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Biology

जेनोफस Ocytes से रिकॉर्डिंग गैप जंक्शन वर्तमान

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

यहां हम ज़ेनोफस ओसाइट में गैप जंक्शन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और एक उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में दोहरी ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किए गए वाणिज्यिक एम्पलीफायर का उपयोग करके दो एपोस्ड ओसाइटों के बीच जंक्शनल वर्तमान रिकॉर्ड करते हैं।

Abstract

जेनोफस ओसाइटों में कोनेक्सिन और इनेक्सिन की हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति गैप जंक्शनों (जीजे) के बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है। हालांकि, यह दृष्टिकोण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है क्योंकि इसके लिए एक आम जमीन साझा करने वाले दो विरोधी ओसाइटों के विभेदक वोल्टेज क्लैंप की आवश्यकता होती है। यद्यपि प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या इस तकनीक को करने में सफल रही है, अनिवार्य रूप से उन सभी ने या तो घर का बना एम्पलीफायरों या वाणिज्यिक एम्पलीफायरों का उपयोग किया है जो एकल-ओसाइट रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किए गए थे। इस तकनीक को लागू करने के लिए अन्य प्रयोगशालाओं के लिए अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है। यद्यपि एक उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड को दोहरी ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए एक वाणिज्यिक एम्पलीफायर में शामिल किया गया है, लेकिन हमारे हाल के अध्ययन तक इसके आवेदन के लिए कोई रिपोर्ट नहीं थी। हमने कई तकनीकी संशोधनों को पेश करके उच्च पक्ष वर्तमान मापने के दृष्टिकोण को अधिक व्यावहारिक और सुविधाजनक बना दिया है, जिसमें चुंबकीय रूप से आधारित रिकॉर्डिंग प्लेटफ़ॉर्म का निर्माण शामिल है जो ओसाइट और विभिन्न इलेक्ट्रोड के सटीक प्लेसमेंट की अनुमति देता है, वोल्टेज डिफरेंशियल इलेक्ट्रोड में कंडक्टर के रूप में स्नान समाधान का उपयोग, संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में एक वाणिज्यिक कम रिसाव केसीएल इलेक्ट्रोड को अपनाना, पतली दीवार कांच केशिकाओं से वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड का निर्माण, और चुंबकीय रूप से आधारित उपकरणों का उपयोग करके सभी इलेक्ट्रोड की स्थिति। यहां वर्णित विधि दो विरोधी ज़ेनोफस ओसाइटों के बीच जंक्शनल करंट (आईजे) की सुविधाजनक और मजबूत रिकॉर्डिंग की अनुमति देती है।

Introduction

जीजे अंतरकोशिकीय चैनल हैं जो पड़ोसी कोशिकाओं के बीच छोटे साइटोसोलिक अणुओं के वर्तमान प्रवाह और आदान-प्रदान की अनुमति दे सकते हैं। वे कई सेल प्रकारों में मौजूद हैं और विभिन्न शारीरिक कार्यों को करते हैं। कशेरुकियों में जीजे का गठन कनेक्सिन द्वारा किया जाता है, जबकि अकशेरुकी में इननेक्सिन द्वारा। प्रत्येक जीजे में दो जुदा हेमीचैनल होते हैं, जिनमें या तो 6 या 8 सबयूनिट्स प्रति हेमिचैनल होते हैं, यह इस बात पर निर्भर करता है कि वे 1,2,3 मेंकॉनेक्सिन या इननेक्सिन हैं या नहीं। मनुष्यों में 21 कोनेक्सिन जीन4 होते हैं, जबकि आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले अकशेरुकी मॉडल सी एलिगन्स और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में क्रमशः 25 और 8 इननेक्सिन जीन होते हैं, क्रमशः 5,6। जीन टेपों के वैकल्पिक splicing जीजे प्रोटीन की विविधता को और बढ़ा सकता है, कम से कमinnexins 7,8 के लिए।

जीजे को आणविक रचनाओं के आधार पर तीन श्रेणियों में विभाजित किया जा सकता है: होमोटाइपिक, हेटरोटाइपिक और हेटरोमेरिक। एक होमोटाइपिक जीजे में इसके सभी सबयूनिट्स समान होते हैं। एक हेटरोटाइपिक जीजे में दो होमोमेरिक हेमिचैनल होते हैं, लेकिन दो हेमिचैनल दो अलग-अलग जीजे प्रोटीन द्वारा बनते हैं। एक हेटेरोमेरिक जीजे में कम से कम एक हेटरोमेरिक हेमिचैनल होता है। जीजे की आणविक विविधताएं अलग-अलग बायोफिजिकल गुण प्रदान कर सकती हैं जो उनके शारीरिक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण हैं। जीजे बायोफिजिकल गुणों को भी नियामक प्रोटीन 9 द्वारा संशोधित किया जाताहै। यह समझने के लिए कि जीजे अपने शारीरिक कार्यों को कैसे करते हैं, उनकी आणविक रचनाओं, बायोफिजिकल गुणों और उनके कार्यों में नियामक प्रोटीन की भूमिकाओं को जानना महत्वपूर्ण है।

हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग अक्सर आयन चैनलों के जैव भौतिक गुणों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है, जिसमें जीजे भी शामिल हैं, और उन पर नियामक प्रोटीन के प्रभाव। क्योंकि हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति प्रणालियां विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देती हैं, वे आम तौर पर मूल ऊतकों की तुलना में प्रोटीन कार्यों को विच्छेदित करने के लिए अधिक उपयुक्त होते हैं जहां अनावश्यक कार्यों वाले प्रोटीन विश्लेषण को जटिल कर सकते हैं, और आईजे की रिकॉर्डिंग अप्राप्य हो सकती है। दुर्भाग्य से, न्यूरो -2 ए सेल को छोड़कर सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइनें अंतर्जात connexins द्वारा जटिलताओं के कारण जीजे बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हैं। यहां तक कि न्यूरो -2 ए कोशिकाएं भी इस तरह के विश्लेषण के लिए हमेशा उपयुक्त नहीं होती हैं। उदाहरण के लिए, हम न्यूरो -2 ए कोशिकाओं में किसी भी आईजे का पता नहीं लगा सकते हैं जो यूएनसी -7 और यूएनसी -9 के साथ संक्रमित है, या तो अनुपस्थिति या यूएनसी -1 (अप्रकाशित) की उपस्थिति में, जो सी एलिगेंस 9,10 में यूएनसी -9 जीजे के कार्य के लिए आवश्यक है। दूसरी ओर, ज़ेनोफस ओसाइट जीजे के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक उपयोगी वैकल्पिक प्रणाली है। यद्यपि वे एक अंतर्जात जीजे प्रोटीन, connexin 38 (Cx38)11 व्यक्त करते हैं, संभावित जटिलताओं को एक विशिष्ट एंटीसेंस ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड12 को इंजेक्ट करके आसानी से टाला जा सकता है। हालांकि, ज़ेनोफस ओसाइटों के साथ जीजे के विश्लेषण के लिए दो जुदा कोशिकाओं के विभेदक वोल्टेज क्लैंप की आवश्यकता होती है, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है। मेंढक ब्लास्टोमेयर के डबल वोल्टेज क्लैंप की शुरुआती सफलताओं को लगभग 40 साल पहले13,14 साल पहले रिपोर्ट किया गया था। तब से, कई अध्ययनों ने इस तकनीक का उपयोग युग्मित ज़ेनोपस ओसाइटों में आईजे को रिकॉर्ड करने के लिए किया है। हालांकि, अनिवार्य रूप से पिछले सभी अध्ययनों को या तो घर का बना एम्पलीफायरों 12,15,16 या एकल ओसाइटों (GeneClamp 500, AxoClamp 2A, या AxoClamp 2B, अक्षतंतु उपकरण, यूनियन सिटी, सीए) 8,17,18,19,20 पर रिकॉर्डिंग के लिए डिज़ाइन किए गए वाणिज्यिक एम्पलीफायरों के साथ किया गया है। . क्योंकि यहां तक कि वाणिज्यिक एम्पलीफायर भी डबल ओसाइट वोल्टेज क्लैंप के लिए निर्देश प्रदान नहीं करते हैं, इसलिए इस तकनीक को लागू करने के लिए नए या कम परिष्कृत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगशालाओं के लिए अक्सर चुनौतीपूर्ण होता है।

डबल ओसाइट वोल्टेज क्लैंप के लिए केवल एक वाणिज्यिक एम्पलीफायर विकसित किया गया है, वार्नर इंस्ट्रूमेंट्स से ओसी -725 सी (सामग्री की तालिका, चित्रा 1 ए)। इस एम्पलीफायर का उपयोग या तो एक मानक मोड (एकल ओसाइट के लिए) या एक उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड (एकल या दोहरे ओसाइटों के लिए) में किया जा सकता है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि इसकी वोल्टेज जांच में दो सॉकेट जुड़े हुए हैं या नहीं (चित्रा 1 बी, सी)। हालांकि, हमारे हाल के अध्ययन7 तक, इसके उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में इस एम्पलीफायर के उपयोग का वर्णन करने वाला एक भी प्रकाशन नहीं था। हालांकि एम्पलीफायर का उपयोग दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग के लिए एक अन्य प्रयोगशाला द्वारा किया गया है, इसका उपयोग उच्च पक्ष मोड21,22 के बजाय मानक में किया गया था। अपने उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में एम्पलीफायर का उपयोग कर रिपोर्ट की यह कमी तकनीकी कठिनाइयों के कारण हो सकती है। हम निर्माता से निर्देशों का पालन करके उच्च पक्ष मोड का उपयोग करके स्थिर दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में असमर्थ थे। इन वर्षों में, हमने दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग के लिए तीन अलग-अलग दृष्टिकोणों की कोशिश की है, जिसमें उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में दो ओसी -725 सी एम्पलीफायरों, मानक मोड में दो ओसी -725 सी एम्पलीफायरों और किसी अन्य निर्माता से दो एम्पलीफायरों का उपयोग करना शामिल है। हम अंततः व्यापक परीक्षण और त्रुटि के बाद केवल पहले दृष्टिकोण के साथ स्थिर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में सफल रहे। यह प्रकाशन उन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है और प्रदर्शित करता है जिनका उपयोग हम ज़ेनोफस ओसाइट्स में जीजे प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए करते हैं, रिकॉर्ड मैं उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड का उपयोग करके जे करता हूं, और लोकप्रिय वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा का विश्लेषण करता हूं। डबल वोल्टेज-क्लैंप तकनीक के बारे में अतिरिक्त जानकारी अन्य प्रकाशनों19,23 में पाई जा सकती है।

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Protocol

सर्जरी कनेक्टिकट स्कूल ऑफ मेडिसिन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए की जाती है।

1. मेंढक सर्जरी और defollicuated ocytes की तैयारी

  1. एक वयस्क मादा अफ्रीकी पंजे वाले मेंढक (ज़ेनोफस लेविस) (सामग्री की तालिका) को एक शांत (बर्फ के साथ) ट्राइकेन समाधान (~ 300 मिलीग्राम / एल) में विसर्जित करके एनेस्थेटिकाइज़ करें।
  2. प्रतीक्षा करें (~ 15 मिनट) जब तक मेंढक अपने वेब किए गए पैरों को निचोड़ने के लिए बहुत कम या कोई प्रतिक्रिया नहीं दिखाता है। मेंढक को एक ऑपरेटिंग टेबल पर रखें, जिसका पेट ऊपर की ओर हो।
  3. बाएं या दाएं निचले पेट के क्षेत्र पर एक अनुदैर्ध्य चीरा (8-10 मिमी लंबा) के बाद, धीरे से संदंश की एक जोड़ी के साथ अंडाशय ऊतक का एक छोटा सा टुकड़ा खींचें, और छोटे कैंची की एक जोड़ी के साथ अंडाशय ऊतक को मुक्त करें।
  4. तुरंत एक Ca2 + मुक्त ND96 समाधान (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl 2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) में मुक्त अंडाशय ऊतक विसर्जित एक 60 मिमी पेट्री पकवान के अंदर.
  5. एक 5-0 रेशम टांके (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके सरल बाधित टांके द्वारा चीरा बंद करने के बाद, मेंढक को वसूली के लिए एक उथले पानी के टैंक में वापस डाल दिया।
    नोट: चीरा दो चरणों में बंद हो जाता है: पहले पेरिटोनियल और मांसपेशियों की परतें, और फिर त्वचा की परत। प्रत्येक मेंढक को लगातार दो सर्जरी के बीच कम से कम 4 सप्ताह के अंतराल के साथ 5 सर्जरी के अधीन किया जाता है।
  6. पृथक अंडाशय ऊतक को 50-एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 20 मिलीग्राम कोलेजेनेस (सामग्री की तालिका) और20 मिलीग्राम हाइलूरोनिडेज (सामग्री की तालिका) के साथ सीए 2 + मुक्त एनडी 96 समाधान के 10 मिलीलीटर शामिल हैं।
  7. कमरे के तापमान (आरटी) पर एक कक्षीय शेकर पर ट्यूब को हिलाएं जब तक कि सभी ओसाइट अलग -थलग (एकान्त) न हो जाएं।
  8. इसके बाद, एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके पेट्री डिश में 30-50 ओसाइट्स को स्थानांतरित करें और यह निर्धारित करने के लिए कि क्या वे डीफॉलिकुलेटेड हैं, यह निर्धारित करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (≥25x उच्चतम आवर्धन शक्ति) के तहत अक्सर ओसाइट्स की जांच करें।
    नोट: पाश्चर पिपेट को एक हीरे के स्क्राइबर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके एक व्यापक टिप खोलने के लिए "कट" किया जाना चाहिए और काटने के किनारे को चिकना करने के लिए फ्लेम किया जाना चाहिए।
  9. जैसे ही 70% -80% ओसाइट्स को डीफोलिकुलेट किया जाता है, ट्यूब को धीरे से झुकाकर एंजाइम समाधान को डिकेंट करें। ND96 समाधान (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl 2 1.8 mM,MgCl 2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5) के साथ ट्यूब को भरकर 5 बार ओसाइट्स को धोएं और समाधान को डिकेंटिंग करें।
  10. अंतिम धोने के बाद, ND96 समाधान युक्त 60-मिमी पेट्री डिश में ओसाइटों को स्थानांतरित करें। चुनें और एक साफ ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर सोडियम पाइरूवेट (2 mM) और पेनिसिलिन-streptomycin (100 U / mL) के साथ पूरक ND96 समाधान युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश के लिए बड़े और स्वस्थ दिखने वाले ओसाइट्स को स्थानांतरित करें।
    नोट: "बड़े और स्वस्थ दिखने वाले ओसाइट" चरणों वी और VI के वे हैं जो एंजाइमों द्वारा अधिक-पाचन का कोई संकेत नहीं दिखाते हैं।
  11. पेट्री डिश को एक पर्यावरण कक्ष (15-18 डिग्री सेल्सियस) के अंदर चुने गए ओसाइटों वाले व्यंजन को रखें।

2. जीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एक आरएनए प्रतिलेखन किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके विट्रो में एक विशिष्ट कोनेक्सिन या इननेक्सिन के पूरक आरएनए (सीआरएनए) को संश्लेषित करें।
  2. आरएनए प्रतिलेखन किट के उपयोगकर्ता मैनुअल में वर्णित लिथियम क्लोराइड विधि का उपयोग करके सीआरएनए को अवक्षेपित करें।
  3. 70% इथेनॉल के साथ गोली को धोएं, इसे न्यूक्लिएज-मुक्त एच 2 ओ के20μL में भंग करें, और राइबोन्यूक्लिएज अवरोधक (40 यू, सामग्री की तालिका) के 1 μL जोड़ें।
  4. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके सीआरएनए की एकाग्रता को मापें।
  5. CRNA को Cx38 एंटीसेंस ओलिगो के साथ मिलाएं ताकि अंतिम सांद्रता 200-1,000 ng / μL cRNA और 100 ng / μL oligo हो।
    नोट: ऑलिगो अनुक्रम 5'-GCTTTAGTAATTCCCATCCTCCTGCCATGTTTC-3′, जो न्यूक्लियोटाइड्स से मेल खाता है -5 से +25 में Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI परिग्रहण: NM_001088018)11. ओलिगो को सीआरएनए के साथ मिश्रित होने से पहले स्टॉक समाधान (2.0 मिलीग्राम / एमएल) के रूप में रखा जाता है।
  6. 2 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज (~ 16,000 x g) में कताई करके cRNA में कणों को समाप्त करें, और जल्दी से पूरे supernatant को pipetting द्वारा एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें (माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब के नीचे परेशान करने से बचें)।
  7. cRNA को एलीकोट (2.5 μL / शीशी) में विभाजित करें, और एलीकोट को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
  8. एक त्वरित इलाज epoxy चिपकने वाला का उपयोग कर एक 35 मिमी पेट्री पकवान के नीचे करने के लिए नायलॉन जाल (सामग्री की तालिका) के एक छोटे से टुकड़े (~ 1 सेमी x 1 सेमी) gluing द्वारा एक ओसाइट इंजेक्शन पकवान तैयार करें।
    नोट: ओसाइट इंजेक्शन डिश पुन: प्रयोज्य है। प्रत्येक उपयोग के बाद इसे 70% इथेनॉल के साथ धो लें।
  9. ND96 समाधान के साथ लगभग आधे रास्ते में ओसाइट इंजेक्शन डिश भरें (पाइरूवेट और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)।
  10. पेट्री डिश के अंदर पंक्तियों में 25-30 ओसाइट रखें।
  11. स्वचालित नैनोलीटर इंजेक्टर (सामग्री की तालिका) के उपयोगकर्ता मैनुअल में निर्देशों का पालन करके ओसाइट इंजेक्शन के लिए ग्लास माइक्रोपिपेट्स तैयार करें।
    नोट: एक microelectrode beveler (सामग्री की तालिका) का उपयोग तेज इंजेक्शन micropipettes है कि ocytes को कम से कम नुकसान का कारण का उत्पादन करने में मदद कर सकते हैं।
  12. हल्के खनिज तेल के साथ एक इंजेक्शन माइक्रोपिपेट को बैकफिल करें, और इसे इंजेक्टर के माइक्रोपिपेट धारक में डालें।
  13. संग्रहीत ऐलीकोट में से एक से सीआरएनए को पेट्री डिश कवर की अंदर की सतह पर या पिपेटिंग द्वारा नीचे स्थानांतरित करें।
  14. इंजेक्टर नियंत्रक में FILL बटन दबाकर माइक्रोपिपेट की नोक में cRNA ड्रॉपलेट को एस्पिरेट करें।
  15. INJECT बटन दबाकर cRNA (~ 50 nL/oocyte) को इंजेक्ट करें ।
    नोट:: इंजेक्शन वॉल्यूम इंजेक्टर नियंत्रक में डिप स्विचेस द्वारा सेट किया जा सकता है।
  16. इंजेक्ट किए गए ओसाइटों को एनडी 96 समाधान (पाइरूवेट और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) वाले एक नए पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और उन्हें 1-3 दिनों के लिए पर्यावरण कक्ष (15-18 डिग्री सेल्सियस) के अंदर रखें (जीजे प्रोटीन अभिव्यक्ति की गति और स्तर के आधार पर)। एक नए पेट्री डिश में ओसाइटों को स्थानांतरित करके समाधान को दैनिक रूप से बदलें।

3. ओसाइट युग्मन

  1. इंजेक्ट किए गए ओसाइट्स में से कुछ को एनडी 96 समाधान युक्त 35-मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
  2. दो ठीक चिमटी (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें धीरे से पारदर्शी vitelline झिल्ली है कि ओसाइट लपेटता है बंद छीलने के लिए.
    नोट: पहले उपयोग से पहले और समय-समय पर चिमटी युक्तियों को तेज करना आवश्यक हो सकता है, ठीक (600 ग्रिट) सैंडपेपर के एक टुकड़े का उपयोग करके।
  3. ND96 समाधान युक्त एक ओसाइट युग्मन कक्ष (चित्रा 1 D) में प्रति अच्छी तरह से 2 ocytes रखें (पाइरूवेट और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक)।
    नोट: ओसाइट युग्मन कक्ष का निर्माण एक माइक्रोवेल मिनिट्रे (सामग्री की तालिका) के एक छोटे से टुकड़े को 35 मिमी पेट्री डिश (सामग्री की तालिका) के नीचे एक त्वरित इलाज एपॉक्सी चिपकने वाला का उपयोग करके किया जाता है। मिनिट्रे को गर्म तार कटर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके छोटे टुकड़ों में काटा जाता है। ओसाइट युग्मन के लिए मिनिट्रे का उपयोग मूल रूप से दूसरों द्वारा वर्णित किया गया था24। यद्यपि एक जीजे प्रोटीन अपने साइटोसोलिक डोमेन25 में अमीनो एसिड अवशेषों के चार्ज गुणों के आधार पर ओसाइट सेल झिल्ली में गैर-समान रूप से वितरित कर सकता है, यादृच्छिक युग्मन (जानवर और ओसाइट के वनस्पति ध्रुवों के बीच भेदभाव किए बिना) सामान्य रूप से पर्याप्त प्रतीत होता है।
  4. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अलगाव तालिका पर आरटी पर युग्मित ओसाइट युक्त पेट्री डिश रखें।
    नोट:: युग्मन अवधि कुछ घंटों से एक दिन के लिए भिन्न हो सकते हैं। एक सुविधाजनक अभ्यास देर से दोपहर में ओसाइटों को जोड़ना और अगले दिन उनसे रिकॉर्ड करना है।

4. अधिग्रहण प्रणाली की तैयारी

  1. दो OC-725C ओसाइट क्लैंप एम्पलीफायरों (सामग्री की तालिका) को एक आंतरिक डुबकी स्विच (चित्रा 1B) को समायोजित करके उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड पर कॉन्फ़िगर करें।
  2. एम्पलीफायरों को पहले रियर पैनलों पर ग्राउंड सर्किट सॉकेट को इंटरकनेक्ट करके और फिर फैराडे पिंजरे और रिकॉर्डिंग चैंबर को रोशन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फाइबर लाइट से जोड़कर ग्राउंड करें।
  3. एम्पलीफायरों को एनालॉग-टू-डिजिटल सिग्नल कनवर्टर (सामग्री की तालिका) से कनेक्ट करें, और एम्पलीफायर निर्माता के निर्देशों के बाद उन्हें pClamp सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिका) के क्लैम्पेक्स मॉड्यूल में कॉन्फ़िगर करें।
  4. एम्पलीफायर के साथ आपूर्ति किए गए मॉडल सेल के साथ अधिग्रहण प्रणाली का परीक्षण करें।
    1. वीडीआईएफएफ जांच और वर्तमान (आई) केबलों को मॉडल सेल से कनेक्ट करें, वीडीआईएफएफ जांच में लाल और काले सॉकेट को शामिल जम्पर के साथ कनेक्ट करें, जम्पर के किसी भी पैर को मॉडल सेल में या तो पिन से कनेक्ट करें, और मॉडल सेल में ग्राउंड वायर को एम्पलीफायर के ग्राउंड्स सर्किट सॉकेट से केबल से कनेक्ट करें (चित्रा 1 ई)।
    2. शून्य वोल्टेज इलेक्ट्रोड (Vm) और स्नान इलेक्ट्रोड (Im) एम्पलीफायर के मीटर Vm ऑफसेट और Ve ऑफसेट knobs, क्रमशः बदल कर, बंद से या तो तेजी से या धीमी गति से Clamp स्विच और लाभ डायल दक्षिणावर्त एक स्तर है कि उचित वोल्टेज क्लैंप की अनुमति देता है (चित्रा 1A) की अनुमति देता है करने के लिए बारी. D.C. GAIN स्विच या तो OUT या IN स्थिति में हो सकता है।
    3. यह पुष्टि करने के लिए कि Vm मीटर में प्रदर्शित वोल्टेज अधिग्रहण प्रोटोकॉल के अनुसार बदलता है और वोल्टेज और वर्तमान निशान Clampex में ठीक से प्रदर्शित होते हैं, कुछ वोल्टेज चरणों वाले एक साधारण अधिग्रहण प्रोटोकॉल चलाएँ।
      नोट: इस दृष्टिकोण का उपयोग करके हर बार केवल एक एम्पलीफायर का परीक्षण किया जा सकता है।

5. रिकॉर्डिंग मैं युग्मित ocytes के बीच जे

  1. रिकॉर्डिंग के लिए अधिग्रहण प्रोटोकॉल बनाएँ मैं pClamp सॉफ्टवेयर में जे.
    नोट:: दो अधिग्रहण प्रोटोकॉल बनाएँ। उनमें से एक में, एम्पलीफायर # 1 का उपयोग झिल्ली वोल्टेज (वीएम) चरणों की एक श्रृंखला का उत्पादन करने के लिए किया जाता है (उदाहरण के लिए, -150 से +90 एमवी 10-एमवी अंतराल पर), जबकि एम्पलीफायर # 2 का उपयोग एक स्थिर वीएम (जैसे, -30 एमवी) बनाए रखने के लिए किया जाता है। अन्य प्रोटोकॉल में, एम्पलीफायर # 2 का उपयोग वीएम चरणों का उत्पादन करने के लिए किया जाता है, जबकि एम्पलीफायर # 1 का उपयोग निरंतर वीएम को बनाए रखने के लिए किया जाता है। सकारात्मक और नकारात्मक वीएम चरणों को वैकल्पिक रूप से लागू किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, -150, +90, -140, +80 ......), जिसे अधिग्रहण प्रोटोकॉल में उपयोगकर्ता सूची सुविधा का उपयोग करके क्लैम्पेक्स में प्रोग्राम किया जा सकता है।
  2. रिकॉर्डिंग चरण सेट करें
    1. रिकॉर्डिंग प्लेटफ़ॉर्म में पेट्री डिश रिसेप्टैकल में युग्मित ओसाइट युक्त एक पेट्री डिश ड्रॉप करें (चित्रा 2 ए)
    2. ओसाइटों की एक जोड़ी का चयन करें और यदि आवश्यक हो तो पेट्री डिश को घुमाएं ताकि दो ओसाइट बाएं और दाएं दिशा में हों, और अपने चुंबकीय आधार द्वारा स्थिति में मंच को लॉक करें।
    3. अलगाव तालिका पर उपयुक्त स्थानों पर वर्तमान और वोल्टेज जांच को पकड़े हुए चुंबकीय स्टैंड को ठीक करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि एक एम्पलीफायर से वर्तमान और वोल्टेज जांच बाईं ओर स्थित हैं, जबकि दूसरे एम्पलीफायर से वे दाईं ओर हैं, और वोल्टेज जांच प्रत्येक तरफ वर्तमान जांच के सामने है (चित्रा 2 बी, सी)।
  3. संदर्भ इलेक्ट्रोड सेट करें
    1. उपयोगकर्ता पक्ष की ओर पेट्री डिश के किनारे के पास एक संदर्भ इलेक्ट्रोड (सामग्री की तालिका) रखें (चित्रा 2 बी, सी)।
    2. संदर्भ इलेक्ट्रोड को दो VDIFF जांच में से केवल एक में ब्लैक सॉकेट (सर्किट ग्राउंड) से कनेक्ट करें।
  4. VDIFF इलेक्ट्रोड सेट अप करें
    1. कांच के माइक्रोपिपेट्स की एक जोड़ी खींचें, हीरा स्क्राइबर (सामग्री की तालिका) के साथ टिप का एक सा तोड़ दें, और आग चमकाने से टिप किनारे को चिकना करें।
      नोट: टिप प्रतिरोध 150 kΩ से कम होना चाहिए (पिपेट में ND96 के साथ मापा जाता है)। आमतौर पर 20-150 kΩ के टिप प्रतिरोध के साथ माइक्रोपिपेट्स का उपयोग किया जाता है।
    2. एक अल्कोहल बर्नर की लौ के ऊपर माइक्रोपिपेट को पकड़ो ताकि इसे टिप से 1 सेमी दूर एक स्थिति ~ 1 सेमी पर एक चिकनी कोण (~ 130 डिग्री) पर मोड़ा जा सके।
      नोट: निर्मित micropipettes पुन: प्रयोज्य हैं। प्रत्येक उपयोग के बाद उन्हें पानी से कुल्ला करें।
    3. ND96 समाधान के साथ पूरी तरह से ग्लास पिपेट को बैकफिल करें, इसे एक प्रीफिल्ड (ND96 के साथ) माइक्रोइलेक्ट्रोड होल्डर (सामग्री की तालिका, चित्रा 2 डी) में डालें, और यह सुनिश्चित करें कि सिस्टम में कोई हवा के बुलबुले मौजूद नहीं हैं।
    4. एक VDIFF इलेक्ट्रोड कनेक्शन तार (चित्रा 2D) के 2-मिमी सॉकेट में माइक्रोइलेक्ट्रोड धारक के 2-मिमी पिन डालें।
    5. चुंबकीय रूप से आधारित क्लैंपर (चित्रा 2 डी) पर 2-मिमी सॉकेट क्लैंप करें, और दो ओसाइट्स (चित्रा 2 ई) में से एक की ओर वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड की नोक का लक्ष्य रखें।
      नोट: clamper की स्थिति और कोण समायोजित करें ताकि इलेक्ट्रोड की नोक ओसाइट के बहुत करीब है
    6. VDIFF इलेक्ट्रोड कनेक्शन तार के 1-mm पिन को लाल सॉकेट (VDIFF इनपुट) में VDIFF जांच में उसी तरफ डालें.
    7. तैयार करें और इसी तरह की प्रक्रियाओं के बाद अन्य ओसाइट और एम्पलीफायर के लिए एक वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें।
      नोट: ocytes और सभी इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का एक क्लोज-अप दृश्य चित्र 2E में दिखाया गया है।
  5. वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड सेट करें
    1. कांच केशिकाओं से वोल्टेज और वर्तमान इलेक्ट्रोड तैयार करें, उन्हें (लगभग आधे रास्ते में) एक KCl समाधान (KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, KOH के साथ pH 7.4) के साथ बैकफिल करें, और उन्हें एम्पलीफायरों के साथ प्रदान किए गए इलेक्ट्रोड धारकों में डालें।
      नोट: इलेक्ट्रोड में ~ 1 MΩ का प्रतिरोध होना चाहिए। उपयुक्त इलेक्ट्रोड को एक प्रकार की पतली दीवार वाले ग्लास केशिकाओं (सामग्री की तालिका) से प्राप्त किया जा सकता है, जो खींचने के मापदंडों के एक विशिष्ट सेट का उपयोग करता है (तालिका 1)। इस तरह के सुझाव आसानी से एम्पलीफायर पर Vm या Ve BUZZ बटन को दबाने की आवश्यकता के बिना ओसाइट सेल झिल्ली में प्रवेश कर सकते हैं।
    2. स्नान समाधान में इलेक्ट्रोड को कम करें, Vm ऑफसेट और Ve ऑफसेट डायल को चालू करके Vm और Im मीटर को शून्य करें और Vm इलेक्ट्रोड टेस्ट और Ve इलेक्ट्रोड टेस्ट दबाकर इलेक्ट्रोड प्रतिरोध की जांच करें।
    3. वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड को ओसाइटों में डालें, और नकारात्मक झिल्ली क्षमता (आमतौर पर -20 से -50 एमवी) का निरीक्षण करें।
      नोट:: एक ही एम्पलीफायर के Vm और Im मीटर दो समान या बहुत समान मान प्रदर्शित करना चाहिए।
  6. डेटा अधिग्रहण
    1. एम्पलीफायर के क्लैंप अनुभाग में, पुष्टि करें कि D.C. GAIN इन स्थिति में है, GAIN घुंडी को एक स्तर पर दक्षिणावर्त घुमाएं जो उचित वोल्टेज क्लैंप (आमतौर पर पूर्ण श्रेणी के एक तिहाई से आधे तक) की अनुमति देता है, और क्लैंप स्विच को बंद से फास्ट में बदल देता है।
      नोट: क्लैंप चालू करने पर, Vm और Im मीटर क्रमशः होल्डिंग वोल्टेज और होल्डिंग करंट प्रदर्शित करेंगे। यद्यपि होल्डिंग करंट ओसाइट स्थितियों के आधार पर कुछ हद तक भिन्न हो सकता है, यह आम तौर पर होल्डिंग वीएम (जैसे, -30 एमवी) पर छोटा और स्थिर होता है।
    2. एक अधिग्रहण प्रोटोकॉल चलाएँ।
      नोट:: चार निशान स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाएगा। एक एम्पलीफायर से वोल्टेज और वर्तमान निशान ओसाइट # 1 पर लागू वीएम चरणों और वीएम चरणों का उत्पादन करने के लिए आवश्यक वर्तमान को इंगित करते हैं, जबकि अन्य एम्पलीफायर से वे ओसाइट # 2 के निरंतर वीएम (-30 एमवी) को इंगित करते हैं, और वर्तमान को इस निरंतर वीएम को बनाए रखने के लिए इंजेक्ट किया जाता है। वर्तमान में ओसाइट # 2 में इंजेक्ट किया गया आईजे का प्रतिनिधित्व करता है।

6. डेटा विश्लेषण

  1. Clampfit के साथ विश्लेषण.
    1. pClamp के Clampfit मॉड्यूल में एक रिकॉर्ड की गई abf फ़ाइल खोलें।
    2. मैंजे निशान से पहले आधार रेखा के एक खंड को संलग्न करने के लिए कर्सर 1 और 2 का उपयोग करें।
    3. बेसलाइन विंडो को बाहर लाने के लिए आइकन एडजस्ट बेसलाइन पर क्लिक करें। विधि के लिए कर्सर 1..2 का माध्य घटाएँ का चयन करें, और पुष्टि करें कि ट्रेस चयन के लिए सभी दृश्यमान संकेत और सभी दृश्यमान ट्रेस चयनित हैं।
    4. ठीक क्लिक करने पर, बेसलाइन विंडो बंद हो जाती है, सभी वर्तमान और वोल्टेज निशान की आधार रेखा शून्य स्तर पर अभिसरण करती है। ध्यान दें कि वोल्टेज चरण नए स्तरों पर बदल जाते हैं जो मूल वोल्टेज माइनस होल्डिंग वोल्टेज (जैसे, -30 एमवी) के बराबर होते हैं।
    5. स्थिर-राज्यI j का उपयोग करके I j और Vj संबंध को प्लॉट करने के लिए, मैंजे के एक वांछित खंड को संलग्न करता हूं जो स्थिर-राज्य का प्रतिनिधित्व करता है मैं कर्सर 1 और 2 के साथ जे जे, वोल्टेज चरणों की समय खिड़की के भीतर कहीं भी कर्सर 3 रखें।
    6. एक I-V विंडो खोलने के लिए Analyze/ Quick Graph/ I-V पर जाएं ।
    7. X-अक्ष (वोल्टेज) के अंतर्गत, सिग्नल से कर्सर 3 का चयन करें, ड्रॉपडाउन मेनू में वोल्टेज चरण संकेत (जैसे, वोल्टेज 1) निर्दिष्ट करें, और बॉक्स को उलटें चेक करें।
      नोट:: इनवर्ट बॉक्स को Vm को V j के बराबर मानों में कनवर्ट करने के लिए चेक किया जाता है, जिसे oocyte #1 के oocyte #2-V m के Vm के रूप में परिभाषित किया गया है।
    8. Y-अक्ष (वर्तमान) के अंतर्गत, सिग्नल के बगल में ड्रॉपडाउन मेनू से Ij सिग्नल (जैसे, वर्तमान 0) के स्रोत का चयन करें, ड्रॉपडाउन मेनू से कर्सर 1..2 के रूप में क्षेत्र को परिभाषित करें, और माध्य का चयन करें।
      नोट: चोटी मैंj और Vj संबंधों प्लॉट करने के लिए, कर्सर 1 और 2 मैंj ट्रेस चरण 6.1.5 में चोटी मैंj युक्त के खंड संलग्न करना चाहिए और चरण 6.1.8 में पीक ( मतलब के बजाय) का चयन करें।
    9. गंतव्य विकल्प के अंतर्गत, या तो बदलें या जोड़ें का चयन करें.
    10. I-V विंडो में ठीक क्लिक करने पर, एक Ij - Vj संबंध स्क्रीन पर प्रदर्शित होता है, और संबंधित Ij और Vj मान विंडो/परिणाम पर क्लिक करके पाया जा सकता है।
  2. प्लॉट और OriginPro (सामग्री की तालिका) में जी जे-वी जे संबंध फिट
    1. Vj और Ij मान वाले दो स्तंभों की प्रतिलिपि Clampfit (चरण 6.1.10) के परिणाम विंडो से मूल में एक नई कार्यपुस्तिका में प्रतिलिपि बनाएँ। सुनिश्चित करें कि Vj और Ij मान क्रमशः X और Y स्तंभों के अंतर्गत हैं।
    2. स्तंभ क्लिक करके/ नए स्तंभ जोड़ें द्वारा कार्यपुस्तिका में चार नए स्तंभ जोड़ें.
    3. पहले नए स्तंभ को Gj के रूप में नाम दें, इसे सेट स्तंभ मान विंडो में "column Ij/column Vj * 1,000" समीकरण दर्ज करके भरें, और Gj-V j संबंध का स्कैटर प्लॉट बनाएँ।
      नोट: 1,000 (वैकल्पिक) द्वारा गुणा बाद के चरणों में बहुत छोटी संख्याओं से निपटने की असुविधा से बचने के लिए है।
    4. नकारात्मक और सकारात्मक V j श्रेणियों पर Gj डेटा अंक फिट करें स्वतंत्र रूप से बोल्ट्जमैन फ़ंक्शन के लिए। बोल्ट्जमान समीकरण में फिटिंग से Gjmax, Gjmin, A, और V0 मानों को दर्ज करके V j = 0 mV पर G j = 0 mV की गणना करें, जिसे स्प्रेडशीट में किया जा सकता है। इस प्रकार प्राप्त जीजे का उपयोग अगले चरण में जीजेमैक्स के रूप में किया जाएगा।
      नोट: बोल्ट्जमान फ़ंक्शन को फिट करने के लिए समीकरण है: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, जिसमें V0 Vj है जिस पर चालकता अर्ध-अधिकतम है, Gjmax अधिकतम चालकता है, Gjmin Vj-असंवेदनशील है अवशिष्ट चालकता23. फिटिंग करने के लिए, पहले Boltzmann समीकरण OriginPro में एक नए फिटिंग फ़ंक्शन के रूप में जोड़ें, और फिर फिटिंग के लिए इस फ़ंक्शन का चयन करें। फिटिंग फ़ंक्शन निष्पादित करने से पहले Gjmax, Gjmin, V0, और A के लिए अनुमानित बीज मान दर्ज करें. सुनिश्चित करें कि Gjmax पैरामीटर इस फिटिंग के लिए ठीक नहीं है।
    5. दूसरे और तीसरे नए स्तंभों को nGj-L और nGj-R ("n" "सामान्यीकृत" के लिए" के रूप में नाम दें), और उन्हें G j स्तंभ को G jmax मानों द्वारा विभाजित करके भरें, जो क्रमशः बाएं और दाएं Gj - Vj curves से व्युत्पन्न हैं (चरण 6.2.4)।
    6. चौथे नए स्तंभ को nGj-LR के रूप में नाम दें, और इसे क्रमशः nGj-L और nGj-R स्तंभों के नकारात्मक और धनात्मक Vj श्रेणियों से मानों की प्रतिलिपि बनाकर भरें.
    7. Vj पर nGj-LR के लिए एक स्कैटर प्लॉट बनाएँ, और स्वतंत्र रूप से बोल्ट्जमैन फ़ंक्शन के लिए नकारात्मक और सकारात्मक Vj श्रेणियों पर डेटा बिंदुओं को फिट करें। सुनिश्चित करें कि Gjmax पैरामीटर फिटिंग के लिए 1.0 पर तय किया गया है।
    8. फिटिंग परिणामों के रिकॉर्ड रखें (उदाहरण के लिए, फिट ग्राफ और जीजेमिन, वी0, और ए मान)।

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Representative Results

UNC-7 और UNC-9 C. elegans के innexins हैं। जबकि UNC-9 में केवल एक आइसोफॉर्म है, UNC-7 में कई आइसोफॉर्म हैं जो मुख्य रूप से उनके अमीनो टर्मिनलों की लंबाई और अमीनो एसिड अनुक्रम 7,8 में भिन्न होते हैं। ये इनेक्सिन होमोटाइपिक के साथ-साथ हेटरोटाइपिक (यूएनसी -7 और यूएनसी -9 के) जीजे का निर्माण कर सकते हैं जब ज़ेनोफस ओसाइट 7,8 में व्यक्त किया जाता है। प्रतिनिधि मैंजे निशान और परिणामस्वरूप सामान्यीकृत जीजे-वी जे UNC-7b और UNC-9 homotypic GJs के संबंधों को चित्र 3 में दिखाया गया है। युग्मित ओसाइटों के साथ इन प्रयोगों में, ओसाइट 1 के वीएम को होल्डिंग वोल्टेज (-30 एमवी) से विभिन्न स्तरों पर क्लैंप किया गया था, जबकि ओसाइट 2 को आईजे की निगरानी के लिए -30 एमवी पर स्थिर रखा गया था। परिणामों से पता चलता है कि इन दो प्रकार के जीजे वीजे-निर्भर आईजे निष्क्रियता दर, वीजे निर्भरता (जीजे-वी जे वक्र की ढलान द्वारा इंगित) और अवशिष्ट जीजे की मात्रा में भिन्न होते हैं। UNC-7 और UNC-9 GJs के कई अन्य उदाहरण, जिनमें GJs को सुधारना शामिल है, हमारे हाल के प्रकाशन 7 में पाया जा सकताहै।

Figure 1
चित्र1: ओसाइट युग्मन कक्ष और एम्पलीफायर सेटअप। (A) ओसाइट क्लैंप एम्पलीफायर OC-725C का फ्रंट पैनल। (बी) एम्पलीफायर के अंदर एक डीआईपी स्विच उच्च पक्ष वर्तमान माप के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है। 2, 5, और 7 को छोड़कर सभी टॉगल स्विच उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में एम्पलीफायर का उपयोग करने के लिए बंद स्थिति में हैं। (सी) लाल सॉकेट ( वीडीआईएफएफ इनपुट के लिए) और ब्लैक सॉकेट (सर्किट ग्राउंड के लिए) के साथ एक वीडीआईएफएफ जांच या तो असंबद्ध या जुड़ा हुआ है। जांच का उपयोग मानक वोल्टेज-क्लैंप मोड के लिए किया जा सकता है जब दो सॉकेट जुड़े होते हैं। (d) एक ओसाइट युग्मन कक्ष. (ई) उच्च पक्ष वर्तमान मापन मोड में एम्पलीफायर के साथ अधिग्रहण प्रणाली के परीक्षण के लिए कनेक्शन के साथ एक मॉडल सेल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ओसाइट और इलेक्ट्रोड सेटअप। (A) रिकॉर्डिंग चरण। वृत्ताकार छेद का व्यास 36 मिमी है। (B) आरेख विभिन्न इलेक्ट्रोड की स्थिति को दर्शाता है। (c) विभिन्न इलेक्ट्रोडों का वास्तविक लेआउट। (घ) दो वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड उनके धारकों और कनेक्शन केबलों के साथ दो अलग-अलग चुंबकीय क्लैंपों द्वारा रिकॉर्डिंग चरण पर क्लैंप किए गए हैं, जिनमें एक संशोधित आगर ब्रिज चुंबकीय धारक (सामग्री की तालिका) (शीर्ष) और एक ट्यूब क्लैंप (सामग्री की तालिका) (नीचे) शामिल हैं। पूर्व अपने बड़े चुंबकीय आधार के कारण इलेक्ट्रोड की स्थिति को बनाए रखने में अधिक स्थिर है लेकिन संशोधन की आवश्यकता होती है। कांच के माइक्रोपिपेट्स को झुकने वाले कोणों को दिखाने के लिए उनके ऑपरेटिंग पदों से 90 डिग्री घुमाया जाता है। (ई) ओसाइटों और इलेक्ट्रोड की एक जोड़ी का एक क्लोज-अप दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग निशान. (A) आरेख ओसाइट प्रयोग दिखा रहा है। नकारात्मक और धनात्मक झिल्ली वोल्टेज (Vm) चरणों को -30 mV के होल्डिंग Vm से Oocyte 1 पर लागू किया जाता है जबकि Oocyte 2 -30 mV के स्थिर Vm पर आयोजित किया जाता है। ट्रांसजंक्शनल वोल्टेज (वीजे) को ओसाइट 1 के ओसाइट 2 -वीएम के वीएम के वी एम के रूप में परिभाषित किया गया है। (बी). नमूना मैंजे निशान और परिणामस्वरूप सामान्यीकृत जंक्शनल चालकता (जीजे) -Vj UNC-9 homotypic अंतराल जंक्शनों के संबंध. (सी) नमूना मैंजे निशान और परिणामस्वरूप UNC-7b homotypic अंतराल जंक्शनों के सामान्यीकृत जी जे-वी जे संबंध. जीजे-वी जे संबंधों को बोल्ट्जमैन फ़ंक्शन (लाल रेखाओं) द्वारा फिट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चरण सं. गर्मी खींचना वेग समय
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
पुलिंग पैरामीटर (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html) की परिभाषाओं के लिए निर्माता की वेबसाइट पर उपयोगकर्ता मैनुअल देखें।

तालिका 1: इलेक्ट्रोड खींच पैरामीटर. ये पैरामीटर पतली दीवार ग्लास केशिकाओं (सामग्री की तालिका) और पी -97 माइक्रोपिपेट खींचने वाले (सामग्री की तालिका) पर 258 के रैंप तापमान पर आधारित हैं। उन्हें आपके खींचने वाले पर इस ग्लास के लिए रैंप तापमान के अनुसार समायोजित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, यदि खींचने वाले पर रैंप तापमान 20 डिग्री अधिक है, तो प्रत्येक चरण में 20 डिग्री जोड़ें और आवश्यक समायोजन करें। आम तौर पर, टिप आकार को अंतिम चरण के वेग को समायोजित करके अनुकूलित किया जा सकता है। कृपया खींचने वाले पैरामीटर (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html) के अर्थों के लिए निर्माता की वेबसाइट पर उपयोगकर्ता मैनुअल को देखें।

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Discussion

सिस्टम अनुकूलन दोहरी ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप प्रयोगों के लिए आवश्यक प्रतीत होता है। इसके बिना, रिकॉर्डिंग अत्यधिक अस्थिर हो सकती है, और एम्पलीफायरों को लक्ष्य वीएम तक पहुंचने के लिए अत्यधिक मात्रा में वर्तमान इंजेक्ट करना पड़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप ओसाइट क्षति और रिकॉर्डिंग विफलताएं हो सकती हैं। उच्च पक्ष वर्तमान मापन विधि के साथ स्थिर दोहरी ओसाइट रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए कई कारक महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड में उचित प्रतिरोध (~ 1 MΩ) होना चाहिए, और उनके धारकों को साफ होना चाहिए। दूसरा, वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड में कम प्रतिरोध (<150 kΩ) होना चाहिए और ओसाइट के करीब होना चाहिए। तीसरा, एक ही ओसाइट (वोल्टेज, वर्तमान और वीडीआईएफएफ) के लिए सभी इलेक्ट्रोड को एक ही तरफ (बाएं या दाएं) पर तैनात किया जाना चाहिए, और इलेक्ट्रोड का क्रम (पीछे से सामने तक) वर्तमान, वोल्टेज और वीडीआईएफएफ होना चाहिए। अंत में, संदर्भ इलेक्ट्रोड उपयोगकर्ता की ओर 35 मिमी पेट्री डिश के किनारे के पास स्थित होना चाहिए।

हमने निर्माता से कुछ अनुशंसित प्रक्रियाओं को संशोधित किया है और कुछ अन्य सुधार किए हैं। उनमें से हैं: 1) ND96-भरे हुए माइक्रोपिपेट्स के बजाय KCl-लोडेड अगर पुलों के बजाय VDIFF इलेक्ट्रोड के रूप में सेवा करने के लिए। कांच इलेक्ट्रोड का निर्माण करना आसान है, पुन: प्रयोज्य, और ocytes के लिए गैर-हानिकारक; 2) संदर्भ इलेक्ट्रोड के रूप में एक कम रिसाव KCl इलेक्ट्रोड. इस इलेक्ट्रोड में कम प्रतिरोध (~ 2.7 kΩ) और स्थिर क्षमता होती है, और थोड़ा इलेक्ट्रोलाइट्स (~ 5.7 x 10-8 mL / h) लीक होता है; 3) एक कस्टम-डिज़ाइन और निर्मित रिकॉर्डिंग प्लेटफ़ॉर्म जो ओसाइट्स और विभिन्न इलेक्ट्रोड की स्थिर, सुविधाजनक और सटीक स्थिति की अनुमति देता है। यह चरण एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, दोहरी गूज़नेक के साथ एक फाइबर लाइट, और चार चुंबकीय स्टैंड को माउंट करने और वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड की स्थिति के लिए उपयोग किए जाने वाले चार चुंबकीय स्टैंड तक पर्याप्त पहुंच प्रदान करता है; और 4) पतली दीवार कांच केशिकाओं के एक प्रकार से वर्तमान और वोल्टेज इलेक्ट्रोड का निर्माण। इन इलेक्ट्रोडों में वांछित टिप प्रतिरोध (0.5-1.4 MΩ) होता है, जो ओसाइट सेल झिल्ली को बहुत आसानी से प्रवेश कर सकता है, और ओसाइट को न्यूनतम नुकसान पहुंचा सकता है।

कभी-कभी, रिकॉर्डिंग सिस्टम ठीक से काम नहीं करता है, जैसा कि असामान्य रूप से बड़े या लगातार बढ़ते होल्डिंग करंट, वर्तमान इलेक्ट्रोड के चारों ओर सेल झिल्ली में एक सफेद स्थान का विकास, और वोल्टेज कमांड के जवाब में अस्थिर वीएम ट्रेस द्वारा इंगित किया गया है। संभावित कारण हैं 1) एक वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड सिस्टम में एक छोटा सा हवा का बुलबुला होता है या वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड की नोक ओसाइट की ओर ठीक से लक्षित नहीं होती है; 2) एक वोल्टेज या वर्तमान इलेक्ट्रोड में उच्च प्रतिरोध होता है (उदाहरण के लिए >2 MΩ) या इसका धारक नमक जमा से गंदा होता है; 3) एक वीडीआईएफएफ इलेक्ट्रोड के लिए कनेक्शन तार टूट गया है; 4) D.C. लाभ वोल्टेज क्लैंप के दौरान IN करने के लिए सेट नहीं है।

यहां हमने जेनोफस ओसाइट से आईजे की रिकॉर्डिंग के लिए एक विधि का वर्णन किया है। यह दो विरोधी ओसाइटों के एक स्थिर वोल्टेज क्लैंप की अनुमति देता है। इस विधि को लागू करना आसान है और ऐसा लगता है कि जीजे के बायोफिजिकल गुणों का विश्लेषण करने के लिए कोई स्पष्ट सीमाएं नहीं हैं। हालांकि, हम यह बताने की स्थिति में नहीं हैं कि यह अन्य प्रकाशित तरीकों के साथ कैसे तुलना करता है। हम आशा करते हैं कि प्रयोगशालाएं जो डबल ओसाइट वोल्टेज-क्लैंप तकनीक की स्थापना में नई रुचि रखती हैं, उन्हें इस विधि पर विचार करने लायक मिलेगा।

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Disclosures

लेखकों के पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम तकनीकी विकास के प्रारंभिक चरण में उनकी भागीदारी के लिए हैयिंग झान, कियान जीई, आंकड़ों के साथ मदद करने के लिए किरणमयी वेदांथम, और ओसाइट पेयरिंग चैंबर पर सलाह के लिए डॉ कैमिलो पेराचिया को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

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जीव विज्ञान अंक 179 गैप जंक्शन innexin Caenorhabditis elegans C. elegans Xenopus ocytes जंक्शनल करंट वोल्टेज क्लैंप
<em>जेनोफस</em> Ocytes से रिकॉर्डिंग गैप जंक्शन वर्तमान
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Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

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