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Biology

Registrazione della corrente di giunzione gap dagli ovociti xenopus

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

Qui presentiamo un protocollo per esprimere le proteine gap junction negli ovociti Xenopus e registrare la corrente giunzionale tra due ovociti apposti utilizzando un amplificatore commerciale progettato per registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti in una modalità di misurazione della corrente laterale elevata.

Abstract

L'espressione eterologa di connessioni e innexine negli ovociti di Xenopus è un approccio potente per studiare le proprietà biofisiche delle giunzioni gap (GJ). Tuttavia, questo approccio è tecnicamente impegnativo perché richiede un morsetto di tensione differenziale di due ovociti opposti che condividono un terreno comune. Sebbene un piccolo numero di laboratori sia riuscito a eseguire questa tecnica, essenzialmente tutti hanno utilizzato amplificatori fatti in casa o amplificatori commerciali progettati per registrazioni di singoli ovociti. Spesso è difficile per altri laboratori implementare questa tecnica. Sebbene una modalità di misurazione della corrente laterale elevata sia stata incorporata in un amplificatore commerciale per le registrazioni a doppio morsetto di tensione degli ovociti, non c'era stata alcuna segnalazione per la sua applicazione fino al nostro recente studio. Abbiamo reso l'approccio di misurazione della corrente laterale elevata più pratico e conveniente introducendo diverse modifiche tecniche, tra cui la costruzione di una piattaforma di registrazione a base magnetica che consente il posizionamento preciso di ovociti e vari elettrodi, l'uso della soluzione del bagno come conduttore negli elettrodi differenziali di tensione, l'adozione di un elettrodo KCl commerciale a bassa perdita come elettrodo di riferimento, fabbricazione di elettrodi di corrente e tensione da capillari di vetro a parete sottile e posizionamento di tutti gli elettrodi utilizzando dispositivi a base magnetica. Il metodo qui descritto consente registrazioni convenienti e robuste della corrente giunzionale (Ij) tra due ovociti Xenopus opposti.

Introduction

I GJ sono canali intercellulari che possono consentire il flusso di corrente e lo scambio di piccole molecole citosoliche tra cellule vicine. Esistono in molti tipi di cellule e svolgono diverse funzioni fisiologiche. I GJ nei vertebrati sono formati da connessioni, mentre quelli negli invertebrati da innexine. Ogni GJ è costituito da due emicanali giustapposti con 6 o 8 subunità per emicanale, a seconda che siano connesse o innexine 1,2,3. Gli esseri umani hanno 21 geni della connexina4, mentre i modelli di invertebrati comunemente usati C. elegans e Drosophila melanogaster hanno 25 e 8 geni dell'innexina, rispettivamente 5,6. Lo splicing alternativo dei trascritti genici può aumentare ulteriormente la diversità delle proteine GJ, almeno per le innexine 7,8.

I PJ possono essere suddivisi in tre categorie basate su composizioni molecolari: omotipica, eterotipica ed eteromerica. Un GJ omotipico ha tutte le sue subunità identiche. Un GJ eterotipico ha due emicanali omomerici, ma i due emicanali sono formati da due diverse proteine GJ. Un GJ eteromerico contiene almeno un emicale eteromerico. Le diversità molecolari dei PJ possono conferire proprietà biofisiche distinte che sono importanti per le loro funzioni fisiologiche. Le proprietà biofisiche di GJ sono anche modulate dalle proteineregolatrici 9. Per capire come i PJ svolgono le loro funzioni fisiologiche, è importante conoscere le loro composizioni molecolari, le proprietà biofisiche e i ruoli delle proteine regolatrici nelle loro funzioni.

I sistemi di espressione eterologa sono spesso usati per studiare le proprietà biofisiche dei canali ionici, compresi i PJ, e gli effetti delle proteine regolatrici su di essi. Poiché i sistemi di espressione eterologhi consentono l'espressione di proteine specifiche, sono generalmente più suscettibili di sezionare le funzioni proteiche rispetto ai tessuti nativi in cui le proteine con funzioni ridondanti possono complicare l'analisi e la registrazione di Ij può essere irraggiungibile. Sfortunatamente, le linee cellulari più comunemente usate tranne la cellula Neuro-2A sono inappropriate per lo studio delle proprietà biofisiche di GJ a causa di complicazioni da parte delle connessioni endogene. Anche le cellule Neuro-2A non sono sempre appropriate per questo tipo di analisi. Ad esempio, non siamo riusciti a rilevare alcun ij nelle cellule Neuro-2A trasfettate con le innexine UNC-7 e UNC-9 né in assenza né in presenza di UNC-1 (non pubblicato), che è necessario per la funzione di UNC-9 GJs in C. elegans 9,10. D'altra parte, gli ovociti xenopus sono un utile sistema alternativo per le analisi elettrofisiologiche dei PJ. Sebbene esprimano una proteina GJ endogena, la connexina 38 (Cx38)11, le potenziali complicanze possono essere facilmente evitate iniettando uno specifico oligonucleotide12 antisenso. Tuttavia, le analisi dei PJ con ovociti Xenopus richiedono un morsetto di tensione differenziale di due cellule giustapposte, il che è tecnicamente impegnativo. I primi successi del morsetto a doppia tensione dei blastomeri di rana sono stati riportati circa 40 anni fa13,14. Da allora, molti studi hanno utilizzato questa tecnica per registrare Ij negli ovociti Xenopus accoppiati. Tuttavia, essenzialmente tutti gli studi precedenti sono stati eseguiti con amplificatori fatti in casa 12,15,16 o amplificatori commerciali progettati per registrazioni su singoli ovociti (GeneClamp 500, AxoClamp 2A, o AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Poiché anche gli amplificatori commerciali non forniscono istruzioni per il doppio morsetto di tensione degli ovociti, è spesso difficile per i laboratori elettrofisiologici nuovi o meno sofisticati implementare questa tecnica.

Solo un amplificatore commerciale è stato sviluppato per il morsetto a doppia tensione degli ovociti, l'OC-725C di Warner Instruments (Table of Materials, Figure 1A). Questo amplificatore può essere utilizzato in modalità standard (per ovociti singoli) o in modalità di misurazione della corrente laterale elevata (per ovociti singoli o doppi) a seconda che siano collegate due prese nella sonda di tensione (Figura 1B, C). Tuttavia, fino al nostro recente studio7, non c'era stata una sola pubblicazione che descrivesse l'uso di questo amplificatore nella sua modalità di misurazione della corrente laterale elevata. Sebbene l'amplificatore sia stato utilizzato da un altro laboratorio per la registrazione di doppi ovociti, è stato utilizzato nella modalità standard piuttosto che nella modalità high side21,22. Questa mancanza di rapporti che utilizzano l'amplificatore nella sua modalità di misurazione della corrente laterale elevata potrebbe essere dovuta a difficoltà tecniche. Non siamo stati in grado di ottenere registrazioni stabili di doppi ovociti utilizzando la modalità high side seguendo le istruzioni del produttore. Nel corso degli anni, abbiamo provato tre diversi approcci per la doppia registrazione degli ovociti, tra cui l'utilizzo di due amplificatori OC-725C nella modalità di misurazione della corrente laterale alta, due amplificatori OC-725C in modalità standard e due amplificatori di un altro produttore. Alla fine siamo riusciti a ottenere registrazioni stabili solo con il primo approccio dopo lunghi tentativi ed errori. Questa pubblicazione descrive e dimostra le procedure che utilizziamo per esprimere le proteine GJ negli ovociti Xenopus, registrare Ij utilizzando la modalità di misurazione della corrente laterale alta e analizzare i dati elettrofisiologici utilizzando il popolare software commerciale. Ulteriori informazioni sulla tecnica del doppio morsetto di tensione possono essere trovate in altre pubblicazioni19,23.

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Protocol

Gli interventi chirurgici vengono eseguiti seguendo un protocollo approvato dal comitato istituzionale per la cura degli animali della University of Connecticut School of Medicine.

1. Chirurgia della rana e preparazione di ovociti defollicuti

  1. Anestetizzare una femmina adulta di rana artigliata africana (Xenopus laevis) (Tabella dei materiali) immergendola in una soluzione fredda (con ghiaccio) di tricaina (~ 300 mg / L).
  2. Attendere (~ 15 minuti) fino a quando la rana mostra poca o nessuna risposta alla spremitura dei piedi palmati. Adagiare la rana su un tavolo operatorio con la pancia rivolta verso l'alto.
  3. Dopo un'incisione longitudinale (lunga 8-10 mm) sulla regione addominale inferiore sinistra o destra, estrarre delicatamente un piccolo pezzo di tessuto ovarico con un paio di pinze e tagliare liberamente il tessuto ovarico con un paio di piccole forbici.
  4. Immergere immediatamente il tessuto ovarico libero in una soluzione di ND96 ca2+-free (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) all'interno di una capsula di Petri da 60 mm.
  5. Dopo aver chiuso l'incisione con semplici suture interrotte usando una sutura di seta 5-0 (Tabella dei materiali), rimettere la rana in un serbatoio di acqua poco profonda per il recupero.
    NOTA: L'incisione viene chiusa in due fasi: prima gli strati peritoneale e muscolare e poi lo strato cutaneo. Ogni rana è sottoposta a 5 interventi chirurgici con almeno un intervallo di 4 settimane tra due interventi chirurgici consecutivi.
  6. Trasferire il tessuto ovarico isolato in un tubo centrifugo da 50 mL contenente 10 mL di soluzione di ND96 ca2+-free con 20 mg di collagenasi (Tabella dei materiali) e 20 mg di ialuronidasi (Tabella dei materiali).
  7. Agitare il tubo su uno shaker orbitale a temperatura ambiente (RT) fino a quando tutti gli ovociti non sono diventati isolati (solitari).
  8. Successivamente, trasferire 30-50 ovociti in una capsula di Petri usando una pipetta Pasteur di vetro ed esaminare frequentemente gli ovociti sotto uno stereomicroscopio (≥25 volte il più alto potere di ingrandimento) per determinare se sono defolliculati.
    NOTA: La pipetta Pasteur deve essere "tagliata" ad un'apertura di punta più ampia usando uno scriba diamantato (Table of Materials) e fiammata per levigare il tagliente.
  9. Non appena il 70%-80% degli ovociti viene defollicolato, decantare la soluzione enzimatica inclinando delicatamente il tubo. Lavare gli ovociti 5 volte riempiendo il tubo con la soluzione ND96 (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) e decantando la soluzione.
  10. Dopo il lavaggio finale, trasferire gli ovociti in una capsula di Petri da 60 mm contenente soluzione ND96. Prelevare e trasferire ovociti di grandi dimensioni e dall'aspetto sano in una capsula di Petri da 60 mm contenente soluzione di ND96 integrata con piruvato di sodio (2 mM) e penicillina-streptomicina (100 U / mL) utilizzando una pipetta Pasteur di vetro pulito.
    NOTA: gli "ovociti grandi e dall'aspetto sano" sono quelli degli stadi V e VI che non mostrano alcun segno di eccessiva digestione da parte degli enzimi.
  11. Posizionare la capsula di Petri contenente gli ovociti raccolti all'interno di una camera ambientale (15-18 °C).

2. Espressione della proteina GJ

  1. Sintetizzare l'RNA complementare (cRNA) di una specifica connexina o innexina in vitro utilizzando un kit di trascrizione dell'RNA (Tabella dei materiali) seguendo il protocollo del produttore.
  2. Precipitare il cRNA utilizzando un metodo di cloruro di litio descritto nel manuale utente del kit di trascrizione dell'RNA.
  3. Lavare il pellet con etanolo al 70%, scioglierlo in 20 μL di H2O senza nucleasi e aggiungere 1 μL di inibitore della ribonucleasi (40 U, Tabella dei materiali).
  4. Misurare la concentrazione del cRNA utilizzando uno spettrofotometro (Table of Materials).
  5. Mescolare il cRNA con un oligo antisenso Cx38 in modo che le concentrazioni finali siano 200-1.000 ng/μL cRNA e 100 ng/μL oligo.
    NOTA: La sequenza oligo è 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, che corrisponde ai nucleotidi da -5 a +25 in Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Accession: NM_001088018)11. L'oligo viene conservato come soluzione madre (2,0 mg/mL) prima di essere miscelato con il cRNA.
  6. Eliminare le particelle nel cRNA ruotando in una microcentrifuga (~ 16.000 x g) per 2 minuti e trasferire rapidamente l'intero surnatante in un nuovo tubo mediante pipettaggio (evitare di disturbare il fondo del tubo microcentrifuga).
  7. Dividere il cRNA in aliquote (2,5 μL/flaconcino) e conservare le aliquote in un congelatore a -80 °C.
  8. Preparare una piastra per iniezione di ovociti incollando un piccolo pezzo (~ 1 cm x 1 cm) di rete di nylon (Table of Materials) sul fondo di una capsula di Petri da 35 mm utilizzando un adesivo epossidico a rapida polimerizzazione.
    NOTA: La piastra per iniezione di ovociti è riutilizzabile. Lavarlo con il 70% di etanolo dopo ogni utilizzo.
  9. Riempire la piastra per iniezione di ovociti circa a metà strada con la soluzione ND96 (integrata con piruvato e penicillina-streptomicina).
  10. Posizionare 25-30 ovociti in file all'interno della capsula di Petri.
  11. Preparare micropipette di vetro per iniezioni di ovociti seguendo le istruzioni nel manuale d'uso dell'iniettore nanoliter automatizzato (Tabella dei materiali).
    NOTA: l'uso di una smussatrice a microelettrodo (Tabella dei materiali) può aiutare a produrre micropipette a iniezione acuta che causano danni minimi agli ovociti.
  12. Riempire una micropipetta di iniezione con olio minerale leggero e inserirla nel supporto della micropipetta dell'iniettore.
  13. Trasferire il cRNA da una delle aliquote immagazzinate alla superficie interna di una copertura o di un fondo della capsula di Petri mediante pipettaggio.
  14. Aspirare la goccia di cRNA nella punta della micropipetta premendo il pulsante FILL nel controller dell'iniettore.
  15. Iniettare il cRNA (~50 nL/ovocita) premendo il pulsante INJECT .
    NOTA: il volume di iniezione può essere impostato dagli interruttori di immersione nel controller dell'iniettore.
  16. Trasferire gli ovociti iniettati in una nuova capsula di Petri contenente soluzione di ND96 (integrata con piruvato e penicillina-streptomicina) e tenerli all'interno della camera ambientale (15-18 °C) per 1-3 giorni (a seconda della velocità e del livello di espressione della proteina GJ). Sostituire la soluzione ogni giorno trasferendo gli ovociti in una nuova capsula di Petri.

3. Accoppiamento degli ovociti

  1. Trasferire alcuni degli ovociti iniettati in una capsula di Petri da 35 mm contenente soluzione di ND96.
  2. Utilizzare due pinzette sottili (Table of Materials) per staccare delicatamente la membrana vitellina trasparente che avvolge l'ovocita.
    NOTA: Potrebbe essere necessario affilare le punte della pinzetta prima del primo utilizzo e di tanto in tanto, utilizzando un pezzo di carta vetrata fine (600 Grit).
  3. Posizionare 2 ovociti per pozzetto in una camera di accoppiamento degli ovociti (Figura 1D) contenente soluzione di ND96 (integrata con piruvato e penicillina-streptomicina).
    NOTA: La camera di accoppiamento degli ovociti è costruita incollando un piccolo pezzo di un Minitray Microwell (Table of Materials) sul fondo di una capsula di Petri da 35 mm (Table of Materials) utilizzando un adesivo epossidico a indurimento rapido. Il Minitray viene tagliato in piccoli pezzi utilizzando una fresa a filo caldo (Table of Materials). L'uso del Minitray per l'accoppiamento degli ovociti è stato originariamente descritto da altri24. Sebbene una proteina GJ possa distribuirsi in modo non uniforme nella membrana cellulare dell'ovocita a seconda delle proprietà di carica dei residui di amminoacidi nei suoi domini citosolici25, l'accoppiamento casuale (senza discriminare tra i poli animale e vegetale dell'ovocita) sembra essere sufficiente in generale.
  4. Tenere la capsula di Petri contenente ovociti accoppiati a RT sulla tavola di isolamento da utilizzare per le registrazioni elettrofisiologiche.
    NOTA: la durata dell'accoppiamento può variare da poche ore a un giorno. Una pratica conveniente è quella di accoppiare gli ovociti nel tardo pomeriggio e registrare da loro il giorno seguente.

4. Preparazione del sistema di acquisizione

  1. Configurare due amplificatori a morsetto per ovociti OC-725C (Table of Materials) sulla modalità di misurazione della corrente laterale alta regolando un interruttore di immersione interno (Figura 1B).
  2. Mettere a terra gli amplificatori interconnettendo prima le prese del circuito di terra sui pannelli posteriori e quindi collegandosi alla gabbia di Faraday e alla luce in fibra utilizzata per illuminare la camera di registrazione.
  3. Collegare gli amplificatori a un convertitore di segnale analogico-digitale (Table of Materials) e configurarli nel modulo Clampex del software pClamp (Table of Materials) seguendo le istruzioni del produttore dell'amplificatore.
  4. Testare il sistema di acquisizione con la cella modello fornita con l'amplificatore.
    1. Collegare la sonda VDIFF e i cavi di corrente (I) alla cella modello, collegare le prese rosse e nere nella sonda VDIFF con il ponticello incluso, collegare entrambe le gambe del ponticello a uno dei pin nella cella modello e collegare il filo di terra nella cella modello al cavo dalla presa GROUNDS CIRCUIT dell'amplificatore (Figura 1E).
    2. Azzerare i misuratori voltage electrode (Vm) e Bath Electrode (Im) dell'amplificatore ruotando rispettivamente le manopole Vm OFFSET e Ve OFFSET , commutare Clamp da OFF a Fast o SLOW e ruotare la ghiera GAIN in senso orario a un livello che consenta un corretto morsetto di tensione (Figura 1A). L'interruttore D.C. GAIN può trovarsi in posizione OUT o IN .
    3. Eseguire un semplice protocollo di acquisizione contenente alcuni passaggi di tensione per confermare che la tensione visualizzata nel misuratore Vm cambia in base al protocollo di acquisizione e che le tracce di tensione e corrente vengono visualizzate correttamente in Clampex.
      NOTA: è possibile testare un solo amplificatore ogni volta utilizzando questo approccio.

5. Registrazione Ij tra ovociti accoppiati

  1. Creare protocolli di acquisizione per la registrazione Ij nel software pClamp.
    NOTA: creare due protocolli di acquisizione. In uno di essi, l'amplificatore # 1 viene utilizzato per produrre una serie di passi di tensione di membrana (Vm) (ad esempio, da -150 a +90 mV a intervalli di 10 mV), mentre l'amplificatore #2 viene utilizzato per mantenere costante Vm (ad esempio, -30 mV). Nell'altro protocollo, l'amplificatore #2 viene utilizzato per produrre i passi Vm , mentre l'amplificatore # 1 viene utilizzato per mantenere la costante Vm. I passi Vm positivi e negativi devono essere applicati in alternativa (ad esempio, -150, +90, -140, +80 ......), che possono essere programmati in Clampex utilizzando la funzione User List nel protocollo di acquisizione.
  2. Impostare la fase di registrazione
    1. Rilasciare una capsula di Petri contenente ovociti accoppiati nel recipiente della capsula di Petri nella piattaforma di registrazione (Figura 2A)
    2. Selezionare una coppia di ovociti e ruotare la capsula di Petri, se necessario, in modo che i due ovociti siano nella direzione sinistra e destra e bloccare lo stadio in posizione dalla sua base magnetica.
    3. Fissare i supporti magnetici tenendo le sonde di corrente e tensione in posizioni appropriate sulla tavola di isolamento.
      NOTA: Assicurarsi che le sonde di corrente e tensione di un amplificatore si trovino sul lato sinistro, mentre quelle dell'altro amplificatore si trovino sul lato destro e che la sonda di tensione si trovi davanti alla sonda di corrente su ciascun lato (Figura 2B, C).
  3. Impostare l'elettrodo di riferimento
    1. Posizionare un elettrodo di riferimento (Tabella dei materiali) vicino al bordo della capsula di Petri verso il lato utente (Figura 2B, C).
    2. Collegare l'elettrodo di riferimento alla presa nera (Circuit Ground) in una sola delle due sonde VDIFF .
  4. Impostare gli elettrodi VDIFF
    1. Tirare un paio di micropipette di vetro, rompere un po 'della punta con lo scriba diamante (Table of Materials) e lisciare il bordo della punta mediante lucidatura a fuoco.
      NOTA: la resistenza della punta deve essere inferiore a 150 kΩ (misurata con ND96 nella pipetta). In genere vengono utilizzate micropipette con resistenza della punta di 20-150 kΩ.
    2. Tenere la micropipetta sopra la fiamma di un bruciatore ad alcool per piegarla ad un angolo liscio (~ 130 °) in una posizione a ~ 1 cm di distanza dalla punta.
      NOTA: le micropipette fabbricate sono riutilizzabili. Risciacquarli con acqua dopo ogni utilizzo.
    3. Riempire completamente la pipetta di vetro con la soluzione ND96, inserirla in un porta microelettrodo preriempito (con ND96) (Tabella dei materiali, Figura 2D) e assicurarsi che nel sistema non siano presenti bolle d'aria.
    4. Inserire il perno da 2 mm del supporto del microelettrodo nella presa da 2 mm di un filo di collegamento dell'elettrodo VDIFF (Figura 2D).
    5. Bloccare la presa da 2 mm su un clamper a base magnetica (Figura 2D) e puntare la punta dell'elettrodo VDIFF verso uno dei due ovociti (Figura 2E).
      NOTA: Regolare la posizione e l'angolo del clamper in modo che la punta dell'elettrodo sia molto vicina all'ovocita
    6. Inserire il pin da 1 mm del filo di collegamento dell'elettrodo VDIFF nella presa rossa (V DIFF Input) nella sonda VDIFF sullo stesso lato.
    7. Preparare e collegare un elettrodo VDIFF per l'altro ovocita e amplificatore seguendo procedure simili.
      NOTA: una vista ravvicinata di una coppia di ovociti e di tutti gli elettrodi è mostrata nella Figura 2E.
  5. Impostare gli elettrodi di corrente e tensione
    1. Preparare elettrodi di tensione e corrente da capillari di vetro, riempirli (circa a metà strada) con una soluzione KCl (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 con KOH) e inserirli nei portaelettrodi forniti con gli amplificatori.
      NOTA: gli elettrodi devono avere una resistenza di ~1 MΩ. Elettrodi adatti possono essere ottenuti da un tipo di capillari di vetro a parete sottile (Table of Materials) utilizzando un insieme specifico di parametri di trazione (Tabella 1). Tali punte possono facilmente penetrare nella membrana cellulare dell'ovocita senza la necessità di premere il pulsante Vm o Ve BUZZ sull'amplificatore.
    2. Abbassare gli elettrodi nella soluzione del bagno, azzerare i misuratori Vm e Im ruotando le ghiere Vm OFFSET e Ve OFFSET e controllare la resistenza degli elettrodi premendo Vm Electrode Test e Ve Electrode Test.
    3. Inserire gli elettrodi di corrente e tensione negli ovociti e osservare i potenziali di membrana negativi (in genere da -20 a -50 mV).
      NOTA: i misuratori Vm e Im dello stesso amplificatore dovrebbero visualizzare due valori identici o molto simili.
  6. Acquisizione dati
    1. Nella sezione Morsetto dell'amplificatore, verificare che D.C. GAIN sia in posizione IN , ruotare la manopola GAIN in senso orario a un livello che consenta un corretto morsetto di tensione (in genere da un terzo a metà dell'intero intervallo) e ruotare l'interruttore a morsetto da OFF a FAST.
      NOTA: all'accensione del morsetto, i misuratori Vm e Im visualizzeranno rispettivamente la tensione di mantenimento e la corrente di mantenimento. Sebbene la corrente di mantenimento possa variare leggermente a seconda delle condizioni degli ovociti, è generalmente piccola e stabile al mantenimento Vm (ad esempio, -30 mV).
    2. Eseguire un protocollo di acquisizione.
      NOTA: sullo schermo verranno visualizzate quattro tracce. Le tracce di tensione e corrente di un amplificatore indicano i passi Vm applicati all'ovocita #1 e la corrente necessaria per produrre i passi Vm , mentre quelli dell'altro amplificatore indicano la costante Vm (-30 mV) dell'ovocita #2, e la corrente iniettata per mantenere questa costante Vm. La corrente iniettata nell'ovocita #2 rappresenta l'Ij.

6. Analisi dei dati

  1. Analisi con Clampfit.
    1. Aprire un file abf registrato nel modulo Clampfit di pClamp.
    2. Utilizzare i cursori 1 e 2 per racchiudere un segmento della linea di base prima delle tracce Ij .
    3. Fare clic sull'icona Regola linea di base per visualizzare una finestra della linea di base. Selezionare Sottrai media dei cursori 1..2 per Metodo e verificare che Tutti i segnali visibili e Tutte le tracce visibili siano selezionati per Selezione traccia.
    4. Facendo clic su OK, la finestra Baseline si chiude, le linee di base di tutte le tracce di corrente e tensione convergono al livello zero. Si noti che i passi di tensione passano a nuovi livelli che sono uguali alla tensione originale meno la tensione di mantenimento (ad esempio, -30 mV).
    5. Per tracciare la relazione Ij e Vj usando lo stato stazionario Ij, racchiudere un segmento desiderato delle tracce Ij che rappresentano lo stato stazionario Ij con i cursori 1 e 2, posizionare il cursore 3 ovunque all'interno della finestra temporale dei passi di tensione.
    6. Vai su Analizza / Quick Graph / I-V per aprire una finestra I-V .
    7. In Asse X (tensione), selezionare Cursore 3 da Segnale, specificare il segnale del passo di tensione (ad esempio, Tensione 1) nel menu a discesa e selezionare la casella Inverti.
      NOTA: la casella Inverti è selezionata per convertire Vm in valori equivalenti a Vj, definito come Vm dell'ovocita #2-Vm dell'ovocita #1.
    8. In Asse Y (Corrente), selezionare la sorgente del segnale Ij (ad esempio, Corrente 0) dal menu a discesa accanto a Segnale, definire Regione come Cursori 1..2 dal menu a discesa e selezionare Media.
      NOTA: per tracciare le relazioni di picco Ij e Vj , i cursori 1 e 2 devono racchiudere il segmento di tracce Ij contenente il picco Ij nel passaggio 6.1.5 e selezionare Picco ( anziché Media) nel passaggio 6.1.8.
    9. Nell'opzione Destinazione selezionare Sostituisci o Aggiungi.
    10. Facendo clic su OK nella finestra I-V , sullo schermo viene visualizzata una relazione Ij - Vj e i valori Ij e Vj corrispondenti possono essere trovati facendo clic su Finestra/Risultato.
  2. Traccia e adatta la relazione Gj-V j in OriginPro (Tabella dei materiali)
    1. Copiare le due colonne contenenti i valori Vj e Ij dalla finestra Risultati di Clampfit (passaggio 6.1.10) in una nuova cartella di lavoro in Origin. Assicurarsi che i valori Vj e Ij siano rispettivamente sotto le colonne X e Y.
    2. Aggiungere quattro nuove colonne nella cartella di lavoro facendo clic su Colonna/Aggiungi nuove colonne.
    3. Denominare la prima nuova colonna come Gj, riempirla inserendo l'equazione "colonna Ij/colonna Vj * 1.000" nella finestra Imposta valori colonna e creare un grafico a dispersione della relazione Gj-V j.
      NOTA: La moltiplicazione per 1.000 (opzionale) serve ad evitare l'inconveniente di avere a che fare con numeri molto piccoli nei passaggi successivi.
    4. Adatta i punti dati Gj sugli intervalli Vj negativi e positivi indipendentemente dalla funzione di Boltzmann. Calcola Gj a Vj = 0 mV inserendo i valori Gjmax, Gjmin, A e V0 dal raccordo nell'equazione di Boltzmann, che può essere fatto in un foglio di calcolo. Il Gj così ottenuto sarà usato come Gjmax nella fase successiva.
      NOTA: L'equazione per adattarsi alla funzione di Boltzmann è: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, in cui V0 è la Vj a cui la conduttanza è semi-massimale, Gjmax è la conduttanza massimale, Gjmin è la Vj-insensibile conduttanza residua23. Per eseguire il raccordo, aggiungete innanzitutto l'equazione di Boltzmann come nuova funzione di raccordo in OriginPro, quindi selezionate questa funzione per il raccordo. Immettete valori di inizializzazione approssimativi per Gjmax, Gjmin, V0 e A prima di eseguire la funzione di raccordo. Assicurarsi che il parametro Gjmax non sia fisso per questo raccordo.
    5. Denominate la seconda e la terza nuova colonna come nGj-L e nGj-R ("n" per "normalizzato") e riempitele dividendo la colonna Gj per i valori Gjmax derivati rispettivamente dalle curve Gj - Vj sinistra e destra (passo 6.2.4).
    6. Denominare la quarta nuova colonna come nGj-LR e riempirla copiando i valori dagli intervalli Vj negativo e positivo delle colonne nGj-L e nGj-R, rispettivamente.
    7. Create un grafico a dispersione per nGj-LR su Vj e adattate i punti dati sugli intervalli Vj negativo e positivo alla funzione di Boltzmann in modo indipendente. Assicuratevi che il parametro Gjmax sia fissato a 1.0 per il raccordo.
    8. Tenere traccia dei risultati del raccordo (ad esempio, il grafico adattato e i valori Gjmin, V0 e A ).

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Representative Results

UNC-7 e UNC-9 sono innexins di C. elegans. Mentre UNC-9 ha una sola isoforma, UNC-7 ha più isoforme che differiscono principalmente per la lunghezza e la sequenza amminoacidica dei loro terminali amminici 7,8. Queste annessine possono formare GJ omotipici ed eterotipici (di UNC-7 e UNC-9) quando espressi negli ovociti di Xenopus 7,8. Le tracce rappresentative Ij e le conseguenti relazioni normalizzate Gj-V j dei PJ omotipici UNC-7b e UNC-9 sono mostrate nella Figura 3. In questi esperimenti con ovociti accoppiati, Vm di Ovocyte 1 sono stati bloccati a livelli diversi dalla tensione di tenuta (-30 mV), mentre quello di Oocyte 2 è stato mantenuto costante a -30 mV per monitorare l'Ij. I risultati mostrano che questi due tipi di GJ differiscono nel tasso di inattivazione Vj-dipendente Ij, nella dipendenza Vj (indicata dalla pendenza della curva Gj-V j) e nella quantità del residuo Gj j. Molti altri esempi di PJ UNC-7 e UNC-9, tra cui i PJ rettificativi, possono essere trovati nella nostra recente pubblicazione7.

Figure 1
Figura 1: Camera di accoppiamento degli ovociti e configurazione dell'amplificatore. (A) Pannello frontale dell'amplificatore a morsetto per ovociti OC-725C. (B) Un interruttore DIP all'interno dell'amplificatore configurato per la misurazione della corrente laterale elevata. Tutti gli interruttori a levetta tranne 2, 5 e 7 sono in posizione OFF per utilizzare l'amplificatore nella modalità di misurazione della corrente laterale alta. (C) Una sonda VDIFF con la presa rossa (per l'ingresso VDIFF ) e la presa nera (per la messa a terra del circuito) non collegate o collegate. La sonda può essere utilizzata per la modalità di morsetto di tensione standard quando le due prese sono collegate. (D) Una camera di accoppiamento degli ovociti. (E) Una cella modello con connessioni per testare il sistema di acquisizione con l'amplificatore nella modalità di misurazione della corrente laterale alta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Configurazione di ovociti ed elettrodi. (A) La fase di registrazione. Il foro circolare ha un diametro di 36 mm. (B) Diagramma che mostra le posizioni dei vari elettrodi. (C) Disposizione effettiva dei vari elettrodi. (D) Due elettrodi VDIFF con i loro supporti e cavi di collegamento bloccati sullo stadio di registrazione da due diversi morsetti magnetici, tra cui un supporto magnetico Agar Bridge modificato (Tabella dei materiali) (in alto) e un morsetto per tubi (Tabella dei materiali) (in basso). Il primo è più stabile nel mantenere la posizione dell'elettrodo a causa della sua base magnetica più grande, ma richiede modifiche. Le micropipette di vetro vengono ruotate di 90° dalle loro posizioni operative per mostrare gli angoli di curvatura. (E) Una vista ravvicinata di una coppia di ovociti e degli elettrodi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Tracce di registrazione rappresentative. (A) Diagramma che mostra l'esperimento sugli ovociti. I passi di tensione di membrana negativa e positiva (Vm) vengono applicati all'ovocita 1 da un Vm di -30 mV mentre l'ovocita 2 è mantenuto a una Vm costante di -30 mV. La tensione transgiuntiva (Vj) è definita come Vm dell'ovocita 2 -Vm dell'ovocita 1. (B). Tracce del campione Ij e della risultante relazione normalizzata di conduttanza giunzionale (Gj) -Vj delle giunzioni gap omotipiche UNC-9. (C) Tracce del campione Ij e della risultante relazione Gj-V j normalizzata delle giunzioni gap omotipiche UNC-7b. Le relazioni Gj-V j sono regolate da una funzione di Boltzmann (linee rosse). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Passo No. Calore Tirare Velocità Ore
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
Fare riferimento al manuale dell'utente sul sito Web del produttore per le definizioni dei parametri di trazione (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Tabella 1: Parametri di trazione degli elettrodi. Questi parametri si basano su capillari di vetro a parete sottile (Table of Materials) e una temperatura di rampa di 258 a un estrattore di micropipette P-97 (Table of Materials). Devono essere regolati in base alla temperatura della rampa per questo vetro sull'estrattore. Ad esempio, se la temperatura della rampa sull'estrattore è superiore di 20°, aggiungere 20° a ciascun gradino e apportare le regolazioni necessarie. Generalmente, la dimensione della punta può essere ottimizzata regolando la velocità dell'ultimo passaggio. Fare riferimento al manuale dell'utente sul sito Web del produttore per i significati dei parametri di trazione (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

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Discussion

L'ottimizzazione del sistema sembra essere necessaria per gli esperimenti a doppio morsetto di tensione degli ovociti. Senza di esso, le registrazioni possono essere altamente instabili e gli amplificatori potrebbero dover iniettare una quantità eccessiva di corrente per raggiungere il Vm target, con conseguente danno agli ovociti e guasti di registrazione. Diversi fattori sono fondamentali per ottenere registrazioni stabili di doppi ovociti con il metodo di misurazione della corrente laterale elevata. Innanzitutto, gli elettrodi di corrente e tensione devono avere una resistenza appropriata (~ 1 MΩ) e i loro supporti devono essere puliti. In secondo luogo, gli elettrodi VDIFF devono avere una bassa resistenza (<150 kΩ) ed essere vicini agli ovociti. In terzo luogo, tutti gli elettrodi per lo stesso ovocita (tensione, corrente e VDIFF) devono essere posizionati sullo stesso lato (sinistro o destro) e l'ordine degli elettrodi (da dietro a davanti) deve essere corrente, tensione e VDIFF. Infine, l'elettrodo di riferimento deve essere posizionato vicino al bordo della capsula di Petri da 35 mm verso l'utente.

Abbiamo modificato alcune procedure consigliate dal produttore e apportato alcuni altri miglioramenti. Tra questi ci sono: 1) micropipette riempite con ND96 invece di ponti di agar caricati con KCl per fungere da elettrodi VDIFF . Gli elettrodi di vetro sono facili da costruire, riutilizzabili e non dannosi per gli ovociti; 2) un elettrodo KCl a bassa dispersione come elettrodo di riferimento. Questo elettrodo ha una bassa resistenza (~2,7 kΩ) e un potenziale stabile, e perde poco elettroliti (~5,7 x 10-8 mL/h); 3) una piattaforma di registrazione progettata e costruita su misura che consente un posizionamento stabile, comodo e preciso degli ovociti e dei vari elettrodi. Questo stadio fornisce anche un ampio accesso a uno stereomicroscopio, una luce a fibra con doppio collo d'oca e i quattro supporti magnetici utilizzati per montare e posizionare gli elettrodi di corrente e tensione; e 4) fabbricazione di elettrodi di corrente e tensione da un tipo di capillari di vetro a parete sottile. Questi elettrodi hanno la resistenza della punta desiderata (0,5-1,4 MΩ), possono penetrare molto facilmente nella membrana cellulare degli ovociti e causare danni minimi agli ovociti.

Occasionalmente, il sistema di registrazione non funziona correttamente, come indicato da una corrente di tenuta insolitamente grande o in continuo aumento, dallo sviluppo di una macchia bianca nella membrana cellulare attorno all'elettrodo corrente e da tracce di Vm instabili in risposta ai comandi di tensione. Le possibili cause sono 1) un sistema di elettrodi VDIFF ha una piccola bolla d'aria o la punta dell'elettrodo VDIFF non è puntata correttamente verso l'ovocita; 2) un elettrodo di tensione o corrente ha un'elevata resistenza (ad es. >2 MΩ) o il suo supporto è sporco dal deposito di sale; 3) il filo di collegamento per un elettrodo VDIFF è rotto; 4) il guadagno D.C. non è impostato su IN durante il morsetto di tensione.

Qui abbiamo descritto un metodo per registrare ij dagli ovociti di Xenopus . Permette un morsetto di tensione stabile di due ovociti opposti. Questo metodo è facile da implementare e sembra non avere limitazioni evidenti per l'analisi delle proprietà biofisiche dei PJ. Tuttavia, non siamo in grado di dire come si confronta con altri metodi pubblicati. Speriamo che i laboratori che sono recentemente interessati a impostare la tecnica del doppio morsetto di tensione degli ovociti trovino questo metodo degno di considerazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Acknowledgments

Ringraziamo Haiying Zhan, Qian Ge per il loro coinvolgimento nella fase iniziale dello sviluppo tecnico, Kiranmayi Vedantham per l'aiuto con le figure e il Dr. Camillo Peracchia per consigli sulla camera di accoppiamento degli ovociti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

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References

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Biologia Numero 179 giunzione gap innexin Caenorhabditis elegans C. elegans ovociti Xenopus corrente giunzionale morsetto di tensione
Registrazione della corrente di giunzione gap dagli <em>ovociti xenopus</em>
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Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

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