Summary
여기서 우리는 Xenopus 난모세포에서 갭 접합 단백질을 발현하고 하이 사이드 전류 측정 모드에서 이중 난모세포 전압 클램프 기록을 위해 설계된 상용 증폭기를 사용하여 두 개의 apposed 난모세포 사이의 접합 전류를 기록하는 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
제노푸스 난모세포에서 접합체와 이넥신의 이종성 발현은 갭 접합 (GJs)의 생물 물리학 적 특성을 연구하기위한 강력한 접근법입니다. 그러나이 접근법은 공통점을 공유하는 두 개의 대향하는 난모세포의 차동 전압 클램프가 필요하기 때문에 기술적으로 어렵습니다. 소수의 실험실이이 기술을 성공적으로 수행했지만 본질적으로 모두 수제 증폭기 또는 단일 난모세포 녹음을 위해 설계된 상업용 증폭기를 사용했습니다. 다른 실험실에서이 기술을 구현하는 것은 종종 어렵습니다. 하이사이드 전류 측정 모드가 이중 난자 전압 클램프 기록을위한 상업용 증폭기에 통합되었지만 최근 연구까지 그 적용에 대한 보고서는 없었습니다. 우리는 난모세포 및 다양한 전극을 정밀하게 배치 할 수있는 자기 기반 기록 플랫폼 구축, 전압 차동 전극의 도체로서의 욕조 솔루션 사용, 상업용 저누설 KCl 전극을 기준 전극으로 채택하는 등 몇 가지 기술적 수정을 도입하여 하이 사이드 전류 측정 접근법을보다 실용적이고 편리하게 만들었습니다. 얇은 벽 유리 모세 혈관에서 전류 및 전압 전극을 제작하고 자기 기반 장치를 사용하여 모든 전극을 배치합니다. 여기에 설명 된 방법은 두 개의 대향하는 Xenopus 난자 사이의 접합 전류 (Ij)의 편리하고 강력한 기록을 가능하게합니다.
Introduction
GJ는 이웃 세포들 사이의 작은 세포질 분자의 전류 흐름 및 교환을 허용할 수 있는 세포간 채널이다. 그들은 많은 세포 유형에 존재하며 다양한 생리 기능을 수행합니다. 척추 동물의 GJ는 코넥신에 의해 형성되는 반면, 무척추 동물의 GJ는 이넥신에 의해 형성됩니다. 각 GJ는 이들이 연결관인지 또는 이넥신 1,2,3인지에 따라 반채널당 6개 또는 8개의 서브유닛을 갖는 두 개의 병치된 반채널로 구성된다. 인간은 21 개의 코넥신 유전자4를 가지고 있으며, 일반적으로 사용되는 무척추 동물 모델 C. elegans와 Drosophila melanogaster는 각각 25 및 8 개의 이넥신 유전자를 가지고 있으며 5,6 개가 있습니다. 유전자 전사체의 대안적인 스플라이싱은 적어도 이넥신 7,8에 대해 GJ 단백질의 다양성을 더욱 증가시킬 수 있다.
GJ는 분자 조성에 따라 세 가지 범주로 나눌 수 있습니다 : 동형, 이형, 이종 및 이종이체. 호모타입 GJ는 모든 서브유닛이 동일하다. 이형형 GJ는 두 개의 호모머 반수채널을 갖지만, 두 개의 반쪽 채널은 두 개의 서로 다른 GJ 단백질에 의해 형성된다. 이질성 GJ는 적어도 하나의 이종이머 반수채널을 함유한다. GJ의 분자 다양성은 생리적 기능에 중요한 뚜렷한 생체물리학적 특성을 부여할 수 있다. GJ 생물물리학적 특성은 또한 조절 단백질9에 의해 조절된다. GJ가 생리적 기능을 수행하는 방법을 이해하려면 분자 구성, 생물 물리학 적 특성 및 기능에서 조절 단백질의 역할을 아는 것이 중요합니다.
이종 발현 시스템은 종종 GJ를 포함한 이온 채널의 생체 물리학 적 특성과 조절 단백질이 그들에 미치는 영향을 연구하는 데 사용됩니다. 이종 발현 시스템은 특정 단백질의 발현을 허용하기 때문에, 이들은 일반적으로 중복 기능을 갖는 단백질이 분석을 복잡하게 할 수 있고, Ij의 기록이 달성될 수 없는 천연 조직보다 단백질 기능을 해부하는 데 더 적합하다. 불행히도, Neuro-2A 세포를 제외한 가장 일반적으로 사용되는 세포주는 내인성 연결에 의한 합병증으로 인해 GJ 생물 물리학 적 특성을 연구하는 데 부적절합니다. Neuro-2A 세포조차도 이러한 종류의 분석에 항상 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 우리는 C. elegans 9,10에서 UNC-9 GJ의 기능에 필요한 UNC-1 (미공개)의 부재 또는 존재 중 하나에서 이넥신 UNC-7 및 UNC-9로 형질감염된 Neuro-2A 세포에서 어떠한 Ij도 검출할 수 없었다. 한편, 제노푸스 난모세포는 GJ의 전기생리학적 분석을 위한 유용한 대안 시스템이다. 이들은 내인성 GJ 단백질인 코넥신 38(Cx38)11을 발현하지만, 특정 안티센스 올리고뉴클레오티드12를 주입함으로써 잠재적인 합병증을 쉽게 피할 수 있다. 그러나 Xenopus 난모세포를 가진 GJ의 분석은 두 개의 병치된 세포의 차동 전압 클램프를 필요로 하며, 이는 기술적으로 어려운 과제입니다. 개구리 블라스토미어의 이중 전압 클램프의 초기 성공은 약 40 년 전13,14 년보고되었습니다. 그 이후로, 많은 연구들이 짝을 이룬 제노푸스 난모세포에서 Ij를 기록하기 위해 이 기술을 사용했다. 그러나 본질적으로 이전의 모든 연구는 수제 증폭기 12,15,16 또는 단일 난모세포에서의 녹음을 위해 설계된 상업용 증폭기 (GeneClamp 500, AxoClamp 2A 또는 AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20으로 수행되었습니다. . 상업용 증폭기조차도 이중 난자 전압 클램프에 대한 지침을 제공하지 않기 때문에 새롭거나 덜 정교한 전기 생리학 실험실에서이 기술을 구현하는 것이 종종 어렵습니다.
이중 난모세포 전압 클램프용 상용 증폭기는 단 하나, 워너 인스트루먼츠의 OC-725C(재료 표, 그림 1A)용으로 개발되었습니다. 이 증폭기는 전압 프로브에 두 소켓이 연결되어 있는지 여부에 따라 표준 모드(단일 난모세포의 경우) 또는 하이사이드 전류 측정 모드(단일 또는 이중 난모세포의 경우)에서 사용할 수 있습니다(그림 1B, C). 그러나, 우리의 최근 연구7까지, 하이사이드 전류 측정 모드에서 이 증폭기의 사용을 설명하는 단일 간행물은 없었다. 증폭기는 이중 난자 기록을 위해 다른 실험실에서 사용되었지만 하이 사이드 모드21,22가 아닌 표준에서 사용되었습니다. 하이사이드 전류 측정 모드에서 증폭기를 사용하는 이러한 보고서 부족은 기술적 어려움 때문일 수 있습니다. 우리는 제조업체의 지침에 따라 하이 사이드 모드를 사용하여 안정적인 이중 난자 기록을 얻을 수 없었습니다. 수년에 걸쳐, 우리는 하이 사이드 전류 측정 모드에서 두 개의 OC-725C 증폭기, 표준 모드에서 두 개의 OC-725C 증폭기 및 다른 제조업체의 두 개의 증폭기를 사용하는 것을 포함하여 이중 난자 기록에 대한 세 가지 접근 방식을 시도했습니다. 우리는 결국 광범위한 시행 착오 후 첫 번째 접근 방식으로만 안정적인 녹음을 얻는 데 성공했습니다. 이 간행물은 Xenopus 난모세포에서 GJ 단백질을 발현하고, 하이사이드 전류 측정 모드를 사용하여 Ij를 기록하고, 널리 사용되는 상용 소프트웨어를 사용하여 전기생리학적 데이터를 분석하는 데 사용하는 절차를 설명하고 시연합니다. 이중 전압-클램프 기술에 대한 추가적인 정보는 다른 간행물19,23에서 찾을 수 있다.
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Protocol
수술은 코네티컷 의과 대학의 기관 동물 관리위원회가 승인 한 프로토콜에 따라 수행됩니다.
1. 개구리 수술 및 탈암 난모세포의 준비
- 성인 여성 아프리카 발톱 개구리 (Xenopus laevis) (재료 표)를 시원한 (얼음과 함께) 트리카인 용액 (~ 300 mg / L)에 담그고 마취하십시오.
- 개구리가 웹베드 발을 쥐어 짜는 것에 대한 반응이 거의 없거나 전혀 나타나지 않을 때까지 기다리십시오 (~ 15 분). 개구리를 배꼽을 위로 향하게하는 수술대에 놓습니다.
- 왼쪽 또는 오른쪽 하복부 부위에 세로 절개 (길이 8-10mm) 후 한 쌍의 포셉으로 작은 난소 조직을 부드럽게 꺼내고 한 쌍의 작은 가위로 난소 조직을 잘라냅니다.
- 즉시 유리 난소 조직을Ca2+-free ND96 용액 (NaCl 99 mM, KCl2 mM,MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5)에 담그고 60-mm 페트리 디쉬 안에 넣는다.
- 5-0 실크 봉합사 (재료 표)를 사용하여 간단한 중단 봉합사로 절개를 닫은 후 개구리를 다시 얕은 물 탱크에 넣어 회수하십시오.
참고 : 절개는 두 단계로 닫힙니다 : 먼저 복막과 근육층, 그리고 피부층. 각 개구리는 두 번의 연속 수술 사이에 최소 4 주 간격으로 5 회 수술을받습니다. - 분리된 난소 조직을 20mg의 콜라게나제(표 자료) 및20mg의 히알루로니다아제(표 자료)와 함께 10mL의 Ca2+-free ND96 용액을 함유하는 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다(표 자료).
- 모든 난모세포가 분리될 때까지(독방) 실온(RT)에서 오비탈 쉐이커에서 튜브를 흔든다.
- 그 후, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 30-50 개의 난모세포를 페트리 접시로 옮기고 입체 현미경 (≥25x 최고 배율)으로 난모세포를 자주 검사하여 난모세포가 탈피되었는지 여부를 확인합니다.
참고: 파스퇴르 피펫은 다이아몬드 스크라이서(재료 테이블)를 사용하여 더 넓은 팁 개구부로 "절단"하고 절삭 날의 매끄러움을 부드럽게하기 위해 화염을 뿌려야합니다. - 난모세포의 70 % -80 %가 탈피하자마자 튜브를 부드럽게 기울여 효소 용액을 떨어 뜨립니다. 튜브를 ND96 용액 (NaCl 96 mM, KCl2 mM, CaCl2 1.8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7.5)으로 채우고 용액을 디캔팅하여 난모세포를 5 번 세척한다.
- 최종 세척 후, 난모세포를 ND96 용액을 함유하는 60-mm 페트리 디쉬로 옮긴다. 깨끗하고 건강한 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 크고 건강해 보이는 난모세포를 피루베이트 나트륨(2mM)과 페니실린-스트렙토마이신(100U/mL)이 보충된 ND96 용액이 들어있는 60mm 페트리 접시로 옮겨 보십시오.
참고 : "크고 건강하게 보이는 난모세포"는 효소에 의한 과다 소화의 징후를 보이지 않는 단계 V 및 VI의 세포입니다. - 선별된 난모세포가 들어있는 페트리 접시를 환경 챔버(15-18°C) 내부에 놓는다.
2. GJ 단백질 발현
- 제조사의 프로토콜에 따라 RNA 전사 키트(Table of Materials)를 사용하여 시험관 내에서 특정 코넥신 또는 이넥신의 상보적 RNA(cRNA)를 합성한다.
- RNA 전사 키트의 사용자 매뉴얼에 기재된 염화리튬 방법을 사용하여 cRNA를 침전시킨다.
- 펠렛을 70% 에탄올로 세척하고, 이를 뉴클레아제가없는 H2O20μL에 용해시키고, 1 μL의 리보뉴클레아제 억제제(40 U, 표 소재)를 첨가한다.
- 분광광도계를 이용하여 cRNA의 농도를 측정하였다(표 of Materials).
- cRNA를 Cx38 안티센스 올리고와 혼합하여 최종 농도가 200-1,000 ng/μL cRNA 및 100 ng/μL 올리고가 되도록 합니다.
참고: 올리고 서열은 5'-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3'이며, 이는 제노푸스 라에비스 Cx38 mRNA (NCBI 기탁: NM_001088018)11에서 -5 내지 +25의 뉴클레오티드에 상응한다. 올리고는 cRNA와 혼합되기 전에 원액 (2.0 mg / mL)으로 보관됩니다. - 2분 동안 마이크로원심분리기(∼16,000 x g)에서 방사하여 cRNA의 입자를 제거하고, 피펫팅에 의해 전체 상층액을 새로운 튜브로 신속하게 옮긴다(마이크로원심분리 튜브의 바닥을 교란시키지 않음).
- cRNA를 분취량 (2.5 μL/바이알)로 분할하고, 분취량을 -80°C 냉동고에 보관한다.
- 빠른 경화 에폭시 접착제를 사용하여 35-mm 페트리 접시의 바닥에 나일론 메쉬 (표 자료)의 작은 조각 (∼1 cm x 1 cm)을 접착하여 난모세포 주입 접시를 제조하였다.
참고 : 난모세포 주사 접시는 재사용 가능합니다. 각 사용 후 70 % 에탄올로 씻으십시오. - 난모세포 주사 접시를 ND96 용액 (피루베이트와 페니실린 스트렙토 마이신으로 보충)으로 대략 반쯤 채 웁니다.
- 25-30 개의 난모세포를 페트리 접시 안에 줄지어 놓습니다.
- 자동화 된 나노 리터 주입기의 사용 설명서 (재료 표)의 지침에 따라 난모세포 주사를위한 유리 마이크로 피펫을 준비하십시오.
참고 : 마이크로 전극 베벨러 (재료 표)를 사용하면 난모세포에 최소한의 손상을 입히는 날카로운 주사 마이크로 피펫을 생성하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 주입 마이크로 피펫을 경량 미네랄 오일로 채우고 인젝터의 마이크로 피펫 홀더에 삽입하십시오.
- cRNA를 저장된 분취량 중 하나에서 피펫팅에 의해 페트리 접시 덮개 또는 바닥의 내부 표면으로 옮깁니다.
- cRNA 액적을 인젝터 컨트롤러의 FILL 버튼을 눌러 마이크로피펫의 팁으로 흡인합니다.
- INJECT 버튼을 눌러 cRNA (~ 50 nL / oocyte)를 주입하십시오.
주: 주입 볼륨은 인젝터 컨트롤러의 딥 스위치에 의해 설정될 수 있습니다. - 주입된 난모세포를 ND96 용액(피루베이트 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충됨)을 함유하는 새로운 페트리 접시로 옮기고, 1-3일 동안 환경 챔버(15-18°C) 내부에 보관한다(GJ 단백질 발현 속도 및 수준에 따라 다름). 난모세포를 새로운 페트리 접시로 옮겨 매일 용액을 교체하십시오.
3. 난모세포 페어링
- 주입된 난모세포 몇 개를 ND96 용액이 들어있는 35-mm 페트리 접시에 옮깁니다.
- 두 개의 미세한 핀셋 (재료 표)을 사용하여 난모세포를 감싸는 투명한 비텔린 막을 부드럽게 벗겨냅니다.
참고 : 처음 사용하기 전에 핀셋 팁을 날카롭게해야 할 수도 있고 때로는 미세한 (600 Grit) 사포를 사용하여 핀셋 팁을 날카롭게해야 할 수도 있습니다. - 웰당 2개의 난모세포를 ND96 용액(피루베이트 및 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된)이 들어있는 난모세포 페어링 챔버(도 1D)에 놓는다.
참고: 난모세포 페어링 챔버는 빠른 경화 에폭시 접착제를 사용하여 Microwell Minitray (재료 표)의 작은 조각을 35-mm 페트리 접시 (재료 표)의 바닥에 접착하여 구성됩니다. 미니 트레이는 핫 와이어 커터 (재료 테이블)를 사용하여 작은 조각으로 절단됩니다. 난모세포 짝짓기를 위한 미니트레이의 사용은 원래 다른 사람들(24)에 의해 기술되었다. GJ 단백질이 그의 세포질 도메인25 내의 아미노산 잔기의 전하 특성에 따라 난모세포 세포막에서 불균일하게 분포할 수 있지만, 무작위 짝짓기(난모세포의 동물과 식물 극을 구별하지 않고)는 일반적으로 충분한 것으로 보인다. - 짝을 이룬 난모세포가 들어있는 페트리 접시를 RT에 보관하여 전기생리학적 기록에 사용할 수 있도록 격리 테이블에 보관하십시오.
참고: 페어링 기간은 몇 시간에서 하루까지 다를 수 있습니다. 편리한 연습은 늦은 오후에 난모세포를 짝짓기하고 다음날 그들로부터 기록하는 것입니다.
4. 취득 시스템 준비
- 내부 딥 스위치를 조정하여 두 개의 OC-725C 난모세포 클램프 증폭기(재료 표)를 하이사이드 전류 측정 모드로 구성합니다(그림 1B).
- 먼저 후면 패널의 접지 회로 소켓을 상호 연결한 다음 패러데이 케이지와 레코딩 챔버를 조명하는 데 사용되는 광섬유 조명에 연결하여 증폭기를 접지합니다.
- 증폭기를 아날로그-디지털 신호 변환기(재료 테이블)에 연결하고 증폭기 제조업체의 지침에 따라 pClamp 소프트웨어의 Clampex 모듈(재료 표)에서 구성합니다.
- 증폭기와 함께 제공된 모델 셀로 수집 시스템을 테스트합니다.
- V DIFF 프로브와 전류(I) 케이블을 모델 셀에 연결하고, V DIFF 프로브의 빨강 및 검정 소켓을 포함된 점퍼와 연결하고, 점퍼의 양쪽 레그를 모델 셀의 어느 핀에 연결하고, 모델 셀의 접지선을 증폭기의 GROUNDS 회로 소켓의 케이블에 연결합니다(그림 1E).
- Vm 오프셋 및 Ve 오프셋 노브를 각각 돌려 증폭기의 전압 전극(Vm) 및 배스 전극(Im) 미터를 제로화하고, 클램프를 OFF에서 고속 또는 SLOW로 전환하고, GAIN 다이얼을 시계 방향으로 돌려 적절한 전압 클램프를 허용하는 수준으로 돌립니다(그림 1A). D.C. GAIN 스위치는 OUT 또는 IN 위치에 있을 수 있습니다.
- 몇 가지 전압 단계를 포함하는 간단한 수집 프로토콜을 실행하여 Vm 미터에 표시된 전압이 수집 프로토콜에 따라 변경되고 전압 및 전류 트레이스가 Clampex에 제대로 표시되는지 확인합니다.
참고: 이 방법을 사용할 때마다 하나의 증폭기만 테스트할 수 있습니다.
5. 쌍을 이룬 난모세포 사이의 기록 Ij
- pClamp 소프트웨어에서 Ij 를 기록하기 위한 획득 프로토콜을 생성합니다.
참고: 두 개의 획득 프로토콜을 만듭니다. 이들 중 하나에서, 증폭기 #1은 일련의 막 전압(Vm) 단계들(예를 들어, 10-mV 간격에서 -150 내지 +90 mV)을 생성하는데 사용되는 반면, 증폭기 #2는 일정한 Vm(예를 들어, -30mV)을 유지하기 위해 사용된다. 다른 프로토콜에서, 증폭기 #2는 Vm 스텝을 생성하는데 사용되는 반면, 증폭기#1은 일정한 Vm을 유지하기 위해 사용된다. 포지티브 및 네거티브 Vm 스텝은 대안적으로 적용되어야 하며(예를 들어, -150, +90, -140, +80 ......), 이는 획득 프로토콜의 사용자 리스트 특징을 사용하여 Clampex에서 프로그래밍될 수 있다. - 녹음 단계 설정
- 쌍을 이룬 난모세포가 들어 있는 페트리 접시 하나를 녹음 플랫폼의 페트리 접시 리셉터클에 떨어뜨립니다(그림 2A).
- 한 쌍의 난모세포를 선택하고 필요한 경우 페트리 접시를 회전시켜 두 난모세포가 왼쪽과 오른쪽 방향으로되도록하고 자기 염기에 의해 무대를 제자리에 고정시킵니다.
- 전류 및 전압 프로브를 분리 테이블의 적절한 위치에 고정하는 마그네틱 스탠드를 고정합니다.
주: 한 증폭기의 전류 및 전압 프로브는 왼쪽에 있고 다른 증폭기의 전류 및 전압 프로브는 오른쪽에 있고 전압 프로브는 양쪽의 전류 프로브 앞에 있는지 확인합니다(그림 2B, C).
- 기준 전극 설정
- 페트리 접시의 가장자리 근처에 기준 전극(재료 표)을 사용자 쪽으로 놓습니다(그림 2B, C).
- 기준 전극을 두 개의 VDIFF 프로브 중 하나만 있는 검은색 소켓(회로 접지)에 연결합니다.
- VDIFF 전극 설정
- 한 쌍의 유리 마이크로 피펫을 당기고 다이아몬드 스크라이서 (재료 표)로 팁을 약간 떼어 내고 화재 연마로 팁 가장자리를 부드럽게하십시오.
참고: 팁 저항은 150kΩ 미만이어야 합니다(피펫에서 ND96으로 측정됨). 일반적으로 팁 저항이 20-150kΩ인 마이크로 피펫이 사용됩니다. - 마이크로 피펫을 알코올 버너의 화염 위에 올려 놓고 팁에서 ~ 1cm 떨어진 위치에서 부드러운 각도 (~ 130 °)로 구부립니다.
참고: 제작된 마이크로피펫은 재사용할 수 있습니다. 매번 사용 후 물로 헹구십시오. - 유리 피펫을 ND96 용액으로 완전히 채우고 미리 채워진(ND96 포함) 미세 전극 홀더(재료 표, 그림 2D)에 삽입하고 시스템에 기포가 없는지 확인합니다.
- 미세 전극 홀더의 2mm 핀을 VDIFF 전극 연결 와이어의 2mm 소켓에 삽입합니다(그림 2D).
- 2mm 소켓을 자기 기반 클램퍼에 클램프하고(그림 2D), VDIFF 전극의 팁을 두 난모세포 중 하나를 향하도록 조준합니다(그림 2E).
참고 : 클램퍼의 위치와 각도를 조정하여 전극의 끝이 난모세포에 매우 가깝도록 하십시오. - V DIFF 전극 연결 와이어의 1mm 핀을 같은 측면의 V DIFF 프로브의 빨간색 소켓(V DIFF 입력)에 삽입합니다.
- 유사한 절차에 따라 다른 난모세포 및 증폭기를 위한 VDIFF 전극을 준비하고 연결한다.
참고: 한 쌍의 난모세포와 모든 전극의 클로즈업 뷰가 도 2E에 도시되어 있다.
- 한 쌍의 유리 마이크로 피펫을 당기고 다이아몬드 스크라이서 (재료 표)로 팁을 약간 떼어 내고 화재 연마로 팁 가장자리를 부드럽게하십시오.
- 전류 및 전압 전극 설정
- 유리 모세관으로부터 전압 및 전류 전극을 준비하고, KCl 용액(KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 with KOH)으로 백필하고, 증폭기와 함께 제공된 전극 홀더에 삽입한다.
참고: 전극의 저항은 ~1MΩ이어야 합니다. 적합한 전극은 특정 세트의 당김 파라미터를 사용하여 일종의 얇은 벽 유리 모세혈관(Table of Materials)으로부터 수득될 수 있다(표 1). 이러한 팁은 증폭기의 Vm 또는 Ve BUZZ 버튼을 누를 필요없이 난모세포 세포막에 쉽게 침투 할 수 있습니다. - 전극을 배스 용액으로 낮추고, Vm 오프셋 및 Ve OFFSET 다이얼을 돌려 Vm 및 Im 미터를 제로로 만들고, Vm 전극 테스트 및 Ve 전극 테스트를 눌러 전극 저항을 확인합니다.
- 전류 및 전압 전극을 난모세포에 삽입하고 음의 막 전위 (일반적으로 -20 ~ -50mV)를 관찰하십시오.
참고: 동일한 증폭기의 Vm 및 Im 미터는 두 개의 동일하거나 매우 유사한 값을 표시해야 합니다.
- 유리 모세관으로부터 전압 및 전류 전극을 준비하고, KCl 용액(KCl 3.0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7.4 with KOH)으로 백필하고, 증폭기와 함께 제공된 전극 홀더에 삽입한다.
- 데이터 수집
- 증폭기의 클램프 섹션에서 D.C. GAIN이 IN 위치에 있는지 확인하고 GAIN 노브를 시계 방향으로 돌려 적절한 전압 클램프(일반적으로 전체 범위의 삼분의 일에서 절반)를 허용하는 수준으로 돌린 다음 클램프 스위치를 OFF에서 FAST로 돌립니다.
참고: 클램프를 켜면 Vm 및 Im 미터에 유지 전압과 유지 전류가 각각 표시됩니다. 유지 전류는 난모세포 상태에 따라 다소 변할 수 있지만, 일반적으로 작고 유지 Vm (예를 들어, -30 mV)에서 안정하다. - 획득 프로토콜을 실행합니다.
참고: 네 개의 추적이 화면에 표시됩니다. 한 증폭기로부터의 전압 및 전류 트레이스는 난모세포 #1에 인가되는 Vm 단계와 Vm 단계를 생성하는 데 필요한 전류를 나타내는 반면, 다른 증폭기로부터의 전류는 난모세포 #2의 일정한 Vm(-30mV)을 나타내고, 이 일정한 Vm을 유지하기 위해 주입된 전류를 나타낸다. 난모세포 #2에 주입된 전류는 Ij를 나타낸다.
- 증폭기의 클램프 섹션에서 D.C. GAIN이 IN 위치에 있는지 확인하고 GAIN 노브를 시계 방향으로 돌려 적절한 전압 클램프(일반적으로 전체 범위의 삼분의 일에서 절반)를 허용하는 수준으로 돌린 다음 클램프 스위치를 OFF에서 FAST로 돌립니다.
6. 데이터 분석
- 클램핏으로 분석.
- pClamp의 Clampfit 모듈에서 기록된 abf 파일을 엽니다.
- 커서 1과 2를 사용하여 Ij 추적 전에 기준선의 세그먼트를 둘러싸십시오.
- 베이스라인 조정 아이콘을 클릭하여 베이스라인 창을 불러옵니다. 메서드에서 커서 평균 1..2 빼기를 선택하고 추적 선택을 위해 모든 가시적 신호 및 모든 보이는 트레이스가 선택되었는지 확인합니다.
- 확인을 클릭하면 베이스라인 창이 닫히고 모든 전류 및 전압 트레이스의 베이스라인이 제로 레벨로 수렴됩니다. 전압 단계는 원래 전압에서 유지 전압을 뺀 값(예: -30mV)과 동일한 새로운 레벨로 변경됩니다.
- 정상 상태 Ij를 사용하여 Ij 및 Vj 관계를 플로팅하기 위해, 정상 상태 Ij를 나타내는 Ij 트레이스의 원하는 세그먼트를 커서 1 및 2로 둘러싸고, 전압 단계의 시간 윈도우 내의 어느 곳에나 커서 3을 배치한다.
- 분석/빠른 그래프/I-V로 이동하여 I-V 창을 엽니다.
- X축(전압)에서 신호에서 커서 3을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 전압 스텝 신호(예: 전압 1)를 지정한 다음 반전 확인란을 선택합니다.
참고: 반전 상자는 Vm을 Vj와 동등한 값으로 변환하도록 선택되며, 이는 난모세포 #1의 난모세포 #2-Vm의 Vm으로 정의됩니다. - Y축(현재) 아래에서 신호 옆의 드롭다운 메뉴에서 Ij 신호의 소스(예: 현재 0)를 선택하고 드롭다운 메뉴에서 영역을 커서 1..2로 정의한 다음 평균을 선택합니다.
참고: 피크 Ij 및 Vj 관계를 플로팅하기 위해 커서 1과 2는 단계 6.1.5에서 피크 Ij를 포함하는 Ij 트레이스의 세그먼트를 둘러싸고 단계 6.1.8에서 피크(평균 대신)를 선택해야 합니다. - 대상 옵션에서 바꾸기 또는 추가를 선택합니다.
- I-V 창에서 확인을 클릭하면 화면에 I j - Vj 관계가 표시되고 창 / 결과를 클릭하여 해당 Ij 및 Vj 값을 찾을 수 있습니다.
- OriginPro에서 Gj-Vj 관계를 플롯하고 적합 (재료 표)
- Vj 및 Ij 값을 포함하는 두 열을 Clampfit의 결과 창(6.1.10단계)에서 Origin의 새 통합 문서로 복사합니다. Vj 및 Ij 값이 각각 X 및 Y 열 아래에 있는지 확인하십시오.
- 열/새 열 추가를 클릭하여 통합 문서에 네 개의 새 열을 추가합니다.
- 첫 번째 새 열의 이름을 Gj로 지정하고 열 값 설정 창에 "열 I j/열 Vj * 1,000" 방정식을 입력하여 채우고 G j-Vj 관계의 산점도를 만듭니다.
참고: 1,000(선택 사항)을 곱하면 후속 단계에서 매우 작은 숫자를 처리하는 불편을 피할 수 있습니다. - Gj 데이터 포인트를 음수 및 양수 Vj 범위에 걸쳐 볼츠만 함수에 독립적으로 맞춥니다. 피팅에서 G jmax, G jmin, A 및 V0 값을 스프레드 시트에서 수행 할 수있는 Boltzmann 방정식에 입력하여 V j = 0mV에서 Gj를 계산하십시오. 이렇게 얻어진 Gj는 다음 단계에서 Gjmax로서 사용될 것이다.
참고 : 볼츠만 함수에 맞는 방정식은 G j = (G jmax-G jmin)/{1 + exp[A (Vj-V0)]} + G jmin이며, 여기서 V0은 컨덕턴스가 절반 최대인 Vj, G jmax는 최대 컨덕턴스, G jmin은 V j-insensitive 잔류 컨덕턴스23. 피팅을 수행하려면 먼저 Boltzmann 방정식을 새 피팅 함수로 OriginPro에 추가한 다음 피팅에 대해 이 함수를 선택합니다. 피팅 함수를 실행하기 전에 G jmax, G jmin, V0 및 A에 대한 대략적인 시드 값을 입력합니다. Gjmax 매개변수가 이 피팅에 대해 고정되어 있지 않은지 확인하십시오. - 두 번째 및 세 번째 새 열의 이름을 nGj-L 및 nGj-R("정규화"의 경우 "n")으로 지정하고, Gj 열을 각각 왼쪽 및 오른쪽 Gj-Vj 곡선에서 파생된 Gjmax 값으로 나눔으로써 채웁니다(단계 6.2.4).
- 네 번째 새 열의 이름을 nGj-LR로 지정하고 각각 nGj-L 및 nGj-R 열의 음수 및 양수 Vj 범위에서 값을 복사하여 채웁니다.
- Vj에 대해 nGj-LR에 대한 산점도를 생성하고 음수 및 양수 Vj 범위에 걸쳐 데이터 포인트를 볼츠만 함수에 독립적으로 맞춥니다. 피팅에 대해 Gjmax 매개변수가 1.0으로 고정되어 있는지 확인하십시오.
- 피팅 결과(예: 적합 그래프 및 Gjmin, V0 및 A 값)의 기록을 유지합니다.
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Representative Results
UNC-7과 UNC-9는 C. elegans의 이넥신입니다. UNC-9는 단 하나의 이소형만을 가지고 있지만, UNC-7은 아미노 말단 7,8의 길이와 아미노산 서열에서 주로 상이한 다중 이소형을 갖는다. 이들 이넥신은 제노푸스 난모세포 7,8에서 발현될 때 이형적(UNC-7 및 UNC-9의) GJs뿐만 아니라 동형적을 형성할 수 있다. UNC-7b 및 UNC-9 동형형 GJ의 대표적인 Ij 트레이스 및 생성된 정규화된 Gj-Vj 관계가 도 3에 도시되어 있다. 쌍을 이룬 난모세포를 사용한 이들 실험에서, 난모세포 1의 Vm은 유지 전압(-30 mV)으로부터 상이한 레벨로 클램핑된 반면, 난모세포 2의 V는 Ij를 모니터링하기 위해 -30 mV에서 일정하게 유지되었다. 결과는 이들 두 가지 유형의 GJ가 Vj-의존적 Ij 불활성화 속도, Vj 의존성(Gj-Vj 곡선의 기울기로 나타냄) 및 잔류 Gj의 양에서 상이하다는 것을 보여준다. GJ를 정류하는 것을 포함하여 UNC-7 및 UNC-9 GJ의 많은 다른 예가 최근 간행물7에서 찾을 수 있습니다.
그림 1: 난모세포 페어링 챔버 및 증폭기 설정. (A) 난모세포 클램프 증폭기 OC-725C의 전면 패널. (B) 하이사이드 전류 측정을 위해 구성된 증폭기 내부의 DIP 스위치. 2, 5 및 7을 제외한 모든 토글 스위치는 OFF 위치에 있으므로 하이사이드 전류 측정 모드에서 증폭기를 사용합니다. (C) 빨간색 소켓(V DIFF 입력용)과 검은색 소켓(회로 접지용)이 연결되지 않았거나 연결된 VDIFF 프로브. 프로브는 두 소켓이 연결될 때 표준 전압 클램프 모드에 사용될 수 있습니다. (d) 난모세포 페어링 챔버. (E) 하이사이드 전류 측정 모드에서 증폭기로 수집 시스템을 테스트하기 위한 연결이 있는 모델 셀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 난모세포 및 전극 설정. (A) 기록 단계. 원형 구멍의 직경은 36 mm이다. (B) 다양한 전극의 위치를 나타낸 도면. (C) 다양한 전극의 실제 배치. (D) 두 개의 VDIFF 전극과 홀더 및 연결 케이블이 두 개의 서로 다른 자기 클램프에 의해 기록 스테이지에 클램핑되어 있으며, 여기에는 수정된 아가 브릿지 마그네틱 홀더(테이블 오브 머티너틱 홀더)(상단) 및 튜브 클램프(테이블 오브 머티리얼)(하단)가 포함됩니다. 전자는 더 큰 자기 염기 때문에 전극 위치를 유지하는 데 더 안정적이지만 수정이 필요합니다. 유리 마이크로 피펫은 굽힘 각도를 보여주기 위해 작동 위치에서 90 ° 회전합니다. (e) 한 쌍의 난모세포와 전극의 클로즈업 뷰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 대표적인 기록 흔적. (A) 난모세포 실험을 나타낸 도이다. 음수 및 양성 막 전압(Vm) 단계는 -30mV의 유지 Vm으로부터 난모세포 1에 인가되는 반면, 난모세포 2는 -30mV의 일정한 Vm으로 유지된다. 접합 전압(Vj)은 난모세포 1의 난모세포 2-Vm의 Vm으로 정의된다. (B). 샘플 Ij 트레이스 및 생성된 정규화된 접합 전도도 (Gj)-Vj 관계는 UNC-9 동형적 갭 접합부. (c) 샘플 Ij는 UNC-7b 동형적 갭 접합부의 생성된 정규화된 Gj-Vj 관계를 트레이스한다. G j-Vj 관계는 볼츠만 함수(빨간색 선)에 의해 적합하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 단계 아니오. | 열 | 끌다 | 속도 | 시간 |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| 당기는 매개변수(https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html)의 정의에 대해서는 제조업체 웹 사이트의 사용 설명서를 참조하십시오. | ||||
표 1: 전극 당김 파라미터. 이러한 매개 변수는 얇은 벽 유리 모세 혈관 (재료 표)과 P-97 마이크로 피펫 풀러 (재료 표)에서 258의 램프 온도를 기반으로합니다. 풀러에있는이 유리의 램프 온도에 따라 조정해야합니다. 예를 들어, 풀러의 램프 온도가 20° 더 높은 경우 각 단계에 20°를 추가하고 필요한 조정을 수행합니다. 일반적으로, 팁 크기는 마지막 단계의 속도를 조정함으로써 최적화될 수 있다. 당기는 매개 변수(https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html)의 의미에 대해서는 제조업체 웹 사이트의 사용 설명서를 참조하십시오.
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Discussion
시스템 최적화는 이중 난모세포 전압 클램프 실험에 필요한 것으로 보입니다. 그것 없이는 기록이 매우 불안정 할 수 있으며 증폭기가 목표 Vm에 도달하기 위해 과도한 양의 전류를 주입해야 할 수 있으므로 난모세포 손상 및 기록 실패가 발생할 수 있습니다. 몇 가지 요인은 높은 측면 전류 측정 방법으로 안정적인 이중 난모세포 기록을 얻는 데 중요합니다. 첫째, 전류 및 전압 전극은 적절한 저항 (~ 1MΩ)을 가져야하며 홀더는 깨끗해야합니다. 둘째, VDIFF 전극은 낮은 저항 (<150kΩ)을 가져야하며 난모세포에 가깝습니다. 셋째, 동일한 난모세포에 대한 모든 전극 (전압, 전류 및 V DIFF)은 동일한 측면 (왼쪽 또는 오른쪽)에 위치해야하며 전극의 순서 (뒤에서 앞으로)는 전류, 전압 및 VDIFF이어야합니다. 마지막으로, 기준 전극은 사용자를 향해 35-mm 페트리 접시의 가장자리 근처에 위치해야 한다.
우리는 제조업체의 몇 가지 권장 절차를 수정하고 다른 개선을했습니다. 그 중에는 1) VDIFF 전극으로 사용되는 KCl 로딩 한천 브리지 대신 ND96 충진 마이크로 피펫이 있습니다. 유리 전극은 구성하기 쉽고, 재사용이 가능하며, 난모세포에 해롭지 않습니다. 2) 저누설 KCl 전극을 기준전극으로 한다. 이 전극은 낮은 저항 (~ 2.7kΩ)과 안정적인 전위를 가지며 작은 전해질 (~ 5.7 x 10-8 mL / h)을 누출합니다. 3) 난모세포와 다양한 전극의 안정적이고 편리하며 정확한 위치를 지정할 수있는 맞춤 설계 및 건설 된 녹음 플랫폼. 이 단계는 또한 입체 현미경, 이중 구즈넥이있는 광섬유 조명 및 전류 및 전압 전극을 장착하고 배치하는 데 사용되는 네 개의 자기 스탠드에 대한 충분한 액세스를 제공합니다. 4) 얇은 벽 유리 모세관의 일종으로부터 전류 및 전압 전극의 제조. 이들 전극은 원하는 팁 저항 (0.5-1.4 MΩ)을 가지며, 난모세포 세포막을 매우 쉽게 침투 할 수 있으며, 난모세포에 최소한의 손상을 야기 할 수 있습니다.
때때로, 기록 시스템은 비정상적으로 크거나 지속적으로 증가하는 유지 전류, 전류 전극 주위의 세포막의 백색 반점의 발달, 및 전압 명령에 응답하는 불안정한 Vm 트레이스에 의해 지시되는 바와 같이 제대로 작동하지 않는다. 가능한 원인은 1) V DIFF 전극 시스템이 난모세포를 향해 적절하게 조준되지 않은 작은 기포 또는 V DIFF 전극의 팁; 2) 전압 또는 전류 전극이 높은 저항 (예 : >2 MΩ)을 갖거나 그 홀더가 염 퇴적물로부터 더러워졌습니다. 3) VDIFF 전극을 위한 연결 와이어가 파손되고; 4) D.C. 이득은 전압 클램프 동안 IN으로 설정되지 않습니다.
여기에서는 제노푸스 난모세포로부터 ij를 기록하는 방법을 기술하였다. 그것은 두 개의 반대되는 난모세포의 안정적인 전압 클램프를 허용합니다. 이 방법은 구현하기 쉽고 GJ의 생체 물리학 적 특성을 분석하기위한 명백한 한계가없는 것으로 보입니다. 그러나 우리는 다른 출판 된 방법과 어떻게 비교되는지 알 수있는 위치에 있지 않습니다. 우리는 이중 난자 전압 클램프 기술을 설정하는 데 새롭게 관심이있는 실험실이이 방법을 고려할 가치가 있기를 바랍니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
기술 개발의 초기 단계에 참여한 Haiying Zhan, Qian Ge, 수치를 도와 준 Kiranmayi Vedantham 및 난모세포 페어링 챔버에 대한 조언을 해준 Camillo Peracchia 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
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