Summary
ここでは、 アフリカツメガエル 卵母細胞でギャップ接合タンパク質を発現させ、ハイサイド電流測定モードでのデュアル卵母細胞電圧クランプ記録用に設計された商用アンプを使用して、2つのアポーズ卵母細胞間の接合電流を記録するプロトコルを紹介します。
Abstract
アフリカツメガエル卵母細胞におけるコネキシンおよびイネキシンの異種発現は、ギャップ接合部(GJ)の生物物理学的特性を研究するための強力なアプローチである。しかし、このアプローチは、共通のグランドを共有する2つの対向する卵母細胞の差動電圧クランプを必要とするため、技術的に困難です。少数の研究室がこの技術の実行に成功しましたが、本質的にそれらのすべては、単一の卵母細胞記録用に設計された自家製のアンプまたは市販のアンプのいずれかを使用しています。他のラボでは、この手法を実装することが困難な場合がよくあります。ハイサイド電流測定モードは、デュアル卵母細胞電圧クランプ記録用の商用アンプに組み込まれていますが、最近の研究までその適用に関する報告はありませんでした。我々は、卵母細胞および様々な電極の正確な配置を可能にする磁気ベースの記録プラットフォームの構築、電圧差動電極の導体としての浴液の使用、参照電極としての市販の低リークKCl電極の採用など、いくつかの技術的修正を導入することにより、ハイサイド電流測定アプローチをより実用的かつ便利にしました。 薄肉ガラスキャピラリーからの電流電極および電圧電極の作製、および磁気ベースのデバイスを使用したすべての電極の位置決め。ここで説明する方法は、2つの対向するアフリカツメガエル卵母細胞間の接合電流(Ij)の便利で堅牢な記録を可能にする。
Introduction
GJは、隣接する細胞間の小さな細胞質ゾル分子の電流の流れおよび交換を可能にし得る細胞間チャネルである。それらは多くの細胞型に存在し、多様な生理学的機能を果たす。脊椎動物のGJはコネキシンによって形成されるが、無脊椎動物のGJはイネキシンによって形成される。各GJは、コネキシンまたはイネキシン1,2,3であるかどうかに応じて、ヘミチャネルあたり6または8のサブユニットを有する2つの並置されたヘミチャネルからなる。ヒトは21のコネキシン遺伝子4を有し、一般的に使用される無脊椎動物モデルC. elegansおよびショウジョウバエメラノガスターは、それぞれ25および8個のイネキシン遺伝子を有する5,6を有する。遺伝子転写産物の選択的スプライシングは、少なくともイネキシン7、8について、GJタンパク質の多様性をさらに増加させ得る。
GJは、分子組成に基づいて、ホモタイプ、ヘテロタイプ、およびヘテロメリックの3つのカテゴリに分けることができる。ホモタイプGJは、そのすべてのサブユニットが同一である。ヘテロタイプGJは2つのホモマーヘミチャネルを有するが、2つのヘミチャネルは2つの異なるGJタンパク質によって形成される。ヘテロマーGJは、少なくとも1つのヘテロメリックヘミチャネルを含有する。GJの分子の多様性は、その生理学的機能にとって重要な明確な生物物理学的特性を付与する可能性がある。GJの生物物理学的特性もまた、調節タンパク質9によって調節される。GJが生理学的機能をどのように果たすかを理解するためには、GJの分子組成、生物物理学的特性、およびその機能における調節タンパク質の役割を知ることが重要です。
異種発現系は、GJを含むイオンチャネルの生物物理学的特性、およびそれらに対する調節タンパク質の影響を研究するためにしばしば使用される。異種発現系は特定のタンパク質の発現を可能にするため、冗長な機能を有するタンパク質が分析を複雑にする可能性があり、Ijの記録が達成不可能である可能性がある天然組織よりも、タンパク質機能を解剖するのに一般的に適している。残念なことに、Neuro-2A細胞を除いて最も一般的に使用される細胞株は、内因性コネキシンによる合併症のためにGJ生物物理学的特性を研究するのには不適切である。Neuro-2A細胞でさえ、この種の分析に必ずしも適しているとは限りません。例えば、C. elegans 9,10におけるUNC-9 GJの機能に必要なUNC-1(未発表)の非存在下または存在下で、イネキシンUNC-7およびUNC-9を導入したNeuro-2A細胞において、いかなるIjも検出できなかった。一方、アフリカツメガエル卵母細胞は、GJの電気生理学的分析のための有用な代替システムである。それらは内因性GJタンパク質、コネキシン38(Cx38)11を発現するが、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチド12を注射することによって潜在的な合併症を容易に回避することができる。しかし、アフリカツメガエル卵母細胞を用いたGJの分析には、並置された2つの細胞の差動電圧クランプが必要であり、これは技術的に困難である。カエルの割球の二重電圧クランプの最も初期の成功は、約40年前に報告されました13,14.それ以来、多くの研究がこの技術を使用して、対をなすアフリカツメガエル卵母細胞でIjを記録してきました。しかしながら、本質的に以前の研究はすべて、自家製アンプ12,15,16または単一の卵母細胞上の記録用に設計された市販のアンプ(GeneClamp 500、AxoClamp 2A、またはAxoClamp 2B、Axon Instruments、ユニオンシティ、カリフォルニア州)8,17,18,19,20のいずれかを用いて実施されている。.市販のアンプでさえ二重卵母細胞電圧クランプの指示を提供していないため、新しい、またはそれほど洗練されていない電気生理学的ラボがこの技術を実装することはしばしば困難です。
ダブル卵母細胞電圧クランプ用に開発された商用アンプは、ワーナーインスツルメンツのOC-725C(材料表、図1A)のみです。このアンプは、電圧プローブの2つのソケットが接続されているかどうかに応じて、標準モード(単一卵母細胞の場合)またはハイサイド電流測定モード(単一または二重卵母細胞の場合)のいずれかで使用できます(図1B、C)。しかし、私たちの最近の研究7まで、ハイサイド電流測定モードでのこのアンプの使用を記述した出版物は1つもありませんでした。このアンプは、二重卵母細胞記録のために別の研究室によって使用されてきたが、ハイサイドモード21、22ではなく標準で使用された。このハイサイド電流測定モードでアンプを使用したレポートの欠如は、技術的な問題によるものかもしれません。製造元の指示に従って、ハイサイドモードを使用して安定した二重卵母細胞記録を得ることができませんでした。長年にわたり、デュアル卵母細胞記録には、ハイサイド電流測定モードで2つのOC-725Cアンプ、標準モードで2つのOC-725Cアンプ、および別のメーカーの2つのアンプを使用するなど、3つの異なるアプローチを試してきました。結局、長い試行錯誤の末、最初のアプローチで安定した録音を得ることに成功しました。この出版物は、アフリカツメガエル卵母細胞でGJタンパク質を発現し、ハイサイド電流測定モードを使用してIjを記録し、一般的な市販ソフトウェアを使用して電気生理学的データを分析するために使用する手順を説明および実証します。二重電圧クランプ技術に関する追加情報は、他の刊行物19、23に見出すことができる。
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Protocol
手術は、コネチカット大学医学部の施設動物ケア委員会によって承認されたプロトコルに従って行われます。
1.カエルの手術と脱濾胞卵母細胞の準備
- 大人の雌のアフリカ爪のカエル(アフリカツメガエルのlaevis)(材料表)を冷たい(氷入り)トリカイン溶液(〜300mg / L)に浸して麻酔します。
- カエルがウェッブ付きの足を絞ることにほとんどまたはまったく反応を示さなくなるまで(〜15分)待ちます。カエルを手術台に置き、腹を上に向けて置きます。
- 左腹部または右下腹部のいずれかに縦切開(長さ8〜10mm)した後、一対の鉗子で卵巣組織の小片を静かに引き出し、一対の小さなはさみで卵巣組織を切断する。
- 直ちに遊離卵巣組織をCa2+遊離ND96溶液(NaCl 99 mM、KCl 2 mM、MgCl2 1 mM、HEPES5 mM、pH 7.5)に60mmペトリ皿の中に浸す。
- 5-0のシルク縫合糸(材料表)を使用して単純な中断された縫合糸によって切開を閉じた後、回復のためにカエルを浅い水タンクに戻す。
注:切開部は、まず腹膜層と筋肉層、次に皮膚層の2段階で閉じられます。各カエルは、2回の連続した手術の間に少なくとも4週間の間隔で5回の手術を受けます。 - 単離した卵巣組織を、20mgのコラゲナーゼ(材料表)および20mgのヒアルロニダーゼ(材料表)を含む10mLのCa2+フリーND96溶液を含む50mL遠沈管に移す。
- すべての卵母細胞が単離(孤独)になるまで、室温(RT)でオービタルシェーカーでチューブを振る。
- その後、ガラスパスツールピペットを使用して30〜50個の卵母細胞をシャーレに移し、実体顕微鏡(≥25倍の最高倍率倍率)下で卵母細胞を頻繁に検査して、それらが脱濾胞されているかどうかを判断します。
注:パスツールピペットは、ダイヤモンドスクライバー(材料表)を使用して、より広い先端開口部に「切断」し、刃先を滑らかにするために火をつける必要があります。 - 卵母細胞の70%〜80%が脱卵されたらすぐに、チューブを静かに傾けて酵素溶液をデカントする。ND96溶液(NaCl 96 mM、KCl 2 mM、CaCl 2 1.8 mM、MgCl2 1 mM、HEPES 5 mM、pH 7.5)でチューブを充填し、溶液をデカントすることによって卵母細胞を5回洗浄する。
- 最終洗浄後、卵母細胞をND96溶液を含む60mmシャーレに移す。大きくて健康に見える卵母細胞を選んで、ピルビン酸ナトリウム(2 mM)とペニシリン - ストレプトマイシン(100 U / mL)を添加したND96溶液を含む60 mmペトリ皿に、清潔なガラスパスツールピペットを使用します。
注:「大きくて健康に見える卵母細胞」は、酵素による過剰消化の兆候を示さないステージVおよびVIの卵母細胞である。 - 摘み取った卵母細胞を含むシャーレを環境チャンバー(15〜18°C)内に置く。
2. GJタンパク質発現
- 特定のコネキシンまたはイネキシンの相補的RNA(cRNA)を、製造元のプロトコールに従ってRNA転写キット(材料表)を使用してin vitroで合成する。
- RNA転写キットのユーザーマニュアルに記載されている塩化リチウム法を用いてcRNAを沈殿させる。
- ペレットを70%エタノールで洗浄し、20 μLのヌクレアーゼフリーH2Oに溶解し、1 μLのリボヌクレアーゼ阻害剤を加える(40 U、 材料表)。
- 分光光度計を用いてcRNAの濃度を測定する(材料表)。
- 最終濃度が200~1,000 ng/μL cRNAおよび100 ng/μLオリゴとなるように、cRNAをCx38アンチセンスオリゴと混合する。
注:オリゴ配列は5'-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3'であり、これは アフリカツメガエル Cx38 mRNA(NCBIアクセッション:NM_001088018)11における-5から+25までのヌクレオチドに対応する。オリゴは、cRNAと混合される前にストック溶液(2.0mg/mL)として保持される。 - 微量遠心機(約16,000 x g)で2分間回転させてcRNA中の粒子を除去し、ピペッティングによって上清全体を新しいチューブに素早く移します(微量遠心チューブの底を乱さないでください)。
- cRNAをアリコート(2.5 μL/バイアル)に分割し、-80°Cの冷凍庫に保存します。
- クイックキュアエポキシ接着剤を使用して、ナイロンメッシュ(材料表)の小片(〜1cm x 1cm)を35mmペトリ皿の底に接着することによって卵母細胞注入皿を準備する。
注:卵母細胞注射皿は再利用可能です。使用後は70%エタノールで洗ってください。 - 卵母細胞注射皿をND96溶液(ピルビン酸およびペニシリン - ストレプトマイシンを補充)でほぼ半分に充填する。
- 25〜30個の卵母細胞をペトリ皿の内側に並べる。
- 卵母細胞注射用のガラスマイクロピペットを準備するには、自動ナノリットルインジェクターのユーザーマニュアル(材料表)の指示に従ってください。
注:微小電極ベベラー(材料表)を使用すると、卵母細胞への損傷を最小限に抑えるシャープな注入マイクロピペットの製造に役立ちます。 - 注射用マイクロピペットに軽量鉱物油をバックフィルし、インジェクターのマイクロピペットホルダーに挿入します。
- 保存されたアリコートの1つから、ピペッティングによってシャーレカバーまたは底部の内面にcRNAを移す。
- インジェクターコントローラーのFILLボタンを押して、cRNA液滴をマイクロピペットの先端に吸引します。
- INJECTボタンを押してcRNA(~50nL/卵母細胞)を 注入 します。
メモ:注入量は、インジェクタコントローラのディップスイッチで設定できます。 - 注入した卵母細胞をND96溶液(ピルビン酸およびペニシリン - ストレプトマイシンを補充)を含む新しいペトリ皿に移し、それらを環境チャンバー(15〜18°C)内に1〜3日間保持する(GJタンパク質発現速度およびレベルに依存する)。卵母細胞を新しいペトリ皿に移すことによって、毎日溶液を交換する。
3. 卵母細胞ペアリング
- 注入した卵母細胞のいくつかをND96溶液を含む35mmペトリ皿に移す。
- 2本の細かいピンセット(材料表)を使用して、卵母細胞を包む透明なビテリン膜を優しく剥がします。
メモ:ピンセットチップは、最初の使用前に、場合によっては細かい(600グリット)サンドペーパーを使用してシャープにする必要がある場合があります。 - ND96溶液(ピルビン酸およびペニシリン - ストレプトマイシンを補充)を含む卵母細胞対形成チャンバー(図1D)にウェルあたり2個の卵母細胞を置く。
注:卵母細胞ペアリングチャンバは、クイックキュアエポキシ接着剤を使用して、マイクロウェルミニトレイ(材料表)の小片を35mmシャーレ(材料表)の底に接着することによって構築される。ミニトレイは、ホットワイヤーカッター(材料表)を使用して小片に切断されます。卵母細胞のペアリングのためのミニトレイの使用は、もともと他の人によって説明されていました24。GJタンパク質は、その細胞質ゾルドメイン25内のアミノ酸残基の電荷特性に依存して卵母細胞膜中に不均一に分布するかもしれないが、ランダム対形成(卵母細胞の動物極と植物極を区別せずに)は一般に十分であるように思われる。 - 対をなす卵母細胞を含むペトリ皿を、電気生理学的記録に使用する隔離テーブル上のRTに保管してください。
注: ペアリングの所要時間は数時間から 1 日までさまざまです。便利な練習は、午後遅くに卵母細胞をペアにし、翌日にそれらから記録することです。
4. 取得体制整備
- 内部ディップスイッチを調整して、2つのOC-725C卵母細胞クランプアンプ(材料表)をハイサイド電流測定モードに設定します(図1B)。
- アンプを接地するには、まず背面パネルの接地回路ソケットを接続し、次にファラデーケージと記録チャンバの照明に使用するファイバーライトに接続します。
- アンプをA/D信号変換器(材料表)に接続し、アンプメーカーの指示に従ってpClampソフトウェア(材料表)のClampexモジュールで構成します。
- アンプに付属のモデルセルで集録システムをテストします。
- V DIFFプローブと電流(I)ケーブルをモデルセルに接続し、VDIFFプローブの赤と黒のソケットを付属のジャンパに接続し、ジャンパのどちらかの脚をモデルセルのどちらかのピンに接続し、モデルセルのアース線をアンプのGROUNDS CIRCUITソケットからのケーブルに接続します(図1E)。
- Vm OFFSETノブとVe OFFSETノブをそれぞれ回してアンプの電圧電極(Vm)とバス電極(Im)メーターをゼロにし、クランプをOFFからFastまたはSLOWに切り替え、GAINダイヤルを時計回りに適切な電圧クランプができるレベルにします(図1A)。D.C. GAIN スイッチは、OUT または IN の位置のいずれかにあります。
- いくつかの電圧ステップを含む簡単な集録プロトコルを実行して、Vmメータに表示される電圧が集録プロトコルに従って変化し、電圧と電流のトレースがClampexに正しく表示されることを確認します。
メモ: この方法を使用して毎回テストできるアンプは 1 つだけです。
5. 対をなす卵母細胞間の Ij の記録
- pClampソフトウェア にIj を記録するための集録プロトコルを作成します。
メモ: 2 つの集録プロトコルを作成します。そのうちの1つにおいて、増幅器#1は、一連の膜電圧(Vm)ステップ(例えば、10−mV間隔で−150〜+90mV)を生成するために使用され、一方、増幅器#2は、一定のVm(例えば、−30mV)を維持するために使用される。他のプロトコルでは、増幅器#2はVmステップを生成するために使用され、一方、増幅器#1は一定のVmを維持するために使用される。正と負のVmステップは、集録プロトコルのユーザリスト機能を使用してClampexでプログラムできる、交互に(たとえば、-150、+90、-140、+80......)適用する必要があります。 - 録音ステージの設定
- ペアの卵母細胞を含む1つのペトリ皿を、記録プラットフォームのペトリ皿レセプタクルにドロップします(図2A)
- 一対の卵母細胞を選択し、必要に応じて2つの卵母細胞が左右方向になるようにシャーレを回転させ、その磁気ベースによってステージを所定の位置にロックする。
- 電流プローブと電圧プローブを保持している磁気スタンドを絶縁テーブルの適切な位置に固定します。
メモ:一方のアンプからの電流プローブと電圧プローブが左側にあり、他方のアンプからの電流プローブが右側にあり、電圧プローブが両側の電流プローブの前にあることを確認してください(図2B、C)。
- 参照電極のセットアップ
- 参照電極(材料表)をペトリ皿の端付近にユーザー側に向けて配置します(図2B、C)。
- 参照電極を、2つの VDIFF プローブのうちの1つだけの黒いソケット(回路グランド)に接続します。
- VDIFF電極のセットアップ
- ガラス製のマイクロピペットを引っ張り、ダイヤモンドスクライバー(材料表)で先端を少し切り落とし、ファイヤーポリッシングで先端の端を滑らかにします。
メモ:チップ抵抗は150kΩ未満にする必要があります(ピペットのND96で測定)。通常、チップ抵抗が20~150kΩのマイクロピペットが使用されます。 - マイクロピペットをアルコールバーナーの炎の上にかざして、先端から約1cm離れた位置で滑らかな角度(約130°)に曲げます。
注:製造されたマイクロピペットは再利用可能です。使用するたびに水ですすいでください。 - ガラスピペットをND96溶液で完全にバックフィルし、プレフィルド(ND96付き)マイクロ電極ホルダー(材料表、 図2D)に挿入し、システムに気泡が存在しないことを確認します。
- マイクロ電極ホルダーの2mmピンを VDIFF 電極接続ワイヤの2mmソケットに挿入します(図2D)。
- 磁気ベースのクランプで2mmソケットをクランプし(図2D)、 VDIFF 電極の先端を2つの卵母細胞のうちの1つに向けてください(図2E)。
メモ:電極の先端が卵母細胞に非常に近くなるようにクランプの位置と角度を調整します - V DIFF電極接続ワイヤの1mmピンを、同じ側のV DIFFプローブの赤いソケット(VDIFF入力)に挿入します。
- 同様の手順に従って、他の卵母細胞および増幅器用の VDIFF 電極を準備して接続する。
注:一対の卵母細胞およびすべての電極のクローズアップ図を 図2Eに示す。
- ガラス製のマイクロピペットを引っ張り、ダイヤモンドスクライバー(材料表)で先端を少し切り落とし、ファイヤーポリッシングで先端の端を滑らかにします。
- 電流電極と電圧電極のセットアップ
- ガラスキャピラリーから電圧電極と電流電極を準備し、KCl溶液(KCl 3.0 M、EGTA 10 mM、HEPES 10 mM、KOHでpH 7.4)でそれらをバックフィルし、アンプを備えた電極ホルダーに挿入します。
注:電極の抵抗は~1MΩでなければなりません。適切な電極は、特定の引っ張りパラメータのセット(表1)を使用して、一種の薄肉ガラス毛細血管(材料表)から得ることができる。このようなチップは、アンプのVmまたはVe BUZZボタンを押すことなく、卵母細胞膜に容易に浸透することができる。 - 電極を浴液に下ろし、Vm OFFSETダイヤルとVe OFFSETダイヤルを回してVmとImメーターをゼロにし、Vm電極テストとVe電極テストを押して電極抵抗を確認します。
- 電流電極と電圧電極を卵母細胞に挿入し、負の膜電位(通常-20~-50mV)を観察します。
メモ:同じアンプのVmメーターとImメーターには、2つの同一または非常によく似た値が表示されます。
- ガラスキャピラリーから電圧電極と電流電極を準備し、KCl溶液(KCl 3.0 M、EGTA 10 mM、HEPES 10 mM、KOHでpH 7.4)でそれらをバックフィルし、アンプを備えた電極ホルダーに挿入します。
- データ集録
- アンプのクランプセクションで、D.C. GAINがIN位置にあることを確認し、GAINノブを時計回りに適切な電圧クランプができるレベル(通常は全範囲の3分の1から半分)に回し、クランプスイッチをOFFからFASTに回します。
メモ:クランプをオンにすると、VmメーターとImメーターにそれぞれ保持電圧と保持電流が表示されます。保持電流は卵母細胞の状態によって多少変動し得るが、一般に保持Vm(例えば-30mV)では小さく安定である。 - 取得プロトコルを実行します。
メモ: 画面に 4 つのトレースが表示されます。一方のアンプからの電圧および電流トレースは、卵母細胞#1に印加されるVmステップおよびVmステップを生成するために必要な電流を示し、他方のアンプからのトレースは、卵母細胞#2の定数Vm(-30mV)およびこの一定のVmを維持するために注入された電流を示す。 卵母細胞#2に注入された電流は、Ijを表す。
- アンプのクランプセクションで、D.C. GAINがIN位置にあることを確認し、GAINノブを時計回りに適切な電圧クランプができるレベル(通常は全範囲の3分の1から半分)に回し、クランプスイッチをOFFからFASTに回します。
6. データ解析
- クランプフィットによる解析。
- pClampのクランプフィットモジュールで記録された abf ファイルを開きます。
- カーソル 1 および 2 を使用して、ベースラインのセグメントを Ij トレースの前に囲みます。
- 「 ベースラインを調整」 アイコンをクリックして、「ベースライン」ウィンドウを表示します。「方法」で「 カーソルの平均を減算 1..2 」を選択し、「トレース選択」で「 すべての可視信号 」および 「すべての可視トレース」 が選択されていることを確認します。
- 「 OK」をクリックすると、「ベースライン」ウィンドウが閉じ、すべての電流トレースと電圧トレースのベースラインがゼロレベルで収束します。電圧ステップは、元の電圧から保持電圧を引いた値(-30mVなど)に等しい新しいレベルに変化することに注意してください。
- 定常状態Ijを用いてIjとVjの関係をプロットするには、定常状態Ijを表すIjトレースの所望のセグメントをカーソル1及び2で囲み、電圧ステップの時間窓内の任意の場所にカーソル3を配置する。
- 分析/クイックグラフ/ I-Vに移動してI-Vウィンドウを開きます。
- X軸(電圧)で、信号からカーソル3を選択し、ドロップダウンメニューで電圧ステップ信号(電圧1など)を指定し、反転チェックボックスをオンにします。
メモ: V m を Vj と同等の値に変換するには、[反転] ボックスがオンになっています。これは、卵母細胞 #2 の V m から 1 の Vm として定義されます。 - Y軸(電流)で、「信号」の横にあるドロップダウンメニューからIj信号のソース(例えば、現在の0)を選択し、ドロップダウンメニューから「領域」をカーソル1..2として定義し、「平均」を選択します。
注: ピーク I j と Vj の関係をプロットするには、ステップ 6.1.5 でカーソル 1 と 2 でピーク Ij を含む Ij トレースのセグメントを囲み、ステップ 6.1.8 で (平均ではなく) ピークを選択する必要があります。 - [デスティネーション オプション] で、[置換] または [追加] を選択します。
- I-V ウィンドウで [OK] をクリックすると、I j - V j の関係が画面に表示され、対応する I j 値と V j 値が [ウィンドウ/結果] をクリックすると表示されます。
- OriginProにおけるGj-V j関係のプロットと適合(材料表)
- Vj 値と Ij 値を含む 2 つの列を Clampfit の「結果」ウィンドウから Origin の新しいワークブックにコピーします (ステップ 6.1.10)。V j 値と Ij 値がそれぞれ X 列と Y 列の下にあることを確認します。
- ブックに 4 つの新しい列を追加するには、[ 列] / [新しい列の追加] をクリックします。
- 最初の新しい列に G j という名前を付け、[列の値の設定] ウィンドウに "列 I j/列 V j * 1,000" という式を入力して入力し、G j-V j 関係の散布図を作成します。
注: 1,000 (オプション) による乗算は、後続のステップで非常に小さい数値を処理する不便さを回避するためです。 - 負と正のVj範囲にわたるGjデータ点をボルツマン関数に独立して適合させます。フィッティングから Gjmax、G jmin、A、および V 0 の値を Boltzmann 方程式に入力して、V j = 0 mV で G j を計算します。これはスプレッドシートで実行できます。このようにして得られたGjは、次のステップでGjmaxとして使用されることになる。
注: ボルツマン関数に適合する式は、G j = (G jmax-G jmin)/{1 + exp[A(V j-V 0)]} + G jmin、ここで V0 はコンダクタンスが半最大である Vj であり、G jmax は最大コンダクタンスであり、 Gjmin は V j-非センシティブである残留コンダクタンス23。継ぎ手を実行するには、まずボルツマン方程式を新しい継ぎ手関数として OriginPro に追加し、次にこの関数を継ぎ手として選択します。継ぎ手関数を実行する前に、G jmax、G jmin、V0、および A のシード近似値を入力します。この継ぎ手の Gjmax パラメータが固定されていないことを確認します。 - 2 番目と 3 番目の新しい列に nGj-L および nGj-R という名前を付け ("正規化" を意味する "n")、G j 列を左右の G j - V j 曲線からそれぞれ派生した G jmax 値で割って塗りつぶします (ステップ 6.2.4)。
- 4 番目の新しい列に nGj-LR という名前を付け、nGj-L 列と nGj-R 列の負と正の Vj 範囲からそれぞれ値をコピーして入力します。
- Vj 上の nGj-LR の散布図を作成し、負と正の Vj 範囲のデータ点をボルツマン関数に独立して適合させます。継ぎ手の Gjmax パラメータが 1.0 に固定されていることを確認します。
- フィッティング結果の記録を保持します(たとえば、適合グラフとGjmin、V0、およびA値)。
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Representative Results
UNC-7およびUNC-9はC. elegansのイネキシンである。UNC−9は1つのアイソフォームしか有さないが、UNC−7は、それらのアミノ末端7、8の長さおよびアミノ酸配列において主に異なる複数のアイソフォームを有する。これらのイネキシンは、アフリカツメガエル卵母細胞7、8で発現される場合、ホモタイプおよびヘテロタイプの(UNC−7およびUNC−9の)GJを形成し得る。UNC−7bおよびUNC−9ホモタイプGJsの代表的なIjトレースおよび得られた正規化されたGj−Vj関係を図3に示す。対をなす卵母細胞を用いたこれらの実験では、卵母細胞1のVmを保持電圧(-30mV)とは異なるレベルにクランプし、一方、卵母細胞2のVmは-30mVで一定に保ってIjをモニターした。この結果は、これら2種類のGJが、Vj依存性Ij不活化率、Vj依存性(Gj−Vj曲線の傾きで示す)、および残留 Gjの量において異なることを示している。GJの修正を含むUNC-7およびUNC-9 GJの他の多くの例は、最近の出版物7に見られるかもしれません。
図1:卵母細胞ペアリングチャンバとアンプのセットアップ(A)卵母細胞クランプアンプOC-725Cのフロントパネル。(B) ハイサイド電流測定用に構成されたアンプ内部のDIPスイッチ。2、5、および7を除くすべてのトグルスイッチは、ハイサイド電流測定モードでアンプを使用するためにOFF位置にあります。(C) 赤いソケット(VDIFF入力用)と黒いソケット(回路グランド用)が未接続または接続されているV DIFFプローブ。プローブは、2つのソケットが接続されている場合の標準電圧クランプモードに使用できます。(d)卵母細胞対形成室。(E) ハイサイド電流測定モードでアンプを備えた集録システムをテストするための接続を備えたモデルセル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:卵母細胞と電極のセットアップ(A)記録段階。円形孔の直径は36mmであり、各種電極の位置を示す(B)図。(c)各種電極の実際のレイアウト。(D)2つのVDIFF電極は、修正された寒天ブリッジ磁気ホルダー(材料表)(上)とチューブクランプ(材料表)(下)を含む2つの異なる磁気クランプによって記録ステージ上にクランプされたホルダーと接続ケーブルを備えています。前者は、そのより大きな磁気ベースのために電極位置を維持する上でより安定であるが、修正を必要とする。ガラスマイクロピペットは、曲げ角度を示すために、その動作位置から90°回転します。(e)一対の卵母細胞と電極のクローズアップ図である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:代表的な記録痕跡。負および正の膜電圧(Vm)ステップは、−30mVの保持Vmから卵母細胞1に印加されるが、一方、卵母細胞2は−30mVの一定のVmに保持される。経接合電圧(Vj)は、卵母細胞2のVm-Oocyte 1のVmと定義される。試料IjトレースとUNC-9ホモタイプギャップ接合の正規化接合コンダクタンス(Gj)-Vj関係を得た。(c)試料IjトレースとUNC-7bホモタイプギャップ接合の正規化されたGj−Vj関係。G j-Vj 関係はボルツマン関数 (赤い線) によって適合されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ステップ番号 | 熱 | 引っ張る | 速度 | 時間 |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| プルパラメータ(https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html)の定義については、製造元のWebサイトのユーザーマニュアルを参照してください。 | ||||
表1:電極引っ張りパラメータ これらのパラメータは、薄肉ガラス毛細血管(材料表)およびP-97マイクロピペットプーラーでのランプ温度258(材料表)に基づいています。それらはあなたの引っ張りのこのガラスのためのランプ温度に従って調節される必要がある。たとえば、プーラーのランプ温度が 20° 高い場合は、各ステップに 20° を追加し、必要な調整を行います。一般に、先端サイズは、最後のステップの速度を調整することによって最適化され得る。プルパラメータ(https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html)の意味については、製造元のWebサイトのユーザーマニュアルを参照してください。
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Discussion
システムの最適化は、二重卵母細胞電圧クランプ実験に必要であると思われる。これがないと、記録が非常に不安定になり、アンプがターゲットVmに到達するために過剰な電流を注入しなければならず、卵母細胞の損傷と記録の失敗につながる可能性があります。ハイサイド電流測定法で安定した二重卵母細胞記録を得るためには、いくつかの要因が重要です。まず、電流電極と電圧電極は適切な抵抗(約1MΩ)を持ち、そのホルダは清潔でなければなりません。第2に、VDIFF電極は低抵抗(<150kΩ)で、卵母細胞の近くになければなりません。第3に、同じ卵母細胞(電圧、電流、およびV DIFF)のすべての電極を同じ側(左または右)に配置する必要があり、電極の順序(背面から前面へ)は電流、電圧、およびVDIFFでなければなりません。最後に、参照電極は、ユーザーに向かって35mmのシャーレの端の近くに配置する必要があります。
製造元から推奨される手順をいくつか変更し、その他の改善を行いました。その中には、1) VDIFF 電極として機能するKCl装填寒天ブリッジの代わりにND96充填マイクロピペットがある。ガラス電極は、構築が容易で、再利用可能で、卵母細胞に有害ではありません。2)参照電極として低リークKCl電極を用いる。この電極は低抵抗(〜2.7kΩ)で安定した電位を持ち、電解質(〜5.7 x 10-8mL / h)をほとんど漏れません。3)卵母細胞および様々な電極の安定した、便利で正確な位置決めを可能にするカスタム設計され、構築された記録プラットフォーム。このステージでは、実体顕微鏡、デュアルグースネックを備えたファイバーライト、および電流電極と電圧電極の取り付けと位置付けに使用される4つの磁気スタンドへの十分なアクセスも提供します。4)薄肉ガラスキャピラリーの一種からの電流および電圧電極の作製。これらの電極は、所望の先端抵抗(0.5〜1.4MΩ)を有し、卵母細胞膜を非常に容易に貫通することができ、卵母細胞に最小限の損傷を引き起こす。
時折、記録システムは、異常に大きいか連続的に増加する保持電流、電流電極の周りの細胞膜の白い斑点の発生、および電圧指令に応答して不安定なVmトレースによって示されるように、適切に機能しない。考えられる原因は、1)V DIFF電極系が小さな気泡を有するか、またはVDIFF電極の先端が卵母細胞に対して適切に向けられていない。2)電圧または電流電極が高い抵抗(例えば>2MΩ)を有するか、またはそのホルダが塩堆積物から汚れている。3) VDIFF電極の接続ワイヤが断線している。4) 電圧クランプ時にD.C.ゲインがINに設定されていない。
ここでは、アフリカツメガエル卵母細胞からIjを記録する方法について説明した。これは、2つの対向する卵母細胞の安定した電圧クランプを可能にする。この方法は実装が容易であり、GJの生物物理学的特性を分析するための明白な制限はないようである。しかし、私たちはそれが他の公開された方法とどのように比較されるかを伝える立場にはありません。二重卵母細胞電圧クランプ技術の設定に新たに興味を持つラボが、この方法を検討する価値があると期待しています。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
Haiying Zhan氏、技術開発の初期段階に関与してくれたQian Ge氏、フィギュアの制作を手伝ってくれたKiranmayi Vedantham氏、卵母細胞ペアリングチャンバーに関するアドバイスをしてくれたCamillo Peracchia博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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