Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Enregistrement du courant de jonction de l’espace des ovocytes Xenopus

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

Nous présentons ici un protocole pour exprimer les protéines de jonction lacunaire dans les ovocytes Xenopus et enregistrer le courant jonctionnel entre deux ovocytes apposés à l’aide d’un amplificateur commercial conçu pour les enregistrements à double tension ovocytaire dans un mode de mesure à courant latéral élevé.

Abstract

L’expression hétérologue des connexines et des innexines dans les ovocytes xenopus est une approche puissante pour étudier les propriétés biophysiques des jonctions lacunaires (GJ). Cependant, cette approche est techniquement difficile car elle nécessite une pince de tension différentielle de deux ovocytes opposés partageant un terrain d’entente. Bien qu’un petit nombre de laboratoires aient réussi à exécuter cette technique, pratiquement tous ont utilisé des amplificateurs faits maison ou des amplificateurs commerciaux conçus pour les enregistrements à un seul ovocyte. Il est souvent difficile pour d’autres laboratoires de mettre en œuvre cette technique. Bien qu’un mode de mesure de courant latéral élevé ait été incorporé dans un amplificateur commercial pour les enregistrements à double tension ovocytaire, il n’y avait eu aucun rapport pour son application jusqu’à notre étude récente. Nous avons rendu l’approche de mesure du courant latéral élevé plus pratique et pratique en introduisant plusieurs modifications techniques, notamment la construction d’une plate-forme d’enregistrement magnétique qui permet un placement précis des ovocytes et de diverses électrodes, l’utilisation de la solution de bain comme conducteur dans les électrodes différentielles de tension, l’adoption d’une électrode KCl commerciale à faible fuite comme électrode de référence, fabrication d’électrodes de courant et de tension à partir de capillaires en verre à paroi mince et positionnement de toutes les électrodes à l’aide de dispositifs magnétiques. La méthode décrite ici permet des enregistrements pratiques et robustes du courant jonctionnel (Ij) entre deux ovocytes Xenopus opposés.

Introduction

Les GJ sont des canaux intercellulaires qui peuvent permettre le flux de courant et l’échange de petites molécules cytosoliques entre les cellules voisines. Ils existent dans de nombreux types de cellules et remplissent diverses fonctions physiologiques. Les GJ chez les vertébrés sont formés par les connexines, tandis que ceux chez les invertébrés par les innexines. Chaque GJ se compose de deux hémicanaux juxtaposés avec 6 ou 8 sous-unités par hémicanal, selon qu’il s’agit de connexines ou d’innexines 1,2,3. Les humains ont 21 gènesde connexine 4, tandis que les modèles d’invertébrés couramment utilisés C. elegans et Drosophila melanogaster ont 25 et 8 gènes d’innexine, respectivement 5,6. L’épissage alternatif des transcriptions de gènes peut encore augmenter la diversité des protéines GJ, au moins pour les innexines 7,8.

Les JJ peuvent être divisés en trois catégories en fonction de leur composition moléculaire : homotypique, hétérotypique et hétéromérique. Un GJ homotypique a toutes ses sous-unités identiques. Un GJ hétérotypique a deux hémicanaux homomériques, mais les deux hémicanaux sont formés par deux protéines GJ différentes. Un GJ hétéromérique contient au moins un hémicanal hétéromérique. Les diversités moléculaires des MJ peuvent conférer des propriétés biophysiques distinctes qui sont importantes pour leurs fonctions physiologiques. Les propriétés biophysiques de GJ sont également modulées par les protéines régulatrices9. Pour comprendre comment les MJ remplissent leurs fonctions physiologiques, il est important de connaître leurs compositions moléculaires, leurs propriétés biophysiques et le rôle des protéines régulatrices dans leurs fonctions.

Les systèmes d’expression hétérologues sont souvent utilisés pour étudier les propriétés biophysiques des canaux ioniques, y compris les GJ, et les effets des protéines régulatrices sur eux. Parce que les systèmes d’expression hétérologue permettent l’expression de protéines spécifiques, ils sont généralement plus aptes à disséquer les fonctions protéiques que les tissus natifs où les protéines avec des fonctions redondantes peuvent compliquer l’analyse, et l’enregistrement de Ij peut être inaccessible. Malheureusement, les lignées cellulaires les plus couramment utilisées, à l’exception de la cellule Neuro-2A, sont inappropriées pour étudier les propriétés biophysiques du GJ en raison de complications par les connexines endogènes. Même les cellules Neuro-2A ne sont pas toujours appropriées pour ce type d’analyse. Par exemple, nous n’avons pu détecter aucun Ij dans les cellules Neuro-2A transfectées avec les innexines UNC-7 et UNC-9 en l’absence ou la présence d’UNC-1 (non publié), ce qui est nécessaire pour la fonction des UNC-9 GJs dans C. elegans 9,10. D’autre part, les ovocytes Xenopus sont un système alternatif utile pour les analyses électrophysiologiques des JJ. Bien qu’ils expriment une protéine GJ endogène, la connexine 38 (Cx38)11, les complications potentielles peuvent être facilement évitées en injectant un oligonucléotide antisens spécifique12. Cependant, les analyses de GJ avec des ovocytes Xenopus nécessitent une pince de tension différentielle de deux cellules juxtaposées, ce qui est techniquement difficile. Les premiers succès de la pince à double tension des blastomères de grenouille ont été rapportés il y a environ 40 ans13,14. Depuis lors, de nombreuses études ont utilisé cette technique pour enregistrer Ij dans des ovocytes Xenopus appariés. Cependant, pratiquement toutes les études précédentes ont été réalisées avec des amplificateurs faits maison 12,15,16 ou des amplificateurs commerciaux conçus pour des enregistrements sur des ovocytes simples (GeneClamp 500, AxoClamp 2A ou AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Parce que même les amplificateurs commerciaux ne fournissent pas d’instructions pour la pince de tension à double ovocyte, il est souvent difficile pour les laboratoires électrophysiologiques nouveaux ou moins sophistiqués de mettre en œuvre cette technique.

Un seul amplificateur commercial a été développé pour la pince à double tension ovocytaire, l’OC-725C de Warner Instruments (Table des matériaux, Figure 1A). Cet amplificateur peut être utilisé en mode standard (pour les ovocytes simples) ou en mode de mesure à courant latéral élevé (pour les ovocytes simples ou doubles) selon que deux prises de sa sonde de tension sont connectées (Figure 1B, C). Cependant, jusqu’à notre récente étude7, il n’y avait pas eu une seule publication décrivant l’utilisation de cet amplificateur dans son mode de mesure à courant latéral élevé. Bien que l’amplificateur ait été utilisé par un autre laboratoire pour les enregistrements à double ovocyte, il a été utilisé dans le mode standard plutôt que dans le mode côté haut21,22. Ce manque de rapports utilisant l’amplificateur dans son mode de mesure de courant latéral élevé peut être dû à des difficultés techniques. Nous n’avons pas été en mesure d’obtenir des enregistrements stables à double ovocyte en utilisant le mode côté haut en suivant les instructions du fabricant. Au fil des ans, nous avons essayé trois approches différentes pour les enregistrements à double ovocyte, notamment en utilisant deux amplificateurs OC-725C en mode de mesure à courant latéral élevé, deux amplificateurs OC-725C en mode standard et deux amplificateurs d’un autre fabricant. Nous n’avons finalement réussi à obtenir des enregistrements stables qu’avec la première approche après de nombreux essais et erreurs. Cette publication décrit et démontre les procédures que nous utilisons pour exprimer les protéines GJ dans les ovocytes Xenopus, enregistrer Ij en utilisant le mode de mesure du courant latéral élevé et analyser les données électrophysiologiques à l’aide de logiciels commerciaux populaires. Des informations supplémentaires sur la technique de la double tension-pince peuvent être trouvées dans d’autres publications19,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les chirurgies sont effectuées selon un protocole approuvé par le comité institutionnel de soins aux animaux de la faculté de médecine de l’Université du Connecticut.

1. Chirurgie de la grenouille et préparation d’ovocytes défollicués

  1. Anesthésier une grenouille africaine à griffes femelle adulte (Xenopus laevis) (Table des matériaux) en l’immergeant dans une solution de tricaïne fraîche (avec de la glace) (~300 mg/L).
  2. Attendez (~ 15 min) jusqu’à ce que la grenouille montre peu ou pas de réponse à serrer ses pieds palmés. Posez la grenouille sur une table d’opération avec son ventre tourné vers le haut.
  3. Après une incision longitudinale (8-10 mm de long) sur la région abdominale inférieure gauche ou droite, retirez doucement un petit morceau de tissu ovarien avec une paire de pinces et coupez le tissu ovarien avec une paire de petits ciseaux.
  4. Immergez immédiatement le tissu ovarien libre dans une solution de ND96 sans Ca2+ (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) à l’intérieur d’une boîte de Petri de 60 mm.
  5. Après avoir fermé l’incision par de simples sutures interrompues à l’aide d’une suture en soie 5-0 (table des matériaux), remettez la grenouille dans un réservoir d’eau peu profonde pour la récupération.
    REMARQUE: L’incision est fermée en deux étapes: d’abord les couches péritonéale et musculaire, puis la couche cutanée. Chaque grenouille est soumise à 5 chirurgies avec un intervalle d’au moins 4 semaines entre deux chirurgies consécutives.
  6. Transférer le tissu ovarien isolé dans un tube centrifuge de 50 mL contenant 10 mL de solution de ND96 sans Ca2+ avec 20 mg de collagénase (Table des matériaux) et 20 mg de hyaluronidase (Table des matériaux).
  7. Agiter le tube sur un agitateur orbital à température ambiante (RT) jusqu’à ce que tous les ovocytes soient isolés (solitaires).
  8. Par la suite, transférez 30 à 50 ovocytes dans une boîte de Pétri à l’aide d’une pipette Pasteur en verre et examinez fréquemment les ovocytes sous un stéréomicroscope (≥25x puissance de grossissement la plus élevée) pour déterminer s’ils sont défolliculés.
    REMARQUE: La pipette Pasteur doit être « coupée » à une ouverture de pointe plus large à l’aide d’un scriber en diamant (Table des matériaux) et flammée pour lisser le bord de coupe.
  9. Dès que 70% à 80% des ovocytes sont défolliculés, décantez la solution enzymatique en inclinant doucement le tube. Lavez les ovocytes 5 fois en remplissant le tube avec une solution de ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) et décantation de la solution.
  10. Après le lavage final, transférer les ovocytes dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de ND96. Cueillir et transférer des ovocytes gros et d’apparence saine dans une boîte de Petri de 60 mm contenant une solution de ND96 complétée par du pyruvate de sodium (2 mM) et de la pénicilline-streptomycine (100 U / mL) à l’aide d’une pipette Pasteur en verre propre.
    REMARQUE: Les « ovocytes gros et d’apparence saine » sont ceux des stades V et VI ne montrant aucun signe de digestion excessive par les enzymes.
  11. Placer la boîte de Petri contenant les ovocytes prélevés à l’intérieur d’une chambre environnementale (15-18 °C).

2. Expression de la protéine GJ

  1. Synthétiser l’ARN complémentaire (ARNc) d’une connexine ou d’une innexine spécifique in vitro à l’aide d’un kit de transcription de l’ARN (Table des matériaux) suivant le protocole du fabricant.
  2. Précipiter l’ARNc à l’aide d’une méthode au chlorure de lithium décrite dans le manuel d’utilisation du kit de transcription de l’ARN.
  3. Lavez la pastille avec de l’éthanol à 70 %, dissolvez-la dans 20 μL deH2Osans nucléase et ajoutez 1 μL d’inhibiteur de ribonucléase (40 U, Table des matières).
  4. Mesurer la concentration de l’ARNc à l’aide d’un spectrophotomètre (Table des matériaux).
  5. Mélanger l’ARNc avec un oligo antisens Cx38 de sorte que les concentrations finales soient de 200 à 1 000 ng/μL d’ARNc et de 100 ng/μL d’oligo.
    NOTE: La séquence oligo est 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, qui correspond aux nucléotides de -5 à +25 dans l’ARNm Xenopus laevis Cx38 (accession NCBI: NM_001088018)11. L’oligo est conservé sous forme de solution mère (2,0 mg/mL) avant d’être mélangé avec l’ARNc.
  6. Éliminer les particules dans l’ARNc en tournant dans une microcentrifugeuse (~16 000 x g) pendant 2 min, et transférer rapidement le surnageant entier dans un nouveau tube par pipetage (éviter de perturber le fond du tube de microcentrifugation).
  7. Diviser l’ARNc en aliquotes (2,5 μL/flacon) et conserver les aliquotes dans un congélateur à -80 °C.
  8. Préparez un plat d’injection d’ovocytes en collant un petit morceau (~1 cm x 1 cm) de maille de nylon (table des matériaux) au fond d’une boîte de Petri de 35 mm à l’aide d’un adhésif époxy à durcissement rapide.
    REMARQUE: Le plat d’injection d’ovocytes est réutilisable. Lavez-le avec de l’éthanol à 70% après chaque utilisation.
  9. Remplissez le plat d’injection d’ovocytes à peu près à mi-chemin avec une solution de ND96 (complétée par du pyruvate et de la pénicilline-streptomycine).
  10. Placez 25 à 30 ovocytes en rangées à l’intérieur de la boîte de Pétri.
  11. Préparez les micropipettes en verre pour les injections d’ovocytes en suivant les instructions du manuel d’utilisation de l’injecteur automatisé de nanolitres (Table des matériaux).
    REMARQUE: L’utilisation d’un biseau à microélectrode (Table des matériaux) peut aider à produire des micropipettes d’injection tranchantes qui causent un minimum de dommages aux ovocytes.
  12. Remplissez une micropipette d’injection avec de l’huile minérale légère et insérez-la dans le support de micropipette de l’injecteur.
  13. Transférez l’ARNc de l’une des aliquotes stockées à la surface intérieure d’un couvercle ou d’un fond de boîte de Pétri par pipetage.
  14. Aspirer la gouttelette d’ARNc dans l’extrémité de la micropipette en appuyant sur le bouton FILL du contrôleur de l’injecteur.
  15. Injectez l’ARNc (~50 nL/ovocyte) en appuyant sur le bouton INJECT .
    REMARQUE: Le volume d’injection peut être réglé par les commutateurs dip dans le contrôleur de l’injecteur.
  16. Transférer les ovocytes injectés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant une solution de ND96 (complétée par du pyruvate et de la pénicilline-streptomycine) et les conserver à l’intérieur de la chambre environnementale (15-18 °C) pendant 1 à 3 jours (en fonction de la vitesse et du niveau d’expression de la protéine GJ). Remplacez la solution quotidiennement en transférant les ovocytes dans une nouvelle boîte de Pétri.

3. Appariement d’ovocytes

  1. Transférer quelques-uns des ovocytes injectés dans une boîte de Petri de 35 mm contenant une solution de ND96.
  2. Utilisez deux pinces fines (Table des matières) pour décoller doucement la membrane transparente de vitelline qui enveloppe l’ovocyte.
    REMARQUE: Il peut être nécessaire d’affûter les embouts de la pince avant la première utilisation et de temps en temps, en utilisant un morceau de papier de verre fin (600 Grit).
  3. Placer 2 ovocytes par puits dans une chambre d’appariement d’ovocytes (Figure 1D) contenant une solution de ND96 (complétée par du pyruvate et de la pénicilline-streptomycine).
    REMARQUE: La chambre d’appariement des ovocytes est construite en collant un petit morceau d’un Minitray Microwell (Table des matériaux) au fond d’une boîte de Pétri de 35 mm (Table des matériaux) à l’aide d’un adhésif époxy à durcissement rapide. Le Minitray est coupé en petits morceaux à l’aide d’un coupe-fil chaud (Table des matériaux). L’utilisation du Minitray pour l’appariement des ovocytes a été décrite à l’origine par d’autres24. Bien qu’une protéine GJ puisse se distribuer de manière non uniforme dans la membrane cellulaire des ovocytes en fonction des propriétés de charge des résidus d’acides aminés dans ses domaines cytosoliques25, l’appariement aléatoire (sans discrimination entre les pôles animal et végétal de l’ovocyte) semble être suffisant en général.
  4. Conservez la boîte de Petri contenant des ovocytes appariés à TA sur la table d’isolement à utiliser pour les enregistrements électrophysiologiques.
    REMARQUE: La durée de l’appariement peut varier de quelques heures à une journée. Une pratique pratique consiste à apparier les ovocytes en fin d’après-midi et à les enregistrer le lendemain.

4. Préparation du système d’acquisition

  1. Configurez deux amplificateurs à pince à ovocytes OC-725C (Table des matériaux) sur le mode de mesure du courant latéral élevé en ajustant un interrupteur de trempage interne (Figure 1B).
  2. Mettez les amplificateurs à la terre en interconnectant d’abord les prises de circuit de terre sur les panneaux arrière, puis en les connectant à la cage de Faraday et à la lumière à fibre utilisée pour éclairer la chambre d’enregistrement.
  3. Connectez les amplificateurs à un convertisseur de signal analogique-numérique (Table des matériaux) et configurez-les dans le module Clampex du logiciel pClamp (Table des matériaux) en suivant les instructions du fabricant de l’amplificateur.
  4. Testez le système d’acquisition avec la cellule modèle fournie avec l’amplificateur.
    1. Connectez la sonde DIFF V et les câbles de courant (I) à la cellule modèle, connectez les prises rouge et noire de la sonde DIFF V avec le cavalier inclus, connectez l’une ou l’autre jambe du cavalier à l’une ou l’autre broche de la cellule modèle et connectez le fil de terre de la cellule modèle au câble à partir de la prise GROUNDS CIRCUIT de l’amplificateur (Figure 1E).
    2. Mettez à zéro les compteurs d’électrode de tension (Vm) et d’électrode de bain (Im) de l’amplificateur en tournant les boutons Vm OFFSET et Ve OFFSET , respectivement, passez Clamp de OFF à Fast ou SLOW et tournez le cadran GAIN dans le sens des aiguilles d’une montre à un niveau qui permet une serrage de tension appropriée (Figure 1A). L’interrupteur D.C. GAIN peut se trouver en position OUT ou IN .
    3. Exécutez un protocole d’acquisition simple contenant quelques étapes de tension pour confirmer que la tension affichée dans le compteur Vm change en fonction du protocole d’acquisition et que les traces de tension et de courant sont affichées correctement dans Clampex.
      REMARQUE: Un seul amplificateur peut être testé à chaque fois en utilisant cette approche.

5. Enregistrement Ij entre ovocytes appariés

  1. Créer des protocoles d’acquisition pour l’enregistrement I j dans le logiciel pClamp.
    REMARQUE : Créez deux protocoles d’acquisition. Dans l’un d’eux, l’amplificateur n° 1 est utilisé pour produire une série d’étapes de tension membranaire (Vm) (par exemple, -150 à +90 mV à des intervalles de 10 mV), tandis que l’amplificateur n° 2 est utilisé pour maintenir un Vm constant (par exemple, -30 mV). Dans l’autre protocole, l’amplificateur #2 est utilisé pour produire les pas Vm , tandis que l’amplificateur #1 est utilisé pour maintenir la constante Vm. Les étapes Vm positives et négatives doivent être appliquées alternativement (par exemple, -150, +90, -140, +80 ......), qui peuvent être programmées dans Clampex à l’aide de la fonction User List du protocole d’acquisition.
  2. Configurer l’étape d’enregistrement
    1. Déposer une boîte de Petri contenant des ovocytes appariés dans le récipient de la boîte de Petri dans la plate-forme d’enregistrement (Figure 2A)
    2. Sélectionnez une paire d’ovocytes et faites pivoter la boîte de Pétri si nécessaire pour que les deux ovocytes soient dans les directions gauche et droite, et verrouillez la scène en position par sa base magnétique.
    3. Fixez les supports magnétiques qui maintiennent les sondes de courant et de tension aux endroits appropriés sur la table d’isolement.
      REMARQUE : Assurez-vous que les sondes de courant et de tension d’un amplificateur sont situées sur le côté gauche, tandis que celles de l’autre amplificateur sont sur le côté droit, et que la sonde de tension se trouve devant la sonde de courant de chaque côté (Figure 2B, C).
  3. Configurer l’électrode de référence
    1. Placez une électrode de référence (Table des matériaux) près du bord de la boîte de Petri vers le côté utilisateur (Figure 2B, C).
    2. Connectez l’électrode de référence à la douille noire (Circuit Ground) dans une seule des deux sondes DIFF V.
  4. Configurer les électrodes DIFF V
    1. Tirez une paire de micropipettes en verre, détachez un peu de la pointe avec le scriber en diamant (Table des matériaux) et lissez le bord de la pointe par polissage au feu.
      REMARQUE: La résistance de la pointe doit être inférieure à 150 kΩ (mesurée avec ND96 dans la pipette). On utilise généralement des micropipettes avec une résistance de pointe de 20 à 150 kΩ.
    2. Tenez la micropipette au-dessus de la flamme d’un brûleur à alcool pour la plier à un angle lisse (~130°) à une position ~1 cm de la pointe.
      REMARQUE: Les micropipettes fabriquées sont réutilisables. Rincez-les à l’eau après chaque utilisation.
    3. Remplissez complètement la pipette en verre avec une solution ND96, insérez-la dans un porte-microélectrode prérempli (avec ND96) (table des matériaux, figure 2D) et assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le système.
    4. Insérez la broche de 2 mm du support de microélectrode dans la douille de 2 mm d’un fil de connexion d’électrode DIFF V (Figure 2D).
    5. Serrez la douille de 2 mm sur un pince magnétique (Figure 2D) et dirigez l’extrémité de l’électrode DIFF V vers l’un des deux ovocytes (Figure 2E).
      REMARQUE: Ajustez la position et l’angle de la pince de sorte que la pointe de l’électrode soit très proche de l’ovocyte
    6. Insérez la broche de 1 mm du fil de connexion de l’électrode VDIFF dans la prise rouge (entrée VDIFF ) de la sonde VDIFF du même côté.
    7. Préparez et connectez une électrode DIFF V pour l’autre ovocyte et l’amplificateur en suivant des procédures similaires.
      REMARQUE: Une vue rapprochée d’une paire d’ovocytes et de toutes les électrodes est illustrée à la figure 2E.
  5. Configurer les électrodes de courant et de tension
    1. Préparez les électrodes de tension et de courant à partir de capillaires en verre, remblayez-les (environ à mi-chemin) avec une solution KCl (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 avec KOH) et insérez-les dans les porte-électrodes fournis avec les amplificateurs.
      REMARQUE: Les électrodes doivent avoir une résistance d’environ 1 MΩ. Des électrodes appropriées peuvent être obtenues à partir d’un type de capillaires en verre à paroi mince (table des matériaux) en utilisant un ensemble spécifique de paramètres de traction (tableau 1). De telles pointes peuvent facilement pénétrer dans la membrane cellulaire de l’ovocyte sans avoir besoin d’appuyer sur le bouton Vm ou Ve BUZZ de l’amplificateur.
    2. Abaissez les électrodes dans la solution de bain, mettez à zéro les compteurs Vm et Im en tournant les cadrans Vm OFFSET et Ve OFFSET et vérifiez la résistance des électrodes en appuyant sur Vm Electrode Test et Ve Electrode Test.
    3. Insérez les électrodes de courant et de tension dans les ovocytes et observez les potentiels membranaires négatifs (généralement -20 à -50 mV).
      REMARQUE: Les compteurs Vm et Im du même amplificateur doivent afficher deux valeurs identiques ou très similaires.
  6. Acquisition de données
    1. Dans la section Clamp de l’amplificateur, vérifiez que D.C. GAIN est en position IN , tournez le bouton GAIN dans le sens des aiguilles d’une montre à un niveau qui permet une serrage de tension appropriée (généralement un tiers à la moitié de la plage complète) et tournez l’interrupteur Clamp de OFF à FAST.
      REMARQUE: Lors de l’allumage de la pince, les compteurs Vm et Im afficheront respectivement la tension de maintien et le courant de maintien. Bien que le courant de maintien puisse varier quelque peu en fonction des conditions ovocytaires, il est généralement faible et stable à la station Vm (p. ex., -30 mV).
    2. Exécutez un protocole d’acquisition.
      REMARQUE: Quatre traces seront affichées à l’écran. Les traces de tension et de courant d’un amplificateur indiquent les pas Vm appliqués à l’ovocyte #1 et le courant nécessaire pour produire les pas Vm , tandis que ceux de l’autre amplificateur indiquent la constante Vm (-30 mV) de l’ovocyte #2, et le courant injecté pour maintenir cette constante Vm. Le courant injecté dans l’ovocyte #2 représente le Ij.

6. Analyse des données

  1. Analyse avec Clampfit.
    1. Ouvrez un fichier abf enregistré dans le module Clampfit de pClamp.
    2. Utilisez les curseurs 1 et 2 pour entourer un segment de la ligne de base avant les traces Ij .
    3. Cliquez sur l’icône Ajuster la ligne de base pour afficher une fenêtre de configuration. Sélectionnez Soustraire la moyenne des curseurs 1..2 pour Méthode et vérifiez que Tous les signaux visibles et Toutes les traces visibles sont sélectionnés pour Sélection de trace.
    4. En cliquant sur OK, la fenêtre Ligne de base se ferme, les lignes de base de toutes les traces de courant et de tension convergent vers le niveau zéro. Notez que les pas de tension passent à de nouveaux niveaux qui sont égaux à la tension d’origine moins la tension de maintien (par exemple, -30 mV).
    5. Pour tracer la relation Ij et Vj à l’aide de l’état stable Ij, entourez un segment souhaité des traces Ij représentant l’état stable Ij avec les curseurs 1 et 2, placez le curseur 3 n’importe où dans la fenêtre de temps des pas de tension.
    6. Allez dans Analyser / Graphique rapide / I-V pour ouvrir une fenêtre I-V .
    7. Sous Axe X (tension), sélectionnez Curseur 3 dans Signal, spécifiez le signal de pas de tension (par exemple, Tension 1) dans le menu déroulant, puis cochez la case Inverser.
      REMARQUE: La case Inverser est cochée pour convertir le Vm en valeurs équivalentes à Vj, qui est défini comme Vm de l’ovocyte #2-Vm de l’ovocyte #1.
    8. Sous Axe Y (Courant), sélectionnez la source du signal Ij (par exemple, Courant 0) dans le menu déroulant en regard de Signal, définissez Région comme Curseurs 1..2 dans le menu déroulant, puis sélectionnez Moyenne.
      REMARQUE: Pour tracer les relations de pic Ij et Vj, les curseurs 1 et 2 doivent entourer le segment des traces Ij contenant le pic Ij à l’étape 6.1.5 et sélectionner Pic (au lieu de Moyenne) à l’étape 6.1.8.
    9. Sous l’option Destination , sélectionnez Remplacer ou Ajouter.
    10. Lorsque vous cliquez sur OK dans la fenêtre I-V , une relation Ij - Vj s’affiche à l’écran et les valeurs Ij et Vj correspondantes peuvent être trouvées en cliquant sur Fenêtre/Résultat.
  2. Tracer et ajuster la relation Gj-V j dans OriginPro (Table des matériaux)
    1. Copiez les deux colonnes contenant les valeurs Vj et Ij de la fenêtre Résultats de Clampfit (étape 6.1.10) dans un nouveau classeur dans Origin. Assurez-vous que les valeurs Vj et Ij se trouvent respectivement sous les colonnes X et Y.
    2. Ajoutez quatre nouvelles colonnes dans le classeur en cliquant sur Colonne/Ajouter de nouvelles colonnes.
    3. Nommez la première nouvelle colonne Gj, remplissez-la en entrant l’équation « colonne Ij/colonne Vj * 1 000 » dans la fenêtre Définir les valeurs de colonne et créez un nuage de points de la relation Gj-V j.
      REMARQUE: La multiplication par 1 000 (facultatif) permet d’éviter l’inconvénient de traiter de très petits nombres dans les étapes suivantes.
    4. Ajuster les points de données Gj sur les plages Vj négative et positive indépendamment de la fonction de Boltzmann. Calculez Gj à Vj = 0 mV en entrant les valeurs Gjmax, Gjmin, A et V0 à partir de l’ajustement dans l’équation de Boltzmann, ce qui peut être fait dans une feuille de calcul. Le Gj ainsi obtenu sera utilisé comme Gjmax à l’étape suivante.
      REMARQUE: L’équation pour ajuster la fonction de Boltzmann est: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, dans lequel V0 est le Vj où la conductance est demi-maximale, Gjmax est la conductance maximale, Gjmin est le Vj-insensible conductance résiduelle23. Pour effectuer le raccord, ajoutez d’abord l’équation de Boltzmann en tant que nouvelle fonction d’ajustement dans OriginPro, puis sélectionnez cette fonction pour le raccord. Entrez les valeurs initiales approximatives pour Gjmax, Gjmin, V0 et A avant d’exécuter la fonction d’ajustement. Assurez-vous que le paramètre Gjmax n’est pas fixe pour ce raccord.
    5. Nommez les deuxième et troisième nouvelles colonnes nGj-L et nGj-R (« n » pour « normalisé »), et remplissez-les en divisant la colonne Gj par les valeurs Gjmax dérivées des courbes Gj - Vj gauche et droite, respectivement (étape 6.2.4).
    6. Nommez la quatrième nouvelle colonne nGj-LR et remplissez-la en copiant les valeurs des plages Vj négatives et positives des colonnes nGj-L et nGj-R, respectivement.
    7. Créez un nuage de points pour nGj-LR sur Vj et ajustez indépendamment les points de données sur les plages Vj négative et positive à la fonction de Boltzmann. Assurez-vous que le paramètre Gjmax est fixé à 1,0 pour le raccord.
    8. Conservez des enregistrements des résultats d’ajustement (par exemple, le graphique ajusté et les valeurs Gjmin, V0 et A ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UNC-7 et UNC-9 sont des innexines de C. elegans. Alors que UNC-9 n’a qu’une seule isoforme, UNC-7 a plusieurs isoformes qui diffèrent principalement par la longueur et la séquence d’acides aminés de leurs terminaux aminés 7,8. Ces innexines peuvent former des GJ homotypiques et hétérotypiques (d’UNC-7 et UNC-9) lorsqu’elles sont exprimées dans les ovocytes Xenopus 7,8. Les traces représentatives Ij et les relations Gj-V j j normalisées résultantes des GJ homotypiques UNC-7b et UNC-9 sont illustrées à la figure 3. Dans ces expériences avec des ovocytes appariés, Vm de l’ovocyte 1 ont été serrés à des niveaux différents de la tension de maintien (-30 mV), tandis que celui de l’ovocyte 2 a été maintenu constant à -30 mV pour surveiller le Ij. Les résultats montrent que ces deux types de GJ diffèrent par le taux d’inactivation V j-dépendant I j, la dépendance Vj (indiquée par la pente de la courbe G j-V j), et la quantité du Gj résiduel. De nombreux autres exemples de GJ UNC-7 et UNC-9, y compris des GJ rectifiants, peuvent être trouvés dans notre récente publication7.

Figure 1
Figure 1 : Chambre d’appariement d’ovocytes et configuration de l’amplificateur. (A) Panneau avant de l’amplificateur à pince à ovocytes OC-725C. (B) Un commutateur DIP à l’intérieur de l’amplificateur configuré pour la mesure du courant latéral élevé. Tous les interrupteurs à bascule, à l’exception de 2, 5 et 7, sont en position OFF pour utiliser l’amplificateur en mode de mesure de courant latéral élevé. (C) Une sonde DIFF V avec la prise rouge (pour l’entrée VDIFF) et la prise noire (pour la masse du circuit) non connectées ou connectées. La sonde peut être utilisée pour le mode tension-pince standard lorsque les deux prises sont connectées. (D) Une chambre d’appariement d’ovocytes. (E) Une cellule modèle avec des connexions pour tester le système d’acquisition avec l’amplificateur en mode de mesure de courant latéral élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Configuration des ovocytes et des électrodes. (A) L’étape d’enregistrement. Le trou circulaire a un diamètre de 36 mm. (B) Schéma montrant les positions des différentes électrodes. (C) Disposition réelle des différentes électrodes. (D) Deux électrodes DIFF V avec leurs supports et câbles de connexion serrés sur la scène d’enregistrement par deux pinces magnétiques différentes, y compris un support magnétique Agar Bridge modifié (table des matériaux) (en haut) et une pince à tube (table des matériaux) (en bas). Le premier est plus stable dans le maintien de la position de l’électrode en raison de sa base magnétique plus grande, mais nécessite une modification. Les micropipettes en verre sont tournées de 90° à partir de leurs positions de fonctionnement afin de montrer les angles de flexion. (E) Vue rapprochée d’une paire d’ovocytes et des électrodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Traces d’enregistrement représentatives. (A) Diagramme montrant l’expérience ovocyte. Les pas de tension membranaire négative et positive (Vm) sont appliqués à l’ovocyte 1 à partir d’un maintien Vm de -30 mV tandis que l’ovocyte 2 est maintenu à un Vm constant de -30 mV. La tension transjonctionnelle (Vj) est définie comme Vm de l’ovocyte 2-V m de l’ovocyte 1. (B). Échantillon Ij traces et la conductance jonctionnelle normalisée (Gj) -Vj qui en résulte des jonctions lacunaires homotypiques UNC-9. (C) Échantillon Ij traces et la relation Gj-V j j normalisée qui en résulte des jonctions lacunaires homotypiques UNC-7b. Les relations Gj-V j sont ajustées par une fonction de Boltzmann (lignes rouges). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

N° d’étape Chaleur Tirer Vitesse Heure
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
Reportez-vous au manuel d’utilisation sur le site Web du fabricant pour obtenir des définitions des paramètres de traction (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Tableau 1 : Paramètres de traction des électrodes. Ces paramètres sont basés sur des capillaires en verre à paroi mince (Table des matériaux) et une température de rampe de 258 à un extracteur de micropipette P-97 (Table des matériaux). Ils doivent être ajustés en fonction de la température de la rampe pour ce verre sur votre extracteur. Par exemple, si la température de la rampe sur le extracteur est supérieure de 20 °, ajoutez 20 ° à chaque étape et effectuez les ajustements nécessaires. Généralement, la taille de la pointe peut être optimisée en ajustant la vitesse de la dernière étape. Veuillez vous référer au manuel d’utilisation sur le site Web du fabricant pour connaître la signification des paramètres de tirage (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

L’optimisation du système semble nécessaire pour les expériences à double tension ovocytaire-pince. Sans cela, les enregistrements peuvent être très instables et les amplificateurs peuvent avoir à injecter une quantité excessive de courant pour atteindre la Vm cible, ce qui entraîne des dommages aux ovocytes et des échecs d’enregistrement. Plusieurs facteurs sont essentiels pour obtenir des enregistrements stables de deux ovocytes avec la méthode de mesure du courant latéral élevé. Tout d’abord, les électrodes de courant et de tension doivent avoir une résistance appropriée (~ 1 MΩ) et leurs supports doivent être propres. Deuxièmement, les électrodes VDIFF doivent avoir une faible résistance (<150 kΩ) et être proches des ovocytes. Troisièmement, toutes les électrodes pour le même ovocyte (tension, courant et VDIFF) doivent être positionnées du même côté (gauche ou droite), et l’ordre des électrodes (de l’arrière vers l’avant) doit être courant, tension et VDIFF. Enfin, l’électrode de référence doit être située près du bord de la boîte de Petri de 35 mm vers l’utilisateur.

Nous avons modifié quelques procédures recommandées par le fabricant et apporté d’autres améliorations. Parmi eux, il y a: 1) des micropipettes remplies de ND96 au lieu de ponts de gélose chargés en KCl pour servir d’électrodes DIFF V. Les électrodes en verre sont faciles à construire, réutilisables et non nocives pour les ovocytes; 2) une électrode KCl à faible fuite comme électrode de référence. Cette électrode a une faible résistance (~2,7 kΩ) et un potentiel stable, et fuit peu d’électrolytes (~5,7 x 10-8 mL / h); 3) une plate-forme d’enregistrement conçue et construite sur mesure qui permet un positionnement stable, pratique et précis des ovocytes et des différentes électrodes. Cette étape offre également un accès suffisant à un stéréomicroscope, à une lumière à fibre avec deux cols de cygne et aux quatre supports magnétiques utilisés pour monter et positionner les électrodes de courant et de tension; et 4) la fabrication d’électrodes de courant et de tension à partir d’un type de capillaires en verre à paroi mince. Ces électrodes ont la résistance de pointe souhaitée (0,5-1,4 MΩ), peuvent pénétrer très facilement dans la membrane cellulaire des ovocytes et causer un minimum de dommages aux ovocytes.

Parfois, le système d’enregistrement ne fonctionne pas correctement, comme l’indiquent un courant de maintien exceptionnellement important ou en constante augmentation, le développement d’une tache blanche dans la membrane cellulaire autour de l’électrode de courant et des traces vm instables en réponse aux commandes de tension. Les causes possibles sont 1) un système d’électrode VDIFF a une petite bulle d’air ou la pointe de l’électrode VDIFF n’est pas dirigée correctement vers l’ovocyte; 2) une électrode de tension ou de courant a une résistance élevée (par exemple, >2 MΩ) ou son support est sale par dépôt de sel; 3) le fil de connexion d’une électrode DIFF en V est cassé; 4) le gain D.C. n’est pas réglé sur IN pendant la serrage de tension.

Ici, nous avons décrit une méthode d’enregistrement I j à partird’ovocytes Xenopus . Il permet une pince de tension stable de deux ovocytes opposés. Cette méthode est facile à mettre en œuvre et ne semble pas avoir de limites évidentes pour analyser les propriétés biophysiques des MJ. Cependant, nous ne sommes pas en mesure de dire comment il se compare à d’autres méthodes publiées. Nous espérons que les laboratoires qui s’intéressent nouvellement à la mise en place de la technique de la double tension ovocytaire trouveront cette méthode intéressante à considérer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions Haiying Zhan, Qian Ge pour leur implication dans la phase initiale du développement technique, Kiranmayi Vedantham pour leur aide avec les chiffres, et le Dr Camillo Peracchia pour ses conseils sur la chambre d’appariement des ovocytes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
  2. Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
  3. Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
  4. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  5. Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
  6. Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
  7. Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
  8. Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
  9. Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
  10. Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
  11. Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
  12. Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
  13. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
  15. Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
  16. Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
  17. Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
  18. Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
  19. Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
  20. Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
  21. Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
  22. Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
  23. del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
  24. Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
  25. Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).

Tags

Biologie numéro 179 jonction lacunaire l’innexine Caenorhabditis elegans C. elegans les ovocytes Xenopus courant jonctionnel pince de tension
Enregistrement du courant de jonction de l’espace des <em>ovocytes Xenopus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter