Summary
Her præsenterer vi en protokol til at udtrykke gap junction proteiner i Xenopus oocytter og registrere junctional strøm mellem to apposed oocytter ved hjælp af en kommerciel forstærker designet til dual oocyt spændingsklemme optagelser i en høj sidestrøm målemodus.
Abstract
Heterolog ekspression af connexiner og innexiner i Xenopus oocytter er en stærk tilgang til at studere de biofysiske egenskaber ved gap junctions (GJs). Denne tilgang er imidlertid teknisk udfordrende, fordi den kræver en differentiel spændingsklemme af to modsatte oocytter, der deler et fælles grundlag. Selvom et lille antal laboratorier har formået at udføre denne teknik, har stort set alle brugt enten hjemmelavede forstærkere eller kommercielle forstærkere, der var designet til single-oocytoptagelser. Det er ofte udfordrende for andre laboratorier at implementere denne teknik. Selvom en høj sidestrømsmålemodus er blevet indarbejdet i en kommerciel forstærker til dobbelt oocytspændingsklemmeoptagelser, havde der ikke været nogen rapport om dens anvendelse før vores nylige undersøgelse. Vi har gjort højsidestrømsmålemetoden mere praktisk og praktisk ved at introducere flere tekniske modifikationer, herunder konstruktionen af en magnetisk baseret optageplatform, der muliggør præcis placering af oocytter og forskellige elektroder, brug af badeopløsningen som leder i spændingsdifferentielle elektroder, vedtagelse af en kommerciel KCl-elektrode med lav lækage som referenceelektrode, fremstilling af strøm- og spændingselektroder fra tyndvæggede glaskapillærer og placering af alle elektroderne ved hjælp af magnetisk baserede enheder. Metoden beskrevet her muliggør praktiske og robuste optagelser af forbindelsesstrøm (Ij) mellem to modsatte Xenopus oocytter.
Introduction
GLI'er er intercellulære kanaler, der kan tillade den aktuelle strøm og udveksling af små cytosoliske molekyler mellem naboceller. De findes i mange celletyper og udfører forskellige fysiologiske funktioner. GJ'er hos hvirveldyr er dannet af connexiner, mens de i hvirvelløse dyr af innexiner. Hver GJ består af to sidestillede hæmikanaler med enten 6 eller 8 underenheder pr. hemikanal, afhængigt af om de er connexiner eller innexiner 1,2,3. Mennesker har 21 connexingener4, mens de almindeligt anvendte hvirvelløse modeller C. elegans og Drosophila melanogaster har henholdsvis 25 og 8 innexingener,henholdsvis 5,6. Alternativ splejsning af gentranskripter kan yderligere øge mangfoldigheden af GJ-proteiner, i det mindste for innexiner 7,8.
GLI'er kan opdeles i tre kategorier baseret på molekylære sammensætninger: homotypisk, heterotypisk og heteromerisk. En homotypisk GJ har alle sine underenheder identiske. En heterotypisk GJ har to homomere hæmikanaler, men de to hæmikanaler dannes af to forskellige GJ-proteiner. En heteromer GJ indeholder mindst en heteromer hemikanal. De molekylære mangfoldigheder af GLI'er kan give forskellige biofysiske egenskaber, der er vigtige for deres fysiologiske funktioner. GJ biofysiske egenskaber moduleres også af regulatoriske proteiner9. For at forstå, hvordan GLI'er udfører deres fysiologiske funktioner, er det vigtigt at kende deres molekylære sammensætninger, biofysiske egenskaber og regulatoriske proteiners roller i deres funktioner.
Heterologe ekspressionssystemer bruges ofte til at studere biofysiske egenskaber af ionkanaler, herunder GLI'er, og virkningerne af regulatoriske proteiner på dem. Fordi heterologe ekspressionssystemer tillader ekspression af specifikke proteiner, er de generelt mere modtagelige for at dissekere proteinfunktioner end indfødte væv, hvor proteiner med overflødige funktioner kan komplicere analysen, og registrering af Ij kan være uopnåelig. Desværre er de mest almindeligt anvendte cellelinjer undtagen Neuro-2A-cellen uhensigtsmæssige til at studere GJ biofysiske egenskaber på grund af komplikationer af endogene connexiner. Selv Neuro-2A-celler er ikke altid egnede til denne form for analyse. For eksempel kunne vi ikke detektere nogen Ij i Neuro-2A-celler transfekteret med innexinerne UNC-7 og UNC-9 i hverken fravær eller tilstedeværelse af UNC-1 (ikke offentliggjort), hvilket er nødvendigt for funktionen af UNC-9 GJs i C. elegans 9,10. På den anden side er Xenopus oocytter et nyttigt alternativt system til elektrofysiologiske analyser af GJ'er. Selvom de udtrykker et endogent GJ-protein, connexin 38 (Cx38)11, kan potentielle komplikationer let undgås ved at injicere et specifikt antisense-oligonukleotid12. Analyser af GLI'er med Xenopus oocytter kræver imidlertid en differentiel spændingsklemme af to sidestillede celler, hvilket er teknisk udfordrende. De tidligste succeser med dobbeltspændingsklemme af frøblastomerer blev rapporteret for omkring 40 år siden13,14. Siden da har mange undersøgelser brugt denne teknik til at optage Ij i parrede Xenopus oocytter. Imidlertid er stort set alle de tidligere undersøgelser blevet udført med enten hjemmelavede forstærkere 12,15,16 eller kommercielle forstærkere designet til optagelser på enkelte oocytter (GeneClamp 500, AxoClamp 2A eller AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Fordi selv de kommercielle forstærkere ikke giver instruktioner til dobbelt oocytspændingsklemme, er det ofte udfordrende for nye eller mindre sofistikerede elektrofysiologiske laboratorier at implementere denne teknik.
Der er kun udviklet én kommerciel forstærker til dobbelt oocytspændingsklemme, OC-725C fra Warner Instruments (Table of Materials, figur 1A). Denne forstærker kan anvendes i enten en standardtilstand (for enkelte oocytter) eller en måletilstand med høj sidestrøm (for enkelte eller dobbelte oocytter) afhængigt af om to stikkontakter i dens spændingssonde er tilsluttet (figur 1B, C). Indtil vores nylige undersøgelse7 havde der imidlertid ikke været en eneste publikation, der beskrev brugen af denne forstærker i dens måletilstand med høj sidestrøm. Selvom forstærkeren er blevet brugt af et andet laboratorium til dobbelt oocytoptagelser, blev den brugt i standarden snarere end den høje sidetilstand21,22. Denne mangel på rapporter, der bruger forstærkeren i sin måletilstand med høj sidestrøm, kan skyldes tekniske vanskeligheder. Vi var ikke i stand til at opnå stabile dobbelte oocytoptagelser ved hjælp af high side-tilstanden ved at følge instruktionerne fra producenten. I årenes løb har vi prøvet tre forskellige tilgange til dobbelt oocytoptagelser, herunder brug af to OC-725C-forstærkere i højsidestrømsmåletilstand, to OC-725C-forstærkere i standardtilstand og to forstærkere fra en anden producent. Til sidst lykkedes det os kun at opnå stabile optagelser med den første tilgang efter omfattende forsøg og fejl. Denne publikation beskriver og demonstrerer de procedurer, vi bruger til at udtrykke GJ-proteiner i Xenopus oocytter, registrere Ij ved hjælp af højsidestrømsmålemodus og analysere de elektrofysiologiske data ved hjælp af populær kommerciel software. Yderligere oplysninger om dobbeltspændingsklemmeteknikken findes i andre publikationer19,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Operationerne udføres efter en protokol godkendt af det institutionelle dyreplejeudvalg ved University of Connecticut School of Medicine.
1. Frøkirurgi og forberedelse af defollicerede oocytter
- Anæstesi en voksen kvindelig afrikansk klofrø (Xenopus laevis) (Table of Materials) ved at nedsænke i en kølig (med is) tricainopløsning (~ 300 mg / l).
- Vent (~ 15 minutter), indtil frøen viser ringe eller ingen reaktion på at klemme sine webbed fødder. Læg frøen på et operationsbord med maven vendt op.
- Efter et langsgående snit (8-10 mm langt) på enten venstre eller højre nedre abdominale region, træk forsigtigt et lille stykke æggestokvæv ud med et par tang og skær ovarievævet fri med et par små saks.
- Det frie ovarievæv nedsænkes straks i en Ca2+-fri ND96-opløsning (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) inde i en 60 mm petriskål.
- Efter at have lukket snittet ved hjælp af enkle afbrudte suturer ved hjælp af en 5-0 silkesutur (Table of Materials), sæt frøen tilbage i en lavvandstank til genopretning.
BEMÆRK: Snittet er lukket i to trin: først peritoneal- og muskellagene og derefter hudlaget. Hver frø udsættes for 5 operationer med mindst 4 ugers interval mellem to på hinanden følgende operationer. - Det isolerede ovarievæv overføres til et 50 ml centrifugerør indeholdende 10 ml Ca2+-fri ND96-opløsning med 20 mg kollagenase (materialetabel) og 20 mg hyaluronidase (materialetabel).
- Ryst røret på en orbital ryster ved stuetemperatur (RT), indtil alle oocytter er blevet isoleret (ensomme).
- Derefter overføres 30-50 oocytter til en petriskål ved hjælp af en pasteur-pipette af glas og undersøges oocytterne ofte under et stereomikroskop (≥25x højeste forstørrelseseffekt) for at afgøre, om de er defolliceret.
BEMÆRK: Pasteur-pipetten skal "skæres" til en bredere spidsåbning ved hjælp af en diamantskriver (Table of Materials) og flammes for at glatte skærekanten. - Så snart 70% -80% af oocytterne er defolliceret, dekanteres enzymopløsningen ved forsigtigt at vippe røret. Oocytterne vaskes 5 gange ved at fylde røret op med ND96-opløsning (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) og dekantering af opløsningen.
- Efter den endelige vask overføres oocytterne til en 60 mm petriskål indeholdende ND96-opløsning. Pluk og overfør store og sunde oocytter til en 60 mm petriskål indeholdende ND96-opløsning suppleret med natriumpyruvat (2 mM) og penicillin-streptomycin (100 U/ml) ved hjælp af en pasteurpipette af rent glas.
BEMÆRK: "store og sunde oocytter" er dem i trin V og VI, der ikke viser tegn på overfordøjelse af enzymerne. - Anbring petriskålen, der indeholder de plukkede oocytter, inde i et miljøkammer (15-18 °C).
2. GJ-proteinekspression
- Syntetiser komplementært RNA (cRNA) af et specifikt connexin eller innexin in vitro ved anvendelse af et RNA-transkriptionssæt (Table of Materials) efter producentens protokol.
- Udfælde cRNA'et ved hjælp af en lithiumchloridmetode beskrevet i brugervejledningen til RNA-transkriptionssættet.
- Vask pelleten med 70% ethanol, opløs den i 20 μL nukleasefriH20, og tilsæt 1 μL ribonukleasehæmmer (40 U, Materialetabel).
- Mål koncentrationen af cRNA'et ved hjælp af et spektrofotometer (Table of Materials).
- Bland cRNA'et med en Cx38 antisense oligo, så de endelige koncentrationer er 200-1.000 ng / μL cRNA og 100 ng / μL oligo.
BEMÆRK: Oligosekvensen er 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, hvilket svarer til nukleotiderne fra -5 til +25 i Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI-tiltrædelse: NM_001088018)11. Oligo opbevares som en stamopløsning (2,0 mg/ml), inden den blandes med cRNA'et. - Eliminer partikler i cRNA'et ved at spinde i en mikrocentrifuge (~ 16.000 x g) i 2 minutter, og overfør hurtigt hele supernatanten til et nyt rør ved pipettering (undgå at forstyrre bunden af mikrocentrifugerøret).
- Del cRNA'et i alikvoter (2,5 μL/hætteglas), og opbevar alikvoterne i en fryser på -80 °C.
- Forbered en oocytinjektionsskål ved at lime et lille stykke (~ 1 cm x 1 cm) nylonnet (Table of Materials) til bunden af en 35 mm petriskål ved hjælp af et hurtighærdende epoxyklæbemiddel.
BEMÆRK: Oocytinjektionsskålen kan genbruges. Vask det med 70% ethanol efter hver brug. - Fyld oocytinjektionsskålen ca. halvvejs med ND96-opløsning (suppleret med pyruvat og penicillin-streptomycin).
- Placer 25-30 oocytter i rækker inde i petriskålen.
- Forbered glasmikropipetter til oocytinjektioner ved at følge instruktionerne i brugervejledningen til den automatiserede nanoliterinjektor (Table of Materials).
BEMÆRK: Brug af en mikroelektrodeveler (Table of Materials) kan hjælpe med at producere skarpe injektionsmikropipetter, der forårsager minimal skade på oocytter. - Fyld en injektionsmikropipette med let mineralolie, og sæt den i injektorens mikropipetteholder.
- Overfør cRNA'et fra en af de lagrede alikvoter til den indvendige overflade af et petriskålsdæksel eller bund ved pipettering.
- Aspirat cRNA-dråben ind i spidsen af mikropipetten ved at trykke på FILL-knappen i injektorregulatorcontrolleren.
- Injicer cRNA (~ 50 nL / oocyt) ved at trykke på INJECT knappen.
BEMÆRK: Indsprøjtningsvolumenet kan indstilles af dyppekontakterne i injektorregulatorregulatoren. - De injicerede oocytter overføres til en ny petriskål indeholdende ND96-opløsning (suppleret med pyruvat og penicillin-streptomycin), og de opbevares inde i miljøkammeret (15-18 °C) i 1-3 dage (afhængigt af GJ-proteinekspressionshastighed og -niveau). Udskift opløsningen dagligt ved at overføre oocytterne til en ny petriskål.
3. Parring af oocyt
- Et par af de injicerede oocytter overføres til en 35 mm petriskål indeholdende ND96-opløsning.
- Brug to fine pincet (Table of Materials) til forsigtigt at skrælle den gennemsigtige vitellinmembran af, der omslutter oocytten.
BEMÆRK: Det kan være nødvendigt at skærpe pincetspidserne inden første brug og fra tid til anden ved hjælp af et stykke fint (600 Grit) sandpapir. - 2 oocytter pr. brønd anbringes i et oocytparringskammer (figur 1D) indeholdende ND96-opløsning (suppleret med pyruvat og penicillin-streptomycin).
BEMÆRK: Oocytparringskammeret er konstrueret ved at lime et lille stykke af en Microwell Minitray (Table of Materials) til bunden af en 35 mm petriskål (Table of Materials) ved hjælp af et hurtighærdende epoxyklæbemiddel. Minitray skæres i små stykker ved hjælp af en varm trådskærer (Table of Materials). Brug af Minitray til oocytparring blev oprindeligt beskrevet af andre24. Selvom et GJ-protein kan fordele sig uensartet i oocytcellemembranen afhængigt af ladningsegenskaberne for aminosyrerester i dets cytosoliske domæner25, synes tilfældig parring (uden at diskriminere mellem oocyttens animalske og vegetabilske poler) generelt at være tilstrækkelig. - Opbevar petriskålen, der indeholder parrede oocytter ved RT, på isolationsbordet, der skal bruges til elektrofysiologiske optagelser.
BEMÆRK: Parringsvarigheden kan variere fra et par timer til en dag. En bekvem praksis er at parre oocytter sent på eftermiddagen og optage fra dem den følgende dag.
4. Forberedelse af anskaffelsessystem
- Konfigurer to OC-725C oocytklemmeforstærkere (Table of Materials) til måletilstanden for høj sidestrøm ved at justere en intern dip-switch (figur 1B).
- Jord forstærkerne ved først at forbinde Ground Circuit-stikkene på bagpanelerne og derefter tilslutte til Faraday-buret og fiberlyset, der bruges til at belyse optagekammeret.
- Tilslut forstærkerne til en analog-til-digital signalomformer (Table of Materials), og konfigurer dem i Clampex-modulet i pClamp-softwaren (Table of Materials) efter instruktioner fra forstærkerproducenten.
- Test anskaffelsessystemet med den modelcelle, der følger med forstærkeren.
- Tilslut VDIFF-sonden og strømkablerne (I) til modelcellen, tilslut de røde og sorte stik i VDIFF-sonden med den medfølgende jumper, tilslut begge ben på jumperen til en af stifterne i modelcellen, og tilslut jordledningen i modelcellen til kablet fra forstærkerens GROUNDS CIRCUIT-stik (figur 1E).
- Nulr spændingselektroden (Vm) og badeelektroden (Im) meter for forstærkeren ved at dreje henholdsvis Vm OFFSET- og Ve OFFSET-knapperne , skift klemme fra OFF til enten Hurtig eller LANGSOM og drej GAIN-drejeknappen med uret til et niveau, der muliggør korrekt spændingsklemme (figur 1A). D.C. GAIN-kontakten kan være i enten OUT- eller IN-positionen .
- Kør en simpel anskaffelsesprotokol, der indeholder et par spændingstrin for at bekræfte, at den spænding, der vises i Vm-måleren, ændres i henhold til anskaffelsesprotokollen, og at spændings- og strømspor vises korrekt i Clampex.
BEMÆRK: Kun én forstærker må testes hver gang ved hjælp af denne fremgangsmåde.
5. Optagelse Ij mellem parrede oocytter
- Opret anskaffelsesprotokoller til optagelse Ij i pClamp-softwaren.
BEMÆRK: Opret to anskaffelsesprotokoller. I en af dem bruges forstærker nr. 1 til at producere en række membranspændingstrin (Vm) (f.eks. -150 til +90 mV ved 10 mV-intervaller), mens forstærker nr. 2 bruges til at opretholde en konstant Vm (f.eks. -30 mV). I den anden protokol bruges forstærker #2 til at producere V m-trinnene, mens forstærker nr. 1 bruges til at opretholde konstanten Vm. De positive og negative Vm-trin skal anvendes alternativt (f.eks. -150, +90, -140, +80 ......), som kan programmeres i Clampex ved hjælp af funktionen Brugerliste i anskaffelsesprotokollen. - Konfigurer optagelsesfasen
- Slip en petriskål indeholdende parrede oocytter i petriskålsbeholderen i optageplatformen (figur 2A)
- Vælg et par oocytter, og drej petriskålen om nødvendigt, så de to oocytter er i venstre og højre retning, og lås scenen på plads ved hjælp af dens magnetiske base.
- Fastgør de magnetiske stativer, der holder strøm- og spændingssonderne på passende steder på isolationsbordet.
BEMÆRK: Sørg for, at strøm- og spændingssonderne fra den ene forstærker er placeret på venstre side, mens dem fra den anden forstærker er på højre side, og at spændingssonden er foran strømsonden på hver side (figur 2B, C).
- Opsætning af referenceelektroden
- Anbring en referenceelektrode (Table of Materials) nær kanten af petriskålen mod brugersiden (figur 2B, C).
- Tilslut referenceelektroden til den sorte stikkontakt (Circuit Ground) i kun en af de to V DIFF-sonder.
- Opsætning af V DIFF-elektroderne
- Træk et par mikropipetter af glas, bryd lidt af spidsen af med diamantskriveren (Table of Materials), og glat spidskanten ved brandpolering.
BEMÆRK: Spidsmodstanden skal være mindre end 150 kΩ (målt med ND96 i pipetten). Typisk anvendes mikropipetter med spidsmodstand på 20-150 kΩ. - Hold mikropipetten over flammen på en alkoholbrænder for at bøje den i en jævn vinkel (~ 130 °) i en position ~ 1 cm væk fra spidsen.
BEMÆRK: Fremstillede mikropipetter kan genbruges. Skyl dem med vand efter hver brug. - Fyld glaspipetten helt op med ND96-opløsning, indsæt den i en fyldt (med ND96) mikroelektrodeholder (Materialetabel, figur 2D), og sørg for, at der ikke er luftbobler i systemet.
- Indsæt mikroelektrodeholderens 2 mm stift i 2 mm-stikket på en V DIFF-elektrodeforbindelsesledning (figur 2D).
- Fastgør 2 mm-stikket på en magnetisk baseret klemme (figur 2D), og ret spidsen af VDIFF-elektroden mod en af de to oocytter (figur 2E).
BEMÆRK: Juster klemmens position og vinkel, så spidsen af elektroden er meget tæt på oocytten - Indsæt 1 mm stiften på V DIFF-elektrodeforbindelsesledningen i det røde stik (VDIFF-indgang) i VDIFF-sonden på samme side.
- Forbered og tilslut en VDIFF-elektrode til den anden oocyt og forstærker efter lignende procedurer.
BEMÆRK: Et nærbillede af et par oocytter og alle elektroderne er vist i figur 2E.
- Træk et par mikropipetter af glas, bryd lidt af spidsen af med diamantskriveren (Table of Materials), og glat spidskanten ved brandpolering.
- Opsætning af strøm- og spændingselektroder
- Forbered spændings- og strømelektroder fra glaskapillærer, genopfyld dem (ca. halvvejs) med en KCl-opløsning (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 med KOH), og indsæt dem i elektrodeholderne, der følger med forstærkerne.
BEMÆRK: Elektroderne skal have en modstand på ~1 MΩ. Egnede elektroder kan opnås fra en type tyndvæggede glaskapillærer (Table of Materials) ved hjælp af et specifikt sæt trækparametre (tabel 1). Sådanne spidser kan let trænge ind i oocytcellemembranen uden at skulle trykke på hverken Vm- eller Ve BUZZ-knappen på forstærkeren. - Sænk elektroderne ned i badeopløsningen, nulr Vm- og Im-målerne ved at dreje Vm OFFSET- og Ve OFFSET-drejeknapperne , og kontroller elektrodemodstanden ved at trykke på Vm-elektrodetest og Ve-elektrodetest.
- Indsæt strøm- og spændingselektroder i oocytterne, og observer negative membranpotentialer (typisk -20 til -50 mV).
BEMÆRK: Vm- og Im-målerne for den samme forstærker skal vise to identiske eller meget ens værdier.
- Forbered spændings- og strømelektroder fra glaskapillærer, genopfyld dem (ca. halvvejs) med en KCl-opløsning (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 med KOH), og indsæt dem i elektrodeholderne, der følger med forstærkerne.
- Dataindsamling
- I klemmesektionen af forstærkeren skal du bekræfte, at D.C. GAIN er i IN-position , dreje GAIN-knappen med uret til et niveau, der muliggør korrekt spændingsklemme (typisk en tredjedel til halvdelen af hele området), og drej klemmekontakten fra OFF til FAST.
BEMÆRK: Når klemmen tændes, viser Vm- og Im-målerne henholdsvis holdespændingen og holdestrømmen. Selvom holdestrømmen kan variere noget afhængigt af oocytforholdene, er den generelt lille og stabil ved bedriften Vm (f.eks. -30 mV). - Kør en anskaffelsesprotokol.
BEMÆRK: Fire spor vises på skærmen. Spændings- og strømsporene fra en forstærker angiver de Vm-trin, der anvendes på oocyt #1, og den strøm, der er nødvendig for at producere Vm-trinnene, mens de fra den anden forstærker angiver den konstante Vm (-30 mV) af oocyt #2 og den strøm, der injiceres for at opretholde denne konstante Vm. Strømmen injiceret i oocyt nr. 2 repræsenterer Ij.
- I klemmesektionen af forstærkeren skal du bekræfte, at D.C. GAIN er i IN-position , dreje GAIN-knappen med uret til et niveau, der muliggør korrekt spændingsklemme (typisk en tredjedel til halvdelen af hele området), og drej klemmekontakten fra OFF til FAST.
6. Analyse af data
- Analyse med Clampfit.
- Åbn en optaget abf-fil i Clampfit-modulet i pClamp.
- Brug markørerne 1 og 2 til at omslutte et segment af grundlinjen før I j-sporene.
- Klik på ikonet Juster baseline for at få et Baseline-vindue frem. Vælg Træk gennemsnit af markører 1..2 fra for Metode, og bekræft, at Alle synlige signaler og Alle synlige spor er valgt under Markering af sporing.
- Når du klikker på OK, lukkes vinduet Basislinje, basislinjerne for alle strøm- og spændingsspor konvergerer på nulniveauet. Bemærk, at spændingstrinnene ændres til nye niveauer, der er lig med den oprindelige spænding minus holdespændingen (f.eks. -30 mV).
- For at plotte Ij - og Vj-forholdet ved hjælp af steady-state Ij skal du vedlægge et ønsket segment af Ij-sporene , der repræsenterer steady-state Ij med markørerne 1 og 2, placere markøren 3 hvor som helst inden for tidsvinduet for spændingstrinnene.
- Gå til Analyser / Hurtig graf / I-V for at åbne et I-V-vindue .
- Under X-akse (spænding) skal du vælge Markør 3 fra Signal, angive spændingstrinsignalet (f.eks. Spænding 1) i rullemenuen og markere afkrydsningsfeltet Inverter.
BEMÆRK: Afkrydsningsfeltet Inverter er markeret for at konvertere Vm til værdier svarende til Vj, som er defineret som Vm af oocyt #2-V m af oocyt #1. - Under Y-aksen (Aktuel) skal du vælge kilden til Ij-signalet (f.eks. Aktuel 0) i rullemenuen ud for Signal, definere Region som Markører 1..2 i rullemenuen og vælge Middelværdi.
BEMÆRK: For at afbilde top Ij og Vj relationer skal markører 1 og 2 omslutte segmentet af Ij-spor , der indeholder toppen Ij i trin 6.1.5 og vælge Peak (i stedet for Mean) i trin 6.1.8. - Under Indstillingen Destination skal du vælge enten Erstat eller Tilføj.
- Når du klikker på OK i I-V-vinduet , vises en Ij - Vj-relation på skærmen, og de tilsvarende Ij - og Vj-værdier kan findes ved at klikke på Vindue/Resultat.
- Plot og tilpas Gj-V j-relationen i OriginPro (Table of Materials)
- Kopiér de to kolonner, der indeholder værdier for Vj og Ij , fra vinduet Resultater i Clampfit (trin 6.1.10) til en ny projektmappe i Origin. Sørg for, at værdierne Vj og Ij er under henholdsvis X- og Y-kolonnerne.
- Tilføj fire nye kolonner i projektmappen ved at klikke på Kolonne/Tilføj nye kolonner.
- Navngiv den første nye kolonne som Gj, udfyld den ved at indtaste ligningen "kolonne Ij/kolonne V j * 1.000" i vinduet Angiv kolonneværdier, og opret et punktdiagram for G j-V j-relationen.
BEMÆRK: Multiplikationen med 1.000 (valgfrit) er for at undgå ulejligheden ved at håndtere meget små tal i efterfølgende trin. - Tilpas G j-datapunkterne over de negative og positive Vj-områder uafhængigt af Boltzmann-funktionen. Beregn Gj ved Vj = 0 mV ved at indtaste værdierne Gjmax, Gjmin, A og V0 fra tilpasningen i Boltzmann-ligningen, hvilket kan gøres i et regneark. Den således opnåede Gj vil blive brugt som Gjmax i næste trin.
BEMÆRK: Ligningen, der passer til Boltzmann-funktionen, er: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, hvor V0 er Vj, hvor konduktansen er halvmaksimal, Gjmax er den maksimale konduktans, Gjmin er V j-ufølsom resterende konduktans23. For at udføre tilpasningen skal du først tilføje Boltzmann-ligningen som en ny tilpasningsfunktion i OriginPro og derefter vælge denne funktion til montering. Angiv omtrentlige frøværdier for Gjmax, Gjmin, V0 og A, før tilpasningsfunktionen udføres. Sørg for, at Gjmax-parameteren ikke er fastgjort til denne montering. - Navngiv den anden og tredje nye kolonne som nGj-L og nGj-R ("n" for "normaliseret"), og udfyld dem ved at dividere G j-kolonnen med Gjmax-værdierne afledt af henholdsvis venstre og højre Gj - Vj kurver (trin 6.2.4).
- Navngiv den fjerde nye kolonne som nGj-LR, og udfyld den ved at kopiere værdier fra de negative og positive Vj-områder i henholdsvis nGj-L- og nGj-R-kolonnerne.
- Opret et punktdiagram for nGj-LR over Vj, og tilpas datapunkterne over de negative og positive Vj-områder til Boltzmann-funktionen uafhængigt. Sørg for, at Gjmax-parameteren er fastgjort til 1,0 for beslaget.
- Føre optegnelser over tilpasningsresultaterne (f.eks. den monterede graf og værdierne Gjmin, V0 og A ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UNC-7 og UNC-9 er innexiner af C. elegans. Mens UNC-9 kun har en isoform, har UNC-7 flere isoformer, der hovedsageligt adskiller sig i længden og aminosyresekvensen af deres aminoterminaler 7,8. Disse innexiner kan danne homotypiske såvel som heterotypiske (af UNC-7 og UNC-9) GJ'er, når de udtrykkes i Xenopus oocytter 7,8. Repræsentative Ij spor og de resulterende normaliserede Gj-V j relationer mellem UNC-7b og UNC-9 homotypiske GJ'er er vist i figur 3. I disse eksperimenter med parrede oocytter blev Vm af Oocyt 1 fastspændt til forskellige niveauer fra holdespændingen (-30 mV), mens Oocyt 2 blev holdt konstant ved -30 mV for at overvåge Ij. Resultaterne viser, at disse to typer GLI'er adskiller sig i den Vj-afhængige Ij inaktiveringshastighed, Vj afhængighed (angivet ved hældningen af Gj-V j kurven) og mængden af den resterende Gj. Mange andre eksempler på UNC-7 og UNC-9 GJ'er, herunder rettelse af GJ'er, kan findes i vores seneste publikation7.
Figur 1: Oocytparringskammer og forstærkeropsætning. (A) Frontpanelet på oocytklemmeforstærkeren OC-725C. (B) En DIP-kontakt inde i forstærkeren, der er konfigureret til måling af høj sidestrøm. Alle vippekontakter undtagen 2, 5 og 7 er i OFF-position for at bruge forstærkeren i måletilstanden for høj sidestrøm. (C) En VDIFF-sonde med det røde stik (til VDIFF-indgang ) og det sorte stik (til kredsløbsjord), der enten ikke er tilsluttet eller tilsluttet. Sonden kan anvendes til standardspændingsklemmetilstanden, når de to stikkontakter er tilsluttet. D) Et oocytparringskammer. (E) En modelcelle med tilslutninger til test af anskaffelsessystemet med forstærkeren i målemodus for høj sidestrøm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning af oocyt og elektrode. (A) Optagelsestrinnet. Det cirkulære hul har en diameter på 36 mm. (B) Diagram, der viser positionerne af de forskellige elektroder. (C) Faktisk udformning af de forskellige elektroder. (D) To V DIFF-elektroder med deres holdere og tilslutningskabler fastspændt på optagelsestrinnet af to forskellige magnetiske klemmer, herunder en modificeret Agar Bridge Magnetic Holder (Table of Materials) (øverst) og en rørklemme (Materialetabel) (nederst). Førstnævnte er mere stabil i at opretholde elektrodepositionen på grund af sin større magnetiske base, men kræver modifikation. Glasmikropipetterne drejes 90° fra deres driftspositioner for at vise bøjningsvinklerne. (E) Et nærbillede af et par oocytter og elektroderne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentative registreringsspor. (A) Diagram, der viser oocyteksperimentet. Negative og positive membranspændingstrin (Vm) påføres Oocyt 1 fra en holdende Vm på -30 mV, mens Oocyt 2 holdes ved en konstant Vm på -30 mV. Den transjunktionelle spænding (Vj) er defineret som Vm af Oocyt 2 -Vm af Oocyt 1. (B). Prøve Ij spor og den resulterende normaliserede junctional konduktans (Gj) -Vj forhold mellem UNC-9 homotypiske gap junctions. (C) Prøve Ij spor og det resulterende normaliserede Gj-V j forhold mellem UNC-7b homotypiske mellemrumskryds. Gj-V j-relationerne er monteret med en Boltzmann-funktion (røde linjer). Klik her for at se en større version af denne figur.
| Trin Nej. | Varme | Trække | Hastighed | Tidspunkt |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| Se brugervejledningen på producentens websted for at få definitioner af trækparametrene (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html). | ||||
Tabel 1: Elektrode trækker parametre. Disse parametre er baseret på tyndvæggede glaskapillærer (Table of Materials) og en rampetemperatur på 258 ved en P-97 mikropipette puller (Table of Materials). De skal justeres i henhold til rampetemperaturen for dette glas på din aftræker. Hvis rampetemperaturen på aftrækkeren f.eks. er 20° højere, skal du tilføje 20° til hvert trin og foretage de nødvendige justeringer. Generelt kan spidsstørrelsen optimeres ved at justere hastigheden på det sidste trin. Se brugervejledningen på producentens hjemmeside for betydninger af trækparametrene (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systemoptimering ser ud til at være nødvendig for eksperimenter med dobbelt oocytspændingsklemme. Uden det kan optagelser være meget ustabile, og forstærkerne skal muligvis injicere en for stor mængde strøm for at nå mål-Vm'en, hvilket resulterer i oocytskader og optagelsesfejl. Flere faktorer er afgørende for at opnå stabile dobbelte oocytoptagelser med målemetoden med høj sidestrøm. For det første skal strøm- og spændingselektrerne have passende modstand (~ 1 MΩ), og deres holdere skal være rene. For det andet skal V DIFF-elektroderne have lav modstand (<150 kΩ) og være tæt på oocytterne. For det tredje skal alle elektroderne til den samme oocyt (spænding, strøm og VDIFF) placeres på samme side (venstre eller højre), og elektrodernes rækkefølge (fra bagside til front) skal være strøm, spænding og VDIFF. Endelig skal referenceelektroden placeres nær kanten af 35 mm petriskålen mod brugeren.
Vi har ændret et par anbefalede procedurer fra producenten og foretaget nogle andre forbedringer. Blandt dem er: 1) ND96-fyldte mikropipetter i stedet for KCl-belastede agarbroer til at fungere som V DIFF-elektroder. Glaselektrerne er lette at konstruere, genanvendelige og ikke-skadelige for oocytter; 2) en KCl-elektrode med lav lækage som referenceelektrode. Denne elektrode har lav modstand (~ 2,7 kΩ) og stabilt potentiale og lækker små elektrolytter (~ 5,7 x 10-8 ml / t); 3) en specialdesignet og konstrueret optageplatform, der muliggør stabil, bekvem og præcis positionering af oocytter og de forskellige elektroder. Denne fase giver også rigelig adgang til et stereomikroskop, et fiberlys med dobbelt svanehals og de fire magnetiske stativer, der bruges til at montere og placere strøm- og spændingselektroder; og 4) fremstilling af strøm- og spændingselektroder fra en type tyndvæggede glaskapillærer. Disse elektroder har den ønskede spidsmodstand (0,5-1,4 MΩ), kan trænge ind i oocytcellemembranen meget let og forårsage minimal skade på oocytter.
Lejlighedsvis fungerer optagesystemet ikke korrekt, som det fremgår af en usædvanlig stor eller kontinuerligt stigende holdestrøm, udvikling af en hvid plet i cellemembranen omkring den aktuelle elektrode og ustabile Vm-spor som reaktion på spændingskommandoer. De mulige årsager er 1) et V DIFF-elektrodesystem har en lille luftboble, eller spidsen af VDIFF-elektroden er ikke rettet korrekt mod oocytten; 2) en spændings- eller strømelektrode har høj modstand (f.eks. >2 MΩ), eller dens holder er snavset af saltaflejring; 3) forbindelsesledningen til en VDIFF-elektrode er brudt; 4) D.C. forstærkningen er ikke indstillet til IN under spændingsklemmen.
Her har vi beskrevet en metode til optagelse af Ij fra Xenopus oocytter. Det tillader en stabil spændingsklemme af to modsatte oocytter. Denne metode er let at implementere og synes ikke at have nogen åbenlyse begrænsninger for analyse af GLI's biofysiske egenskaber. Vi er dog ikke i stand til at fortælle, hvordan det sammenligner med andre offentliggjorte metoder. Vi håber, at laboratorier, der for nylig er interesserede i at oprette den dobbelte oocytspændingsklemmeteknik, vil finde denne metode værd at overveje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Haiying Zhan, Qian Ge for deres engagement i den indledende fase af den tekniske udvikling, Kiranmayi Vedantham for at hjælpe med tallene og Dr. Camillo Peracchia for råd om oocytparringskammeret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K.
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J.
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).
