Summary
Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke gapkryssproteiner i Xenopus oocytter og registrere koblingsstrøm mellom to appocytter ved hjelp av en kommersiell forsterker designet for doble oocyttspenningsklemmeopptak i en høy sidestrøm målemodus.
Abstract
Heterologt uttrykk for connexins og innexins i Xenopus oocytes er en kraftig tilnærming for å studere de biofysiske egenskapene til gapkryss (GJs). Denne tilnærmingen er imidlertid teknisk utfordrende fordi den krever en differensialspenningsklemme på to motsatte oocytter som deler en felles bakke. Selv om et lite antall laboratorier har lyktes med å utføre denne teknikken, har egentlig alle brukt enten hjemmelagde forsterkere eller kommersielle forsterkere som ble designet for enkeltoocyttopptak. Det er ofte utfordrende for andre laboratorier å implementere denne teknikken. Selv om en høy sidestrøm målemodus har blitt innlemmet i en kommersiell forsterker for doble oocyttspenningsklemmeopptak, hadde det ikke vært noen rapport for søknaden før vår nylige studie. Vi har gjort den høye sidestrømsmålemetoden mer praktisk og praktisk ved å introdusere flere tekniske modifikasjoner, inkludert bygging av en magnetisk basert opptaksplattform som muliggjør presis plassering av oocytter og ulike elektroder, bruk av badeløsningen som leder i spenningsdifferensialelektroder, vedtakelse av en kommersiell lavlekkasje KCl-elektrode som referanseelektrode, fabrikasjon av strøm- og spenningselektroder fra tynnveggede glasskapillærer, og posisjonering av alle elektrodene ved hjelp av magnetisk baserte enheter. Metoden beskrevet her tillater praktiske og robuste opptak av koblingsstrøm (Ij) mellom to motsatte Xenopus oocytter.
Introduction
GJs er intercellulære kanaler som kan tillate strømstrøm og utveksling av små cytosoliske molekyler mellom nærliggende celler. De eksisterer i mange celletyper og utfører forskjellige fysiologiske funksjoner. GJs i vertebrater dannes av connexins, mens de invertebrater av innexins. Hver GJ består av to sammenstilte hemichannels med enten 6 eller 8 underenheter per hemichannel, avhengig av om de er connexins eller innexins 1,2,3. Mennesker har 21 konnexingener4, mens de ofte brukte hvirvelløse modellene C. elegans og Drosophila melanogaster har henholdsvis 25 og 8 innexingener. Alternativ skjøting av gentranskripsjoner kan ytterligere øke mangfoldet av GJ-proteiner, i hvert fall for innexiner 7,8.
GJs kan deles inn i tre kategorier basert på molekylære komposisjoner: homotypisk, heterotypisk og hetermerisk. En homotypisk GJ har alle sine underenheter identiske. En heterotypisk GJ har to homomeriske hemichannels, men de to hemichannels er dannet av to forskjellige GJ-proteiner. En heteromerisk GJ inneholder minst ett heteromerisk hemichannel. De molekylære diversitetene til GJs kan gi distinkte biofysiske egenskaper som er viktige for deres fysiologiske funksjoner. GJ biofysiske egenskaper moduleres også av regulatoriske proteiner9. For å forstå hvordan GJs utfører sine fysiologiske funksjoner, er det viktig å kjenne deres molekylære sammensetninger, biofysiske egenskaper og rollene til regulatoriske proteiner i deres funksjoner.
Heterologe uttrykkssystemer brukes ofte til å studere biofysiske egenskaper til ionkanaler, inkludert GJs, og effekten av regulatoriske proteiner på dem. Fordi heteroologe uttrykkssystemer tillater uttrykk for spesifikke proteiner, er de generelt mer mottagelige for å dissekere proteinfunksjoner enn innfødte vev der proteiner med overflødige funksjoner kan komplisere analysen, og registrering av Ij kan være uoppnåelig. Dessverre er de mest brukte cellelinjene unntatt Neuro-2A-cellen upassende for å studere GJ biofysiske egenskaper på grunn av komplikasjoner ved endogene connexins. Selv Neuro-2A celler er ikke alltid egnet for denne typen analyse. For eksempel kunne vi ikke oppdage noen Ij i Neuro-2A-celler transfektert med innexins UNC-7 og UNC-9 i verken fravær eller tilstedeværelse av UNC-1 (upublisert), som kreves for funksjonen til UNC-9 GJs i C. elegans 9,10. På den annen side er Xenopus oocytter et nyttig alternativt system for elektrofysiologiske analyser av GJs. Selv om de uttrykker et endogent GJ-protein, konnexin 38 (Cx38)11, kan potensielle komplikasjoner lett unngås ved å injisere et spesifikt antisense oligonukleotid12. Analyser av GJs med Xenopus oocytter krever imidlertid en differensialspenningsklemme av to sammenstilte celler, noe som er teknisk utfordrende. De tidligste suksessene med dobbeltspenningsklemme av frosk blastomerer ble rapportert for ca 40 år siden13,14. Siden da har mange studier brukt denne teknikken til å spille inn Ij i parede Xenopus oocytter. Imidlertid har egentlig alle de tidligere studiene blitt utført med enten hjemmelagde forsterkere 12,15,16 eller kommersielle forsterkere designet for opptak på enkeltoocytter (GeneClamp 500, AxoClamp 2A eller AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA) 8,17,18,19,20 . Fordi selv de kommersielle forsterkere ikke gir instruksjoner for dobbel oocyttspenningsklemme, er det ofte utfordrende for nye eller mindre sofistikerte elektrofysiologiske laboratorier å implementere denne teknikken.
Bare en kommersiell forsterker er utviklet for dobbel oocyttspenningsklemme, OC-725C fra Warner Instruments (Materialbord, figur 1A). Denne forsterkeren kan brukes enten i standardmodus (for enkle oocytter) eller en målemodus med høy sidestrøm (for enkle eller doble oocytter) avhengig av om to kontakter i spenningssonden er tilkoblet (figur 1B, C). Men frem til vår nylige studie7 hadde det ikke vært en eneste publikasjon som beskrev bruken av denne forsterkeren i sin høye sidestrøm målemodus. Selv om forsterkeren har blitt brukt av et annet laboratorium for doble oocyttopptak, ble den brukt i standarden i stedet for høysidemodus21,22. Denne mangelen på rapporter som bruker forsterkeren i sin høye sidestrøm målemodus kan skyldes tekniske problemer. Vi klarte ikke å oppnå stabile doble oocyttopptak ved hjelp av høysidemodus ved å følge instruksjonene fra produsenten. Gjennom årene har vi prøvd tre forskjellige tilnærminger for doble oocyttopptak, inkludert bruk av to OC-725C-forsterkere i målemodus med høy sidestrøm, to OC-725C forsterkere i standardmodus og to forsterkere fra en annen produsent. Vi lyktes til slutt med å skaffe stabile opptak bare med den første tilnærmingen etter omfattende prøving og feiling. Denne publikasjonen beskriver og demonstrerer prosedyrene vi bruker for å uttrykke GJ-proteiner i Xenopus oocytter, registrere Ij ved hjelp av den høye siden nåværende målemodus, og analysere elektrofysiologiske data ved hjelp av populær kommersiell programvare. Ytterligere informasjon om dobbel spenningsklemmeteknikk finnes i andre publikasjoner 19,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Operasjonene utføres etter en protokoll godkjent av den institusjonelle dyrepleiekomiteen ved University of Connecticut School of Medicine.
1. Frosk kirurgi og forberedelse av defollicuated oocytter
- Bedøv en voksen kvinnelig afrikansk kloret frosk (Xenopus laevis) (Materialbord) ved å fordype seg i en kjølig (med is) trikainoppløsning (~ 300 mg / L).
- Vent (~ 15 min) til frosken viser liten eller ingen respons på å klemme sine webbed føtter. Legg frosken på et operasjonsbord med magen vendt opp.
- Etter et langsgående snitt (8-10 mm langt) på enten venstre eller høyre nedre bukregion, trekk forsiktig ut et lite stykke eggstokkvev med et par tang, og kutt frigjør eggstokkvevet med en liten saks.
- Senk straks det frie eggstokkvevet ned i en Ca2+-fri ND96-løsning (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) inne i en 60 mm Petri-tallerken.
- Etter å ha lukket snittet ved enkle avbrutte suturer ved hjelp av en 5-0 silke sutur (Materialbord), legg frosken tilbake i en grunne vanntank for utvinning.
MERK: Snittet er lukket i to trinn: først bukhinne- og muskellagene, og deretter hudlaget. Hver frosk blir utsatt for 5 operasjoner med minst et 4-ukers intervall mellom to påfølgende operasjoner. - Overfør det isolerte eggstokkvevet til et 50 ml sentrifugerør som inneholder 10 ml Ca2+-fri ND96-oppløsning med 20 mg kollagenase (materialbord) og 20 mg hyaluronidase (materialbord).
- Rist røret på en orbital shaker ved romtemperatur (RT) til alle oocyttene er blitt isolert (ensomme).
- Deretter overfører du 30-50 oocytter til en Petri-tallerken ved hjelp av en glass pasteurpipette og undersøker oocyttene ofte under et stereomikroskop (≥25x høyeste forstørrelseskraft) for å avgjøre om de er avfolliculated.
MERK: Pasteurpipetten skal "kuttes" til en bredere spissåpning ved hjelp av en diamantspisser (Materialbord) og flammes for å glatte ut skjærekanten. - Så snart 70% -80% av oocyttene er defolliculated, dekanterer enzymoppløsningen ved å forsiktig vippe røret. Vask oocyttene 5 ganger ved å fylle opp røret med ND96-oppløsning (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) og dekanter løsningen.
- Etter den endelige vasken, overfør oocyttene til en 60 mm Petri-tallerken som inneholder ND96-løsning. Plukk og overfør store og sunne oocytter til en 60 mm Petri-tallerken som inneholder ND96-oppløsning supplert med natriumpyuvatt (2 mM) og penicillin-streptomycin (100 U/ml) ved hjelp av en ren pasteurpipette i glass.
MERK: "store og sunne oocytter" er stadier V og VI som ikke viser tegn til over fordøyelse av enzymene. - Plasser Petri-retten som inneholder de plukkede oocyttene inne i et miljøkammer (15-18 °C).
2. GJ protein uttrykk
- Syntetiser komplementær RNA (cRNA) av en spesifikk konnexin eller innexin in vitro ved hjelp av et RNA-transkripsjonssett (Materialliste) etter produsentens protokoll.
- Utfell cRNA ved hjelp av en litiumkloridmetode som er beskrevet i brukerhåndboken for RNA-transkripsjonssettet.
- Vask pelletsen med 70% etanol, oppløs den i 20 μL nukleasefri H2O, og tilsett 1 μL ribonukleasehemmer (40 U, Materialbord).
- Mål konsentrasjonen av cRNA ved hjelp av et spektrofotometer (Materialtabell).
- Bland cRNA med en Cx38 antisense oligo slik at de endelige konsentrasjonene er 200-1000 ng/μL cRNA og 100 ng/μL oligo.
MERK: Oligo-sekvensen er 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, som tilsvarer nukleotidene fra -5 til +25 i Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI Accession: NM_001088018)11. Oligo oppbevars som en lagerløsning (2,0 mg/ml) før den blandes med cRNA. - Eliminer partikler i cRNA ved å spinne i en mikrocentrifuge (~ 16,000 x g) i 2 min, og overfør raskt hele supernatanten til et nytt rør ved pipettering (unngå å forstyrre bunnen av mikrocentrifugerøret).
- Del cRNA i aliquots (2,5 μL/hetteglass), og oppbevar aliquots i en -80 °C fryser.
- Forbered en oocyttinjeksjonsfat ved å lime et lite stykke (~ 1 cm x 1 cm) nylonnetting (Materialbord) til bunnen av en 35 mm Petri-tallerken ved hjelp av et hurtigherdet epoksylim.
MERK: Oocyttinjeksjonsfatet kan brukes på nytt. Vask det med 70% etanol etter hver bruk. - Fyll oocyttinjeksjonsfatet omtrent halvveis med ND96-oppløsning (supplert med pyruvat og penicillin-streptomycin).
- Plasser 25-30 oocytter i rader inne i Petri-parabolen.
- Forbered mikropipetter i glass for oocyttinjeksjoner ved å følge instruksjonene i brukerhåndboken for den automatiserte nanoliterinjektoren (materiallisten).
MERK: Bruk av en mikroelektrodeformidler (Materialbord) kan bidra til å produsere skarpe mikropipetter for injeksjon som forårsaker minimal skade på oocytter. - Fyll en injeksjonsmikropipette med lett mineralolje, og sett den inn i mikropipetteholderen til injektoren.
- Overfør cRNA fra en av de lagrede aliquots til innsiden av en Petri parabolen deksel eller bunn ved pipettering.
- Aspirer cRNA-dråpen inn i spissen av mikropipetten ved å trykke på FILL-knappen i injektorkontrolleren.
- Injiser cRNA (~50 nL/oocyte) ved å trykke på INJECT-knappen .
MERK: Injeksjonsvolumet kan stilles inn av dipbryterne i injektorkontrolleren. - Overfør de injiserte oocyttene til en ny Petri-tallerken som inneholder ND96-oppløsning (supplert med pyruvat og penicillin-streptomycin), og hold dem inne i miljøkammeret (15-18 °C) i 1-3 dager (avhengig av GJ-proteinuttrykkshastighet og -nivå). Bytt ut løsningen daglig ved å overføre oocyttene til en ny Petri-tallerken.
3. Oocyte paring
- Overfør noen av de injiserte oocyttene til en 35 mm Petri-tallerken som inneholder ND96-oppløsning.
- Bruk to fine pinsett (Materialbord) for å forsiktig skrelle av den gjennomsiktige vitellinemembranen som omslutter oocytten.
MERK: Det kan være nødvendig å slipe pinsettspissene før første gangs bruk og fra tid til annen bruke et stykke fint (600 Grit) sandpapir. - Plasser 2 oocytter per brønn i et oocyttparingskammer (figur 1D) som inneholder ND96-oppløsning (supplert med pyruvat og penicillin-streptomycin).
MERK: Oocyttparingskammeret er konstruert ved å lime et lite stykke Microwell Minitray (Materialbord) til bunnen av en 35 mm petriskål (Materialbord) ved hjelp av et hurtigherdet epoksylim. Minitray er kuttet i små biter ved hjelp av en varm trådkutter (Materialbord). Bruk av Minitray for oocyttparing ble opprinnelig beskrevet av andre24. Selv om et GJ-protein kan fordele seg ikke-ensartet i oocyttcellemembranen avhengig av ladeegenskaper til aminosyrerester i sine cytosoliske domener25, synes tilfeldig paring (uten å diskriminere mellom dyret og vegetalpolene i oocytten) å være tilstrekkelig generelt. - Oppbevar Petri-retten som inneholder parrede oocytter ved RT på isolasjonsbordet som skal brukes til elektrofysiologiske opptak.
MERK: Paringsvarigheten kan variere fra noen timer til én dag. En praktisk praksis er å pare oocytter sent på ettermiddagen og registrere fra dem neste dag.
4. Klargjøring av anskaffelsessystem
- Konfigurer to OC-725C oocyttklemmeforsterkere (materialbord) til målemodus med høy sidestrøm ved å justere en intern dip-bryter (figur 1B).
- Jord forsterkerne ved først å koble sammen Ground Circuit-kontaktene på bakpanelene og deretter koble til Faraday-buret og fiberlyset som brukes til å belyse opptakskammeret.
- Koble forsterkerne til en analog-til-digital signalkonverterer (Materialfortegnelse), og konfigurer dem i Clampex-modulen til pClamp-programvaren (Materialfortegnelse) ved å følge instruksjonene fra forsterkerprodusenten.
- Test oppkjøpssystemet med modellcellen som følger med forsterkeren.
- Koble VDIFF-proben og strømkablene (I) til modellcellen, koble de røde og svarte kontaktene i VDIFF-sonden til den medfølgende jumperen, koble begge benene på jumperen til en av pinnene i modellcellen, og koble jordledningen i modellcellen til kabelen fra GROUNDS CIRCUIT-kontakten på forsterkeren (figur 1E).
- Null spenningselektroden (Vm) og badelektroden (Im) på forsterkeren ved å dreie henholdsvis VM OFFSET- og Ve OFFSET-knottene, slå klemmen fra AV til enten Rask eller LANGSOM og vri GAIN-rattet med klokken til et nivå som tillater riktig spenningsklemme (figur 1A). D.C GAIN-bryteren kan enten være på OUT- eller IN-posisjon.
- Kjør en enkel anskaffelsesprotokoll som inneholder noen få spenningstrinn for å bekrefte at spenningen som vises i VM-måleren endres i henhold til anskaffelsesprotokollen, og at spennings- og strømspor vises riktig i Clampex.
MERK: Bare én forsterker kan testes hver gang ved hjelp av denne tilnærmingen.
5. Opptak Ij mellom parkoblede oocytter
- Opprett anskaffelsesprotokoller for innspilling Ij i pClamp-programvaren.
MERK: Opprett to anskaffelsesprotokoller. I en av dem brukes forsterker # 1 til å produsere en rekke membranspenningstrinn (Vm) (f.eks. -150 til +90 mV ved 10 mV-intervaller), mens forsterker #2 brukes til å opprettholde en konstant Vm (f.eks. -30 mV). I den andre protokollen brukes forsterker #2 til å produsere Vm-trinnene , mens forsterker # 1 brukes til å opprettholde den konstante Vm. De positive og negative Vm-trinnene bør brukes alternativt (f.eks. -150, +90, -140, +80 ......), som kan programmeres i Clampex ved hjelp av brukerlistefunksjonen i anskaffelsesprotokollen. - Sette opp innspillingsfasen
- Slipp en Petri-tallerken som inneholder parede oocytter, i Petri-tallerkenbeholderen i opptaksplattformen (figur 2A)
- Velg et par oocytter og roter Petri-parabolen om nødvendig slik at de to oocyttene er i venstre og høyre retning, og lås scenen på plass ved den magnetiske basen.
- Fest de magnetiske stativene som holder strøm- og spenningssondene på passende steder på isolasjonsbordet.
MERK: Kontroller at strøm- og spenningssondene fra den ene forsterkeren er plassert på venstre side, mens de fra den andre forsterkeren er på høyre side, og at spenningssonden er foran den nåværende sonden på hver side (figur 2B, C).
- Sett opp referanseelektroden
- Plasser en referanseelektrode (Materialbord) nær kanten av Petri-retten mot brukersiden (figur 2B, C).
- Koble referanseelektroden til den svarte kontakten (Circuit Ground) i bare én av de to VDIFF-sondene .
- Sette opp VDIFF-elektrodene
- Trekk et par mikropipetter i glass, bryt av litt av spissen med diamantskriveren (Materialbord), og glatt ut spisskanten ved å brenne polering.
MERK: Spissmotstanden skal være mindre enn 150 kΩ (målt med ND96 i pipetten). Vanligvis brukes mikropipetter med spissmotstand på 20-150 kΩ. - Hold mikropipetten over flammen på en alkoholbrenner for å bøye den til en jevn vinkel (~130°) i en posisjon ~1 cm fra spissen.
MERK: Fremstilte mikropipetter kan brukes på nytt. Skyll dem med vann etter hver bruk. - Fyll glasspipetten helt med ND96-oppløsning, sett den inn i en forhåndsfylt (med ND96) mikroelektrodeholder (Materialbord, figur 2D), og sørg for at det ikke er luftbobler i systemet.
- Sett den 2 mm pinnen på mikroelektrodholderen inn i 2 mm-kontakten på en V DIFF-elektrodetilkoblingsledning (figur 2D).
- Klem 2 mm-kontakten på en magnetisk basert klemme (figur 2D), og rett spissen av VDIFF-elektroden mot en av de to oocyttene (figur 2E).
MERK: Juster klemmeenhetens posisjon og vinkel slik at elektrodens spiss er svært nær oocytten - Sett 1 mm-pinnen på VDIFF-elektrodens tilkoblingsledning inn i den røde kontakten (VDIFF Input) i VDIFF-proben på samme side.
- Forbered og koble til en VDIFF-elektrode for den andre oocytten og forsterkeren etter lignende prosedyrer.
MERK: Et nærbilde av et par oocytter og alle elektrodene er vist i figur 2E.
- Trekk et par mikropipetter i glass, bryt av litt av spissen med diamantskriveren (Materialbord), og glatt ut spisskanten ved å brenne polering.
- Sett opp strøm- og spenningselektroder
- Forbered spennings- og strømelektroder fra glasskapillær, fyll dem på nytt (omtrent halvveis) med en KCl-løsning (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 med KOH), og sett dem inn i elektrodeholderne som følger med forsterkerne.
MERK: Elektrodene skal ha en motstand på ~1 MΩ. Egnede elektroder kan fås fra en type tynnveggede glasskapillærer (Materialbord) ved hjelp av et bestemt sett med trekkparametere (tabell 1). Slike tips kan lett trenge inn i oocyttcellemembranen uten å måtte trykke på enten VM eller Ve BUZZ-knappen på forsterkeren. - Senk elektrodene ned i badeløsningen, null VM- og Im-målerne ved å dreie VM OFFSET - og Ve OFFSET-hjulene og kontrollere elektrodemotstanden ved å trykke på VM Electrode Test og Ve Electrode Test.
- Sett inn strøm- og spenningselektrodene i oocyttene, og følg negative membranpotensialer (vanligvis -20 til -50 mV).
MERK: VM- og Im-målerne med samme forsterker skal vise to identiske eller svært like verdier.
- Forbered spennings- og strømelektroder fra glasskapillær, fyll dem på nytt (omtrent halvveis) med en KCl-løsning (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 med KOH), og sett dem inn i elektrodeholderne som følger med forsterkerne.
- Datainnsamling
- I klemmedelen på forsterkeren må du kontrollere at D.C. GAIN er på i posisjon, vri GAIN-knappen med urviseren til et nivå som tillater riktig spenningsklemme (vanligvis en tredjedel til halvparten av hele spekteret), og vri klemmebryteren fra AV til FAST.
MERK: Når du slår på klemmen, vil VM- og Im-målerne vise henholdsvis holdespenningen og holdestrømmen. Selv om holdestrømmen kan variere noe avhengig av oocyttforhold, er den generelt liten og stabil ved holdende Vm (f.eks. -30 mV). - Kjør en anskaffelsesprotokoll.
MERK: Fire spor vises på skjermen. Spenningen og strømsporene fra den ene forsterkeren indikerer VM-trinnene som brukes på oocyte #1 og strømmen som trengs for å produsere VM-trinnene , mens de fra den andre forsterkeren indikerer den konstante VM (-30 mV) av oocyte # 2, og strømmen injisert for å opprettholde denne konstante VM. Strømmen som injiseres i oocytt #2 representerer Ij.
- I klemmedelen på forsterkeren må du kontrollere at D.C. GAIN er på i posisjon, vri GAIN-knappen med urviseren til et nivå som tillater riktig spenningsklemme (vanligvis en tredjedel til halvparten av hele spekteret), og vri klemmebryteren fra AV til FAST.
6. Dataanalyse
- Analyse med Clampfit.
- Åpne en innspilt abf-fil i Clampfit-modulen til pClamp.
- Bruk markører 1 og 2 til å omslutte et segment av grunnlinjen før Ij-sporingene .
- Klikk på ikonet Juster opprinnelig plan for å få frem et Opprinnelig plan-vindu. Velg Trekk fra gjennomsnittet for markører 1..2 for Metode, og kontroller at Alle synlige signaler og Alle synlige spor er valgt for Spor valg.
- Når du klikker ok, lukkes Basislinje-vinduet, grunnlinjene for alle gjeldende og spenningsspor konvergerer på nullnivå. Vær oppmerksom på at spenningstrinnene endres til nye nivåer som er lik den opprinnelige spenningen minus holdespenningen (f.eks. -30 mV).
- For å plotte Ij - og Vj-forholdet ved hjelp av steady-state Ij, legg ved et ønsket segment av Ij-sporene som representerer steady-state Ij med markører 1 og 2, plasser markøren 3 hvor som helst i tidsvinduet til spenningstrinnene.
- Gå til Analyser / Hurtigdiagram / I-V for å åpne et I-V-vindu .
- Under X-akse (spenning) velger du Markør 3 fra Signal, angir spenningstrinnsignalet (f.eks. spenning 1) i rullegardinmenyen og merker av for Inverter.
MERK: Det er merket av for Inverter for å konvertere Vm til verdier som tilsvarer Vj, som er definert som Vm av oocytt #2-V m av oocytt #1. - Under Y-akse (strøm) velger du kilden til Ij-signalet (f.eks. gjeldende 0) fra rullegardinmenyen ved siden av Signal, definerer Region som markører 1..2 fra rullegardinmenyen og velger Gjennomsnitt.
MERK: For å plotte topp Ij - og Vj-relasjoner , bør markører 1 og 2 omslutte segmentet av Ij-spor som inneholder toppen jegj i trinn 6.1.5 og velge Peak (i stedet for Mean) i trinn 6.1.8. - Velg Erstatt eller Tilføy under Målalternativ.
- Når du klikker på OK i I-V-vinduet , vises et Ij - Vj-forhold på skjermen, og de tilsvarende Ij - og Vj-verdiene kan bli funnet ved å klikke vindu / resultat.
- Plott og monter Gj-V j-forholdet i OriginPro (Materialfortegnelse)
- Kopier de to kolonnene som inneholder verdiene Vj og Ij , fra Resultat-vinduet i Clampfit (trinn 6.1.10) til en ny arbeidsbok i Origin. Kontroller at verdiene Vj og Ij er under henholdsvis X- og Y-kolonnene.
- Legg til fire nye kolonner i arbeidsboken ved å klikke Kolonne / Legg til nye kolonner.
- Gi den første nye kolonnen navnet Gj, fyll den ved å skrive inn formelen "kolonne Ij/kolonne Vj * 1 000" i vinduet Angi kolonneverdier, og opprett et punkttegning av forholdet Gj-V j.
MERK: Multiplikasjonen med 1000 (valgfritt) er å unngå ulempene ved å håndtere svært små tall i etterfølgende trinn. - Tilpass Gj-datapunktene over de negative og positive Vj-områdene uavhengig av hverandre til Boltzmann-funksjonen. Beregn verdiene Gj ved Vj = 0 mV ved å angi verdiene Gjmax, Gjmin, A og V0 fra armaturen til Boltzmann-ligningen, som kan gjøres i et regneark. Gj som er oppnådd vil bli brukt som Gjmax i neste trinn.
MERK: Ligningen som passer boltzmann-funksjonen er: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, der V0 er Vj-en der ledningsevnen er halvt maksimal, Gjmax er maksimal ledningsevne, Gjmin er Vj-ufølsom resterende ledning23. Hvis du vil utføre armaturen, må du først legge til Boltzmann-ligningen som en ny tilpasningsfunksjon i OriginPro, og deretter velge denne funksjonen for montering. Angi omtrentlige frøverdier for Gjmax, Gjmin, V0 og A før du utfører tilpasningsfunksjonen. Kontroller at Gjmax-parameteren ikke er fast for denne armaturen. - Gi den andre og tredje nye kolonnen navnet nGj-L og nGj-R ("n" for "normalisert"), og fyll dem ved å dele Gj-kolonnen med Gjmax-verdiene avledet fra henholdsvis venstre og høyre Gj - Vj-kurver (trinn 6.2.4).
- Gi den fjerde nye kolonnen navnet nGj-LR, og fyll den ved å kopiere verdier fra henholdsvis de negative og positive Vj-områdene i kolonnene nGj-L og nGj-R.
- Lag en scatter-tomt for nGj-LR over Vj, og tilpass datapunktene over de negative og positive Vj-områdene til Boltzmann-funksjonen uavhengig. Kontroller at Gjmax-parameteren er festet til 1.0 for armaturen.
- Hold oversikt over monteringsresultatene (f.eks. den monterte grafen og verdiene Gjmin, V0 og A ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UNC-7 og UNC-9 er innexiner av C. elegans. Mens UNC-9 bare har en isoform, har UNC-7 flere isoformer som hovedsakelig varierer i lengde og aminosyresekvens av aminoterminalene 7,8. Disse innexinene kan danne homotypiske så vel som heterotypiske (av UNC-7 og UNC-9) GJs når de uttrykkes i Xenopus oocytter 7,8. Representative Ij-spor og de resulterende normaliserte Gj-V j-relasjonene unc-7b og UNC-9 homotypiske GJs er vist i figur 3. I disse eksperimentene med parrede oocytter ble Vm av Oocyte 1 klemt til forskjellige nivåer fra holdespenningen (-30 mV), mens Oocyte 2 ble holdt konstant på -30 mV for å overvåke Ij. Resultatene viser at disse to typene GJs varierer i Vj-avhengig Ij inaktiveringshastighet, Vj-avhengighet (angitt av hellingen til Gj-V j-kurven), og mengden av gjenværende Gj. Mange andre eksempler på UNC-7 og UNC-9 GJs, inkludert utbedring av GJs, finnes i vår nylige publikasjon7.
Figur 1: Oocytt paringskammer og forsterkeroppsett. (A) Frontpanel på oocyttklemmeforsterkeren OC-725C. (B) En DIP-bryter inne i forsterkeren som er konfigurert for den høye sidestrømmålingen. Alle vekslebryterne unntatt 2, 5 og 7 er i AV-posisjon for å bruke forsterkeren i målemodus med høy sidestrøm. (C) En VDIFF-sonde med den røde kontakten (for VDIFF-inngang ) og den svarte kontakten (for Circuit Ground) enten frakoblet eller tilkoblet. Sonden kan brukes til standard spenningsklemmemodus når de to kontaktene er tilkoblet. (D) Et oocyttparingskammer. (E) En modellcelle med tilkoblinger for testing av oppkjøpssystemet med forsterkeren i målemodus med høy sidestrøm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oocytt og elektrodeoppsett. (A) Opptakstrinnet. Det sirkulære hullet har en diameter på 36 mm. (B) Diagram som viser posisjonene til de forskjellige elektrodene. (C) Faktisk utforming av de ulike elektrodene. (D) To VDIFF-elektroder med holdere og tilkoblingskabler klemt på opptakstrinnet av to forskjellige magnetiske klemmer, inkludert en modifisert Agar Bridge Magnetic Holder (Table of Materials) (topp) og en rørklemme (Tabell over materialer) (bunn). Førstnevnte er mer stabil i å opprettholde elektrodeposisjonen på grunn av sin større magnetiske base, men krever modifikasjon. Mikropipettene i glass roteres 90° fra driftsposisjonene for å vise bøyevinklene. (E) Et nærbilde av et par oocytter og elektrodene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representativt opptaksspor. (A) Diagram som viser oocytteksperimentet. Negative og positive membranspenningstrinn (Vm) påføres Oocyte 1 fra en holdende Vm på -30 mV mens Oocyte 2 holdes på en konstant Vm på -30 mV. Den transjunksjonelle spenningen (Vj) er definert som Vm av Oocyte 2 -Vm av Oocyte 1. (B). Prøve Ij spor og den resulterende normaliserte junctional ledning (Gj) -Vj forholdet mellom UNC-9 homotypiske gapkryss. (C) Prøve Ij spor og det resulterende normaliserte Gj-V j-forholdet mellom UNC-7b homotypiske gapkryss. Gj-V j-relasjonene er utstyrt med en Boltzmann-funksjon (røde linjer). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Trinnnr. | Varme | Trekke | Hastighet | Tid |
| 1 | 260 | ... | 40 | 200 |
| 2 | 240 | ... | 40 | 200 |
| 3 | 240 | 60 | 40 | 200 |
| 4 | 245 | 100 | 60 | 200 |
| Se brukerhåndboken på produsentens webområde for definisjoner av trekkparametrene (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html). | ||||
Tabell 1: Elektrodetrekkingsparametere. Disse parametrene er basert på tynnveggede glasskapillærer (Materialbord) og en rampetemperatur på 258 ved en P-97 mikropipettetrekker (Materialbord). De må justeres i henhold til rampetemperaturen for dette glasset på pulleren din. Hvis for eksempel rampetemperaturen på trekkeren er 20° høyere, tilsett 20° i hvert trinn og gjør nødvendige justeringer. Vanligvis kan spissstørrelsen optimaliseres ved å justere hastigheten på det siste trinnet. Se brukerhåndboken på produsentens nettsted for betydninger av trekkparametrene (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Systemoptimalisering ser ut til å være nødvendig for doble oocyttspenningsklemmeeksperimenter. Uten det kan opptakene være svært ustabile, og forsterkerne må kanskje injisere for mye strøm for å nå målet VM, noe som resulterer i oocyttskader og opptaksfeil. Flere faktorer er avgjørende for å oppnå stabile doble oocyttopptak med den høye sidestrømsmålemetoden. For det første må strøm- og spenningselektrodene ha passende motstand (~ 1 MΩ), og holderne må være rene. For det andre må VDIFF-elektrodene ha lav motstand (<150 kΩ) og være nær oocyttene. For det tredje må alle elektrodene for samme oocytt (spenning, strøm og VDIFF) plasseres på samme side (venstre eller høyre), og rekkefølgen på elektrodene (fra baksiden til forsiden) skal være strøm, spenning og VDIFF. Til slutt skal referanseelektroden plasseres nær kanten av 35 mm Petri-parabolen mot brukeren.
Vi har endret noen anbefalte prosedyrer fra produsenten og gjort noen andre forbedringer. Blant dem er: 1) ND96-fylte mikropipetter i stedet for KCl-ladede agarbroer for å tjene som VDIFF-elektroder . Glasselektrodene er enkle å konstruere, gjenbrukbare og ikke-skadelige for oocytter; 2) en lav lekkasje KCl elektrode som referanseelektrode. Denne elektroden har lav motstand (~ 2,7 kΩ) og stabilt potensial, og lekker små elektrolytter (~ 5,7 x 10-8 ml / t); 3) en spesialdesignet og konstruert opptaksplattform som tillater stabil, praktisk og presis posisjonering av oocytter og de forskjellige elektrodene. Dette stadiet gir også god tilgang til et stereomikroskop, et fiberlys med doble goosenecks, og de fire magnetiske stativene som brukes til å montere og plassere strøm- og spenningselektrodene; og 4) fabrikasjon av strøm- og spenningselektroder fra en type tynnveggede glasskapillærer. Disse elektrodene har ønsket spissmotstand (0,5-1,4 MΩ), kan trenge inn i oocyttcellemembranen veldig enkelt, og forårsake minimal skade på oocytter.
Av og til fungerer ikke opptakssystemet som det skal, som indikert av en uvanlig stor eller kontinuerlig økende holdestrøm, utvikling av en hvit flekk i cellemembranen rundt den nåværende elektroden, og ustabile VM-spor som svar på spenningskommandoer. De mulige årsakene er 1) et VDIFF-elektrodesystem har en liten luftboble eller spissen av VDIFF-elektroden er ikke rettet riktig mot oocytten; 2) en spenning eller strømelektrode har høy motstand (f.eks. >2 MΩ) eller holderen er skitten fra saltavsetning; 3) tilkoblingsledningen for en VDIFF-elektrode er ødelagt; 4) D.C. forsterkningen er ikke stilt inn på IN under spenningsklemmen.
Her har vi beskrevet en metode for opptak Ij fra Xenopus oocytes. Det tillater en stabil spenningsklemme på to motsatte oocytter. Denne metoden er enkel å implementere og ser ikke ut til å ha noen åpenbare begrensninger for å analysere de biofysiske egenskapene til GJs. Vi er imidlertid ikke i stand til å fortelle hvordan det sammenlignes med andre publiserte metoder. Vi håper at laboratorier som nylig er interessert i å sette opp den doble oocyttspenningsklemmeteknikken, vil finne denne metoden verdt å vurdere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker Haiying Zhan, Qian Ge for deres engasjement i den første fasen av teknisk utvikling, Kiranmayi Vedantham for å hjelpe med tallene, og Dr. Camillo Peracchia for råd om oocyttparingskammeret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar Bridge Magnetic Holder | ALA Scientific Instruments | MPSALT-H | More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket. |
| Auto Nanoliter Injector | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | Nanoject II | Automated nanoliter injector |
| Collagenase, Type II | Gibco-USA, Langley, OK, USA | 17101-015 | |
| Diamond Scriber | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 62108-ST | |
| Differential Voltage Probe | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | 7255DI | |
| Analog-to-Digital Signal Converter | Molecular Devices, San Jose,CA, USA | Digidata 1440A | |
| Dumont #5 Tweezers | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | 500341 | |
| Glass Capillaries | Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA | 3-000-203-G/X | |
| Hot Wire Cutter | Amazon.com | Proxxon 37080 | An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal. |
| Hyaluronidase, Type I-S | MilliporeSigma, Burlington, MA, USA | H3506 | |
| Magnetic Holder Base | Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA | MB-L-45 | |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instrument, Novato, CA, USA | BV-10 | |
| Microelectrode Holder | World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA | MEH1S15 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument, , Novato, CA, USA | P-97 | |
| mMESSAGE mMACHINETM T3 | Invitrogen-FisherScientific | AM1348 | |
| Nunc MicroWell MiniTray | Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA | 438733 | Microwell Minitray |
| Nylon mesh | Component Supply Company, Sparta, TN, USA | U-CMN-1000 | |
| Oocyte Clamp Amplifier | Warner Instruments, , Hamden, CT, USA | OC-725C | |
| OriginPro | OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA | 2020b | |
| pClamp | Molecular Devices, , San Jose,CA, USA | Version 10 | |
| Reference Electrode | World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA | DRIREF-2SH | Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes |
| RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) | Invitrogen-FisherScientific | 10777-019 | |
| Silk Suture 5-0 | Covidien, North Haven, CT, USA | VS890 | |
| Spectrophotometer NanoDrop Lite | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| Thin Wall Glass Capallaries | World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA | TW150F-4 | |
| Tube Clamper | Narishige International USA, Amityville, NY, USA | CAT-1 | Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base. |
| Xenopus laevis | Xenopus Express, Brooksville, FL, USA | IMP-XL-FM |
References
- Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
- Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
- Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
- Sohl, G., Willecke, K.
- Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J.
- Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
- Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
- Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
- Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
- Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
- Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
- Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
- Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
- Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
- Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
- Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
- Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
- Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
- Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
- Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
- Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
- del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
- Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
- Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).
