Summary
Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.
Abstract
Heterologe expressie van connexinen en innexinen in Xenopus-eicellen is een krachtige benadering voor het bestuderen van de biofysische eigenschappen van gap junctions (GI's). Deze aanpak is echter technisch uitdagend omdat het een differentiële spanningsklem vereist van twee tegenover elkaar staande eicellen die een gemeenschappelijke basis delen. Hoewel een klein aantal laboratoria erin is geslaagd deze techniek uit te voeren, hebben ze in wezen allemaal zelfgemaakte versterkers of commerciële versterkers gebruikt die zijn ontworpen voor opnames met één eicel. Het is vaak een uitdaging voor andere laboratoria om deze techniek te implementeren. Hoewel een hoge zijstroommeetmodus is opgenomen in een commerciële versterker voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen, was er tot onze recente studie geen rapport voor de toepassing ervan. We hebben de benadering van het meten van hoge zijstromen praktischer en handiger gemaakt door verschillende technische wijzigingen te introduceren, waaronder de constructie van een magnetisch gebaseerd opnameplatform dat nauwkeurige plaatsing van eicellen en verschillende elektroden mogelijk maakt, gebruik van de badoplossing als geleider in spannings differentiële elektroden, goedkeuring van een commerciële KCl-elektrode met lage lekkage als referentie-elektrode, fabricage van stroom- en spanningselektroden uit dunwandige glazen haarvaten en positionering van alle elektroden met behulp van magnetisch gebaseerde apparaten. De hier beschreven methode maakt handige en robuuste opnames van junctionele stroom (Ij) tussen twee tegengestelde Xenopus-eicellen mogelijk.
Introduction
GJs zijn intercellulaire kanalen die de stroomstroom en uitwisseling van kleine cytosolische moleculen tussen naburige cellen mogelijk maken. Ze bestaan in vele celtypen en vervullen verschillende fysiologische functies. Js bij gewervelde dieren worden gevormd door connexinen, terwijl die bij ongewervelde dieren worden gevormd door innexinen. Elke GJ bestaat uit twee naast elkaar geplaatste hemichannels met 6 of 8 subeenheden per hemikanaal, afhankelijk van of het connexinen of innexinenzijn 1,2,3. Mensen hebben 21 connexinegenen4, terwijl de veelgebruikte ongewervelde modellen C. elegans en Drosophila melanogaster respectievelijk 25 en 8 innexinegenen hebben, respectievelijk 5,6. Alternatieve splicing van gentranscripten kan de diversiteit van GJ-eiwitten verder verhogen, althans voor innexinen 7,8.
GI's kunnen worden onderverdeeld in drie categorieën op basis van moleculaire samenstellingen: homotypisch, heterotypisch en heteromeer. Een homotypische GJ heeft al zijn subeenheden die identiek zijn. Een heterotypische GJ heeft twee homomere hemichannels, maar de twee hemichannels worden gevormd door twee verschillende GJ-eiwitten. Een heteromere GJ bevat ten minste één heteromeer hemikanaal. De moleculaire diversiteit van GI's kan verschillende biofysische eigenschappen verlenen die belangrijk zijn voor hun fysiologische functies. GJ biofysische eigenschappen worden ook gemoduleerd door regulerende eiwitten9. Om te begrijpen hoe GI's hun fysiologische functies uitvoeren, is het belangrijk om hun moleculaire samenstellingen, biofysische eigenschappen en de rol van regulerende eiwitten in hun functies te kennen.
Heterologe expressiesystemen worden vaak gebruikt om biofysische eigenschappen van ionkanalen, waaronder GI's, en de effecten van regulerende eiwitten daarop te bestuderen. Omdat heterologe expressiesystemen de expressie van specifieke eiwitten mogelijk maken, zijn ze over het algemeen beter vatbaar voor het ontleden van eiwitfuncties dan inheemse weefsels, waar eiwitten met redundante functies de analyse kunnen bemoeilijken en registratie van Ij onbereikbaar kan zijn. Helaas zijn de meest gebruikte cellijnen behalve de Neuro-2A-cel niet geschikt voor het bestuderen van GJ biofysische eigenschappen als gevolg van complicaties door endogene connexinen. Zelfs Neuro-2A-cellen zijn niet altijd geschikt voor dit soort analyses. We konden bijvoorbeeld geen Ij detecteren in Neuro-2A-cellen getransfecteerd met de innexinen UNC-7 en UNC-9 in afwezigheid of aanwezigheid van UNC-1 (ongepubliceerd), wat nodig is voor de functie van UNC-9 GI's in C. elegans 9,10. Aan de andere kant zijn Xenopus-eicellen een nuttig alternatief systeem voor elektrofysiologische analyses van GI's. Hoewel ze een endogene GJ-eiwit tot expressie brengen, connexine 38 (Cx38)11, kunnen mogelijke complicaties gemakkelijk worden vermeden door een specifiek antisense oligonucleotide12 te injecteren. Analyses van JS met Xenopus-eicellen vereisen echter een differentiële spanningsklem van twee naast elkaar geplaatste cellen, wat technisch uitdagend is. De vroegste successen van dubbele spanningsklem van kikkerblastomeren werden ongeveer 40 jaar geleden gemeld 13,14. Sindsdien hebben veel studies deze techniek gebruikt om Ij vast te leggen in gepaarde Xenopus-eicellen. In wezen zijn echter alle voorgaande studies uitgevoerd met zelfgemaakte versterkers 12,15,16 of commerciële versterkers ontworpen voor opnames op enkele eicellen (GeneClamp 500, AxoClamp 2A of AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Omdat zelfs de commerciële versterkers geen instructies geven voor dubbele eicelspanningsklem, is het vaak een uitdaging voor nieuwe of minder geavanceerde elektrofysiologische laboratoria om deze techniek te implementeren.
Er is slechts één commerciële versterker ontwikkeld voor dubbele eicelspanningsklem, de OC-725C van Warner Instruments (Table of Materials, Figuur 1A). Deze versterker kan worden gebruikt in een standaardmodus (voor enkele eicellen) of een hoge zijstroommeetmodus (voor enkele of dubbele eicellen), afhankelijk van of er twee stopcontacten in de spanningsonde zijn aangesloten (figuur 1B, C). Tot onze recente studie7 was er echter geen enkele publicatie geweest die het gebruik van deze versterker in zijn hoge zijstroommeetmodus beschreef. Hoewel de versterker door een ander laboratorium is gebruikt voor dubbele eicelopnamen, werd deze gebruikt in de standaard in plaats van de hoge zijmodus21,22. Dit gebrek aan rapporten met behulp van de versterker in de hoge zijstroommeetmodus kan te wijten zijn aan technische problemen. We waren niet in staat om stabiele dubbele eicelopnamen te verkrijgen met behulp van de hoge zijmodus door de instructies van de fabrikant te volgen. In de loop der jaren hebben we drie verschillende benaderingen voor dubbele eicelopnamen geprobeerd, waaronder het gebruik van twee OC-725C-versterkers in de hoge zijstroommeetmodus, twee OC-725C-versterkers in de standaardmodus en twee versterkers van een andere fabrikant. Uiteindelijk is het ons gelukt om pas met de eerste aanpak na uitgebreid vallen en opstaan stabiele opnames te behalen. Deze publicatie beschrijft en demonstreert de procedures die we gebruiken om GJ-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen, Ij te registreren met behulp van de hoge zijstroommeetmodus en de elektrofysiologische gegevens te analyseren met behulp van populaire commerciële software. Aanvullende informatie over de dubbele spanningsklemtechniek is te vinden in andere publicaties19,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De operaties worden uitgevoerd volgens een protocol dat is goedgekeurd door de institutionele dierverzorgingscommissie van de University of Connecticut School of Medicine.
1. Kikkerchirurgie en bereiding van gedefollicueerde eicellen
- Verdoof een volwassen vrouwelijke Afrikaanse klauwkikker (Xenopus laevis) (Table of Materials) door onder te dompelen in een koele (met ijs) tricaïne-oplossing (~ 300 mg / L).
- Wacht (~ 15 min) totdat de kikker weinig of geen reactie vertoont op het knijpen van zijn zwemvliezen. Leg de kikker op een operatietafel met zijn buik naar boven gericht.
- Na een longitudinale incisie (8-10 mm lang) op de linker- of rechteronderbuik, trekt u voorzichtig een klein stukje eierstokweefsel uit met een tang en snijdt u het eierstokweefsel vrij met een kleine schaar.
- Dompel het vrije eierstokweefsel onmiddellijk onder in een Ca2+-vrije ND96-oplossing (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) in een petrischaaltje van 60 mm.
- Na het sluiten van de incisie door eenvoudige onderbroken hechtingen met behulp van een 5-0 zijden hechtdraad (Tabel van materialen), plaatst u de kikker terug in een ondiep waterreservoir voor herstel.
OPMERKING: De incisie wordt in twee stappen gesloten: eerst de peritoneale en spierlagen en vervolgens de huidlaag. Elke kikker wordt onderworpen aan 5 operaties met een interval van ten minste 4 weken tussen twee opeenvolgende operaties. - Breng het geïsoleerde eierstokweefsel over in een centrifugebuis van 50 ml met 10 ml Ca2+-vrije ND96-oplossing met 20 mg collagenase (materiaaltabel) en 20 mg hyaluronidase (materiaaltabel).
- Schud de buis op een orbitale shaker bij kamertemperatuur (RT) totdat alle eicellen geïsoleerd zijn (solitair).
- Breng daarna 30-50 eicellen over naar een petrischaaltje met behulp van een glazen Pasteur-pipet en onderzoek de eicellen regelmatig onder een stereomicroscoop (≥25x hoogste vergrotingsvermogen) om te bepalen of ze zijn gedefolliculeerd.
OPMERKING: De Pasteur pipet moet worden "gesneden" naar een bredere puntopening met behulp van een diamantscribent (Table of Materials) en worden gevlamd om de snijkant glad te strijken. - Zodra 70% -80% van de eicellen zijn gedefolliculeerd, decanteert u de enzymoplossing door de buis voorzichtig te kantelen. Was de eicellen 5 keer door de buis te vullen met ND96-oplossing (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) en de oplossing te decanteren.
- Breng na de laatste wasbeurt de eicellen over in een petrischaaltje van 60 mm met ND96-oplossing. Pluk en breng grote en gezond uitziende eicellen over naar een petrischaaltje van 60 mm met ND96-oplossing aangevuld met natriumpyruvaat (2 mM) en penicilline-streptomycine (100 U / ml) met behulp van een pasteurpipet van schoon glas.
OPMERKING: "grote en gezond uitziende eicellen" zijn die van stadia V en VI die geen tekenen van oververtering door de enzymen vertonen. - Plaats de petrischaal met de geplukte eicellen in een milieukamer (15-18 °C).
2. GJ-eiwitexpressie
- Synthetiseer complementair RNA (cRNA) van een specifiek connexine of innexine in vitro met behulp van een RNA-transcriptiekit (Table of Materials) volgens het protocol van de fabrikant.
- Precimeer het cRNA met behulp van een lithiumchloridemethode die wordt beschreven in de gebruikershandleiding van de RNA-transcriptiekit.
- Was de pellet met 70% ethanol, los deze op in 20 μL nucleasevrij H2O en voeg 1 μL ribonucleaseremmer (40 E, Tabel van materialen) toe.
- Meet de concentratie van het cRNA met behulp van een spectrofotometer (Table of Materials).
- Meng het cRNA met een Cx38 antisense oligo zodat de uiteindelijke concentraties 200-1.000 ng/μL cRNA en 100 ng/μL oligo zijn.
OPMERKING: De oligosequentie is 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, wat overeenkomt met de nucleotiden van -5 tot +25 in Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Accession: NM_001088018)11. Het oligo wordt bewaard als een stamoplossing (2,0 mg/ml) voordat het wordt gemengd met het cRNA. - Elimineer deeltjes in het cRNA door gedurende 2 minuten in een microcentrifuge (~ 16.000 x g) te draaien en breng snel het hele supernatant over naar een nieuwe buis door pipetteren (vermijd verstoring van de bodem van de microcentrifugebuis).
- Verdeel het cRNA in aliquots (2,5 μL/injectieflacon) en bewaar de aliquots in een vriezer van -80 °C.
- Bereid een eicelinjectieschaal door een klein stukje (~ 1 cm x 1 cm) nylon gaas (Table of Materials) op de bodem van een petrischaaltje van 35 mm te lijmen met behulp van een snelhardende epoxylijm.
OPMERKING: De eicelinjectieschaal is herbruikbaar. Was het na elk gebruik met 70% ethanol. - Vul de eicelinjectieschaal ongeveer halverwege met ND96-oplossing (aangevuld met pyruvaat en penicilline-streptomycine).
- Plaats 25-30 eicellen in rijen in de petrischaal.
- Bereid glazen micropipettes voor eicelinjecties door de instructies in de gebruikershandleiding van de geautomatiseerde nanoliterinjector (Materiaaltabel) te volgen.
OPMERKING: Het gebruik van een micro-elektrode-afschuiner (Tabel van materialen) kan helpen bij het produceren van scherpe injectiemicropipettes die minimale schade aan eicellen veroorzaken. - Vul een injectie micropipette op met lichtgewicht minerale olie en plaats deze in de micropipettehouder van de injector.
- Breng het cRNA van een van de opgeslagen aliquots over naar het binnenoppervlak van een petrischaaldeksel of bodem door te pipetteren.
- Zuig de cRNA-druppel in de punt van de micropipette door op de FILL-knop in de injectorcontroller te drukken.
- Injecteer het cRNA (~50 nL/eicel) door op de INJECT-knop te drukken.
OPMERKING: Het injectievolume kan worden ingesteld door de dipschakelaars in de injectorregelaar. - Breng de geïnjecteerde eicellen over naar een nieuwe petrischaal met ND96-oplossing (aangevuld met pyruvaat en penicilline-streptomycine) en bewaar ze gedurende 1-3 dagen in de milieukamer (15-18 °C) (afhankelijk van de snelheid en het niveau van de GJ-eiwitexpressie). Vervang de oplossing dagelijks door de eicellen over te brengen naar een nieuwe petrischaal.
3. Eicelparen
- Breng enkele van de geïnjecteerde eicellen over in een petrischaaltje van 35 mm met ND96-oplossing.
- Gebruik twee fijne pincetten (Table of Materials) om het transparante vitelline-membraan dat de eicel omwikkelt voorzichtig af te pellen.
OPMERKING: Het kan nodig zijn om de pincetpunten te slijpen voor het eerste gebruik en van tijd tot tijd, met behulp van een stuk fijn (600 Grit) schuurpapier. - Plaats 2 eicellen per putje in een eicelparenkamer (figuur 1D) met ND96-oplossing (aangevuld met pyruvaat en penicilline-streptomycine).
OPMERKING: De eicelparenkamer wordt geconstrueerd door een klein stukje van een Microwell Minitray (Table of Materials) op de bodem van een petrischaaltje van 35 mm (Table of Materials) te lijmen met behulp van een snel uithardende epoxylijm. De Minitray wordt in kleine stukjes gesneden met behulp van een hete draadsnijder (Table of Materials). Het gebruik van de Minitray voor eicelparen werd oorspronkelijk beschreven door anderen24. Hoewel een GJ-eiwit zich niet-uniform in het eicelmembraan kan verdelen, afhankelijk van de ladingseigenschappen van aminozuurresiduen in zijn cytosolische domeinen25, lijkt willekeurige paring (zonder onderscheid te maken tussen de dierlijke en plantaardige polen van de eicel) in het algemeen voldoende te zijn. - Bewaar de petrischaal met gepaarde eicellen bij RT op de isolatietafel voor gebruik voor elektrofysiologische opnamen.
OPMERKING: De koppelingsduur kan variëren van enkele uren tot één dag. Een handige oefening is om eicellen in de late namiddag te paren en de volgende dag van hen op te nemen.
4. Voorbereiding van het acquisitiesysteem
- Configureer twee OC-725C eicelklemversterkers (Materiaaltabel) naar de hoge zijstroommeetmodus door een interne dipschakelaar aan te passen (figuur 1B).
- Aard de versterkers door eerst de Ground Circuit-aansluitingen op de achterpanelen met elkaar te verbinden en vervolgens verbinding te maken met de kooi van Faraday en het vezellicht dat wordt gebruikt voor het verlichten van de opnamekamer.
- Sluit de versterkers aan op een analoog-naar-digitaal signaalomvormer (Materiaaltabel) en configureer ze in de Clampex-module van de pClamp-software (Materiaaltabel) volgens instructies van de fabrikant van de versterker.
- Test het acquisitiesysteem met de modelcel die bij de versterker is geleverd.
- Sluit de VDIFF-sonde en stroomkabels (I) aan op de modelcel, sluit de rode en zwarte aansluitingen in de VDIFF-sonde aan op de meegeleverde jumper, sluit beide poten van de jumper aan op een van beide pinnen in de modelcel en sluit de aardingsdraad in de modelcel aan op de kabel van de GROUNDS CIRCUIT-aansluiting van de versterker (figuur 1E).
- Nul de spanningselektrode (Vm) en badelektrode (Im) meters van de versterker door respectievelijk de Vm OFFSET- en Ve OFFSET-knoppen te draaien, schakel klem van UIT naar snel of LANGZAAM en draai de GAIN-wijzerplaat met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt (figuur 1A). De D.C. GAIN-schakelaar kan zich in de OUT- of de IN-stand bevinden.
- Voer een eenvoudig acquisitieprotocol uit met een paar spanningsstappen om te bevestigen dat de spanning die wordt weergegeven in de Vm-meter verandert volgens het acquisitieprotocol en dat spannings- en stroomsporen correct worden weergegeven in Clampex.
OPMERKING: Met deze aanpak kan slechts één versterker per keer worden getest.
5. Opname Ij tussen gepaarde eicellen
- Maak acquisitieprotocollen voor het opnemen van I j in de pClamp-software.
OPMERKING: Maak twee acquisitieprotocollen. In een van hen wordt versterker # 1 gebruikt om een reeks membraanspanning (Vm) stappen te produceren (bijv. -150 tot +90 mV met intervallen van 10 mV), terwijl versterker # 2 wordt gebruikt om een constante Vm (bijv. -30 mV) te handhaven. In het andere protocol wordt versterker # 2 gebruikt om de Vm-stappen te produceren, terwijl versterker # 1 wordt gebruikt om de constante Vm te behouden. De positieve en negatieve Vm-stappen moeten als alternatief worden toegepast (bijv. -150, +90, -140, +80 ......), die in Clampex kunnen worden geprogrammeerd met behulp van de gebruikerslijstfunctie in het acquisitieprotocol. - Het opnamestadium instellen
- Laat een petrischaal met gepaarde eicellen in de petrischaal in het opnameplatform vallen (figuur 2A)
- Selecteer een paar eicellen en draai de petrischaal indien nodig zodat de twee eicellen zich in de linker- en rechterrichting bevinden en vergrendel het stadium in positie door de magnetische basis.
- Bevestig de magnetische standaards die de stroom- en spanningsondes op de juiste plaatsen op de isolatietafel houden.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de stroom- en spanningsondes van de ene versterker zich aan de linkerkant bevinden, terwijl die van de andere versterker zich aan de rechterkant bevinden en dat de spanningsonde zich aan elke kant voor de stroomsonde bevindt (figuur 2B, C).
- De referentie-elektrode instellen
- Plaats een referentie-elektrode (Tabel met materialen) in de buurt van de rand van de petrischaal naar de gebruikerszijde (figuur 2B, C).
- Sluit de referentie-elektrode aan op de zwarte aansluiting (Circuit Ground) in slechts één van de twee VDIFF-sondes .
- De VDIFF-elektroden instellen
- Trek aan een paar glazen micropipettes, breek een beetje van de punt af met de diamantscribent (Table of Materials) en maak de puntrand glad door vuur te polijsten.
OPMERKING: De tipweerstand moet minder dan 150 kΩ zijn (gemeten met ND96 in de pipet). Meestal worden micropipettes met een tipweerstand van 20-150 kΩ gebruikt. - Houd de micropipette boven de vlam van een alcoholbrander om deze in een gladde hoek (~ 130 °) te buigen op een positie van ~ 1 cm van de punt.
OPMERKING: Gefabriceerde micropipettes zijn herbruikbaar. Spoel ze na elk gebruik af met water. - Vul de glazen pipet volledig op met ND96-oplossing, plaats deze in een voorgevulde (met ND96) micro-elektrodehouder (Materiaaltabel, figuur 2D) en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het systeem aanwezig zijn.
- Steek de 2 mm-pen van de micro-elektrodehouder in de 2 mm-aansluiting van een VDIFF-elektrodeverbindingsdraad (figuur 2D).
- Klem de 2 mm-aansluiting op een magnetisch gebaseerde klemklem (figuur 2D) en richt de punt van de VDIFF-elektrode op een van de twee eicellen (figuur 2E).
OPMERKING: Pas de positie en hoek van de klem aan zodat de punt van de elektrode zeer dicht bij de eicel ligt - Steek de 1 mm-pin van de VDIFF-elektrode-aansluitdraad in de rode aansluiting (VDIFF-ingang ) in de VDIFF-sonde aan dezelfde kant.
- Bereid een VDIFF-elektrode voor de andere eicel en versterker voor en sluit deze aan volgens vergelijkbare procedures.
OPMERKING: Een close-up van een paar eicellen en alle elektroden zijn weergegeven in figuur 2E.
- Trek aan een paar glazen micropipettes, breek een beetje van de punt af met de diamantscribent (Table of Materials) en maak de puntrand glad door vuur te polijsten.
- De stroom- en spanningselektroden instellen
- Bereid spannings- en stroomelektroden voor uit glazen haarvaten, vul ze (ongeveer halverwege) op met een KCl-oplossing (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 met KOH) en plaats ze in de elektrodehouders die bij de versterkers zijn geleverd.
OPMERKING: De elektroden moeten een weerstand van ~1 MΩ hebben. Geschikte elektroden kunnen worden verkregen uit een soort dunwandige glazen haarvaten (Tabel van materialen) met behulp van een specifieke set trekparameters (tabel 1). Dergelijke tips kunnen gemakkelijk het eicelmembraan binnendringen zonder dat u op de Vm- of ve BUZZ-knop op de versterker hoeft te drukken. - Laat de elektroden in de badoplossing zakken, nul de Vm- en Im-meters door aan de Vm OFFSET - en Ve OFFSET-wijzerplaten te draaien en controleer de elektrodeweerstand door op Vm Electrode Test en Ve Electrode Test te drukken.
- Plaats de stroom- en spanningselektroden in de eicellen en observeer negatieve membraanpotentialen (meestal -20 tot -50 mV).
OPMERKING: De Vm- en Im-meters van dezelfde versterker moeten twee identieke of zeer vergelijkbare waarden weergeven.
- Bereid spannings- en stroomelektroden voor uit glazen haarvaten, vul ze (ongeveer halverwege) op met een KCl-oplossing (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 met KOH) en plaats ze in de elektrodehouders die bij de versterkers zijn geleverd.
- Data-acquisitie
- Controleer in het klemgedeelte van de versterker dat D.C. GAIN zich in de IN-positie bevindt, draai de GAIN-knop met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt (meestal een derde tot de helft van het volledige bereik) en draai de klemschakelaar van UIT naar SNEL.
OPMERKING: Bij het inschakelen van de klem geven de Vm- en Im-meters respectievelijk de houdspanning en de vasthoudstroom weer. Hoewel de houdstroom enigszins kan variëren, afhankelijk van de omstandigheden van de eicellen, is deze over het algemeen klein en stabiel op het bedrijf Vm (bijv. -30 mV). - Voer een acquisitieprotocol uit.
OPMERKING: Er worden vier sporen op het scherm weergegeven. De spannings- en stroomsporen van de ene versterker geven de Vm-stappen aan die worden toegepast op eicel #1 en de stroom die nodig is om de Vm-stappen te produceren, terwijl die van de andere versterker de constante Vm (-30 mV) van eicel #2 aangeven, en de stroom die wordt geïnjecteerd om deze constante Vm te behouden. De stroom geïnjecteerd in eicel #2 vertegenwoordigt de Ij.
- Controleer in het klemgedeelte van de versterker dat D.C. GAIN zich in de IN-positie bevindt, draai de GAIN-knop met de klok mee naar een niveau dat de juiste spanningsklem mogelijk maakt (meestal een derde tot de helft van het volledige bereik) en draai de klemschakelaar van UIT naar SNEL.
6. Data-analyse
- Analyse met Clampfit.
- Open een opgenomen abf-bestand in de Clampfit-module van pClamp.
- Gebruik cursor 1 en 2 om een segment van de basislijn in te sluiten vóór de Ij-traceringen .
- Klik op het pictogram Basislijn aanpassen om een basislijnvenster te openen. Selecteer Gemiddelde van cursors aftrekken 1..2 voor Methode en controleer of Alle zichtbare signalen en Alle zichtbare sporen zijn geselecteerd voor Traceerselectie.
- Wanneer u op OK klikt, wordt het venster Basislijn gesloten, de basislijnen van alle stroom- en spanningssporen komen samen op het nulniveau. Merk op dat de spanningsstappen veranderen naar nieuwe niveaus die gelijk zijn aan de oorspronkelijke spanning minus de houdspanning (bijv. -30 mV).
- Om de Ij - en Vj-relatie te plotten met behulp van steady-state Ij, omsluit een gewenst segment van de Ij-sporen die steady-state Ij vertegenwoordigen met cursors 1 en 2, plaats cursor 3 ergens binnen het tijdvenster van de spanningsstappen.
- Ga naar Analyseren / Snelle grafiek / I-V om een I-V-venster te openen.
- Selecteer onder X-as (spanning) cursor 3 van Signaal, geef het spanningstapsignaal (bijvoorbeeld Spanning 1) op in het vervolgkeuzemenu en vink het vakje Omkeren aan.
OPMERKING: Het vakje Omkeren is aangevinkt om de Vm om te zetten in waarden die gelijk zijn aan Vj, die wordt gedefinieerd als Vm eicel #2-Vm eicel #1. - Selecteer onder Y-as (stroom) de bron van het Ij-signaal (bijvoorbeeld Huid 0) in het vervolgkeuzemenu naast Signaal, definieer Regio als Cursors 1..2 in het vervolgkeuzemenu en selecteer Gemiddelde.
OPMERKING: Om piek Ij - en Vj-relaties te plotten, moeten cursors 1 en 2 het segment van Ij-sporen omsluiten dat de piek Ij in stap 6.1.5 bevat en Piek (in plaats van Gemiddelde) selecteren in stap 6.1.8. - Selecteer onder Bestemmingsoptie de optie Vervangen of Toevoegen.
- Wanneer u in het I-V-venster op OK klikt, wordt een Ij - Vj-relatie op het scherm weergegeven en kunnen de bijbehorende Ij- en Vj-waarden worden gevonden door op Venster / Resultaat te klikken.
- Plot en pas de Gj-V j-relatie in OriginPro (Tabel met materialen)
- Kopieer de twee kolommen met Vj - en Ij-waarden uit het resultatenvenster van Clampfit (stap 6.1.10) naar een nieuwe werkmap in Origin. Zorg ervoor dat de waarden Vj en Ij zich onder respectievelijk de kolommen X en Y bevinden.
- Voeg vier nieuwe kolommen toe aan de werkmap door op Kolom/Nieuwe kolommen toevoegen te klikken.
- Geef de eerste nieuwe kolom een naam als Gj, vul deze in door de vergelijking "kolom Ij/kolom Vj * 1.000" in te voeren in het venster Kolomwaarden instellen en maak een spreidingsdiagram van de Gj-V j-relatie.
OPMERKING: De vermenigvuldiging met 1.000 (optioneel) is om het ongemak van het omgaan met zeer kleine aantallen in volgende stappen te voorkomen. - Plaats de Gj-gegevenspunten over het negatieve en positieve Vj-bereik onafhankelijk van de Boltzmann-functie. Bereken Gj bij Vj = 0 mV door de Gjmax-, Gjmin-, A- en V0-waarden van de aanpassing in de Boltzmann-vergelijking in te voeren, wat in een spreadsheet kan worden gedaan. De aldus verkregen Gj zal in de volgende stap als Gjmax worden gebruikt.
OPMERKING: De vergelijking die past bij de Boltzmann-functie is: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, waarbij V0 de Vj is waarbij de geleiding halfmaximaal is, Gjmax de maximale geleiding, Gjmin de Vj-ongevoelig restgeleiding23. Om de fitting uit te voeren, voegt u eerst de Boltzmann-vergelijking als een nieuwe aanpasfunctie toe aan OriginPro en selecteert u vervolgens deze functie voor montage. Voer geschatte zaadwaarden in voor de Gjmax, Gjmin, V0 en A voordat u de aanpassingsfunctie uitvoert. Zorg ervoor dat de G jmax-parameter niet is vastgesteld voor deze fitting. - Noem de tweede en derde nieuwe kolom nGj-L en nGj-R ("n" voor "genormaliseerd") en vul ze op door de kolom Gj te delen door de Gjmax-waarden die zijn afgeleid van respectievelijk de linker- en rechter Gj - Vj-curven (stap 6.2.4).
- Geef de vierde nieuwe kolom een naam als nGj-LR en vul deze in door waarden te kopiëren uit het negatieve en positieve Vj-bereik van respectievelijk de kolommen nGj-L en nGj-R.
- Maak een spreidingsdiagram voor nGj-LR over Vj en pas de gegevenspunten over het negatieve en positieve Vj-bereik onafhankelijk van elkaar aan op de Boltzmann-functie. Zorg ervoor dat de G jmax-parameter is vastgesteld op 1,0 voor de fitting.
- Houd de montageresultaten bij (bijv. de aangebrachte grafiek en de Gjmin-, V0- en A-waarden ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UNC-7 en UNC-9 zijn innexinen van C. elegans. Terwijl UNC-9 slechts één isovorm heeft, heeft UNC-7 meerdere isovormen die voornamelijk verschillen in de lengte en aminozuurvolgorde van hun aminoterminals 7,8. Deze innexinen kunnen zowel homotypische als heterotypische (van UNC-7 en UNC-9) GI's vormen wanneer ze worden uitgedrukt in Xenopus-eicellen 7,8. Representatieve Ij-sporen en de resulterende genormaliseerde Gj-V j-relaties van UNC-7b en UNC-9 homotypische GV's zijn weergegeven in figuur 3. In deze experimenten met gepaarde eicellen werd Vm van eicel 1 op verschillende niveaus geklemd dan de houdspanning (-30 mV), terwijl die van eicel 2 constant werd gehouden op -30 mV om de Ij te controleren. De resultaten laten zien dat deze twee soorten GV's verschillen in de Vj-afhankelijke I j-inactivatiesnelheid, Vj-afhankelijkheid (aangegeven door de helling van de Gj-V j-curve) en de hoeveelheid van de resterende Gj. Vele andere voorbeelden van UNC-7 en UNC-9 GI's, waaronder het corrigeren van GV's, zijn te vinden in onze recente publicatie7.
Figuur 1: Oöcytkoppelingskamer en versterkeropstelling. (A) Voorpaneel van de oöcytplemversterker OC-725C. (B) Een DIP-schakelaar in de versterker die is geconfigureerd voor de hoge zijstroommeting. Alle tuimelschakelaars behalve 2, 5 en 7 staan in de UIT-stand om de versterker in de hoge zijstroommeetmodus te gebruiken. (C) Een VDIFF-sonde met de rode aansluiting (voor VDIFF-ingang ) en zwarte aansluiting (voor Circuit Ground) niet aangesloten of aangesloten. De sonde kan worden gebruikt voor de standaard spanningsklemmodus wanneer de twee stopcontacten zijn aangesloten. (D) Een eicelparenkamer. (E) Een modelcel met aansluitingen voor het testen van het acquisitiesysteem met de versterker in de hoge zijstroommeetmodus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Opstelling van eicellen en elektroden. (A) De opnamefase. Het cirkelvormige gat heeft een diameter van 36 mm. (B) Diagram met de posities van de verschillende elektroden. (C) Werkelijke lay-out van de verschillende elektroden. (D) Twee VDIFF-elektroden met hun houders en verbindingskabels die op de opnametrap worden geklemd door twee verschillende magnetische klemmen, waaronder een gemodificeerde magnetische houder voor de Agar Bridge (materiaaltabel) (boven) en een buisklem (materiaaltabel) (onder). De eerste is stabieler in het handhaven van de elektrodepositie vanwege de grotere magnetische basis, maar moet worden aangepast. De glazen micropipettes worden 90° gedraaid vanuit hun bedieningsposities om de buighoeken te tonen. (E) Een close-up van een paar eicellen en de elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve registratiesporen. (A) Diagram met het eicelexperiment. Negatieve en positieve membraanspanning (Vm) stappen worden toegepast op eicel 1 van een holding Vm van -30 mV, terwijl Oöcyt 2 wordt gehouden op een constante Vm van -30 mV. De transjunctiespanning (Vj) wordt gedefinieerd als Vm eicel 2 -Vm eicel 1. (B). Monster Ij sporen en de resulterende genormaliseerde junctionele geleiding (Gj) -Vj relatie van UNC-9 homotypische gap junctions. (C) Monster Ij sporen en de resulterende genormaliseerde Gj-V j relatie van UNC-7b homotypische gap junctions. De Gj-V j-relaties worden aanmet een Boltzmann-functie (rode lijnen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Stap nee. | Hitte | Trekken | Snelheid | Tijd |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| Raadpleeg de gebruikershandleiding op de website van de fabrikant voor definities van de pulling-parameters (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html). | ||||
Tabel 1: Parameters voor het trekken van elektroden. Deze parameters zijn gebaseerd op dunwandige glazen haarvaten (Table of Materials) en een ramptemperatuur van 258 bij een P-97 micropipette puller (Table of Materials). Ze moeten worden aangepast aan de oprittemperatuur voor dit glas op uw trekker. Als de oprijplaattemperatuur op de trekker bijvoorbeeld 20° hoger is, voegt u 20° toe aan elke stap en brengt u de nodige aanpassingen aan. Over het algemeen kan de tipgrootte worden geoptimaliseerd door de snelheid van de laatste stap aan te passen. Raadpleeg de gebruikershandleiding op de website van de fabrikant voor de betekenis van de pulling-parameters (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systeemoptimalisatie lijkt noodzakelijk te zijn voor experimenten met dubbele oöcytspanningsklem. Zonder dit kunnen opnames zeer onstabiel zijn en moeten de versterkers mogelijk een overmatige hoeveelheid stroom injecteren om de doel-Vm te bereiken, wat resulteert in oöcytschade en opnamefouten. Verschillende factoren zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van stabiele dubbele eicelopnamen met de hoge zijstroommeetmethode. Ten eerste moeten de stroom- en spanningselektroden de juiste weerstand hebben (~ 1 MΩ) en moeten hun houders schoon zijn. Ten tweede moeten de VDIFF-elektroden een lage weerstand hebben (<150 kΩ) en dicht bij de eicellen zijn. Ten derde moeten alle elektroden voor dezelfde eicel (spanning, stroom en VDIFF) aan dezelfde kant (links of rechts) worden geplaatst en moet de volgorde van de elektroden (van achter naar voren) stroom, spanning en VDIFF zijn. Ten slotte moet de referentie-elektrode zich in de buurt van de rand van de 35 mm petrischaal naar de gebruiker bevinden.
We hebben een paar aanbevolen procedures van de fabrikant aangepast en enkele andere verbeteringen aangebracht. Onder hen zijn: 1) ND96-gevulde micropipettes in plaats van KCl-geladen agarbruggen om te dienen als VDIFF-elektroden . De glaselektroden zijn gemakkelijk te construeren, herbruikbaar en niet schadelijk voor eicellen; 2) een KCl-elektrode met lage lekkage als referentie-elektrode. Deze elektrode heeft een lage weerstand (~ 2,7 kΩ) en stabiele potentiaal en lekt weinig elektrolyten (~ 5,7 x 10-8 ml / h); 3) een op maat ontworpen en geconstrueerd opnameplatform dat een stabiele, handige en nauwkeurige positionering van eicellen en de verschillende elektroden mogelijk maakt. Deze fase biedt ook voldoende toegang tot een stereomicroscoop, een vezellamp met dubbele zwanenhalzen en de vier magnetische standaards die worden gebruikt om de stroom- en spanningselektroden te monteren en te positioneren; en 4) fabricage van stroom- en spanningselektroden uit een soort dunwandige glazen haarvaten. Deze elektroden hebben de gewenste tipweerstand (0,5-1,4 MΩ), kunnen zeer gemakkelijk het eicelmembraan binnendringen en minimale schade aan eicellen veroorzaken.
Af en toe werkt het opnamesysteem niet goed, zoals blijkt uit een ongewoon grote of continu toenemende houdstroom, de ontwikkeling van een witte vlek in het celmembraan rond de stroomelektrode en onstabiele Vm-sporen als reactie op spanningsopdrachten. De mogelijke oorzaken zijn 1) een VDIFF-elektrodesysteem heeft een kleine luchtbel of de punt van de VDIFF-elektrode is niet goed gericht op de eicel; 2) een spannings- of stroomelektrode heeft een hoge weerstand (bijv. >2 MΩ) of de houder is vuil van zoutafzetting; 3) de aansluitdraad voor een VDIFF-elektrode is verbroken; 4) de D.C. versterking is niet ingesteld op IN tijdens de spanningsklem.
Hier hebben we een methode beschreven voor het registreren van Ij van Xenopus-eicellen . Het maakt een stabiele spanningsklem van twee tegenover elkaar staande eicellen mogelijk. Deze methode is eenvoudig te implementeren en lijkt geen duidelijke beperkingen te hebben voor het analyseren van de biofysische eigenschappen van GI's. We zijn echter niet in staat om te zeggen hoe het zich verhoudt tot andere gepubliceerde methoden. We hopen dat laboratoria die nieuw geïnteresseerd zijn in het opzetten van de dubbele oöcytspanningsklemtechniek deze methode het overwegen waard zullen vinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We bedanken Haiying Zhan, Qian Ge voor hun betrokkenheid bij de eerste fase van de technische ontwikkeling, Kiranmayi Vedantham voor het helpen met de cijfers en Dr. Camillo Peracchia voor advies over de eicelparingskamer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K.
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J.
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).
