟾卵母细胞中GJ蛋白的程序，使用高边电流测量模式记录Ij，并使用流行的商业软件分析电生理数据。关于双电压钳位技术的其他信息可以在其他出版物19，23中找到。
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Protocol
手术按照康涅狄格大学医学院机构动物护理委员会批准的协议进行。
1.青蛙手术和去毛化卵母细胞的制备
- 通过浸泡在凉爽（加冰）的三卡因溶液（〜300mg / L）中麻醉成年雌性非洲爪蛙（非洲爪蟾）（材料表）。
- 等待（约15分钟），直到青蛙对挤压其蹼脚表现出很少或没有反应。将青蛙放在手术台上，腹部朝上。
- 在左下腹部或右下腹部区域进行纵向切口（8-10毫米长）后，用一对镊子轻轻拉出一小块卵巢组织，并用一把小剪刀切开卵巢组织。
- 立即将游离卵巢组织浸入60mm培养皿内的Ca2 + 无ND96溶液（NaCl 99mM，KCl 2 mM，MgCl2 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）中。
- 使用5-0丝缝线（材料表）通过简单的中断缝合线关闭切口后，将青蛙放回浅水箱中进行恢复。
注意：切口分两步闭合：首先是腹膜层和肌肉层，然后是皮肤层。每只青蛙接受5次手术，两次连续手术之间至少有4周的间隔。 - 将分离的卵巢组织转移到含有10 mL无Ca2 + ND96溶液的50mL离心管中，其中含有20mg胶原酶（材料表）和20mg透明质酸酶（材料表）。
- 在室温（RT）下在轨道振荡器上摇动管，直到所有卵母细胞都变得孤立（孤立）。
- 此后，使用玻璃巴斯德移液管将30-50个卵母细胞转移到培养皿中，并在立体显微镜（≥25x最高放大倍率）下频繁检查卵母细胞以确定它们是否去毛化。
注：巴斯德移液器应使用金刚石划线器（材料表）“切割”到更宽的吸头开口，并火焰烧平切削刃。 - 一旦70%-80%的卵母细胞被去毛化，通过轻轻倾斜管来倾析酶溶液。通过用ND96溶液（NaCl 96 mM，KCl 2 mM，CaCl 2 1.8 mM，MgCl2 1 mM，HEPES 5 mM，pH 7.5）填充管子并倾析溶液来洗涤卵母细胞5次。
- 最后一次洗涤后，将卵母细胞转移到含有ND96溶液的60mm培养皿中。使用干净的玻璃巴斯德移液器，将大而健康的卵母细胞移植到含有ND96溶液的60mm培养皿中，该培养皿中补充了丙酮酸钠（2 mM）和青霉素 - 链霉素（100 U / mL）。
注意：“大而健康的卵母细胞”是V期和VI期的卵母细胞，没有显示出酶过度消化的迹象。 - 将含有采摘卵母细胞的培养皿置于环境室（15-18°C）内。
2. GJ蛋白表达
- 按照制造商的协议，使用RNA转录试剂盒（材料表） 在体外 合成特定连接蛋白或肠连接蛋白的互补RNA（cRNA）。
- 使用RNA转录试剂盒用户手册中描述的氯化锂方法沉淀cRNA。
- 用70%乙醇洗涤沉淀，将其溶解在20μL无核酸酶H2O中，并加入1μL核糖核酸酶抑制剂（40U， 材料表）。
- 使用分光光度计测量cRNA的浓度（材料表）。
- 将cRNA与Cx38反义寡核苷酸混合，使最终浓度为200-1，000ng / μL cRNA和100 ng / μL寡核苷酸。
注意：寡核苷酸序列为5′-GCTTTAGTAATTCCCCCCTGCCATGTTTC-3′，对应于 非洲爪蟾 Cx38 mRNA（NCBI加入：NM_001088018）11中-5至+25的核苷酸。寡核苷酸在与cRNA混合之前作为储备溶液（2.0mg / mL）保存。 - 通过在微量离心机（〜16，000× g）中旋转2分钟来消除cRNA中的颗粒，并通过移液将整个上清液快速转移到新管中（避免干扰微量离心管的底部）。
- 将cRNA分成等分试样（2.5μL /小瓶），并将等分试样储存在-80°C冰箱中。
- 通过使用快速固化的环氧粘合剂将一小块（〜1 cm x 1 cm）尼龙网（材料表）粘合到35mm培养皿的底部来制备卵母细胞注射皿。
注意：卵母细胞注射皿是可重复使用的。每次使用后用70%乙醇清洗。 - 用ND96溶液（补充丙酮酸盐和青霉素 - 链霉素）填充卵母细胞注射皿约一半。
- 将25-30个卵母细胞排成一排放在培养皿内。
- 按照自动纳升注射器用户手册中的说明准备用于卵母细胞注射的玻璃微量移液器（材料表）。
注意：使用微电极锥体（材料表）可以帮助产生尖锐的注射微移液器，对卵母细胞造成最小的损害。 - 用轻质矿物油回填注射微量移液管，并将其插入注射器的微量移液器支架中。
- 通过移液将cRNA从其中一个储存的等分试样转移到培养皿盖或底部的内表面。
- 通过按下注射器控制器中的填充按钮，将cRNA液滴吸入微量移液管的尖端。
- 通过按下注射按钮 注射 cRNA（约50 nL /卵母细胞）。
注：注射量可由喷油器控制器中的 DIP 开关设置。 - 将注射的卵母细胞转移到含有ND96溶液（补充丙酮酸盐和青霉素 - 链霉素）的新培养皿中，并将其保存在环境室（15-18°C）内1-3天（取决于GJ蛋白表达速度和水平）。每天通过将卵母细胞转移到新的培养皿中来更换溶液。
3. 卵母细胞配对
- 将一些注射的卵母细胞转移到含有ND96溶液的35-mm培养皿中。
- 使用两个细镊子（材料表）轻轻剥离包裹卵母细胞的透明卵黄素膜。
注意：可能需要在首次使用前和不时使用一块细（600粒度）砂纸来打磨镊子尖端。 - 将每孔2个卵母细胞置于含有ND96溶液（补充丙酮酸盐和青霉素 - 链霉素）的卵母细胞配对室（图1D）中。
注意：卵母细胞配对室是通过使用快速固化环氧粘合剂将Microwell Minitray（材料表）的一小块粘合到35mm培养皿（材料表）的底部来构建的。使用热线切割机（材料表）将迷你托盘切割成小块。使用迷你托盘进行卵母细胞配对最初是由其他人描述的24。尽管GJ蛋白可能根据其胞质结构域25中氨基酸残基的电荷特性在卵母细胞细胞膜中不均匀地分布，但随机配对（不区分卵母细胞的动物和植物极）通常就足够了。 - 将含有配对卵母细胞的培养皿保存在室温下，用于电生理记录。
注意：配对持续时间从几个小时到一天不等。一种方便的做法是在下午晚些时候配对卵母细胞，并在第二天记录它们。
4. 采集系统准备
- 通过调整内部拨码开关，将两个OC-725C卵母细胞钳位放大器（材料表）配置为高端电流测量模式（图1B）。
- 首先将后面板上的接地电路插座互连，然后连接到法拉第笼和用于照亮录音室的光纤灯，从而将放大器接地。
- 将放大器连接到模数信号转换器（材料表），并按照放大器制造商的说明在pClamp软件的 Clampex 模块（材料表）中对其进行配置。
- 使用放大器随附的模型单元测试采集系统。
- 将 VDIFF 探头和电流 （I） 电缆连接到模型单元，将 VDIFF 探头中的红色和黑色插座与随附的跳线连接，将跳线的任一支连接到模型单元中的任一引脚，然后将模型单元中的地线连接到放大器 的 GROUND 电路 插座的电缆（图 1E）。
- 通过分别转动Vm OFFSET和Ve OFFSET旋钮，将放大器的电压电极（Vm）和浴电极（Im）仪表归零，将箝位从OFF切换为“快”或“慢”，并将GAIN刻度盘顺时针旋转至允许适当电压钳位的水平（图1A）。D.C. GAIN 开关可能位于 OUT 或 IN 位置。
- 运行包含几个电压步骤的简单采集协议，以确认Vm仪表中显示的电压根据采集协议而变化，并且电压和电流迹线在 Clampex 中正确显示。
注：使用这种方法，每次只能测试一个放大器。
5. 在配对的卵母细胞之间记录Ij
- 创建用于在 pClamp 软件中记录 Ij 的采集协议。
注意：创建两种采集协议。在其中一个中，放大器#1用于产生一系列膜电压（Vm）步长（例如，在10 mV间隔下为-150至+90 mV），而放大器#2用于保持恒定 的Vm （例如，-30 mV）。在另一种协议中，放大器#2用于产生 Vm 步长，而放大器#1用于保持恒定的 Vm。正V m和负 Vm 步长应交替应用（例如，-150，+90，-140，+80 ......），这可以使用采集协议中的 用户列表 功能在Clampex中编程。 - 设置录制阶段
- 将一个含有配对卵母细胞的培养皿放入记录平台中的培养皿容器中（图2A）
- 选择一对卵母细胞，并在必要时旋转培养皿，使两个卵母细胞处于左右方向，并通过其磁性底座将载物台锁定到位。
- 将磁性支架固定在隔离台上的适当位置，将电流和电压探头固定在隔离台上。
注：确保一个放大器的电流和电压探头位于左侧，而另一个放大器的电流和电压探头位于右侧，并且电压探头位于每侧电流探头的前面（图2B，C）。
- 设置参比电极
- 将参比电极（材料表）放置在培养皿边缘附近，朝向用户侧（图2B，C）。
- 仅将参比电极连接到两个 VDIFF 探头之一的黑色插座（电路接地）。
- 设置 VDIFF 电极
- 拉一对玻璃微移液器，用金刚石划线器（材料表）掰开一点尖端，并通过火抛光使尖端边缘光滑。
注意：吸头电阻应小于150 kΩ（在移液器中使用ND96测量）。通常使用尖端电阻为20-150 kΩ的微移液器。 - 将微量移液管保持在酒精燃烧器火焰上方，使其在距尖端约1厘米的位置弯曲至光滑角度（〜130°）。
注：制造的微量移液器可重复使用。每次使用后用水冲洗。 - 用ND96溶液完全回填玻璃移液器，将其插入预填充（用ND96）微电极支架（材料表， 图2D），并确保系统中不存在气泡。
- 将微电极支架的 2 mm 引脚插入 VDIFF 电极连接线的 2 mm 插座中（图 2D）。
- 将2mm插座夹在磁性夹紧器上（图2D），并将 VDIFF 电极的尖端对准两个卵母细胞之一（图2E）。
注意：调整夹紧器的位置和角度，使电极的尖端非常接近卵母细胞 - 将 VDIFF 电极连接线的 1 mm 引脚插入同一侧 VDIFF 探头的红色插座（ VDIFF 输入）。
- 按照类似的程序准备并连接其他卵母细胞和放大器的 VDIFF 电极。
注意：一对卵母细胞和所有电极的特写视图如图 2E所示。
- 拉一对玻璃微移液器，用金刚石划线器（材料表）掰开一点尖端，并通过火抛光使尖端边缘光滑。
- 设置电流和电压电极
- 从玻璃毛细管制备电压和电流电极，用KCl溶液（KCl 3.0 M，EGTA 10 mM，HEPES 10 mM，带KOH的pH 7.4）回填（约一半），然后将其插入放大器提供的电极支架中。
注意：电极的电阻应为~1 MΩ。合适的电极可以使用一组特定的拉参数从一种类型的薄壁玻璃毛细管（材料表）获得（表1）。这种吸头可以很容易地穿透卵母细胞膜，而无需按下放大器上的Vm或Ve BUZZ按钮。 - 将电极降低到浴液中，通过转动Vm OFFSET和Ve OFFSET拨盘将Vm和Im仪表归零，并通过按Vm电极测试和Ve电极测试来检查电极电阻。
- 将电流和电压电极插入卵母细胞，并观察负膜电位（通常为-20至-50mV）。
注：同一放大器的 Vm 和 Im 仪表应显示两个相同或非常相似的值。
- 从玻璃毛细管制备电压和电流电极，用KCl溶液（KCl 3.0 M，EGTA 10 mM，HEPES 10 mM，带KOH的pH 7.4）回填（约一半），然后将其插入放大器提供的电极支架中。
- 数据采集
- 在放大器的“钳位”部分，确认D.C. GAIN处于 IN 位置，顺时针旋转 增益 开关至允许适当电压箝位的水平（通常为整个范围的三分之一到一半），然后将钳位开关从 关断 转到 FAST。
注：打开钳位后，Vm 和 Im 仪表将分别显示保持电压和保持电流。尽管保持电流可能根据卵母细胞条件而有所不同，但它通常在保持 Vm （例如，-30mV）处较小且稳定。 - 运行采集协议。
注意：屏幕上将显示四条迹线。来自一个放大器的电压和电流迹线表示施加到卵母细胞#1的 Vm 步长和产生 Vm 阶跃所需的电流，而来自另一个放大器的电压和电流迹线表示卵母细胞#2的恒定 Vm （-30 mV），以及为维持该恒定 Vm而注入的电流。注射到卵母细胞#2中的电流代表 Ij。
- 在放大器的“钳位”部分，确认D.C. GAIN处于 IN 位置，顺时针旋转 增益 开关至允许适当电压箝位的水平（通常为整个范围的三分之一到一半），然后将钳位开关从 关断 转到 FAST。
6. 数据分析
- 使用钳形进行分析。
- 在 pClamp 的 Clampfit 模块中打开录制的 abf 文件。
- 使用游标 1 和 2 将基线的一段括在 Ij 跟踪之前。
- 单击“ 调整基线” 图标以显示“基线”窗口。为“方法”选择“ 减去游标的平均值 1..2 ”，并确认为“迹线选择”选择了“ 所有可见信号 ”和“ 所有可见 迹线”。
- 单击“ 确定”（OK） 后，“基线”窗口将关闭，所有电流和电压走线的基线将收敛于零电平。请注意，电压阶跃更改为等于原始电压减去保持电压（例如，-30 mV）的新水平。
- 要使用稳态 I j 绘制 Ij 和 V j 关系，请用光标 1 和 2 将表示稳态 Ij 的 Ij 迹线的所需段括起来，将光标 3 放置在电压步长的时间窗口内的任何位置。
- 转到 “分析/快速图形/I-V ”以打开 I-V 窗口。
- 在 “X 轴 （电压）”下， 从“信号”中选择光标 3，在下拉菜单中指定电压步进信号（例如，电压 1），然后选中“ 反相”框。
注意：选中反转框以将 Vm 转换为等效于 Vj 的值，V j 定义为卵母细胞 #2-V m 的卵母细胞 #1 的 Vm。 - 在 Y 轴（当前）下，从信号旁边的下拉菜单中选择 Ij 信号的源（例如，当前 0），从下拉菜单中将区域定义为光标 1..2，然后选择平均值。
注意：要绘制峰值 Ij 和 Vj 关系，游标 1 和 2 应将步骤 6.1.5 中包含峰值 Ij 的 Ij 迹线段包围起来，并在步骤 6.1.8 中选择峰值（而不是平均值）。 - 在“ 目标 ”选项下，选择“ 替换 ”或“ 追加”。
- 在 I-V 窗口中单击“确定”后，屏幕上将显示 Ij - Vj 关系，并且可以通过单击“窗口/结果”找到相应的 Ij 和 Vj 值。
- 在OriginPro中绘制并拟合G j-V j关系（材料表）
- 将包含 Vj 和 Ij 值的两列从 Clampfit 的“结果”窗口（步骤 6.1.10）复制到“源”中的新工作簿。确保 Vj 和 Ij 值分别位于 X 和 Y 列下。
- 通过单击“列/添加新列”在工作簿 中添加四个新列。
- 将第一个新列命名为 Gj，通过在“设置列值”窗口中输入公式“列 Ij/列 Vj * 1，000”来填充它，然后创建 Gj-V j 关系的散点图。
注意：乘以 1，000（可选）是为了避免在后续步骤中处理非常小的数字的不便。 - 在负 V j 范围内与玻尔兹曼函数独立拟合 G j 数据点。通过在玻尔兹曼方程的拟合中输入 Gjmax、Gjmin、A 和 V0 值来计算 V j = 0 mV 时的 G j，这可以在电子表格中完成。由此获得的 Gj 将在下一步中用作 Gjmax。
注意：拟合玻尔兹曼函数的方程是：Gj = （Gjmax-G jmin）/{1 + exp[A（Vj-V 0）]} + Gjmin，其中 V0 是电导率为半极大的 V j，Gjmax 是最大电导，Gjmin 是 Vj 不敏感残余电导23.要执行拟合，请首先将玻尔兹曼方程作为新拟合函数添加到 OriginPro 中，然后选择此函数进行拟合。在执行拟合函数之前，输入 Gjmax、Gjmin、V0 和 A 的近似种子值。确保此拟合的 Gjmax 参数不是固定的。 - 将第二列和第三列命名为 nGj-L 和 nGj-R（“n”表示“归一化”），并通过将 Gj 列除以分别来自左侧和右侧 G j - V j 曲线的 G jmax 值来填充它们（步骤 6.2.4）。
- 将第四个新列命名为 nGj-LR，并分别从 nGj-L 和 nGj-R 列的负 Vj 范围复制值来填充它。
- 在 Vj 上为 nGj-LR 创建散点图，并将负 Vj 范围内的数据点独立拟合到玻尔兹曼函数。确保拟合的 Gjmax 参数固定为 1.0。
- 保留拟合结果的记录（例如，拟合图和 Gjmin、 V0 和 A 值）。
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Representative Results
UNC-7和UNC-9是秀丽隐杆线虫的内联体。虽然UNC-9只有一种亚型，但UNC-7具有多种亚型，其主要区别在于其氨基末端7，8的长度和氨基酸序列。当在非洲爪蟾卵母细胞7，8中表达时，这些连接蛋白可能形成同型和异型（UNC-7和UNC-9）GJ。代表Ij迹线以及由此产生的UNC-7b和UNC-9同型GJ的归一化G j-V j关系如图3所示。在这些配对卵母细胞的实验中，卵母细胞1的Vm被钳位到与保持电压（-30 mV）不同的水平，而卵母细胞2的V m保持在-30 mV以保持恒定以监测Ij。结果表明，这两种类型的GJ在Vj依赖Ij失活率、Vj依赖性（由Gj-V j曲线的斜率表示）和残余Gj的量方面存在差异。UNC-7和UNC-9 GJ的许多其他例子，包括整流GJ，可以在我们最近的出版物7中找到。
图1：卵母细胞配对室和放大器设置。（A）卵母细胞钳位放大器OC-725C的前面板。（B） 放大器内部的 DIP 开关，用于高端电流测量。除 2、5 和 7 外，所有拨动开关均处于 OFF 位置，以便在高端电流测量模式下使用放大器。（C） 带有红色插座（用于VDIFF输入）和黑色插座（用于电路接地）的V DIFF探头，该探头未连接或已连接。当两个插座连接时，探头可用于标准电压钳位模式。（D）卵母细胞配对室。（E） 带有连接装置的模型单元，用于在高压侧电流测量模式下测试放大器的采集系统。请点击此处查看此图的大图。
图2：卵母细胞和电极设置。 （A）记录阶段。圆孔的直径为36毫米（B）图显示了各种电极的位置。（C）各种电极的实际布局。（D） 两个 VDIFF 电极，其支架和连接电缆通过两个不同的磁钳夹在记录台上，包括一个改进的琼脂桥磁支架（材料表）（顶部）和一个管夹（材料表）（底部）。前者由于其较大的磁性基底而在保持电极位置方面更稳定，但需要修改。玻璃微移液器从其操作位置旋转90°，以显示弯曲角度。（E）一对卵母细胞和电极的特写视图。 请点击此处查看此图的大图。
图3：代表性记录迹线。（A）图显示了卵母细胞实验。负膜电压和正膜电压（Vm）步骤从-30 mV的保持Vm施加到卵母细胞1，而卵母细胞2保持在-30 mV的恒定Vm。经结电压（Vj）定义为卵母细胞的Vm 2 -Vm的Oocyte 1。（B）. 样品Ij迹线和所得UNC-9同型间隙结的归一化结导（Gj）-Vj关系。（C）样本Ij迹线和所得的UNC-7b同型间隙结的归一化G j-V j关系。Gj-V j 关系由玻尔兹曼函数（红线）拟合。请点击此处查看此图的大图。
| 步骤编号 | 热 | 拉 | 速度 | 时间 |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| 请参阅制造商网站上的用户手册，了解拉动参数的定义（https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html）。 | ||||
表1：电极拉拔参数。 这些参数基于薄壁玻璃毛细管（材料表）和P-97微量移液管拉拔器的斜坡温度为258（材料表）。它们需要根据拉拔器上该玻璃的斜坡温度进行调整。例如，如果拉拔器上的斜坡温度高出 20°，则每级增加 20° 并进行必要的调整。通常，可以通过调整最后一步的速度来优化尖端尺寸。请参阅制造商网站上的用户手册，了解拉动参数的含义（https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html）。
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Discussion
系统优化似乎是双卵母细胞电压钳夹实验所必需的。没有它，录音可能非常不稳定，放大器可能不得不注入过多的电流才能到达目标 Vm，从而导致卵母细胞损伤和记录失败。有几个因素对于使用高压侧电流测量方法获得稳定的双卵母细胞记录至关重要。首先，电流和电压电极必须具有适当的电阻（~1 MΩ），并且其支架必须清洁。其次， VDIFF 电极必须具有低电阻（<150 kΩ）并且靠近卵母细胞。第三，同一卵母细胞的所有电极（电压，电流和 VDIFF）必须位于同一侧（左或右），电极的顺序（从后到前）应为电流，电压和 VDIFF。最后，参比电极应位于35mm培养皿的边缘附近，朝向用户。
我们修改了制造商推荐的一些程序，并进行了一些其他改进。其中包括：1）ND96填充的微移液器代替KCl负载的琼脂桥作为 VDIFF 电极。玻璃电极易于构建，可重复使用，对卵母细胞无害;2）以低泄漏的KCl电极作为参比电极。该电极具有低电阻（~2.7 kΩ）和稳定的电位，并且泄漏的电解质很少（~5.7 x 10-8 mL / h）;3）定制设计和构建的记录平台，可以稳定，方便，精确地定位卵母细胞和各种电极。该阶段还提供了对立体显微镜，带有双鹅颈管的光纤灯以及用于安装和定位电流和电压电极的四个磁性支架的充足访问;4）从一种薄壁玻璃毛细管制造电流和电压电极。这些电极具有所需的尖端电阻（0.5-1.4 MΩ），可以非常容易地穿透卵母细胞膜，并且对卵母细胞造成最小的损害。
有时，记录系统无法正常工作，例如异常大或持续增加的保持电流，电流电极周围细胞膜中出现白点，以及响应电压命令时不稳定的 Vm 迹线。可能的原因是1） VDIFF 电极系统具有小气泡或 VDIFF 电极的尖端未正确对准卵母细胞;2）电压或电流电极具有高电阻（例如 >2 MΩ）或其支架因盐沉积物而变脏;3） VDIFF 电极的连接线断裂;4） 在电压箝位期间，D.C增益未设置为IN。
在这里，我们描述了一种记录非洲爪蟾卵母细胞Ij的方法。它允许两个相对的卵母细胞的稳定电压钳位。该方法易于实施，并且在分析GJ的生物物理性质方面似乎没有明显的局限性。但是，我们无法判断它与其他已发布方法的比较情况。我们希望新近对建立双卵母细胞电压钳位技术感兴趣的实验室会发现这种方法值得考虑。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢詹海英，钱戈参与技术开发的初始阶段，Kiranmayi Vedantham帮助处理数字，以及Camillo Peracchia博士对卵母细胞配对室的建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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