Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הקלטת זרם צומת גאפ מביציות קסנופוס

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לביטוי חלבוני צומת פערים בביציות קסנופוס ורישום זרם צומתי בין שתי ביציות באמצעות מגבר מסחרי המיועד לרישומי מהדק מתח ביציות כפול במצב מדידת זרם צד גבוה.

Abstract

ביטוי הטרולוגי של קונקסינים ופונקסינים בביציות קסנופוס הוא גישה רבת עוצמה לחקר התכונות הביופיזיות של צמתי פער (GJs). עם זאת, גישה זו מאתגרת מבחינה טכנית מכיוון שהיא דורשת מהדק מתח דיפרנציאלי של שתי ביציות מנוגדות החולקות מכנה משותף. למרות שמספר קטן של מעבדות הצליחו לבצע טכניקה זו, למעשה כולן השתמשו במגברים תוצרת בית או במגברים מסחריים שנועדו להקלטות של ביצית בודדת. לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אחרות ליישם טכניקה זו. למרות שמצב מדידת זרם צד גבוה שולב במגבר מסחרי להקלטות של מהדקי מתח ביציות כפולים, לא היה שום דיווח על יישומו עד למחקר האחרון שלנו. הפכנו את גישת מדידת הזרם הגבוה למעשית ונוחה יותר על ידי הכנסת מספר שינויים טכניים, כולל בניית פלטפורמת הקלטה מבוססת מגנטית המאפשרת מיקום מדויק של ביציות ואלקטרודות שונות, שימוש בתמיסת האמבטיה כמוליכה באלקטרודות דיפרנציאליות מתח, אימוץ אלקטרודת KCl מסחרית עם דליפה נמוכה כאלקטרודת הייחוס, ייצור אלקטרודות זרם ומתח מנימי זכוכית בעלי דופן דקה, ומיקום של כל האלקטרודות באמצעות מכשירים מבוססי מגנטים. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הקלטות נוחות וחזקות של זרם צומתי (Ij) בין שתי ביציות קסנופוס מנוגדות.

Introduction

GJs הם תעלות בין-תאיות שעשויות לאפשר זרימה והחלפה של זרם של מולקולות ציטוזוליות קטנות בין תאים שכנים. הם קיימים בסוגי תאים רבים ומבצעים תפקודים פיזיולוגיים מגוונים. GJs אצל בעלי חוליות נוצרים על ידי connexins, ואילו אלה של חסרי חוליות על ידי innexins. כל GJ מורכב משני המיכנלים עם 6 או 8 תת-יחידות לכל המיקנל, תלוי אם הם קונקסינים או innexins 1,2,3. לבני אדם יש 21 גנים של קונקסין4, בעוד שלדגמים הנפוצים של חסרי חוליות C. elegans ו- Drosophila melanogaster יש 25 ו-8 גנים של innexin, בהתאמה 5,6. שחבור חלופי של תעתיקי גנים עשוי להגדיל עוד יותר את המגוון של חלבוני GJ, לפחות עבור innexins 7,8.

ניתן לחלק את ה-GJs לשלוש קטגוריות המבוססות על הרכבים מולקולריים: הומוטיפיים, הטרוטיפיים והטרומריים. ל-GJ הומוטיפי כל תת-היחידות שלו זהות. ל-GJ הטרוטיפי יש שני המיכנלים הומומריים, אך שני ההמיכנלים נוצרים על ידי שני חלבוני GJ שונים. GJ הטרומרי מכיל לפחות ההמיכנל ההטרומרי אחד. הגיוון המולקולרי של GJs עשוי להעניק תכונות ביופיזיות מובהקות החשובות לתפקודים הפיזיולוגיים שלהם. תכונות ביופיזיות של GJ מווסתות גם על ידי חלבונים רגולטוריים9. כדי להבין כיצד GJs מבצעים את התפקודים הפיזיולוגיים שלהם, חשוב לדעת את ההרכבים המולקולריים שלהם, את התכונות הביופיזיות שלהם ואת התפקידים של חלבונים רגולטוריים בתפקודים שלהם.

מערכות ביטוי הטרולוגיות משמשות לעתים קרובות לחקר תכונות ביופיזיות של תעלות יונים, כולל GJs, ואת ההשפעות של חלבונים רגולטוריים עליהם. מאחר שמערכות ביטוי הטרולוגיות מאפשרות ביטוי של חלבונים ספציפיים, הן בדרך כלל נוחות יותר לניתוח פונקציות חלבונים מאשר רקמות מקומיות שבהן חלבונים עם פונקציות יתירות יכולות לסבך את הניתוח, ורישום של Ij יכול להיות בלתי ניתן להשגה. למרבה הצער, קווי התאים הנפוצים ביותר למעט התא Neuro-2A אינם מתאימים לחקר תכונות ביופיזיות של GJ עקב סיבוכים של קונקסינים אנדוגניים. אפילו תאי Neuro-2A לא תמיד מתאימים לניתוח מסוג זה. לדוגמה, לא הצלחנו לזהות כל Ij בתאי Neuro-2A שעברו טרנספקציה עם innexins UNC-7 ו- UNC-9 בהיעדר או בנוכחות של UNC-1 (לא פורסם), הנדרש לתפקוד של UNC-9 GJs ב- C. elegans 9,10. מצד שני, ביציות קסנופוס הן מערכת חלופית שימושית לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים של GJs. למרות שהם מבטאים חלבון GJ אנדוגני, connexin 38 (Cx38)11, סיבוכים פוטנציאליים ניתן להימנע בקלות על ידי הזרקת אנטיסנס ספציפי oligonucleotide12. עם זאת, ניתוחים של GJs עם ביציות קסנופוס דורשים מהדק מתח דיפרנציאלי של שני תאים מעוותים, וזה מאתגר מבחינה טכנית. ההצלחות המוקדמות ביותר של מהדק מתח כפול של בלסטומרים של צפרדעים דווחו לפני כ-40 שנהלפני כ-13,14 שנה. מאז, מחקרים רבים השתמשו בטכניקה זו כדי לתעד את Ij בביציות קסנופוס מזווגות. עם זאת, למעשה כל המחקרים הקודמים בוצעו עם מגברים תוצרת בית12,15,16 או מגברים מסחריים המיועדים להקלטות על ביציות בודדות (GeneClamp 500, AxoClamp 2A, או AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . מכיוון שאפילו המגברים המסחריים אינם מספקים הוראות למהדק מתח ביציות כפול, לעתים קרובות זה מאתגר עבור מעבדות אלקטרופיזיולוגיות חדשות או פחות מתוחכמות ליישם טכניקה זו.

רק מגבר מסחרי אחד פותח עבור מהדק מתח ביציות כפול, ה-OC-725C ממכשירי וורנר (טבלת חומרים, איור 1A). ניתן להשתמש במגבר זה במצב סטנדרטי (עבור ביציות בודדות) או במצב מדידת זרם צד גבוה (עבור ביציות בודדות או כפולות), תלוי אם שני שקעים בבדיקת המתח שלו מחוברים (איור 1B, C). עם זאת, עד למחקר האחרון שלנו7, לא היה פרסום אחד המתאר את השימוש במגבר זה במצב מדידת הזרם הצדדי הגבוה שלו. למרות שהמגבר שימש מעבדה אחרת להקלטות של שתי ביציות, הוא שימש בתקן ולא במצב הצד הגבוה21,22. היעדר דיווחים זה באמצעות המגבר במצב מדידת הזרם הצדדי הגבוה שלו עשוי לנבוע מקשיים טכניים. לא הצלחנו להשיג הקלטות יציבות של שתי ביציות באמצעות מצב הצד הגבוה על ידי ביצוע הוראות היצרן. במהלך השנים, ניסינו שלוש גישות שונות לרישומי ביציות כפולות, כולל שימוש בשני מגברי OC-725C במצב מדידת זרם צד גבוה, שני מגברי OC-725C במצב סטנדרטי ושני מגברים מיצרן אחר. בסופו של דבר הצלחנו להשיג הקלטות יציבות רק בגישה הראשונה לאחר ניסוי וטעייה נרחבים. פרסום זה מתאר ומדגים את ההליכים בהם אנו משתמשים כדי לבטא חלבוני GJ בביציות קסנופוס, לרשום Ij באמצעות מצב מדידת הזרם הגבוה, ולנתח את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים באמצעות תוכנה מסחרית פופולרית. מידע נוסף על טכניקת הידוק המתח הכפול ניתן למצוא בפרסומים אחרים19,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניתוחים מבוצעים בעקבות פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת קונטיקט.

1. ניתוח צפרדע והכנת ביציות מפורקות

  1. להרדים נקבה בוגרת של צפרדע אפריקאית בעלת טפרים (Xenopus laevis) (טבלת חומרים) על ידי טבילה בתמיסת טריקאין קרירה (עם קרח) (כ-300 מ"ג/ל').
  2. המתן (כ-15 דקות) עד שהצפרדע תציג תגובה מועטה, אם בכלל, ללחיצה על רגליה ברשת. הניחו את הצפרדע על שולחן ניתוחים כשבטנה פונה כלפי מעלה.
  3. לאחר חתך אורכי (באורך 8-10 מ"מ) באזור הבטן התחתונה השמאלית או הימנית, שלפו בעדינות חתיכה קטנה של רקמת שחלה עם זוג מלקחיים, וחתכו את רקמת השחלה עם זוג מספריים קטנים.
  4. לטבול מיד את רקמת השחלה החופשית בתמיסת Ca2+ ללא תמיסת ND96 (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) בתוך צלחת פטרי 60 מ"מ.
  5. לאחר סגירת החתך על ידי תפרים מופרעים פשוטים באמצעות תפר משי 5-0 (טבלת חומרים), החזירו את הצפרדע למיכל מים רדודים להתאוששות.
    הערה: החתך סגור בשני שלבים: תחילה שכבות הצפק והשרירים, ולאחר מכן שכבת העור. כל צפרדע עוברת 5 ניתוחים במרווח של 4 שבועות לפחות בין שני ניתוחים רצופים.
  6. העבר את רקמת השחלה המבודדת לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של תמיסת Ca2+ ללא ND96 עם 20 מ"ג קולגן (טבלת חומרים) ו-20 מ"ג היאלורונידאז (טבלת חומרים).
  7. יש לנער את הצינור על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר (RT) עד שכל הביציות יהפכו מבודדות (בודדות).
  8. לאחר מכן, העבירו 30-50 ביציות לצלחת פטרי באמצעות פיפטה של פסטר זכוכית ובחנו את הביציות לעתים קרובות תחת סטריאומיקרוסקופ (כוח ההגדלה הגבוה ביותר ≥ פי 25) כדי לקבוע אם הן מנופחות.
    הערה: יש "לחתוך" את פיפטת הפסטר לפתח קצה רחב יותר באמצעות כותב יהלומים (טבלת חומרים) ולהבעיר אותה כדי להחליק את קצה החיתוך.
  9. ברגע ש-70%-80% מהביציות מתפרקות, יש לנטרל את תמיסת האנזים על ידי הטיה עדינה של הצינור. לשטוף את הביציות 5 פעמים על ידי מילוי הצינור בתמיסת ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) וטיהור התמיסה.
  10. לאחר הכביסה הסופית, העבירו את הביציות לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה תמיסת ND96. בחרו והעבירו ביציות גדולות ובריאות למראה לצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה תמיסת ND96 בתוספת נתרן פירובט (2 מ"מ) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 U/mL) באמצעות פיפטת פסטר מזכוכית נקייה.
    הערה: "ביציות גדולות ובריאות למראה" הן אלה של שלבים V ו- VI שאינם מראים שום סימן לעיכול יתר על ידי האנזימים.
  11. הניחו את צלחת הפטרי המכילה את הביציות שנקטפו בתוך תא סביבתי (15-18 מעלות צלזיוס).

2. ביטוי חלבון GJ

  1. סינתזה של RNA משלים (cRNA) של קונקסין מסוים או innexin in vitro באמצעות ערכת שעתוק RNA (טבלת חומרים) בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. זרז את ה- cRNA בשיטת ליתיום כלוריד המתוארת במדריך למשתמש של ערכת שעתוק הרנ"א.
  3. שטפו את הכדור עם 70% אתנול, מיסו אותו ב-20 μL של H2O ללא נוקלאז, והוסיפו 1 μL של מעכב ריבונוקלאז (40 U, טבלת חומרים).
  4. מדוד את ריכוז ה- cRNA באמצעות ספקטרופוטומטר (טבלת חומרים).
  5. מערבבים את ה-cRNA עם אוליגו אנטי-סנס Cx38 כך שהריכוזים הסופיים הם 200-1,000 ng/μL cRNA ו-100 ng/μL oligo.
    הערה: רצף האוליגו הוא 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, אשר מתאים לנוקלאוטידים מ-5 עד +25 ב-Xenopus laevis Cx38 mRNA (הצטרפות ל-NCBI: NM_001088018)11. האוליגו נשמר כתמיסת מלאי (2.0 מ"ג/מ"ל) לפני שהוא מעורבב עם ה-cRNA.
  6. יש לחסל חלקיקים ב-cRNA על-ידי סיבוב במיקרו-צנטריפוגה (כ-16,000 x גרם) למשך 2 דקות, ולהעביר במהירות את כל הסופרנטנט לצינור חדש על-ידי צנרת (הימנעו מהפרעה לתחתית הצינור המיקרו-צנטריפוג).
  7. מחלקים את ה-cRNA ל-aliquots (2.5 μL/בקבוקון), ומאחסנים את ה-aliquots במקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
  8. הכינו צלחת להזרקת ביציות על ידי הדבקת חתיכה קטנה (כ-1 ס"מ על 1 ס"מ) של רשת ניילון (טבלת חומרים) לתחתית צלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ באמצעות דבק אפוקסי מהיר לריפוי.
    הערה: צלחת הזרקת הביציות ניתנת לשימוש חוזר. שטפו אותו עם 70% אתנול לאחר כל שימוש.
  9. מלאו את צלחת הזרקת הביציות בערך באמצע הדרך בתמיסת ND96 (בתוספת פירובט ופניצילין-סטרפטומיצין).
  10. מניחים 25-30 ביציות בשורות בתוך צלחת הפטרי.
  11. הכן מיקרופיפטים מזכוכית להזרקות ביציות על ידי ביצוע הוראות במדריך למשתמש של מזרק הננוליטר האוטומטי (טבלת חומרים).
    הערה: שימוש במשפע מיקרו-אלקטרוניקה (טבלת חומרים) יכול לעזור לייצר מיקרו-פיפטים חדים בהזרקה הגורמים נזק מינימלי לביציות.
  12. יש למלא בחזרה מיקרופיפט בהזרקה בשמן מינרלי קל משקל, ולהחדיר אותו למחזיק המיקרופיפט של המזרק.
  13. העבירו את ה-cRNA מאחד האליקוטים המאוחסנים אל המשטח הפנימי של כיסוי צלחת פטרי או תחתיתו על ידי צנרת.
  14. שאפו את טיפת ה-cRNA לקצה המיקרופיפט על ידי לחיצה על כפתור ה-FILL בבקר המזרק.
  15. הזריקו את ה-cRNA (כ-50 nL/ביצית) על ידי לחיצה על כפתור INJECT .
    הערה: נפח ההזרקה עשוי להיות מוגדר על ידי מתגי הטבילה בבקר המזרק.
  16. העבירו את הביציות המוזרקות לצלחת פטרי חדשה המכילה תמיסת ND96 (בתוספת פירובט ופיניצילין-סטרפטומיצין), ושמרו אותן בתוך התא הסביבתי (15-18 מעלות צלזיוס) למשך 1-3 ימים (תלוי במהירות הביטוי של חלבון GJ וברמתו). החלף את התמיסה מדי יום על ידי העברת הביציות לצלחת פטרי חדשה.

3. זיווג ביציות

  1. העבירו כמה מהביציות המוזרקות לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ המכילה תמיסת ND96.
  2. השתמשו בשני פינצטה עדינה (טבלת חומרים) כדי לקלף בעדינות את קרום הוויטלין השקוף שעוטף את הביצית.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לחדד את קצות הפינצטה לפני השימוש הראשון ומדי פעם, באמצעות פיסת נייר זכוכית משובחת (600 Grit).
  3. הניחו 2 ביציות לבאר בתא זיווג ביציות (איור 1D) המכיל תמיסת ND96 (בתוספת פירובט ופניצילין-סטרפטומיצין).
    הערה: תא זיווג הביציות נבנה על ידי הדבקת חתיכה קטנה של מיניטריית Microwell (טבלת חומרים) לתחתית של צלחת פטרי 35 מ"מ (טבלת חומרים) באמצעות דבק אפוקסי בעל ריפוי מהיר. המיניטריי נחתך לחתיכות קטנות באמצעות חותך חוט חם (טבלת חומרים). השימוש במיניטריי לזיווג ביציות תואר במקור על ידי אחרים24. למרות שחלבון GJ עשוי להתפשט באופן לא אחיד בקרום תא הביציות בהתאם לתכונות המטען של שאריות חומצות אמינו בתחומים הציטוזוליים שלו25, נראה כי זיווג אקראי (מבלי להבחין בין בעלי החיים לבין הקטבים הצמחיים של הביצית) מספיק באופן כללי.
  4. שמור את צלחת פטרי המכילה ביציות מזווגות ב- RT על שולחן הבידוד כדי לשמש להקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
    הערה: משך הזיווג יכול להשתנות בין כמה שעות ליום אחד. תרגול נוח הוא להצמיד ביציות בשעות אחר הצהריים המאוחרות ולתעד מהן ביום המחרת.

4. הכנת מערכת רכישה

  1. הגדר שני מגברי מהדקי ביציות OC-725C (טבלת חומרים) למצב מדידת זרם צדדי גבוה על-ידי התאמת מתג טבילה פנימי (איור 1B).
  2. טחנו את המגברים על ידי חיבור תחילה של שקעי מעגל הקרקע בלוחות האחוריים ולאחר מכן חיבור לכלוב פאראדיי ולנורית הסיבים המשמשת להארת תא ההקלטה.
  3. חבר את המגברים לממיר אותות אנלוגי-לדיגיטלי (טבלת חומרים), והגדר אותם במודול Clampex של תוכנת pClamp (טבלת חומרים) בהתאם להוראות מיצרן המגבר.
  4. בדוק את מערכת הרכישה עם תא המודל המסופק עם המגבר.
    1. חברו את הגשושית VDIFF ואת כבלי הזרם (I) לתא המודל, חברו את השקעים האדומים והשחורים בגשושית VDIFF עם המגשר המצורף, חברו את שתי רגלי המגשר לכל פין בתא המודל, וחברו את חוט ההארקה בתא המודל לכבל משקע מעגל ה-GROUNDS של המגבר (איור 1E).
    2. אפס את מטרים של אלקטרודת המתח (Vm) ואלקטרודת האמבטיה (Im) של המגבר על-ידי הפיכת כפתורי ה-Vm OFFSET וה-Ve OFFSET, בהתאמה, החליפו את ה-Clamp מ-OFF ל-FAST או SLOW והפכו את חוגת ה-GAIN בכיוון השעון לרמה המאפשרת מהדק מתח תקין (איור 1A). מתג D.C. GAIN עשוי להיות במצב OUT או IN.
    3. הפעל פרוטוקול רכישה פשוט המכיל כמה שלבי מתח כדי לאשר שהמתח המוצג במד ה- Vm משתנה בהתאם לפרוטוקול הרכישה וכי עקבות המתח והזרם מוצגים כראוי ב- Clampex.
      הערה: ניתן לבדוק רק מגבר אחד בכל פעם באמצעות גישה זו.

5. הקלטת Ij בין ביציות מזווגות

  1. צור פרוטוקולי רכישה להקלטת Ij בתוכנת pClamp.
    הערה: צור שני פרוטוקולי רכישה. באחד מהם, מגבר מספר 1 משמש לייצור סדרה של צעדי מתח ממברנה (Vm) (למשל, -150 עד +90 mV במרווחים של 10-mV), ואילו מגבר #2 משמש לשמירה על Vm קבוע (למשל, -30 mV). בפרוטוקול השני, מגבר #2 משמש לייצור שלבי Vm , ואילו מגבר # 1 משמש לשמירה על קבוע Vm. יש ליישם את שלבי ה - Vm החיוביים והשליליים לחלופין (למשל, -150, +90, -140, +80 ......), אשר ניתן לתכנת ב- Clampex באמצעות תכונת רשימת המשתמשים בפרוטוקול הרכישה.
  2. הגדרת במת ההקלטה
    1. השליכו צלחת פטרי אחת המכילה ביציות מזווגות לתוך כלי הקיבול של צלחת פטרי בפלטפורמת ההקלטה (איור 2A)
    2. בחר זוג ביציות וסובב את צלחת פטרי במידת הצורך כך ששתי הביציות יהיו בכיוון שמאל וימין, ונעל את הבמה במקומה על ידי הבסיס המגנטי שלה.
    3. תקן את המעמדים המגנטיים המחזיקים את בדיקות הזרם והמתח במיקומים המתאימים על שולחן הבידוד.
      הערה: ודא שבדיקות הזרם והמתח ממגבר אחד ממוקמות בצד שמאל, בעוד שבדיקות מהמגבר השני נמצאות בצד ימין, ושבדיקת המתח נמצאת מול גשושית הזרם בכל צד (איור 2B, C).
  3. הגדרת אלקטרודת הייחוס
    1. מקם אלקטרודת ייחוס (טבלת חומרים) ליד קצה צלחת פטרי לכיוון צד המשתמש (איור 2B, C).
    2. חבר את אלקטרודת הייחוס לשקע השחור (Circuit Ground) רק באחת משתי הגשושיות VDIFF .
  4. הגדרת אלקטרודות VDIFF
    1. משכו זוג מיקרו-פיפטים מזכוכית, נתקו מעט מהקצה עם כותב היהלומים (טבלת החומרים), והחליקו את קצה הקצה על ידי ליטוש אש.
      הערה: התנגדות הקצה צריכה להיות פחות מ-150 kΩ (נמדדת עם ND96 בפיפטה). בדרך כלל micropipettes עם התנגדות קצה של 20-150 kΩ משמשים.
    2. החזיקו את המיקרופיפט מעל הלהבה של מבער אלכוהול כדי לכופף אותו לזווית חלקה (~130°) במיקום המרוחק כ-1 ס"מ מהקצה.
      הערה: מיקרופיפטים מפוברקים ניתנים לשימוש חוזר. יש לשטוף אותם במים לאחר כל שימוש.
    3. יש למלא את פיפטת הזכוכית באופן מלא בתמיסת ND96, להכניס אותה למחזיק מיקרו-אלקטרוניקה ממולא מראש (עם ND96) (טבלת חומרים, איור 2D), ולוודא שלא קיימות בועות אוויר במערכת.
    4. הכנס את פין ה-2 מ"מ של מחזיק המיקרו-אלקטרוניקה לשקע 2-מ"מ של חוט חיבור אלקטרודות VDIFF (איור 2D).
    5. הידקו את שקע ה-2 מ"מ על צדפה מבוססת מגנטית (איור 2D), וכיוונו את קצה אלקטרודת ה-VDIFF לעבר אחת משתי הביציות (איור 2E).
      הערה: התאם את המיקום והזווית של הצדפה כך שקצה האלקטרודה יהיה קרוב מאוד לביצית
    6. הכנס את פין ה-1 מ"מ של חוט חיבור האלקטרודה VDIFF לשקע האדום (כניסת VDIFF ) בגשושית VDIFF באותו צד.
    7. הכן וחבר אלקטרודת VDIFF עבור הביצית והמגבר האחרים בעקבות הליכים דומים.
      הערה: מבט מקרוב על זוג ביציות וכל האלקטרודות מוצג באיור 2E.
  5. הגדרת אלקטרודות הזרם והמתח
    1. הכינו אלקטרודות מתח וזרם מנימי זכוכית, מלאו אותן (בערך באמצע הדרך) בתמיסת KCl (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 עם KOH), והכניסו אותן למחזיקי האלקטרודות המסופקים עם המגברים.
      הערה: האלקטרודות צריכות להיות בעלות התנגדות של ~ 1 MΩ. ניתן לקבל אלקטרודות מתאימות מסוג של נימי זכוכית בעלי דופן דקה (טבלת חומרים) באמצעות קבוצה מסוימת של פרמטרי משיכה (טבלה 1). טיפים כאלה יכולים לחדור בקלות את קרום תא הביצית ללא צורך ללחוץ על Vm או על כפתור Ve BUZZ במגבר.
    2. הנמיכו את האלקטרודות לתמיסת האמבטיה, אפסו את מדי ה-Vm וה-Im על ידי הפיכת החוגות Vm OFFSET ו-Ve OFFSET ובדקו את התנגדות האלקטרודות על ידי לחיצה על בדיקת אלקטרודות Vm ומבחן אלקטרודות Ve.
    3. החדירו את אלקטרודות הזרם והמתח לתוך הביציות, וצפו בפוטנציאלי ממברנה שליליים (בדרך כלל -20 עד -50 mV).
      הערה: מדי ה- Vm וה- Im של אותו מגבר צריכים להציג שני ערכים זהים או דומים מאוד.
  6. רכישת נתונים
    1. במקטע Clamp של המגבר, ודא ש- D.C. GAIN נמצא במצב IN, סובב את ידית ה- GAIN בכיוון השעון לרמה המאפשרת מהדק מתח תקין (בדרך כלל שליש עד מחצית מהטווח המלא), וסובב את מתג ה- Clamp מ- כבוי למהיר.
      הערה: בעת הפעלת המהדק, מדי Vm ו- Im יציגו את מתח ההחזקה ואת זרם ההחזקה, בהתאמה. למרות שזרם ההחזקה עשוי להשתנות במקצת בהתאם לתנאי הביציות, הוא בדרך כלל קטן ויציב ב-Vm החזקה (למשל, -30 mV).
    2. הפעל פרוטוקול רכישה.
      הערה: ארבעה עקבות יוצגו על המסך. עקבות המתח והזרם ממגבר אחד מציינים את שלבי ה- Vm המופעלים על ביצית #1 ואת הזרם הדרוש לייצור צעדי ה- Vm , בעוד שאלו מהמגבר השני מציינים את ה- Vm הקבוע (-30 mV) של ביצית #2, ואת הזרם המוזרק כדי לשמור על Vm קבוע זה. הזרם המוזרק לביצית #2 מייצג את ה - Ij.

6. ניתוח נתונים

  1. ניתוח עם Clampfit.
    1. פתח קובץ abf מוקלט במודול Clampfit של pClamp.
    2. השתמש בסמנים 1 ו- 2 כדי להקיף מקטע של קו הבסיס לפני המעקב של Ij .
    3. לחץ על הסמל התאם את קו הבסיס כדי להוציא חלון בסיסי. בחר חיסור ממוצע של סמנים 1..2 עבור שיטה, ואשר שכל האותות הגלויים וכל העקבות הגלויים נבחרו לבחירת עקבות.
    4. בעת לחיצה על אישור, החלון 'קו בסיס' נסגר, קווי הבסיס של כל עקבות הזרם והמתח מתכנסים ברמת האפס. שים לב ששלבי המתח משתנים לרמות חדשות השוות למתח המקורי בניכוי מתח ההחזקה (לדוגמה, -30 mV).
    5. כדי להתוות את יחסי ה- Ij וה- Vj באמצעות מצב יציב Ij, הקף קטע רצוי של עקבות Ij המייצגים מצב יציב Ij עם סמנים 1 ו- 2, מקם את הסמן 3 בכל מקום בתוך חלון הזמן של שלבי המתח.
    6. עבור אל ניתוח / גרף מהיר / I-V כדי לפתוח חלון I-V .
    7. תחת ציר X (מתח), בחר סמן 3 מתוך אות, ציין את אות צעד המתח (לדוגמה, מתח 1) בתפריט הנפתח וסמן את התיבה הפוך.
      הערה: התיבה Invert מסומנת כדי להמיר את Vm לערכים המקבילים ל- Vj, המוגדר כ- Vm של ביצית #2-V m של ביצית #1.
    8. תחת ציר Y (נוכחי), בחר את המקור של אות Ij (לדוגמה, זרם 0) מהתפריט הנפתח לצד אות, הגדר אזור כסמנים 1..2 מהתפריט הנפתח ובחר ממוצע.
      הערה: כדי להתוות את יחסי הגומלין Ij ו- Vj , סמנים 1 ו- 2 צריכים להקיף את הקטע של עקבות Ij המכילים את השיא Ij בשלב 6.1.5 ולבחור שיא (במקום ממוצע) בשלב 6.1.8.
    9. תחת אפשרות יעד , בחר /י ״החלף ״ או ״צרף״.
    10. בעת לחיצה על אישור בחלון I-V , מוצגת על המסך מערכת יחסים Ij - Vj j , וניתן למצוא את הערכים המתאימים Ij ו- Vj על ידי לחיצה על חלון / תוצאה.
  2. להתוות ולהתאים את מערכת היחסים Gj-V j ב- OriginPro (טבלת חומרים)
    1. העתק את שתי העמודות המכילות את ערכי Vj ו - Ij מחלון התוצאות של Clampfit (שלב 6.1.10) לחוברת עבודה חדשה במקור. ודא שערכי Vj ו - Ij נמצאים תחת עמודות X ו- Y, בהתאמה.
    2. הוסף ארבע עמודות חדשות בחוברת העבודה על-ידי לחיצה על עמודה/ הוסף עמודות חדשות.
    3. תן שם לעמודה החדשה הראשונה כ- Gj, מלא אותה על-ידי הזנת המשוואה "עמודה Ij/column Vj * 1,000" בחלון הגדר ערכי עמודה, וצור תרשים פיזור של יחסי הגומלין Gj-V j.
      הערה: הכפל ב- 1,000 (אופציונלי) הוא כדי למנוע את אי הנוחות של התמודדות עם מספרים קטנים מאוד בשלבים הבאים.
    4. התאם את נקודות הנתונים Gj על פני טווחי Vj השליליים והחיוביים באופן עצמאי לפונקציית בולצמן. חשב Gj ב- Vj = 0 mV על ידי הזנת ערכי Gjmax, Gjmin, A ו - V0 מההתאמה למשוואת בולצמן, דבר שניתן לעשות בגיליון אלקטרוני. ה-Gj המתקבל כך ישמש כ-Gjmax בשלב הבא.
      הערה: המשוואה שתתאים לפונקציית בולצמן היא: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, שבו V0 הוא Vj שבו המוליכות היא חצי מקסימלית, Gjmax הוא המוליכות המקסימלית, Gjmin הוא Vj-חסר רגישות מוליכות שיורית23. כדי לבצע את ההתאמה, תחילה הוסף את משוואת בולצמן כפונקציית התאמה חדשה ל- OriginPro, ולאחר מכן בחר פונקציה זו להתאמה. הזן ערכי זרע משוערים עבור Gjmax, Gjmin, V0 ו- A לפני ביצוע פונקציית ההתאמה. ודא שהפרמטר Gjmax אינו קבוע עבור התאמה זו.
    5. תן שם לעמודות החדשות השנייה והשלישית כ- nGj-L ו- nGj-R ("n" עבור "מנורמל"), ומלא אותן על ידי חלוקת העמודה Gj j בערכים Gjmax הנגזרים מהעקומות Gj j - Vj השמאלית והימנית, בהתאמה (שלב 6.2.4).
    6. תן שם לעמודה החדשה הרביעית כ- nGj-LR, ומלא אותה על-ידי העתקת ערכים מטווחי Vj השליליים והחיוביים של העמודות nGj-L ו- nGj-R, בהתאמה.
    7. צור תרשים פיזור עבור nGj-LR מעל Vj, והתאם את נקודות הנתונים מעל טווחי Vj השליליים והחיוביים לפונקציית בולצמן באופן עצמאי. ודא שהפרמטר Gjmax קבוע ב- 1.0 עבור ההתאמה.
    8. שמור רשומות של תוצאות ההתאמה (לדוגמה, הגרף המותאם וערכי Gjmin, V0 ו- A ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UNC-7 ו- UNC-9 הם innexins של C. elegans. בעוד של-UNC-9 יש רק איזופורם אחד, ל-UNC-7 יש מספר איזופורמים הנבדלים זה מזה בעיקר באורך וברצף חומצות האמינו של מסופי האמינו שלהם 7,8. תמימים אלה עשויים ליצור GJs הומוטיפיים כמו גם הטרוטיפיים (של UNC-7 ו- UNC-9) כאשר הם באים לידי ביטוי בביציות קסנופוס 7,8. עקבות מייצגים I j והיחסים המנורמלים Gj-V j j של UNC-7b ו- UNC-9 homotypic GJs מוצגים באיור 3. בניסויים אלה עם ביציות מצומדות, Vm של ביצית 1 היו מהודקים לרמות שונות ממתח ההחזקה (-30 mV), ואילו זה של ביצית 2 נשמר קבוע ב -30 mV כדי לפקח על Ij. התוצאות מראות כי שני סוגים אלה של GJs נבדלים זה מזה בקצב ההשבתה של Vj-תלוי J j, התלות ב-V j (המסומנת על ידי השיפוע של עקומת Gj-V j), וכמות ה-G j השיורית. דוגמאות רבות אחרות של UNC-7 ו- UNC-9 GJs, כולל תיקון GJs, ניתן למצוא בפרסום האחרון שלנו7.

Figure 1
איור 1: תא זיווג ביציות והתקנת מגבר. (B) מתג DIP בתוך המגבר המוגדר למדידת הזרם הצדדי הגבוה. כל מתגי המתגים למעט 2, 5 ו-7 נמצאים במצב כבוי כדי להשתמש במגבר במצב מדידת זרם צד גבוה. (C) גשושית VDIFF עם השקע האדום (עבור כניסת VDIFF) ושקע שחור (עבור תשתית מעגל) לא מחוברים או מחוברים. ניתן להשתמש בבדיקה עבור מצב מהדק המתח הסטנדרטי כאשר שני השקעים מחוברים. (D) תא זיווג ביציות של ביציות. (E) תא מודל עם חיבורים לבדיקת מערכת הרכישה עם המגבר במצב מדידת זרם צדדי גבוה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הגדרת ביצית ואלקטרודות. לחור העגול קוטר של 36 מ"מ. (B) דיאגרמה המציגה את מיקומן של האלקטרודות השונות. (C) פריסה בפועל של האלקטרודות השונות. (D) שתי אלקטרודות VDIFF עם מחזיקיהן וכבלי החיבור שלהן מהודקים על במת ההקלטה על ידי שני מלחציים מגנטיים שונים, כולל מחזיק מגנטי של גשר אגר (טבלת חומרים) (למעלה) ומהדק צינור (טבלת חומרים) (למטה). הראשון יציב יותר בשמירה על מיקום האלקטרודה בגלל הבסיס המגנטי הגדול יותר שלו, אך דורש שינוי. המיקרופיפטים של הזכוכית מסובבים 90° ממיקומי הפעולה שלהם על מנת להראות את זוויות הכיפוף. (E) מבט מקרוב על זוג הביציות והאלקטרודות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מעקבי רישום מייצגים. שלבי מתח ממברנה שליליים וחיוביים (Vm) מוחלים על ביצית 1 מתוך Vm החזקה של -30 mV ואילו ביצית 2 מוחזקת ב- Vm קבוע של -30 mV. המתח הטרנס-כיווני (Vj) מוגדר כ-V m של ביצית 2 -Vm של ביצית 1. (B). עקבות מדגם Ij והיחס המתקבל של מוליכות צמתים מנורמלת (Gj) -Vj של צמתי פערים הומוטיפיים UNC-9. (C) עקבות מדגם Ij והיחס המנורמל Gj-V j שנוצר כתוצאה מכך של צמתי פערים הומוטיפיים של UNC-7b. יחסי Gj-V j מותקנים על ידי פונקציית בולצמן (קווים אדומים). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

שלב לא. חום משך מהירות זמן
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
עיין במדריך למשתמש באתר האינטרנט של היצרן לקבלת הגדרות של פרמטרי המשיכה (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

טבלה 1: פרמטרים של משיכת אלקטרודות. פרמטרים אלה מבוססים על נימי זכוכית בעלי דופן דקה (טבלת חומרים) וטמפרטורת רמפה של 258 במשיכת מיקרופיפט P-97 (טבלת חומרים). הם צריכים להיות מותאמים בהתאם לטמפרטורת הרמפה עבור זכוכית זו על המושך שלך. לדוגמה, אם טמפרטורת הרמפה על המושך גבוהה ב-20°, הוסיפו 20° לכל שלב ובצעו את ההתאמות הנדרשות. באופן כללי, ניתן לייעל את גודל הקצה על ידי התאמת המהירות של השלב האחרון. אנא עיין במדריך למשתמש באתר האינטרנט של היצרן לקבלת משמעויות של פרמטרי המשיכה (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

נראה כי אופטימיזציה של המערכת נחוצה לניסויים כפולים של מהדקי מתח ביציות. בלעדיו, הקלטות יכולות להיות מאוד לא יציבות, וייתכן שהמגברים יצטרכו להזריק כמות מופרזת של זרם כדי להגיע למטרה Vm, וכתוצאה מכך לגרום לנזק לביציות ולכשלים ברישום. מספר גורמים הם קריטיים להשגת רישומי ביציות כפולות יציבות בשיטת מדידת הזרם הצדדי הגבוה. ראשית, אלקטרודות הזרם והמתח חייבות להיות בעלות התנגדות מתאימה (~1 MΩ), ומחזיקיהן חייבים להיות נקיים. שנית, אלקטרודות VDIFF חייבות להיות בעלות התנגדות נמוכה (<150 kΩ) ולהיות קרובות לביציות. שלישית, כל האלקטרודות עבור אותה ביציה (מתח, זרם ו-VDIFF) חייבות להיות ממוקמות באותו צד (שמאל או ימין), וסדר האלקטרודות (מאחור לחזית) צריך להיות זרם, מתח ו-VDIFF. לבסוף, אלקטרודת הייחוס צריכה להיות ממוקמת בסמוך לקצה צלחת פטרי 35 מ"מ לכיוון המשתמש.

שינינו כמה נהלים מומלצים מהיצרן ועשינו כמה שיפורים אחרים. ביניהם: 1) מיקרופיפטים מלאים ב-ND96 במקום גשרי אגר עמוסי KCl שישמשו כאלקטרודות VDIFF . אלקטרודות הזכוכית קלות לבנייה, ניתנות לשימוש חוזר ואינן מזיקות לביציות; 2) אלקטרודת KCl דליפה נמוכה כאלקטרודת הייחוס. אלקטרודה זו היא בעלת התנגדות נמוכה (~2.7 kΩ) ופוטנציאל יציב, והיא דולפת אלקטרוליטים קטנים (~5.7 x 10-8 מ"ל/שעה); 3) פלטפורמת הקלטה מתוכננת ובנויה בהתאמה אישית המאפשרת מיקום יציב, נוח ומדויק של הביציות והאלקטרודות השונות. שלב זה מספק גם גישה נרחבת לסטריאומיקרוסקופ, אור סיבים עם גוסנקים כפולים, וארבעת המעמדים המגנטיים המשמשים להרכבה ולמיקום של אלקטרודות הזרם והמתח; ו-4) ייצור אלקטרודות זרם ומתח מסוג של נימי זכוכית בעלי דופן דקה. לאלקטרודות אלה יש את עמידות הקצה הרצויה (0.5-1.4 MΩ), יכולות לחדור לקרום תאי הביציות בקלות רבה, ולגרום לנזק מינימלי לביציות.

לעיתים, מערכת ההקלטה אינה פועלת כראוי, כפי שמעיד זרם החזקה גדול במיוחד או גדל ברציפות, פיתוח נקודה לבנה בקרום התא סביב אלקטרודת הזרם, ועקבות Vm לא יציבים בתגובה לפקודות מתח. הגורמים האפשריים הם 1) למערכת אלקטרודות VDIFF יש בועת אוויר קטנה או שקצה אלקטרודת VDIFF אינו מכוון כראוי כלפי הביצית; 2) לאלקטרודת מתח או זרם יש התנגדות גבוהה (למשל >2 MΩ) או שמחזיקה מלוכלך ממאגר מלח; 3) חוט החיבור של אלקטרודת VDIFF נשבר; 4) הרווח D.C. אינו מוגדר ל- IN במהלך מהדק המתח.

כאן תיארנו שיטה להקלטת Ij מביציות קסנופוס . זה מאפשר מהדק מתח יציב של שתי ביציות מנוגדות. שיטה זו קלה ליישום ונראה שאין לה מגבלות ברורות לניתוח התכונות הביופיזיות של GJs. עם זאת, איננו בעמדה לדעת כיצד הוא משתווה לשיטות אחרות שפורסמו. אנו מקווים שמעבדות המעוניינות לאחרונה להקים את טכניקת הידוק המתח-ביציות הכפולות ימצאו שיטה זו שווה לשקול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מודים להייינג ג'ן, צ'יאן גה על מעורבותם בשלב הראשוני של הפיתוח הטכני, לקיראנמאיי ודנת'ם על העזרה עם הדמויות, ולד"ר קמילו פראצ'יה על הייעוץ בנוגע לתא זיווג הביציות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
  2. Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
  3. Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
  4. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  5. Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
  6. Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
  7. Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
  8. Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
  9. Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
  10. Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
  11. Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
  12. Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
  13. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
  15. Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
  16. Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
  17. Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
  18. Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
  19. Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
  20. Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
  21. Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
  22. Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
  23. del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
  24. Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
  25. Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).

Tags

ביולוגיה גיליון 179 צומת פערים innexin Caenorhabditis elegans C. elegans ביציות קסנופוס זרם צומתי מהדק מתח
הקלטת זרם צומת גאפ מביציות <em>קסנופוס</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter