Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Запись тока перехода разрыва от ооцитов Ксенопуса

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

Здесь мы представляем протокол для экспрессии белков щелевого перехода в ооцитах Xenopus и регистрации соединительного тока между двумя аппозированными ооцитами с использованием коммерческого усилителя, предназначенного для двойной записи напряжения-зажима ооцитов в режиме измерения высокого бокового тока.

Abstract

Гетерологичная экспрессия коннексинов и иннексинов в ооцитах Xenopus является мощным подходом к изучению биофизических свойств щелевых соединений (ГДЖ). Однако этот подход является технически сложным, поскольку он требует дифференциального напряжения зажима двух противоположных ооцитов, имеющих общую основу. Хотя небольшое количество лабораторий преуспели в выполнении этой техники, по сути, все они использовали либо самодельные усилители, либо коммерческие усилители, которые были разработаны для записи одиночных ооцитов. Другим лабораториям часто сложно реализовать этот метод. Хотя режим измерения высокого бокового тока был включен в коммерческий усилитель для записи двойного напряжения и зажима ооцитов, до нашего недавнего исследования не было отчета о его применении. Мы сделали подход к измерению высокого бокового тока более практичным и удобным, внедрив несколько технических модификаций, включая конструкцию магнитофонной записывающей платформы, которая позволяет точно размещать ооциты и различные электроды, использование раствора ванны в качестве проводника в дифференциальных электродах напряжения, принятие коммерческого электрода KCl с низкой утечкой в качестве электрода сравнения, изготовление электродов тока и напряжения из тонкостенных стеклянных капилляров и позиционирование всех электродов с помощью устройств на магнитной основе. Метод, описанный здесь, позволяет удобно и надежно регистрировать соединительный ток (Ij) между двумя противоположными ооцитами Xenopus .

Introduction

GJ представляют собой межклеточные каналы, которые могут обеспечивать токовый поток и обмен небольшими цитозольными молекулами между соседними клетками. Они существуют во многих типах клеток и выполняют разнообразные физиологические функции. GJ у позвоночных образуются коннексинами, тогда как у беспозвоночных — иннексинами. Каждый GJ состоит из двух сопоставленных гемиханнелей с 6 или 8 субъединицами на гемичаннель, в зависимости от того, являются ли они коннексинами или иннексинами 1,2,3. Люди имеют 21 ген коннексина4, в то время как обычно используемые модели беспозвоночных C. elegans и Drosophila melanogaster имеют 25 и 8 генов инксина соответственно 5,6. Альтернативное сплайсинг транскриптов генов может еще больше увеличить разнообразие белков GJ, по крайней мере, для иннексинов 7,8.

GJ можно разделить на три категории на основе молекулярных композиций: гомотипические, гетеротипические и гетеромерные. Гомотипический GJ имеет все свои субъединицы идентичны. Гетеротипический GJ имеет два гомомерных гемиханнеля, но два гемиханнеля образованы двумя разными белками GJ. Гетеромерный GJ содержит, по меньшей мере, один гетеромерный гемичаннель. Молекулярное разнообразие ГЮ может придавать различные биофизические свойства, которые важны для их физиологических функций. Биофизические свойства GJ также модулируются регуляторными белками9. Чтобы понять, как GJ выполняют свои физиологические функции, важно знать их молекулярный состав, биофизические свойства и роль регуляторных белков в их функциях.

Гетерологичные системы экспрессии часто используются для изучения биофизических свойств ионных каналов, включая GJ, и влияния на них регуляторных белков. Поскольку гетерологичные системы экспрессии позволяют экспрессировать специфические белки, они, как правило, более поддаются препарированию белковых функций, чем нативные ткани, где белки с избыточными функциями могут усложнить анализ, а запись Ij может быть недостижимой. К сожалению, наиболее часто используемые клеточные линии, за исключением клетки Neuro-2A, не подходят для изучения биофизических свойств GJ из-за осложнений эндогенными коннексинами. Даже клетки Neuro-2A не всегда подходят для такого рода анализа. Например, мы не смогли обнаружить I j в клетках Neuro-2A, трансфектированных иннексинами UNC-7 и UNC-9 ни при отсутствии, ни при наличии UNC-1 (неопубликованного), который необходим для функции UNC-9 GJ в C. elegans 9,10. С другой стороны, ооциты Xenopus являются полезной альтернативной системой для электрофизиологического анализа GJ. Хотя они экспрессируют эндогенный белок GJ, коннексин 38 (Cx38)11, потенциальных осложнений можно легко избежать, введя специфический антисмысловой олигонуклеотид12. Тем не менее, анализы GJ с ооцитами Xenopus требуют дифференциального напряжения зажима двух сопоставленных клеток, что технически сложно. О самых ранних успехах двойного напряжения зажима лягушачьих бластомеров сообщалось около 40 лет назад13,14. С тех пор многие исследования использовали эту технику для записи Ij в парных ооцитах Xenopus. Однако практически все предыдущие исследования проводились либо с самодельными усилителями 12,15,16, либо с коммерческими усилителями, предназначенными для записи на одиночных ооцитах (GeneClamp 500, AxoClamp 2A или AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Поскольку даже коммерческие усилители не предоставляют инструкций для зажима двойного напряжения ооцитов, новым или менее сложным электрофизиологическим лабораториям часто сложно реализовать этот метод.

Только один коммерческий усилитель был разработан для двойного зажима напряжения ооцитов, OC-725C от Warner Instruments (Таблица материалов, рисунок 1A). Этот усилитель может быть использован либо в стандартном режиме (для одиночных ооцитов), либо в режиме измерения тока высокой стороны (для одиночных или двойных ооцитов) в зависимости от того, подключены ли две розетки в его датчике напряжения (фиг.1B, C). Однако до нашего недавнего исследования7 не было ни одной публикации, описывающей использование этого усилителя в режиме измерения тока высокой стороны. Хотя усилитель использовался другой лабораторией для записи двойных ооцитов, он использовался в стандартном, а не в высоком боковом режиме21,22. Это отсутствие отчетов с использованием усилителя в режиме измерения тока с высокой стороной может быть связано с техническими трудностями. Мы не смогли получить стабильные записи двойных ооцитов в режиме высокой стороны, следуя инструкциям производителя. На протяжении многих лет мы пробовали три различных подхода к записи двойных ооцитов, в том числе с использованием двух усилителей OC-725C в режиме измерения тока высокой стороны, двух усилителей OC-725C в стандартном режиме и двух усилителей от другого производителя. В конце концов нам удалось получить стабильные записи только при первом подходе после обширных проб и ошибок. Эта публикация описывает и демонстрирует процедуры, которые мы используем для экспрессии белков GJ в ооцитах Xenopus, записи Ij с использованием режима измерения тока высокой стороны и анализа электрофизиологических данных с использованием популярного коммерческого программного обеспечения. Дополнительную информацию о технике двойного напряжения-зажима можно найти в других публикациях19,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Операции выполняются в соответствии с протоколом, утвержденным институциональным комитетом по уходу за животными Медицинской школы Университета Коннектикута.

1. Лягушачья хирургия и подготовка дефолликуированных ооцитов

  1. Обезболить взрослую самку африканской когтистой лягушки (Xenopus laevis) (Таблица материалов), погружая в прохладный (со льдом) раствор трикаина (~300 мг/л).
  2. Подождите (~ 15 минут), пока лягушка не покажет мало или вообще не отреагирует на сдавливание своих перепончатых ног. Положите лягушку на операционный стол животом вверх.
  3. После продольного разреза (длиной 8-10 мм) на левой или правой нижней части живота аккуратно вытащите небольшой кусочек ткани яичника парой щипцов и вырежьте ткань яичника парой мелких ножниц.
  4. Немедленно погрузить свободную ткань яичника в раствор Ca2+-free ND96 (NaCl 99 мМ, KCl 2 мМ, MgCl2 1 мМ, HEPES 5 мМ, рН 7,5) внутрь 60-мм чашки Петри.
  5. После закрытия разреза простыми прерванными швами с использованием шелкового шва 5-0 (Таблица материалов), поместите лягушку обратно в резервуар для мелкой воды для восстановления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез закрывается в два этапа: сначала брюшиный и мышечный слои, а затем слой кожи. Каждая лягушка подвергается 5 операциям с интервалом не менее 4 недель между двумя последовательными операциями.
  6. Переведите выделенную ткань яичника в 50-мл центрифужную трубку, содержащую 10 мл свободного с Ca2+ раствора ND96 с 20 мг коллагеназы (Таблица материалов) и 20 мг гиалуронидазы (Таблица материалов).
  7. Встряхните трубку на орбитальном шейкере при комнатной температуре (RT) до тех пор, пока все ооциты не станут изолированными (одиночными).
  8. После этого переведите 30-50 ооцитов в чашку Петри с помощью стеклянной пипетки Пастера и часто исследуйте ооциты под стереомикроскопом (≥25-кратная наибольшая мощность увеличения), чтобы определить, дефолликулируются ли они.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетку Пастера следует «разрезать» до более широкого отверстия наконечника с помощью алмазного писца (Таблица материалов) и обжечь, чтобы сгладить режущую кромку.
  9. Как только 70%-80% ооцитов дефолликулируют, декантируют раствор фермента, осторожно наклоняя трубку. Промыть ооциты 5 раз, заполнив пробирку раствором ND96 (NaCl 96 мМ, KCl 2 мМ, CaCl2 1,8 мМ, MgCl2 1 мМ, HEPES 5 мМ, рН 7,5) и декантируя раствор.
  10. После окончательной промывки переложите ооциты в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую раствор ND96. Соберите и перенесите крупные и здоровые на вид ооциты в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую раствор ND96, дополненный пируватом натрия (2 мМ) и пенициллин-стрептомицином (100 ЕД/мл), используя чистую стеклянную пипетку Пастера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: «Большие и здоровые на вид ооциты» - это яйцеклетки стадий V и VI, не показывающие признаков переваривания ферментами.
  11. Поместите чашку Петри, содержащую собранные ооциты, в камеру окружающей среды (15-18 °C).

2. Экспрессия белка GJ

  1. Синтезировать комплементарную РНК (цРНК) конкретного коннексина или иннексина in vitro с помощью набора транскрипции РНК (Таблица материалов) в соответствии с протоколом производителя.
  2. Осаждение кРНК с помощью метода хлорида лития, описанного в руководстве пользователя набора транскрипции РНК.
  3. Промыть гранулу 70% этанолом, растворить ее в 20 мкл не содержащего нуклеазыН2Ои добавить 1 мкл ингибитора рибонуклеазы (40 ЕД, таблица материалов).
  4. Измерьте концентрацию цРНК с помощью спектрофотометра (Таблица материалов).
  5. Смешайте цРНК с антисмысловым олиго Cx38 таким образом, чтобы конечные концентрации составляли 200-1000 нг/мкл цРНК и 100 нг/мкл олиго.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Олигопоследовательность представляет собой 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, что соответствует нуклеотидам от -5 до +25 в мРНК Xenopus laevis Cx38 (присоединение к NCBI: NM_001088018)11. Олиго выдерживают в виде исходного раствора (2,0 мг/мл) перед смешиванием с цРНК.
  6. Устраните частицы в цРНК путем вращения в микроцентрифуге (~16 000 х г) в течение 2 мин и быстро перенесите весь супернатант в новую трубку путем пипетирования (избегайте нарушения дна трубки микроцентрифуги).
  7. Разделите цРНК на аликвоты (2,5 мкл/флакон) и храните аликвоты в морозильной камере с температурой -80 °C.
  8. Приготовьте чашку для инъекций ооцитов, приклеив небольшой кусочек (~1 см х 1 см) нейлоновой сетки (Таблица материалов) на дно 35-миллиметровой чашки Петри с использованием эпоксидного клея быстрого отверждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чашка для инъекций ооцитов является многоразовой. Мойте его 70% этанолом после каждого использования.
  9. Наполните чашку для инъекций ооцитов примерно наполовину раствором ND96 (дополненным пируватом и пенициллин-стрептомицином).
  10. Поместите 25-30 ооцитов рядами внутрь чашки Петри.
  11. Подготовьте стеклянные микропипетты для инъекций ооцитов, следуя инструкциям в руководстве пользователя автоматизированного нанолитрового инжектора (Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микроэлектродного фаски (Таблица материалов) может помочь производить острые инъекционные микропипетты, которые вызывают минимальное повреждение ооцитов.
  12. Засыпьте микропипетку для инъекций легким минеральным маслом и вставьте ее в держатель микропипетки инжектора.
  13. Перенос цРНК с одной из хранящихся аликвот на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри или дно путем пипетирования.
  14. Аспирируйте каплю кРНК в кончик микропипетки, нажав кнопку FILL в контроллере инжектора.
  15. Введите цРНК (~50 нЛ/ооцит), нажав кнопку INJECT .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Громкость впрыска может быть установлена погружными переключателями в контроллере инжектора.
  16. Переведите введенные ооциты в новую чашку Петри, содержащую раствор ND96 (дополненный пируватом и пенициллин-стрептомицином), и держите их внутри камеры окружающей среды (15-18 °C) в течение 1-3 дней (в зависимости от скорости и уровня экспрессии белка GJ). Заменяйте раствор ежедневно, перенося ооциты в новую чашку Петри.

3. Спаривание ооцитов

  1. Переведите несколько введенных ооцитов в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую раствор ND96.
  2. Используйте два тонких пинцета (Таблица материалов), чтобы аккуратно отклеить прозрачную вителлиновую мембрану, которая обертывает яйцеклетку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться заточить кончики пинцета перед первым использованием и время от времени, используя кусок мелкой (600 зернистости) наждачной бумаги.
  3. Поместите 2 ооцита на лунку в камеру спаривания ооцитов (рисунок 1D), содержащую раствор ND96 (дополненный пируватом и пенициллин-стрептомицином).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Камера для спаривания ооцитов построена путем приклеивания небольшого кусочка микролунки Minitray (Таблица материалов) к нижней части 35-миллиметровой чашки Петри (Таблица материалов) с использованием эпоксидного клея быстрого отверждения. Minitray разрезается на мелкие кусочки с помощью горячего проволочного резака (Таблица материалов). Использование Minitray для спаривания ооцитов было первоначально описано другими24. Хотя белок GJ может распределяться неравномерно в клеточной мембране ооцитов в зависимости от зарядовых свойств аминокислотных остатков в его цитозольных доменах25, случайное спаривание (без различия между животным и растительным полюсами ооцита) представляется достаточным в целом.
  4. Держите чашку Петри, содержащую парные ооциты в RT, на таблице изоляции, которая будет использоваться для электрофизиологических записей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность сопряжения может варьироваться от нескольких часов до одного дня. Удобной практикой является сопряжение ооцитов в конце дня и запись из них на следующий день.

4. Подготовка системы сбора

  1. Сконфигурируйте два усилителя зажимов ооцитов OC-725C (Таблица материалов) в режим измерения тока высокой стороны путем регулировки внутреннего переключателя погружения (рисунок 1B).
  2. Заземлите усилители, сначала соединив разъемы Ground Circuit на задних панелях, а затем подключившись к клетке Фарадея и оптоволоконному свету, используемому для освещения камеры записи.
  3. Подключите усилители к аналого-цифровому преобразователю сигналов (Таблица материалов) и настройте их в модуле Clampex программного обеспечения pClamp (Таблица материалов), следуя инструкциям производителя усилителя.
  4. Протестируйте систему сбора данных с помощью модельной ячейки, поставляемой с усилителем.
    1. Подключите датчик VDIFF и токовую (I) кабели к ячейке модели, подключите красную и черную розетки в зонде VDIFF с прилагаемой перемычкой, подключите любую ножку перемычки к любому контакту в ячейке модели и подключите заземляющий провод в ячейке модели к кабелю из гнезда GROUNDS CIRCUIT усилителя (рисунок 1E).
    2. Обнулите измерители электрода напряжения (Vm) и электрода ванны (Im) усилителя, повернув ручки Vm OFFSET и Ve OFFSET соответственно, переключите Зажим с OFF на Fast или SLOW и поверните циферблат GAIN по часовой стрелке до уровня, который позволяет использовать правильный зажим напряжения (рисунок 1A). Переключатель D.C. GAIN может находиться в положении OUT или IN.
    3. Запустите простой протокол сбора, содержащий несколько шагов напряжения, чтобы убедиться, что напряжение, отображаемое в измерителе Vm, изменяется в соответствии с протоколом сбора и что следы напряжения и тока отображаются правильно в Clampex.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз с использованием этого подхода можно тестировать только один усилитель.

5. Запись Ij между парными ооцитами

  1. Создание протоколов сбора для записи Ij в программном обеспечении pClamp.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Создайте два протокола сбора. В одном из них усилитель No1 используется для получения серии шагов мембранного напряжения (Вм) (например, от -150 до +90 мВ с интервалами 10 мВ), тогда как усилитель No2 используется для поддержания постоянного Вм (например, -30 мВ). В другом протоколе усилитель No 2 используется для получения шагов Vm, тогда как усилитель # 1 используется для поддержания постоянного Vm. Положительная и отрицательная стадии V m должны применяться альтернативно (например, -150, +90, -140, +80 ......), которые могут быть запрограммированы в Clampex с помощью функции User List в протоколе сбора.
  2. Настройка этапа записи
    1. Опустите одну чашку Петри, содержащую парные ооциты, в емкость чашки Петри на записывающей платформе (рисунок 2A)
    2. Выберите пару ооцитов и при необходимости поверните чашку Петри так, чтобы два ооцита находились в левом и правом направлении, и зафиксируйте сцену в нужном положении своим магнитным основанием.
    3. Закрепите магнитные стойки, удерживающие датчики тока и напряжения, в соответствующих местах на изоляционном столе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что датчики тока и напряжения от одного усилителя расположены с левой стороны, в то время как датчики от другого усилителя находятся с правой стороны, и что датчик напряжения находится перед датчиком тока с каждой стороны (рисунок 2B, C).
  3. Настройка опорного электрода
    1. Поместите опорный электрод (Таблица материалов) рядом с краем чашки Петри со стороны пользователя (рисунок 2B, C).
    2. Подключите опорный электрод к черной розетке (Circuit Ground) только в одном из двух датчиков VDIFF .
  4. Настройка электродов VDIFF
    1. Вытащите пару стеклянных микропипет, отломите немного наконечника алмазным писцом (Таблица материалов) и сгладьте край наконечника огневой полировкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление наконечника должно быть менее 150 кОм (измеряется с помощью ND96 в пипетке). Обычно используются микропипетты с сопротивлением наконечника 20-150 кОм.
    2. Держите микропипетку над пламенем спиртовой горелки, чтобы согнуть ее под углом (~130°) в положении ~1 см от наконечника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изготовленные микропипетты являются многоразовыми. Ополаскивайте их водой после каждого использования.
    3. Полностью засыпьте стеклянную пипетку раствором ND96, вставьте ее в предварительно заполненный (с ND96) держатель микроэлектрода (Таблица материалов, рисунок 2D) и убедитесь, что в системе нет пузырьков воздуха.
    4. Вставьте 2-миллиметровый контакт держателя микроэлектрода в 2-мм разъем соединительного провода электрода VDIFF (рисунок 2D).
    5. Зажмите 2-миллиметровое гнездо на магнитном зажиме (рисунок 2D) и направьте кончик электрода VDIFF к одному из двух ооцитов (рисунок 2E).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте положение и угол зажима так, чтобы кончик электрода находился очень близко к ооциту
    6. Вставьте 1-миллиметровый контакт соединительного провода электрода VDIFF в красную розетку (вход VDIFF ) в датчике VDIFF с той же стороны.
    7. Подготовьте и подключите электрод VDIFF для другого ооцита и усилителя, следуя аналогичным процедурам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крупный план пары ооцитов и всех электродов показан на рисунке 2E.
  5. Настройка электродов тока и напряжения
    1. Подготовьте электроды напряжения и тока из стеклянных капилляров, засыпьте их (примерно наполовину) раствором KCl (KCl 3,0 M, EGTA 10 мМ, HEPES 10 мМ, pH 7,4 с KOH) и вставьте их в держатели электродов, поставляемые с усилителями.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электроды должны иметь сопротивление ~1 МОм. Подходящие электроды могут быть получены из типа тонкостенных стеклянных капилляров (Таблица материалов) с использованием определенного набора параметров вытягивания (таблица 1). Такие наконечники могут легко проникать в клеточную мембрану ооцитов без необходимости нажимать кнопку Vm или Ve BUZZ на усилителе.
    2. Опустите электроды в раствор ванны, обнулите измерители Vm и Im, повернув циферблаты Vm OFFSET и Ve OFFSET , и проверьте сопротивление электрода, нажав Vm Electrode Test и Ve Electrode Test.
    3. Вставьте электроды тока и напряжения в ооциты и наблюдайте отрицательные мембранные потенциалы (обычно от -20 до -50 мВ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерители Vm и Im одного и того же усилителя должны отображать два одинаковых или очень похожих значения.
  6. Сбор данных
    1. В разделе «Зажим» усилителя убедитесь, что D.C. GAIN находится в положении IN , поверните ручку GAIN по часовой стрелке до уровня, позволяющего обеспечить надлежащий зажим напряжения (обычно от одной трети до половины полного диапазона), и поверните переключатель зажима с OFF на FAST.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При включении зажима измерители Vm и Im будут отображать удерживающее напряжение и удерживающий ток соответственно. Хотя удерживающий ток может несколько варьироваться в зависимости от состояния ооцитов, он, как правило, мал и стабилен при удерживающем Vм (например, -30 мВ).
    2. Запустите протокол сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На экране будут отображены четыре следа. Следы напряжения и тока от одного усилителя указывают на ступени Vm , приложенные к ооциту No 1, и ток, необходимый для получения шагов Vm , тогда как следы от другого усилителя указывают на константу Vm (-30 мВ) ооцита No 2 и ток, вводимый для поддержания этой константы Vm. Ток, вводимый в яйцеклетку No 2, представляет собой Ij.

6. Анализ данных

  1. Анализ с помощью Clampfit.
    1. Откройте записанный файл abf в модуле Clampfit pClamp.
    2. Используйте курсоры 1 и 2, чтобы заключить сегмент базовой линии перед трассировками Ij .
    3. Щелкните значок Настроить базовую линию, чтобы открыть окно «Базовый план». Выберите Вычесть среднее значение курсоров 1..2 для параметра Метод и убедитесь, что для параметра Выделение трассировки выбраны все видимые сигналы и Все видимые трассировки.
    4. При нажатии кнопки ОК окно Базовая линия закрывается, базовые линии всех следов тока и напряжения сходятся на нулевом уровне. Обратите внимание, что шаги напряжения изменяются на новые уровни, которые равны исходному напряжению минус удерживающее напряжение (например, -30 мВ).
    5. Чтобы построить отношение Ij и Vj с использованием стационарного состояния Ij, заключите желаемый сегмент трассировок I j, представляющих стационарное состояние Ij с курсорами 1 и 2, поместите курсор 3 в любом месте во временном окне шагов напряжения.
    6. Перейдите в раздел Анализ/Быстрый график/I-V , чтобы открыть окно I-V .
    7. В разделе Ось X (Напряжение) выберите Курсор 3 из Сигнал, укажите сигнал шага напряжения (например, Напряжение 1) в раскрывающемся меню и установите флажок Инвертировать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Установлен флажок Инвертировать для преобразования Vm в значения, эквивалентные Vj, которые определяются как Vm ооцита #2-V m ооцита #1.
    8. В разделе Ось Y (Ток) выберите источник сигнала Ij (например, Current 0) в раскрывающемся меню рядом с пунктом Сигнал, определите Регион как Курсоры 1..2 в раскрывающемся меню и выберите Среднее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы построить пиковые отношения Ij и Vj , курсоры 1 и 2 должны заключить сегмент трассировок Ij , содержащий пик Ij на шаге 6.1.5, и выбрать Пик (вместо Среднего) на шаге 6.1.8.
    9. В разделе Назначение выберите Заменить или Добавить.
    10. При нажатии кнопки OK в окне I-V на экране отображается отношение Ij - Vj , а соответствующие значения Ij и Vj можно найти, щелкнув Окно/Результат.
  2. Построение и соответствие отношения Gj-V j в OriginPro (Таблица материалов)
    1. Скопируйте два столбца, содержащие значения Vj и Ij , из окна Результаты Clampfit (шаг 6.1.10) в новую книгу в Origin. Убедитесь, что значения Vj и Ij находятся в столбцах X и Y соответственно.
    2. Добавьте четыре новых столбца в книгу, щелкнув Столбец/Добавить новые столбцы.
    3. Назовите первый новый столбец как Gj, заполните его, введя в уравнение «столбец Ij/столбец Vj * 1,000» в окне Задать значения столбцов, и создайте точечную диаграмму отношения Gj-V j.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Умножение на 1000 (факультативно) позволяет избежать неудобств, связанных с работой с очень небольшими числами на последующих этапах.
    4. Подогнать точки данных Gj над отрицательным и положительным V j диапазонами независимо от функции Больцмана. Вычислите Gj при Vj = 0 мВ, введя значения Gjmax, Gjmin, A и V0 из подгонки в уравнение Больцмана, что можно сделать в электронной таблице. Полученный таким образом Gj будет использоваться как Gjmax на следующем шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уравнение, соответствующее функции Больцмана: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, в котором V0 — Vj, при котором проводимость полумаксимальна, Gjmax — максимальная проводимость, Gjmin — V j-нечувствительная остаточная проводимость23. Чтобы выполнить подгонку, сначала добавьте уравнение Больцмана в качестве новой функции подгонки в OriginPro, а затем выберите эту функцию для подгонки. Введите приблизительные начальные значения для Gjmax, Gjmin, V0 и A перед выполнением функции подгонки. Убедитесь, что параметр Gjmax не зафиксирован для этой установки.
    5. Назовите второй и третий новые столбцы как nGj-L и nGj-R ("n" для "нормализованных") и заполните их, разделив столбец Gj на значения Gjmax, полученные из левой и правой кривых Gj - V j соответственно (шаг 6.2.4).
    6. Назовите четвертый новый столбец nGj-LR и заполните его, скопировав значения из отрицательного и положительного диапазонов Vj столбцов nGj-L и nGj-R соответственно.
    7. Создайте точечную диаграмму для nGj-LR над Vj и независимо друг от друга поместите точки данных в отрицательном и положительном диапазонах V j в функцию Больцмана. Убедитесь, что параметр Gjmax зафиксирован на уровне 1,0 для установки.
    8. Ведите учет результатов подгонки (например, установленный график и значения Gjmin, V0 и A ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UNC-7 и UNC-9 являются иннексинами C. elegans. В то время как UNC-9 имеет только одну изоформу, UNC-7 имеет несколько изоформ, которые отличаются главным образом длиной и аминокислотной последовательностью своих аминотермий 7,8. Эти иннексины могут образовывать гомотипические, а также гетеротипические (UNC-7 и UNC-9) GJ при экспрессии в ооцитах Xenopus 7,8. Репрезентативные следы Ij и результирующие нормализованные отношения Gj-V j гомотипических GJ UNC-7b и UNC-9 показаны на рисунке 3. В этих экспериментах с парными ооцитами Vm oocyte 1 были зажаты до различных уровней от удерживающего напряжения (-30 мВ), тогда как напряжение Oocyte 2 оставалось постоянным при -30 мВ для мониторинга Ij. Результаты показывают, что эти два типа GJ отличаются Vj-зависимой скоростью инактивации Ij, зависимостью Vj (обозначенной наклоном кривой Gj-V j) и величиной остаточного Gj. Многие другие примеры UNC-7 и UNC-9 GJ, включая исправление GJ, можно найти в нашей недавней публикации7.

Figure 1
Рисунок 1: Установка камеры спаривания ооцитов и усилителя. (А) Передняя панель усилителя зажима ооцитов OC-725C. (B) DIP-переключатель внутри усилителя, сконфигурированный для измерения тока на высокой стороне. Все тумблеры, кроме 2, 5 и 7, находятся в положении OFF для использования усилителя в режиме измерения тока высокой стороны. (C) Датчик VDIFF с красным разъемом (для входа VDIFF ) и черным разъемом (для Circuit Ground) либо неподключенным, либо подключенным. Зонд может использоваться для стандартного режима зажима напряжения при подключении двух разъемов. (D) Камера спаривания ооцитов. (E) Модельная ячейка с соединениями для тестирования системы сбора данных с усилителем в режиме измерения тока высокой стороны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Установка ооцитов и электродов. (А) Этап записи. Круглое отверстие имеет диаметр 36 мм. (B) Диаграмма, показывающая положения различных электродов. (C) Фактическая компоновка различных электродов. (D) Два электрода VDIFF с их держателями и соединительными кабелями, зажатыми на сцене записи двумя различными магнитными зажимами, включая модифицированный магнитный держатель Agar Bridge (таблица материалов) (вверху) и зажим трубки (таблица материалов) (внизу). Первый более стабилен в поддержании положения электрода из-за его большего магнитного основания, но требует модификации. Стеклянные микропипетты поворачиваются на 90° от их рабочего положения, чтобы показать углы изгиба. (E) Крупный план пары ооцитов и электродов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные следы записи. (А) Диаграмма, показывающая эксперимент с ооцитами. Отрицательные и положительные стадии мембранного напряжения (Vm) применяются к oocyte 1 от удержания Vm -30 мВ, тогда как Oocyte 2 удерживается при постоянном Vm -30 мВ. Трансъюнкционное напряжение (Vj) определяется как Vm ооцита 2 -Vm ооцита 1. (B). Образец Ij следов и результирующая нормализованная переходная проводимость (Gj)-Vj отношения гомотипических зазоров UNC-9. (C) Образец следов Ij и результирующая нормализованная связь Gj-V j гомотипических зазорных переходов UNC-7b. Отношения Gj-V j подогнаны функцией Больцмана (красные линии). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Шаг No. Жара Тянуть Скорость Время
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
Обратитесь к руководству пользователя на веб-сайте производителя для определения параметров вытягивания (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Таблица 1: Параметры вытягивания электродов. Эти параметры основаны на тонкостенных стеклянных капиллярах (Таблица материалов) и температуре рампы 258 на съемнике микропипетки P-97 (Таблица материалов). Они должны быть отрегулированы в соответствии с температурой рампы для этого стекла на вашем съемнике. Например, если температура рампы на съемнике на 20° выше, добавьте 20° к каждому шагу и внесите необходимые коррективы. Как правило, размер наконечника может быть оптимизирован путем регулировки скорости последнего шага. Пожалуйста, обратитесь к руководству пользователя на веб-сайте производителя для получения значений параметров вытягивания (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оптимизация системы, по-видимому, необходима для экспериментов с двойным напряжением и зажимом ооцитов. Без него записи могут быть очень нестабильными, и усилителям, возможно, придется вводить чрезмерное количество тока, чтобы достичь целевого Vm, что приводит к повреждению ооцитов и сбоям записи. Несколько факторов имеют решающее значение для получения стабильных записей двойных ооцитов с помощью метода измерения высокого бокового тока. Во-первых, электроды по току и напряжению должны иметь соответствующее сопротивление (~1 МОм), а их держатели должны быть чистыми. Во-вторых, электроды VDIFF должны иметь низкое сопротивление (<150 кОм) и находиться близко к ооцитам. В-третьих, все электроды для одного и того же ооцита (напряжение, ток и VDIFF) должны быть расположены на одной стороне (слева или справа), а порядок электродов (сзади на фронт) должен быть током, напряжением и VDIFF. Наконец, опорный электрод должен быть расположен вблизи края 35-мм чашки Петри по направлению к пользователю.

Мы модифицировали несколько рекомендованных процедур от производителя и внесли некоторые другие улучшения. Среди них: 1) заполненные ND96 микропипетты вместо Агаровых мостиков, нагруженных KCl, которые служат электродами VDIFF . Стеклянные электроды просты в конструировании, многоразовые и не вредны для ооцитов; 2) электрод KCl с низкой утечкой в качестве электрода сравнения. Этот электрод имеет низкое сопротивление (~2,7 кОм) и стабильный потенциал, а также пропускает мало электролитов (~5,7 х 10-8 мл/ч); 3) специально разработанная и изготовленная записывающая платформа, которая обеспечивает стабильное, удобное и точное позиционирование ооцитов и различных электродов. Эта ступень также обеспечивает широкий доступ к стереомикроскопу, оптоволоконному светильнику с двойными гусиными шеями и четырем магнитным стойкам, используемым для установки и позиционирования электродов тока и напряжения; и 4) изготовление электродов тока и напряжения из типа тонкостенных стеклянных капилляров. Эти электроды имеют желаемое сопротивление наконечника (0,5-1,4 МОм), могут очень легко проникать в клеточную мембрану ооцитов и вызывать минимальное повреждение ооцитов.

Иногда система записи не работает должным образом, о чем свидетельствует необычно большой или постоянно увеличивающийся удерживающий ток, развитие белого пятна в клеточной мембране вокруг электрода тока и нестабильные следы Vm в ответ на команды напряжения. Возможными причинами являются: 1) электродная система VDIFF имеет небольшой воздушный пузырь или кончик электрода VDIFF не направлен должным образом к ооциту; 2) электрод напряжения или тока имеет высокое сопротивление (например, >2 МОм) или его держатель загрязнен от отложений соли; 3) оборвался соединительный провод для электрода VDIFF ; 4) коэффициент усиления D.C не установлен на IN во время зажима напряжения.

Здесь мы описали метод записи Ij из ооцитов Xenopus . Это позволяет стабильное напряжение зажима двух противоположных ооцитов. Этот метод прост в реализации и, по-видимому, не имеет очевидных ограничений для анализа биофизических свойств ГУ. Тем не менее, мы не в состоянии сказать, как он сравнивается с другими опубликованными методами. Мы надеемся, что лаборатории, которые недавно заинтересовались настройкой метода двойного напряжения-зажима ооцитов, найдут этот метод достойным рассмотрения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Хайин Чжань, Цянь Гэ за их участие в начальной стадии технического развития, Киранмайи Ведантама за помощь с цифрами и доктора Камилло Пераккья за советы по камере спаривания ооцитов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
  2. Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
  3. Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
  4. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  5. Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
  6. Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
  7. Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
  8. Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
  9. Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
  10. Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
  11. Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
  12. Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
  13. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
  15. Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
  16. Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
  17. Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
  18. Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
  19. Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
  20. Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
  21. Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
  22. Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
  23. del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
  24. Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
  25. Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).

Tags

Биология выпуск 179 щелевой переход инксин Caenorhabditis elegans C. elegans Xenopus oocytes соединительный ток зажим напряжения
Запись тока перехода разрыва от <em>ооцитов Ксенопуса</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter