Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Inspelning av gapkorsningsström från Xenopus-oocyter

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63361
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience, University of Connecticut School of Medicine

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att uttrycka gapkorsningsproteiner i Xenopus-oocyter och registrera korsningsström mellan två apposerade oocyter med hjälp av en kommersiell förstärkare avsedd för dubbla oocytespänningskläminspelningar i ett mätläge med hög sidoström.

Abstract

Heterologt uttryck av konnexiner och innexiner i Xenopus-oocyter är ett kraftfullt tillvägagångssätt för att studera de biofysiska egenskaperna hos gapkorsningar (GJ). Detta tillvägagångssätt är dock tekniskt utmanande eftersom det kräver en differentiell spänningsklämma av två motsatta oocyter som delar en gemensam grund. Även om ett litet antal laboratorier har lyckats utföra denna teknik, har i princip alla använt antingen hemlagade förstärkare eller kommersiella förstärkare som var utformade för en-oocyte inspelningar. Det är ofta utmanande för andra laboratorier att implementera denna teknik. Även om ett mätläge med hög sidoström har införlivats i en kommersiell förstärkare för inspelningar av dubbla oocytespänningsklämmor, hade det inte funnits någon rapport för dess tillämpning förrän vår senaste studie. Vi har gjort mätmetoden för hög sidoström mer praktisk och bekväm genom att införa flera tekniska modifieringar, inklusive konstruktionen av en magnetiskt baserad inspelningsplattform som möjliggör exakt placering av oocyter och olika elektroder, användning av badlösningen som ledare i spänningsdifferentialelektroder, antagande av en kommersiell KCl-elektrod med lågt läckage som referenselektrod, tillverkning av ström- och spänningselektroder från tunnväggiga glaskapillärer och positionering av alla elektroder med hjälp av magnetiskt baserade anordningar. Metoden som beskrivs här möjliggör praktiska och robusta inspelningar av korsningsström (Ij) mellan två motsatta Xenopus-oocyter .

Introduction

GJs är intercellulära kanaler som kan möjliggöra strömflöde och utbyte av små cytosoliska molekyler mellan angränsande celler. De finns i många celltyper och utför olika fysiologiska funktioner. GJs hos ryggradsdjur bildas av konnexiner, medan de hos ryggradslösa djur av innexiner. Varje GJ består av två sammansatta hemikanaler med antingen 6 eller 8 underenheter per hemikanal, beroende på om de är konnexiner eller innexiner 1,2,3. Människor har 21 konnexingener4, medan de vanliga ryggradslösa modellerna C. elegans och Drosophila melanogaster har 25 respektive 8 innexingener, 5,6. Alternativ skarvning av gentranskript kan ytterligare öka mångfalden av GJ-proteiner, åtminstone för innexiner 7,8.

GJs kan delas in i tre kategorier baserade på molekylära kompositioner: homotypiska, heterotypiska och heteromeriska. En homotypisk GJ har alla dess underenheter identiska. En heterotypisk GJ har två homomera hemikanaler, men de två hemikanalerna bildas av två olika GJ-proteiner. En heteromerisk GJ innehåller minst en heteromerisk hemikanal. De molekylära mångfalderna hos GJs kan ge distinkta biofysiska egenskaper som är viktiga för deras fysiologiska funktioner. GJ biofysiska egenskaper moduleras också av reglerande proteiner9. För att förstå hur GJs utför sina fysiologiska funktioner är det viktigt att känna till deras molekylära kompositioner, biofysiska egenskaper och rollerna hos reglerande proteiner i deras funktioner.

Heterologa uttryckssystem används ofta för att studera biofysiska egenskaper hos jonkanaler, inklusive GJs, och effekterna av reglerande proteiner på dem. Eftersom heterologa uttryckssystem tillåter uttryck av specifika proteiner är de i allmänhet mer mottagliga för dissekering av proteinfunktioner än inhemska vävnader där proteiner med redundanta funktioner kan komplicera analysen, och registrering av Ij kan vara ouppnåelig. Tyvärr är de vanligaste cellinjerna utom Neuro-2A-cellen olämpliga för att studera GJ-biofysiska egenskaper på grund av komplikationer av endogena konnexiner. Även Neuro-2A-celler är inte alltid lämpliga för denna typ av analys. Till exempel kunde vi inte upptäcka några Ij i Neuro-2A-celler transfekterade med innexinerna UNC-7 och UNC-9 i antingen frånvaron eller närvaron av UNC-1 (opublicerad), vilket krävs för funktionen av UNC-9 GJs i C. elegans 9,10. Å andra sidan är Xenopus-oocyter ett användbart alternativt system för elektrofysiologiska analyser av GJs. Även om de uttrycker ett endogent GJ-protein, connexin 38 (Cx38)11, kan potentiella komplikationer lätt undvikas genom att injicera en specifik antisenseoligonukleotid12. Analyser av GJs med Xenopus-oocyter kräver dock en differentiell spänningsklämma av två sammansatta celler, vilket är tekniskt utmanande. De tidigaste framgångarna med dubbelspänningsklämma av grodblastomerer rapporterades för cirka 40 år sedan13,14. Sedan dess har många studier använt denna teknik för att registrera Ij i parade Xenopus-oocyter. I huvudsak alla tidigare studier har dock utförts med antingen hemlagade förstärkare 12,15,16 eller kommersiella förstärkare avsedda för inspelningar på enstaka oocyter (GeneClamp 500, AxoClamp 2A eller AxoClamp 2B, Axon Instruments, Union City, CA)8,17,18,19,20 . Eftersom även de kommersiella förstärkarna inte ger instruktioner för dubbel oocytespänningsklämma är det ofta utmanande för nya eller mindre sofistikerade elektrofysiologiska laboratorier att implementera denna teknik.

Endast en kommersiell förstärkare har utvecklats för dubbel oocytespänningsklämma, OC-725C från Warner Instruments (Table of Materials, Figur 1A). Denna förstärkare kan användas i antingen ett standardläge (för enstaka oocyter) eller ett högströmsmätningsläge (för enkla eller dubbla oocyter) beroende på om två uttag i spänningssonden är anslutna (figur 1B, C). Men fram till vår senaste studie7 hade det inte funnits en enda publikation som beskriver användningen av denna förstärkare i sitt höga sidoströmsmätläge. Även om förstärkaren har använts av ett annat laboratorium för dubbla oocyteinspelningar, användes den i standarden snarare än det höga sidoläget21,22. Denna brist på rapporter som använder förstärkaren i sitt högströmsmätningsläge kan bero på tekniska svårigheter. Vi kunde inte få stabila dubbla oocyteinspelningar med hjälp av det höga sidoläget genom att följa instruktionerna från tillverkaren. Under årens lopp har vi provat tre olika metoder för dubbla oocyteinspelningar, inklusive att använda två OC-725C-förstärkare i mätläget för hög sidoström, två OC-725C-förstärkare i standardläget och två förstärkare från en annan tillverkare. Vi lyckades så småningom få stabila inspelningar först med det första tillvägagångssättet efter omfattande försök och fel. Denna publikation beskriver och demonstrerar de procedurer vi använder för att uttrycka GJ-proteiner i Xenopus-oocyter, registrera Ij med hjälp av mätläget för hög sidoström och analysera elektrofysiologiska data med hjälp av populär kommersiell programvara. Ytterligare information om dubbelspänningsklämtekniken finns i andra publikationer19,23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Operationerna utförs enligt ett protokoll som godkänts av den institutionella djurvårdskommittén vid University of Connecticut School of Medicine.

1. Grodkirurgi och beredning av defollicerade oocyter

  1. Bedöva en vuxen kvinnlig afrikansk klogroda (Xenopus laevis) (Materialtabell) genom att nedsänka i en sval (med is) trikainlösning (~ 300 mg / L).
  2. Vänta (~ 15 min) tills grodan visar lite eller inget svar på att klämma på sina bäddade fötter. Lägg grodan på ett operationsbord med magen uppåt.
  3. Efter ett längsgående snitt (8-10 mm långt) på antingen vänster eller höger nedre bukregion, dra försiktigt ut en liten bit äggstocksvävnad med ett par pincett och skär loss äggstocksvävnaden med ett par små saxar.
  4. Sänk omedelbart ner den fria äggstocksvävnaden i en Ca2+-fri ND96-lösning (NaCl 99 mM, KCl 2 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) inuti en 60 mm petriskål.
  5. Efter att ha stängt snittet med enkla avbrutna suturer med en 5-0 silkessutur (Materialtabell), sätt tillbaka grodan i en grund vattentank för återhämtning.
    OBS: Snittet stängs i två steg: först bukhinnan och muskelskikten och sedan hudskiktet. Varje groda utsätts för 5 operationer med minst 4 veckors intervall mellan två på varandra följande operationer.
  6. Överför den isolerade äggstocksvävnaden till ett 50 ml centrifugrör innehållande 10 ml Ca2+-fri ND96-lösning med 20 mg kollagenas (materialtabell) och 20 mg hyaluronidas (materialtabell).
  7. Skaka röret på en orbital shaker vid rumstemperatur (RT) tills alla oocyter har blivit isolerade (ensamma).
  8. Överför därefter 30-50 oocyter till en petriskål med hjälp av en Pasteur-pipett av glas och undersök oocyterna ofta under ett stereomikroskop (≥25x högsta förstoringseffekt) för att avgöra om de är defolliculated.
    OBS: Pasteurpipetten ska "skäras" till en bredare spetsöppning med en diamantskrivare (Materialtabell) och flammas för att jämna ut skäreggen.
  9. Så snart 70% -80% av oocyterna är avpollejade, dekantera enzymlösningen genom att försiktigt luta röret. Tvätta oocyterna 5 gånger genom att fylla på röret med ND96-lösning (NaCl 96 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 1 mM, HEPES 5 mM, pH 7,5) och dekantera lösningen.
  10. Efter den slutliga tvätten, överför oocyterna till en 60 mm petriskål innehållande ND96-lösning. Plocka och överför stora och friska oocyter till en 60 mm petriskål innehållande ND96-lösning kompletterad med natriumpyruvat (2 mM) och penicillin-streptomycin (100 U / ml) med en pasteurpipett av rent glas.
    OBS: "stora och friska oocyter" är de i steg V och VI som inte visar några tecken på översmältning av enzymerna.
  11. Placera petriskålen som innehåller de plockade oocyterna i en miljökammare (15-18 °C).

2. GJ-proteinuttryck

  1. Syntetisera komplementärt RNA (cRNA) av ett specifikt konnexin eller innexin in vitro med användning av ett RNA-transkriptionssats (Materialtabell) enligt tillverkarens protokoll.
  2. Fäll ut cRNA med användning av en litiumkloridmetod som beskrivs i användarhandboken för RNA-transkriptionssatsen.
  3. Tvätta pelletsen med 70% etanol, lös upp den i 20 μL nukleasfriH2Ooch tillsätt 1 μL ribonukleashämmare (40 U, Materialtabell).
  4. Mät koncentrationen av cRNA med hjälp av en spektrofotometer (Materialtabell).
  5. Blanda cRNA med en Cx38 antisense oligo så att de slutliga koncentrationerna är 200-1000 ng / μL cRNA och 100 ng / μL oligo.
    OBS: Oligosekvensen är 5′-GCTTTAGTAATTCCCATCCTGCCATGTTTC-3′, vilket motsvarar nukleotiderna från -5 till +25 i Xenopus laevis Cx38 mRNA (NCBI-anslutning: NM_001088018)11. Oligo hålls som en stamlösning (2,0 mg / ml) innan den blandas med cRNA.
  6. Eliminera partiklar i cRNA genom att snurra i en mikrocentrifug (~ 16 000 x g) i 2 minuter och överför snabbt hela supernatanten till ett nytt rör genom pipettering (undvik att störa botten av mikrocentrifugröret).
  7. Dela cRNA i alikvoter (2,5 μL / injektionsflaska) och förvara alikvoterna i en -80 ° C frys.
  8. Förbered en äggcellinjektionsskål genom att limma en liten bit (~ 1 cm x 1 cm) nylonnät (materialtabell) på botten av en 35 mm petriskål med ett snabbhärdande epoxilim.
    OBS: Äggcellinjektionsskålen är återanvändbar. Tvätta den med 70% etanol efter varje användning.
  9. Fyll äggcellsinjektionsskålen ungefär halvvägs med ND96-lösningen (kompletterad med pyruvat och penicillin-streptomycin).
  10. Placera 25-30 oocyter i rader inuti petriskålen.
  11. Förbered glasmikropipetter för äggcellsinjektioner genom att följa instruktionerna i användarhandboken för den automatiserade nanoliterinjektorn (Materialtabell).
    OBS: Användning av en mikroelektrodfasning (Materialtabell) kan hjälpa till att producera skarpa injektionsmikropipetter som orsakar minimal skada på oocyter.
  12. Återfyll en injektionsmikropipett med lätt mineralolja och sätt in den i injektorns mikropipetthållare.
  13. Överför cRNA från en av de lagrade alikvoterna till insidan av ett petriskålskydd eller botten genom pipettering.
  14. Aspirera cRNA-droppen i mikropipettens spets genom att trycka på FILL-knappen i injektorregulatorn.
  15. Injicera cRNA (~ 50 nL / oocyte) genom att trycka på INJECT-knappen .
    OBS: Injektionsvolymen kan ställas in av doppbrytarna i injektorregulatorn.
  16. Överför de injicerade oocyterna till en ny petriskål innehållande ND96-lösning (kompletterad med pyruvat och penicillin-streptomycin) och förvara dem inne i miljökammaren (15-18 °C) i 1-3 dagar (beroende på GJ-proteinuttryckshastighet och -nivå). Byt ut lösningen dagligen genom att överföra oocyterna till en ny petriskål.

3. Oocyterparning

  1. Överför några av de injicerade oocyterna till en 35 mm petriskål innehållande ND96-lösning.
  2. Använd två fina pincett (Table of Materials) för att försiktigt avlägsna det transparenta vitellinmembranet som omsluter äggcellen.
    OBS: Det kan vara nödvändigt att slipa pincettspetsarna före första användningen och då och då med en bit fint (600 Grit) sandpapper.
  3. Placera 2 oocyter per brunn i en äggcellsparningskammare (figur 1D) innehållande ND96-lösning (kompletterad med pyruvat och penicillin-streptomycin).
    OBS: Oocyteparningskammaren är konstruerad genom att limma en liten bit av en Microwell Minitray (Table of Materials) på botten av en 35 mm petriskål (Table of Materials) med hjälp av ett snabbhärdande epoxilim. Minitray skärs i små bitar med en varm trådskärare (Table of Materials). Användning av Minitray för äggcellsparning beskrevs ursprungligen av andra24. Även om ett GJ-protein kan fördelas ojämnt i äggcellmembranet beroende på laddningsegenskaperna hos aminosyrarester i dess cytosoliska domäner25, verkar slumpmässig parning (utan att diskriminera mellan äggcellens djur- och växtpoler) vara tillräcklig i allmänhet.
  4. Förvara petriskålen som innehåller parade oocyter vid RT på isoleringsbordet för att användas för elektrofysiologiska inspelningar.
    OBS: Parningstiden kan variera från några timmar till en dag. En bekväm övning är att para ihop oocyter på sen eftermiddag och spela in från dem följande dag.

4. Förberedelse av förvärvssystem

  1. Konfigurera två OC-725C-okytklämmorförstärkare (Materialtabell) till mätläget för hög sidoström genom att justera en intern doppbrytare (Figur 1B).
  2. Jorda förstärkarna genom att först koppla ihop jordkretsuttagen på bakpanelerna och sedan ansluta till Faraday-buret och fiberljuset som används för att belysa inspelningskammaren.
  3. Anslut förstärkarna till en analog-till-digital-signalomvandlare (Table of Materials) och konfigurera dem i Clampex-modulen i pClamp-programvaran (Table of Materials) enligt instruktioner från förstärkartillverkaren.
  4. Testa förvärvssystemet med modellcellen som medföljer förstärkaren.
    1. Anslut VDIFF-sonden och strömkablarna (I) till modellcellen, anslut de röda och svarta uttagen i VDIFF-sonden med den medföljande bygeln, anslut vardera benet på bygeln till endera stiftet i modellcellen och anslut jordledningen i modellcellen till kabeln från förstärkarens GROUNDS CIRCUIT-uttag (figur 1E).
    2. Nollställ mätarna Voltage Electrode (Vm) och Bath Electrode (Im) genom att vrida vm OFFSET respektive Ve OFFSET-rattarna , växla Clamp från OFF till antingen Fast eller SLOW och vrid GAIN-ratten medurs till en nivå som möjliggör korrekt spänningsklämma (Figur 1A). D.C. GAIN-omkopplaren kan vara i antingen OUT - eller IN-läget .
    3. Kör ett enkelt förvärvsprotokoll som innehåller några spänningssteg för att bekräfta att spänningen som visas i Vm-mätaren ändras enligt förvärvsprotokollet och att spännings- och strömspår visas korrekt i Clampex.
      OBS: Endast en förstärkare får testas varje gång med denna metod.

5. Inspelning Ij mellan parade oocyter

  1. Skapa förvärvsprotokoll för inspelning Ij i pClamp-programvaran.
    OBS: Skapa två förvärvsprotokoll. I en av dem används förstärkare # 1 för att producera en serie membranspänningssteg (Vm) (t.ex. -150 till +90 mV vid 10 mV-intervall), medan förstärkare # 2 används för att upprätthålla en konstant Vm (t.ex. -30 mV). I det andra protokollet används förstärkare # 2 för att producera Vm-stegen , medan förstärkare # 1 används för att upprätthålla konstanten Vm. De positiva och negativa Vm-stegen bör tillämpas alternativt (t.ex. -150, +90, -140, +80 ......), som kan programmeras i Clampex med hjälp av funktionen Användarlista i förvärvsprotokollet.
  2. Ställ in inspelningsfasen
    1. Släpp en petriskål som innehåller parade oocyter i petriskålsbehållaren i inspelningsplattformen (figur 2A)
    2. Välj ett par oocyter och rotera petriskålen om det behövs så att de två oocyterna är i vänster och höger riktning och lås scenen i position med sin magnetiska bas.
    3. Fäst de magnetiska stativen som håller ström- och spänningssonderna på lämpliga platser på isoleringsbordet.
      OBS: Se till att ström- och spänningssonderna från en förstärkare är placerade på vänster sida, medan de från den andra förstärkaren är på höger sida, och att spänningssonden är framför strömsonden på varje sida (Figur 2B, C).
  3. Ställ in referenselektroden
    1. Placera en referenselektrod (Materialtabell) nära petriskålens kant mot användarsidan (figur 2B, C).
    2. Anslut referenselektroden till det svarta uttaget (Circuit Ground) i endast en av de två VDIFF-sonderna .
  4. Ställ in VDIFF-elektroderna
    1. Dra ett par glasmikropipetter, bryt av lite av spetsen med diamantskrivaren (Table of Materials) och släta ut spetskanten genom brandpolering.
      OBS: Spetsmotståndet bör vara mindre än 150 kΩ (mätt med ND96 i pipetten). Vanligtvis används mikropipetter med spetsmotstånd på 20-150 kΩ.
    2. Håll mikropipetten ovanför lågan på en alkoholbrännare för att böja den till en jämn vinkel (~ 130 °) i en position ~ 1 cm från spetsen.
      OBS: Tillverkade mikropipetter är återanvändbara. Skölj dem med vatten efter varje användning.
    3. Återfyll glaspipetten helt med ND96-lösningen, sätt in den i en förfylld (med ND96) mikroelektrodhållare (materialtabell, figur 2D) och se till att inga luftbubblor finns i systemet.
    4. Sätt i 2 mm-stiftet på mikroelektrodhållaren i 2 mm-uttaget på en V DIFF-elektrodanslutningstråd (figur 2D).
    5. Kläm fast 2 mm-uttaget på en magnetiskt baserad klämma (figur 2D) och rikta spetsen på VDIFF-elektroden mot en av de två oocyterna (figur 2E).
      OBS: Justera klämmans position och vinkel så att elektrodens spets ligger mycket nära äggcellen
    6. Sätt i 1 mm-stiftet på V DIFF-elektrodanslutningskabeln i det röda uttaget (VDIFF-ingång) i VDIFF-sonden på samma sida.
    7. Förbered och anslut en VDIFF-elektrod för den andra oocyten och förstärkaren enligt liknande procedurer.
      OBS: En närbild av ett par oocyter och alla elektroder visas i figur 2E.
  5. Ställ in ström- och spänningselektroderna
    1. Förbered spännings- och strömelektroder från glaskapillärer, fyll på dem (ungefär halvvägs) med en KCl-lösning (KCl 3,0 M, EGTA 10 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4 med KOH) och sätt in dem i elektrodhållarna som medföljer förstärkarna.
      OBS: Elektroderna ska ha ett motstånd på ~ 1 MΩ. Lämpliga elektroder kan erhållas från en typ av tunnväggiga glaskapillärer (materialtabell) med användning av en specifik uppsättning dragparametrar (tabell 1). Sådana tips kan lätt tränga in i oocytecellmembranet utan att behöva trycka på varken Vm- eller Ve BUZZ-knappen på förstärkaren.
    2. Sänk elektroderna i badlösningen, nollställ Vm- och Im-mätarna genom att vrida på Vm OFFSET - och Ve OFFSET-rattarna och kontrollera elektrodmotståndet genom att trycka på Vm Electrode Test och Ve Electrode Test.
    3. Sätt in ström- och spänningselektroderna i oocyterna och observera negativa membranpotentialer (vanligtvis -20 till -50 mV).
      OBS: Vm- och Im-mätarna på samma förstärkare ska visa två identiska eller mycket liknande värden.
  6. Datainsamling
    1. I klämsektionen på förstärkaren bekräftar du att D.C. GAIN är i IN-läge , vrid GAIN-ratten medurs till en nivå som tillåter korrekt spänningsklämma (vanligtvis en tredjedel till hälften av hela intervallet) och vrid klämbrytaren från OFF till FAST.
      OBS: När du slår på klämman visar VM- och Im-mätarna hållspänningen respektive hållströmmen. Även om hållströmmen kan variera något beroende på oocyter, är den i allmänhet liten och stabil vid anläggningen Vm (t.ex. -30 mV).
    2. Kör ett förvärvsprotokoll.
      OBS: Fyra spår visas på skärmen. Spännings- och strömspåren från en förstärkare indikerar vm-stegen som appliceras på oocyte # 1 och strömmen som behövs för att producera Vm-stegen , medan de från den andra förstärkaren indikerar konstanten Vm (-30 mV) för oocyte # 2 och strömmen injiceras för att upprätthålla denna konstanta Vm. Strömmen som injiceras i äggcell # 2 representerar Ij.

6. Dataanalys

  1. Analys med Clampfit.
    1. Öppna en inspelad abf-fil i Clampfit-modulen i pClamp.
    2. Använd markörerna 1 och 2 för att omsluta ett segment av baslinjen före Ij-spårningarna .
    3. Klicka på ikonen Justera baslinje för att ta fram ett baslinjefönster. Välj Subtrahera medelvärdet av markörer 1..2 som Metod och bekräfta att Alla synliga signaler och Alla synliga spår är markerade för Spårval.
    4. När du klickar på OK stängs baslinjefönstret, baslinjerna för alla ström- och spänningsspår konvergerar på nollnivå. Observera att spänningsstegen ändras till nya nivåer som är lika med den ursprungliga spänningen minus hållspänningen (t.ex. -30 mV).
    5. För att plotta Ij och Vj-förhållandet med steady-state Ij, bifoga ett önskat segment av Ij-spåren som representerar steady-state Ij med markörerna 1 och 2, placera markören 3 var som helst inom tidsfönstret för spänningsstegen.
    6. Gå till Analysera / Snabbdiagram / I-V för att öppna ett I-V-fönster .
    7. Under X-axel (spänning) väljer du Markör 3 från Signal, anger spänningsstegssignalen (t.ex. Spänning 1) i rullgardinsmenyn och markerar rutan Invertera.
      OBS: Inverteringsrutan är markerad för att konvertera Vm till värden som motsvarar Vj, vilket definieras som Vm av oocyten #2-V m av oocyten #1.
    8. Under Y-axel (Aktuell) väljer du källan till Ij-signalen (t.ex. Aktuell 0) i rullgardinsmenyn bredvid Signal, definierar Region som Markörer 1..2 i rullgardinsmenyn och väljer Medelvärde.
      OBS: För att plotta topp Ij - och Vj-relationer bör markörerna 1 och 2 omsluta segmentet av Ij-spår som innehåller toppen Ij i steg 6.1.5 och välja Peak (istället för Mean) i steg 6.1.8.
    9. Under Alternativet Mål väljer du antingen Ersätt eller Lägg till.
    10. När du klickar på OK i I-V-fönstret visas ett Ij - Vj-förhållande på skärmen, och motsvarande Ij - och Vj-värden kan hittas genom att klicka på Fönster / Resultat.
  2. Plotta och passa Gj-V j-förhållandet i OriginPro (Materialtabell)
    1. Kopiera de två kolumnerna som innehåller Vj - och Ij-värden från resultatfönstret i Clampfit (steg 6.1.10) till en ny arbetsbok i Origin. Kontrollera att Vj - och Ij-värdena finns under kolumnerna X respektive Y.
    2. Lägg till fyra nya kolumner i arbetsboken genom att klicka på Kolumn/Lägg till nya kolumner.
    3. Namnge den första nya kolumnen som Gj, fyll i den genom att ange ekvationen "kolumn Ij / kolumn Vj * 1000" i fönstret Ange kolumnvärden och skapa ett spridningsdiagram för Gj-V j-relationen.
      OBS: Multiplikationen med 1000 (valfritt) är att undvika besväret med att hantera mycket små tal i efterföljande steg.
    4. Anpassa Gj-datapunkterna över de negativa och positiva Vj-områdena oberoende av Boltzmann-funktionen. Beräkna Gj vid Vj = 0 mV genom att ange värdena Gjmax, Gjmin, A och V0 från monteringen i Boltzmannekvationen, vilket kan göras i ett kalkylblad. Den sålunda erhållna Gj kommer att användas som Gjmax i nästa steg.
      OBS: Ekvationen för att passa Boltzmann-funktionen är: Gj = (Gjmax-G jmin)/{1 + exp[A(Vj-V 0)]} + Gjmin, där V0 är Vj vid vilken konduktansen är halvmax, Gjmax är den maximala konduktansen, Gjmin är Vj-okänslig återstående konduktans23. För att utföra monteringen, lägg först till Boltzmann-ekvationen som en ny monteringsfunktion i OriginPro och välj sedan den här funktionen för montering. Ange ungefärliga startvärden för Gjmax, Gjmin, V0 och A innan du kör monteringsfunktionen. Se till att parametern Gjmax inte är fixerad för den här monteringen.
    5. Namnge den andra och tredje nya kolumnen som nGj-L och nGj-R ("n" för "normaliserad") och fyll i dem genom att dividera Gj-kolumnen med Gjmax-värdena härledda från vänster respektive höger Gj - Vj-kurvor (steg 6.2.4).
    6. Namnge den fjärde nya kolumnen som nGj-LR och fyll i den genom att kopiera värden från de negativa och positiva Vj-intervallen i kolumnerna nGj-L respektive nGj-R.
    7. Skapa ett spridningsdiagram för nGj-LR över Vj och anpassa datapunkterna över de negativa och positiva Vj-intervallen till Boltzmann-funktionen oberoende av sig. Se till att parametern Gjmax är fixerad till 1,0 för beslaget.
    8. För register över monteringsresultaten (t.ex. det monterade diagrammet och värdena Gjmin, V0 och A ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

UNC-7 och UNC-9 är innexiner av C. elegans. Medan UNC-9 bara har en isoform, har UNC-7 flera isoformer som huvudsakligen skiljer sig åt i längden och aminosyrasekvensen hos deras aminoterminaler 7,8. Dessa innexiner kan bilda homotypiska såväl som heterotypiska (av UNC-7 och UNC-9) GJs när de uttrycks i Xenopus-oocyter 7,8. Representativa Ij spår och de resulterande normaliserade Gj-V j-relationerna mellan UNC-7b och UNC-9 homotypiska GJ visas i figur 3. I dessa experiment med parade oocyter klämdes Vm av Oocyte 1 till olika nivåer från hållspänningen (-30 mV), medan den för Oocyte 2 hölls konstant vid -30 mV för att övervaka Ij. Resultaten visar att dessa två typer av GJ skiljer sig åt i den Vj-beroende Ij inaktiveringshastigheten, Vj-beroendet (indikerat av lutningen på Gj-V j-kurvan) och mängden återstående Gj. Många andra exempel på UNC-7 och UNC-9 GJs, inklusive rättelse av GJs, finns i vår senaste publikation7.

Figure 1
Figur 1: Inställning av äggcellsparningskammare och förstärkare. (A) Frontpanelen på äggcellsklämförstärkaren OC-725C. (B) En DIP-omkopplare inuti förstärkaren som är konfigurerad för mätning av hög sidoström. Alla vippomkopplare utom 2, 5 och 7 är i OFF-läge för att använda förstärkaren i mätläget för hög sidoström. (C) En VDIFF-sond med det röda uttaget (för VDIFF-ingång ) och det svarta uttaget (för kretsjord) antingen oanslutet eller anslutet. Sonden kan användas för standardspänningsklämläget när de två uttagen är anslutna. (D) En oocyteparningskammare. (E) En modellcell med anslutningar för att testa anskaffningssystemet med förstärkaren i mätläget för hög sidoström. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Oocyte- och elektrodinställning. (A) Inspelningssteget. Det cirkulära hålet har en diameter på 36 mm. (B) Diagram som visar positionerna för de olika elektroderna. (C) Faktisk utformning av de olika elektroderna. (D) Två VDIFF-elektroder med sina hållare och anslutningskablar klämda på inspelningssteget av två olika magnetiska klämmor, inklusive en modifierad Agar Bridge Magnetic Holder (Table of Materials) (överst) och en rörklämma (Table of Materials) (botten). Den förstnämnda är stabilare för att upprätthålla elektrodpositionen på grund av dess större magnetiska bas men kräver modifiering. Glasmikropipetterna roteras 90° från sina arbetspositioner för att visa böjvinklarna. (E) En närbild av ett par oocyter och elektroderna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Representativa registreringsspår. (A) Diagram som visar oocyteexperimentet. Negativa och positiva membranspänningssteg (Vm) appliceras på Oocyte 1 från en håll-Vm på -30 mV medan Oocyte 2 hålls vid en konstant Vm på -30 mV. Den transjunktivala spänningen (Vj) definieras som Vm av Oocyte 2-V m av Oocyte 1. (B). Prov Ij spår och den resulterande normaliserade korsningskonduktansen (Gj) -Vj förhållandet mellan UNC-9 homotypiska gapkorsningar. (C) Prov Ij spår och den resulterande normaliserade Gj-V j förhållandet mellan UNC-7b homotypiska gapkorsningar. Gj-V j-relationerna är monterade med en Boltzmann-funktion (röda linjer). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Steg nej. Värme Dra Hastighet Tid
1 260 ... 40 200
2 240 ... 40 200
3 240 60 40 200
4 245 100 60 200
Se användarhandboken på tillverkarens webbplats för definitioner av dragparametrar (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Tabell 1: Elektroddragningsparametrar. Dessa parametrar är baserade på tunnväggiga glaskapillärer (materialtabell) och en ramptemperatur på 258 vid en P-97 mikropipettavdragare (Materialtabell). De måste justeras efter ramptemperaturen för detta glas på din avdragare. Till exempel, om ramptemperaturen på avdragaren är 20 ° högre, lägg till 20 ° till varje steg och gör nödvändiga justeringar. I allmänhet kan spetsstorleken optimeras genom att justera hastigheten i det sista steget. Se användarhandboken på tillverkarens webbplats för betydelser av dragparametrarna (https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-97.html).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Systemoptimering verkar vara nödvändig för experiment med dubbla oocytespänningsklämmor. Utan det kan inspelningar vara mycket instabila, och förstärkarna kan behöva injicera en överdriven mängd ström för att nå målet Vm, vilket resulterar i oocyteskador och inspelningsfel. Flera faktorer är avgörande för att erhålla stabila dubbla oocyter med mätmetoden för hög sidoström. Först måste ström- och spänningselektroderna ha lämpligt motstånd (~ 1 MΩ), och deras hållare måste vara rena. För det andra måste VDIFF-elektroderna ha låg resistans (<150 kΩ) och vara nära oocyterna. För det tredje måste alla elektroder för samma oocyte (spänning, ström och VDIFF) placeras på samma sida (vänster eller höger), och elektrodernas ordning (från baksida till framsida) ska vara ström, spänning och VDIFF. Slutligen bör referenselektroden placeras nära kanten på 35 mm petriskålen mot användaren.

Vi har ändrat några rekommenderade procedurer från tillverkaren och gjort några andra förbättringar. Bland dem är: 1) ND96-fyllda mikropipetter istället för KCl-laddade agarbroar för att fungera som V DIFF-elektroder. Glaselektroderna är lätta att konstruera, återanvändbara och icke-skadliga för oocyter; 2) en KCl-elektrod med lågt läckage som referenselektrod. Denna elektrod har lågt motstånd (~ 2,7 kΩ) och stabil potential och läcker små elektrolyter (~ 5,7 x 10-8 ml / h); 3) en specialdesignad och konstruerad inspelningsplattform som möjliggör stabil, bekväm och exakt positionering av oocyter och de olika elektroderna. Detta steg ger också gott om tillgång till ett stereomikroskop, ett fiberljus med dubbla svanhalsar och de fyra magnetiska stativen som används för att montera och placera ström- och spänningselektroderna; och 4) tillverkning av ström- och spänningselektroder från en typ av tunnväggiga glaskapillärer. Dessa elektroder har önskat spetsmotstånd (0,5-1,4 MΩ), kan penetrera oocytecellmembranet mycket lätt och orsaka minimal skada på oocyter.

Ibland fungerar inspelningssystemet inte korrekt, vilket indikeras av en ovanligt stor eller kontinuerligt ökande hållström, utveckling av en vit fläck i cellmembranet runt den aktuella elektroden och instabila Vm-spår som svar på spänningskommandon. De möjliga orsakerna är 1) ett VDIFF-elektrodsystem har en liten luftbubbla eller spetsen på VDIFF-elektroden är inte riktad ordentligt mot oocyten; 2) en spännings- eller strömelektrod har hög resistans (t.ex. >2 MΩ) eller dess hållare är smutsig från saltavlagring; 3) anslutningskabeln för en VDIFF-elektrod är trasig; 4) D.C. förstärkningen är inte inställd på IN under spänningsklämman.

Här har vi beskrivit en metod för inspelning av Ij från Xenopus oocyter. Det möjliggör en stabil spänningsklämma av två motsatta oocyter. Denna metod är lätt att implementera och verkar inte ha några uppenbara begränsningar för att analysera de biofysiska egenskaperna hos GJs. Vi är dock inte i stånd att berätta hur det jämförs med andra publicerade metoder. Vi hoppas att laboratorier som nyligen är intresserade av att installera dubbelocytspänningsklämtekniken kommer att finna denna metod värd att överväga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Haiying Zhan, Qian Ge för deras engagemang i det inledande skedet av den tekniska utvecklingen, Kiranmayi Vedantham för att hjälpa till med siffrorna och Dr. Camillo Peracchia för råd om oocyteparningskammaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Bridge Magnetic Holder ALA Scientific Instruments MPSALT-H More stable than the Narishige tube clamper due to its larger magnetic base but it requires modification to accmmodate a 2-mm female socket.
Auto Nanoliter Injector Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA Nanoject II Automated nanoliter injector
Collagenase, Type II Gibco-USA, Langley, OK, USA 17101-015
Diamond Scriber Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 62108-ST
Differential Voltage Probe Warner Instruments, Hamden, CT, USA 7255DI
Analog-to-Digital Signal Converter Molecular Devices, San Jose,CA, USA Digidata 1440A
Dumont #5 Tweezers World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA 500341
Glass Capillaries Drummond Scientific Company, Broomall, PA, USA 3-000-203-G/X
Hot Wire Cutter Amazon.com Proxxon 37080 An alternative is Hercules 8500 DHWT, which has a foot control pedal.
Hyaluronidase, Type I-S MilliporeSigma, Burlington, MA, USA H3506
Magnetic Holder Base Kanetec USA Corp. , Bensenville, IL, USA MB-L-45
Microelectrode Beveler Sutter Instrument, Novato, CA, USA BV-10
Microelectrode Holder World Precision Instruments, , Sarasota, FL, USA MEH1S15
Micropipette Puller Sutter Instrument, , Novato, CA, USA P-97
mMESSAGE mMACHINETM T3 Invitrogen-FisherScientific AM1348
Nunc MicroWell MiniTray Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA 438733 Microwell Minitray
Nylon mesh Component Supply Company, Sparta, TN, USA U-CMN-1000
Oocyte Clamp Amplifier Warner Instruments, , Hamden, CT, USA OC-725C
OriginPro OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA 2020b
pClamp Molecular Devices, , San Jose,CA, USA Version 10
Reference Electrode World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA DRIREF-2SH Specifications: https://www.wpiinc.com/blog/post/compare-dri-ref-reference-electrodes
RNaseOUT (ribonuclease inhibitor) Invitrogen-FisherScientific 10777-019
Silk Suture 5-0 Covidien, North Haven, CT, USA VS890
Spectrophotometer NanoDrop Lite Thermo Scientific ND-LITE-PR
Thin Wall Glass Capallaries World Precision Instruments,Sarasota, FL, USA TW150F-4
Tube Clamper Narishige International USA, Amityville, NY, USA CAT-1 Ready to use but its position is prone to shift due to the small magnetic base.
Xenopus laevis Xenopus Express, Brooksville, FL, USA IMP-XL-FM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Oshima, A., Matsuzawa, T., Murata, K., Tani, K., Fujiyoshi, Y. Hexadecameric structure of an invertebrate gap junction channel. Journal of Molecular Biology. 428 (6), 1227-1236 (2016).
  2. Maeda, S., et al. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 A resolution. Nature. 458 (7238), 597-602 (2009).
  3. Flores, J. A., et al. Connexin-46/50 in a dynamic lipid environment resolved by CryoEM at 1.9 A. Nature Communications. 11 (1), 4331 (2020).
  4. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  5. Starich, T., Sheehan, M., Jadrich, J., Shaw, J. Innexins in C. elegans. Cell Communication & Adhesion. 8 (4-6), 311-314 (2001).
  6. Phelan, P. Innexins: members of an evolutionarily conserved family of gap-junction proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1711 (2), 225-245 (2005).
  7. Shui, Y., Liu, P., Zhan, H., Chen, B., Wang, Z. W. Molecular basis of junctional current rectification at an electrical synapse. Science Advances. 6 (27), (2020).
  8. Starich, T. A., Xu, J., Skerrett, I. M., Nicholson, B. J., Shaw, J. E. Interactions between innexins UNC-7 and UNC-9 mediate electrical synapse specificity in the Caenorhabditis elegans locomotory nervous system. Neural Development. 4, 16 (2009).
  9. Chen, B., Liu, Q., Ge, Q., Xie, J., Wang, Z. W. UNC-1 regulates gap junctions important to locomotion in C. elegans. Current Biology. 17 (15), 1334-1339 (2007).
  10. Jang, H., et al. Dissection of neuronal gap junction circuits that regulate social behavior in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1263-1272 (2017).
  11. Ebihara, L., Beyer, E. C., Swenson, K. I., Paul, D. L., Goodenough, D. A. Cloning and expression of a Xenopus embryonic gap junction protein. Science. 243 (4895), 1194-1195 (1989).
  12. Barrio, L. C., et al. Gap junctions formed by connexins 26 and 32 alone and in combination are differently affected by applied voltage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8410-8414 (1991).
  13. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Voltage dependence of junctional conductance in early amphibian embryos. Science. 204 (4391), 432-434 (1979).
  14. Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. Equilibrium properties of a voltage-dependent junctional conductance. The Journal of General Physiology. 77 (1), 77-93 (1981).
  15. Qu, Y., Dahl, G. Function of the voltage gate of gap junction channels: selective exclusion of molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (2), 697-702 (2002).
  16. Swenson, K. I., Jordan, J. R., Beyer, E. C., Paul, D. L. Formation of gap junctions by expression of connexins in Xenopus oocyte pairs. Cell. 57 (1), 145-155 (1989).
  17. Tong, J. J., Liu, X., Dong, L., Ebihara, L. Exchange of gating properties between rat cx46 and chicken cx45.6. Biophysical Journal. 87 (4), 2397-2406 (2004).
  18. Landesman, Y., White, T. W., Starich, T. A., Shaw, J. E., Goodenough, D. A., Paul, D. L. Innexin-3 forms connexin-like intercellular channels. Journal of Cell Science. 112, 2391-2396 (1999).
  19. Skerrett, I. M., et al. Applying the Xenopus oocyte expression system to the analysis of gap junction proteins. Methods in Molecular Biology. 154, 225-249 (2001).
  20. Nielsen, P. A., Beahm, D. L., Giepmans, B. N., Baruch, A., Hall, J. E., Kumar, N. M. Molecular cloning, functional expression, and tissue distribution of a novel human gap junction-forming protein, connexin-31.9. Interaction with zona occludens protein-1. Journal of Biological Chemistry. 277 (41), 38272-38283 (2002).
  21. Kotsias, B. A., Salim, M., Peracchia, L. L., Peracchia, C. Interplay between cystic fibrosis transmembrane regulator and gap junction channels made of connexins 45, 40, 32 and 50 expressed in oocytes. The Journal of Membrane Biology. 214 (1), 1-8 (2006).
  22. Peracchia, C., Peracchia, L. L. Inversion of both gating polarity and CO2 sensitivity of voltage gating with D3N mutation of Cx50. American Journal of Physiology. 288 (6), 1381-1389 (2005).
  23. del Corsso, C., et al. Transfection of mammalian cells with connexins and measurement of voltage sensitivity of their gap junctions. Nature Protocols. 1 (4), 1799-1809 (2006).
  24. Peracchia, C., Wang, X. G., Peracchia, L. L. Chemical gating of gap junction channels. Methods. 20 (2), 188-195 (2000).
  25. Levine, E., Werner, R., Neuhaus, I., Dahl, G. Asymmetry of gap junction formation along the animal-vegetal axis of Xenopus oocytes. Developmental Biology. 156 (2), 490-499 (1993).

Tags

Biologi utgåva 179 gapkorsning innexin Caenorhabditis elegans C. elegans Xenopus oocyter korsningsström spänningsklämma
Inspelning av <em>gapkorsningsström från Xenopus-oocyter</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap… More

Shui, Y., Wang, Z. W. Recording Gap Junction Current from Xenopus Oocytes. J. Vis. Exp. (179), e63361, doi:10.3791/63361 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter