Summary
Le présent protocole décrit des lignes directrices étape par étape pour les techniques d’opération de l’ARNi chez P. americana.
Abstract
Les cafards, un ravageur sanitaire, sont des espèces essentielles dans les études de développement et de métamorphie des insectes en raison de leur alimentation facile et de leurs caractéristiques hémimétabrines. Ensemble avec des séquences de génome bien annotées, ces avantages ont fait du cafard américain, Periplaneta americana, un modèle important d’insecte hémimétabole. Limité par l’absence de stratégie de knock-out, l’interférence ARN efficace (ARNi) basée sur l’élimination des gènes devient une technique indispensable dans la recherche sur les gènes fonctionnels de P. americana. Le présent protocole décrit les techniques de fonctionnement de l’ARNi chez P. americana. Le protocole comprend (1) la sélection du P. americana aux stades de développement appropriés, (2) la préparation pour le réglage de l’injection, (3) l’injection d’ARNd et (4) la détection de l’efficacité de l’élimination des gènes. L’ARNi est un puissant outil génétique inverse chez P. americana. La majorité des tissus de P. americana sont sensibles à l’ARNds extracellulaire. Sa simplicité permet aux chercheurs d’obtenir rapidement des phénotypes dysfonctionnels sous une ou plusieurs injections d’ARNd ciblant, ce qui permet aux chercheurs de mieux utiliser le P. americana pour les études développementales et métamorphiques.
Introduction
L’interférence ARN (ARNi), un mécanisme conservé sur le plan de l’évolution, devient progressivement un outil génétique inverse essentiel pour inhiber l’expression des gènes dans de nombreux organismes1, depuis qu’Andrew Fire et Craig Mello2 ont développé la stratégie de silence génétique médié par l’ARN double brin (ARNdS). L’ARNds est clivé en fragments de 21 à 23 nucléotides, de petits ARN interférents (siRNA), par l’enzyme Dicer dans les cellules pour activer la voie de l’ARNi. Ensuite, les siRNA sont incorporés dans le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC), qui se couple à l’ARNm cible, provoque un clivage de l’ARNm et entraîne finalement la perte de la fonction génique 3,4,5. Parmi les espèces d’insectes, de nombreuses expériences systémiques d’ARNi ont jusqu’à présent été rapportées dans de nombreux ordres d’insectes, tels que les orthoptères, les isoptères, les hémiptères, les coléoptères, les neuroptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères etles blattodea 5,6,7,8.
Les cafards (Blattaria) sont une famille d’insectes essentielle dans les études développementales et métamorphiques avec leurs cycles de croissance rapides, leur forte adaptabilité à l’environnement et leur grande plasticité développementale9. Avant de découvrir que l’ARNi était compatible avec les cafards, les recherches précédentes se concentraient uniquement sur la prévention et le contrôle des cafards en raison de la rareté des techniques de manipulation génétique chez les cafards. La structure unique de l’oothèque de cafard rendait difficile l’exécution d’un knockout génétique basé sur l’injection d’embryons avec le système CRISPR-Cas9. En outre, la plupart des tissus chez les cafards (tels que P. americana) présentent une réponse systémique robuste à l’ARNi, permettant la génération rapide de phénotypes dysfonctionnels en injectant un ou plusieurs ARNd ciblant 9,10,11. Ces caractéristiques ont fait de l’ARNi une technique indispensable dans la recherche fonctionnelle sur les gènes chez P. americana.
Même si l’utilisation de l’ARNi dans la recherche sur les gènes fonctionnels chez P. americana a été rapportée, aucune description détaillée ou étape par étape n’était disponible. Ce rapport fournit une ligne directrice opérationnelle étape par étape pour l’ARNi chez P. americana, utile pour l’étude de la fonction génique chez d’autres cafards. De plus, ce guide ne se limite pas à Blattodea et peut être appliqué à de nombreux autres insectes avec des modifications mineures.
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Protocol
La ligne de P. americana a été initialement fournie par le Dr Huiling Hao. Cette espèce est maintenue avec la consanguinité depuis 30 ans9.
1. Éclosion et alimentation de P. americana
- Recueillir les oothèques fraîches (immédiatement après la ponte) de P. americana et incuber dans l’incubateur sombre à 25 °C et 60 % d’humidité pendant environ 25 jours. Augmentez ensuite la température et l’humidité à 30 °C et 75% 3 jours avant l’éclosion.
- Utilisez un tamis avec une ouverture de 4 mm pour séparer les nymphes hachées des oothèques.
- Gardez les nymphes dans des récipients cylindriques (12 cm de diamètre et 10 cm de hauteur) dans l’obscurité à 28 °C, 70% d’humidité. Brossez le bord intérieur des récipients avec de la vaseline pour empêcher les cafards de s’échapper. Fournissez de la nourriture, de l’eau et un abri aux rats (plateaux à œufs). Faites attention à l’activité des nymphes et nettoyez régulièrement les excréments et les débris.
2. Sélection des nymphes dans l’amidon approprié
- Utilisez un tube en verre pour choisir le P. americana fraîchement fondu (couleur blanche). Conservez-les dans de nouveaux contenants et attendez le bon stade pour le traitement.
REMARQUE: Après ~ 19 jours dans les conditions d’alimentation ci-dessus, les nymphes dans les 3èmes instars seront disponibles pour injection. La couleur des cafards fraîchement mués est blanche et les instars sont clarifiées par les temps de mue.
3. Préparation du fragment cible avec des promoteurs T7
- En utilisant l’ADNc de P. americana comme modèle, concevoir des amorces appariées pour effectuer la PCR afin d’obtenir un fragment d’ADN de 300 à 800 bp du gène cible9. Ensuite, clonez le fragment pcR dans un vecteur pTOPO (voir Tableau des matériaux) pour le séquençage.
- En utilisant l’ADN du fragment cible comme modèle, synthétisez une nouvelle paire d’amorces avec séquence promotrice T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') aux bornes 5' et effectuez un autre cycle de PCR pour obtenir le fragment cible avec des promoteurs T7 de chaque côté9.
4. Transcription et synthèse de l’ARNds in vitro
- Ajouter 10 μL de tampon T7 2X, 2 μL du mélange enzymatique, T7 Express (voir tableau des matériaux) et 2 μg de produit PCR (obtenu à l’étape 3.2) dans le système de réaction et additionner le volume total à 20 μL avec ddH2O. Mélanger doucement à l’envers manuellement et incuber à 37 °C pendant 30 min et 70 °C pendant 10 min, puis refroidir lentement à température ambiante.
- Diluer la solution de RNase A (4 μg/μL) avec de la ddH2O dans un rapport de 1:200. Ajouter ensuite 1 μL de DNase sans RNase RQ1 (1 U/μL) et 1 μL de solution diluée de RNase A au système (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Maintenant, le volume d’un seul système est de 22 μL. - Incuber à 37 °C pendant 30 min. Ajoutez ensuite 10% du volume total (lors de l’exécution simultanée de réactions N, le volume total est N x 22 μL) d’acétate de sodium et trois volumes du volume total d’isopropanol.
- Mélanger doucement à l’envers manuellement, placer sur de la glace pendant 5 min et centrifuger à 13 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirer le surnageant à l’aide d’une pipette, laver le résidu avec de l’éthanol à 75 % (avec de l’eau traitée au pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) à 25 %), puis centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez à nouveau le surnageant. Sécher la pastille à l’air libre pendant 15 min à température ambiante. Utilisez environ 100 μL d’eau DEPC pour dissoudre l’ARNds, puis diluez l’ARNds jusqu’à la finale 2 μg/μL.
REMARQUE: L’ARNds peut être conservé à -80 °C pendant 6 mois.
5. Chargement de la solution d’ARNds dans la seringue
- Configurez le programme dans la pompe de micro-injection (voir Tableau des matériaux) à l’avance pour vous assurer que le volume de chaque injection est constant. Avant d’utiliser la seringue, nettoyez la seringue en la remplissant d’eau DEPC 8 à 10 fois.
- Installez la seringue de 10 μL sur la pompe de micro-injection, démarrez la pompe et remplissez la seringue avec 10 μL de solution d’ARNd (préparée à l’étape 4.6). Injecter 1 μL de l’ARNds dans une nymphe du3e stade (voir étape 2) et s’assurer qu’elle ne s’échappe pas dans le corps.
6. Injection d’ARNd à P. americana
- Anesthésiez les cafards avec une concentration accrue de CO2 dans un récipient jusqu’à ce que les cafards ne bougent plus, puis procédez immédiatement à l’injection.
- Ramassez doucement le cafard avec une pince à épiler et livrez le cafard vers l’aiguille avec la main. Ensuite, insérez l’aiguille via l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme. A propos de la profondeur d’insertion, moins c’est, mieux c’est.
- Ensuite, injectez la solution d’ARNd dans le cafard. Enfin, retirez la pointe de l’aiguille. Assurez-vous que la pointe de l’aiguille est aussi proche que possible de l’épiderme pour éviter d’endommager les organes internes.
REMARQUE: L’injection doit être faite sous un microscope à dissection. - Mettez les cafards injectés dans des récipients d’essai biologique propres. Attendez environ 10-20 min pour les laisser récupérer des effets du CO2 . Étiqueter les contenants avec la date d’injection, le type et la dose d’ARNds et l’âge du P. americana.
- Placez les cafards injectés dans un environnement sombre à 28 ° C, 70% d’humidité, fournissez de l’eau, de la nourriture et un abri, et observez régulièrement les changements possibles dans le phénotype des cafards.
7. Confirmation de l’élimination et analyse phénotypique
- Évaluer l’efficacité de l’ARNi à l’aide de toutes les techniques de biologie moléculaire disponibles telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et le Transfert Western. Pour des procédures détaillées de qRT-PCR et de Transfert Western, voir les références 1,12.
- Pour observer et analyser les phénotypes liés à l’ARNi, utilisez le microscope adapté aux animaux vivants.
REMARQUE: L’ARNi peut affecter la morphologie, le comportement, la mue, la régénération des membres et d’autres activités physiologiques des cafards. La fréquence spécifique du phénotype est calculée en fonction de conditions spécifiques.
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Representative Results
La figure 1 montre une injection réussie. La seringue de micro-injection avec une aiguille de micro diamètre doit être placée horizontalement sur le booster (Figure 1A). L’aiguille est insérée par l’espace entre deux somites abdominales horizontalement contre l’épiderme (Figure 1B). Assurez-vous que le liquide pénètre dans l’abdomen de P. americana . L’angle trop raide de l’aiguille endommagera les organes internes (Figure 1C), et une mauvaise injection entraîne une fuite de la solution d’ARNds hors de l’abdomen (Figure 1D). Si un ARNds s’échappe, l’animal doit être jeté et une autre injection est effectuée. Le P. americana doit être complètement anesthésié pendant l’injection.
Comme d’autres expériences biologiques, des groupes témoins sont nécessaires lorsque le traitement à l’ARNi est effectué. Les différences de traitement doivent être confirmées par l’ARNi ciblé plutôt que par les effets hors cible de l’ARNds, les dommages pendant l’injection ou l’anesthésie au CO2. Ici, les gènes Ddc (Dopa décarboxylase) et Dpp (décapentaplégique) ont été sélectionnés comme deux exemples pour observer le phénotype des cafards en mue après injection d’ARNd, et un contrôle négatif dsMock11 qui n’a pas de cible chez les animaux, a été effectué comme un contrôle négatif, l’efficacité de l’ARNi a été détectée par qRT-PCR (Figure 2). En prenant l’injection de dsDdc comme exemple (Figure 3A,B), le P. americana avec le gène Ddc renversé aurait l’épiderme blanc pendant une longue période puisque la mélanisation est bloquée (Figure 3B). Dans l’expérience des injections de dsDpp, qui sont nécessaires à la régénération des membres, l’ARNi a perturbé la régénération des membres (Figure 4), ce qui a été rapporté précédemment9.
Figure 1: Instrument et opération d’injection correcte. (A) La seringue sur l’instrument de micro-injection. B) Position correcte de l’aiguille d’injection; aucun liquide ne sort. (C) L’angle trop raide de l’aiguille d’injection peut endommager les organes internes. (D) L’échec de l’injection entraîne l’écoulement de la solution d’ARNd ou de l’hémolymphe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Efficacité de l’ARNi détectée par qRT-PCR. L’efficacité de l’élimination des gènes Ddc et Dpp a été détectée par qRT-PCR, et le dsMock a été utilisé comme témoin négatif. Trois répétitions ont été utilisées pour chaque traitement, et les barres d’erreur indiquent un écart-type des trois répétitions. L’importance des différences a été analysée par le test t de Student. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Exemples d’ARNi réussi pour la perturbation de la mélanisation de l’épiderme chez P. americana. (A) Cafard normal après injection dedsMock avec mélanisation normale. (B) P. americana albiniste médié par l’ARNi Ddc après mue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Exemples d’ARNi réussis pour la perturbation de la régénération des membres chez P. americana. (A) A P. americana avec une patte postérieure amputée. (B-C) P. americana après des traitements à l’ARNi et la mue. La patte arrière a été régénérée dans le groupe témoin dsMock (B), mais pas lorsque le gène Dpp (C) a été réduit au silence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce rapport décrivait une stratégie méthodologique d’ARNi étape par étape chez P. americana; Il convient de noter qu’il peut également être appliqué à d’autres cafards (Blattella germanica, par exemple) et à de nombreux autres insectes présentant des modifications mineures. Cependant, l’efficacité du silençage génique de l’ARNi n’est pas toujours assez élevée, avec un inconvénient évident par rapport à la stratégie d’éliminationgénique 13. L’effet résiduel suivant du niveau du gène peut interférer avec les phénotypes réels. Pour assurer le succès du traitement de l’ARNi, plusieurs conditions essentielles doivent être prises en compte, notamment la condition physique des animaux, la sélection du groupe témoin, la longueur et la concentration des molécules d’ARNds, l’évitement de la possibilité d’effets hors cible (OTE) et la sensibilité différente des tissus à l’ARNds.
Condition physique de P. americana
Les animaux en bonne santé sont la prémisse du succès de l’ARNi et de différentes études fonctionnelles géniques chez P. americana. En outre, pour garder les expériences cohérentes, seuls les cafards qui ont été élevés dans les mêmes conditions sont choisis. Et seules les nymphes plus âgées que le3ème stade (environ 19 jours après l’éclosion) peuvent être utilisées car les nymphes plus jeunes sont trop petites pour être injectées dans la taille du corps.
Sélection du groupe témoin
dsMock11 et dsEGFP et la même dose de solution saline6 de cafard ont été utilisés comme témoins négatifs. Les séquences cibles des témoins négatifs doivent être exogènes et ne pas avoir d’homologie avec la séquence génétique endogène11. dsMock a été préféré parce que l’utilisation de dsEGFP retarderait la croissance et le développement de P. americana dans une certaine mesure.
Longueur de l’ARNds
L’efficacité de l’ARNi est affectée par la longueur des molécules d’ARNd. Les fragments d’ARNds plus longs sont plus efficaces pour faire taire l’ARNm, peut-être parce qu’il produit plus d’ARNs, ou que des fragments d’ARNd plus courts sont absorbés par les cellules moins efficacement 1. Chez P. americana et B. germanica, l’ARNds entre 300 bp et 800 bp semble idéal pour les expériences d’ARNi 6,9,10,14. Un ARNds court peut être insuffisant pour induire une réponse systémique à l’ARNi, tandis qu’un ARNds long peut augmenter le risqued’OTE 1.
Concentration d’ARNd
La concentration d’ARNds peut également influencer l’efficacité de l’ARNi 1,15. Pour les nymphes du3ème stade de P. americana, 1 μg d’ARNds semble être une quantité raisonnable, et 4-6 μg convient àl’adulte 6,9,14,16. La quantité précise d’ARNd utilisée pour l’injection peut être ajustée en fonction des gènes, des tissus et de la taille corporelle du P. americana.
Effets hors cible
L’OTE de l’ARNi est difficile à éviterau total 17,18. Deux régions de l’ARNds ne se chevauchant pas peuvent être conçues pour réduire l’effet de l’OTE sur les phénotypes5. Si les ARNds ciblant deux régions distinctes produisent le même effet, la possibilité d’un phénomène de faux positif induit par l’OTE pourrait être exclue.
Procédé de détection de l’efficacité de l’ARNi
L’analyse phénotypique est l’approche la plus intuitive pour évaluer l’ARNi, et la qRT-PCR et l’analyse Western blotting sont les deux normes d’or pour mesurer l’efficacité du knockdown. qRT-PCR est une méthode simple pour déterminer l’efficacité des interférences au niveau d’ARNm 6,9,10. Les amorces doivent être conçues à partir de la région de ciblage de l’ARNd. L’analyse western par transfert est une autre méthode d’analyse des interférences au niveau des protéines, mais nécessite des anticorps spécifiques. Cependant, aucun effet phénotypique particulier n’est parfois observé, même avec une efficacité de silencieux élevée (>90%). Une explication possible de cet effet résiduel est l’expansion massive de la famille de gènes chez les cafards; les redondances des gènes contrôlent de nombreuses fonctions et phénotypes particuliers. Une autre explication possible est que le niveau minimum d’expression des gènes requis pour être suffisamment fonctionnel est extrêmement faible. Ceux-ci conduisent à l’échec de l’obtention d’un phénotype particulier, même avec une efficacité aRNi suffisamment élevée.
Spécificité tissulaire pour la sensibilité à l’ARNi
L’efficacité d’interférence dans certains tissus de cafards (tels que l’ovaire et les glandes accessoires) n’est pas assez élevée, ce qui pourrait être la barrière pénétrante pour l’ARNd 5,19; l’efficacité différente de l’ARNi chez différentes espèces d’insectes est également observée, ce qui dépend de la dégradation enzymatique de l’ARNds dans l’hémolymphe15,20. Quelques idées sont raisonnables pour améliorer l’efficacité de l’ARNi dans les tissus de P. americana, telles que la digestion de l’ARNds en siARN in vitro21, l’augmentation de la dose d’ARNd et des temps d’injection, et l’utilisation de nanomatériaux comme support pour l’administration.
En conclusion, la grande efficacité de l’ARNi associée à des séquences de génome bien annotées9 fait de P. americana un bon modèle pour étudier la fonction des gènes dans un large éventail d’études développementales, physiologiques et comportementales. De même, ce rapport peut servir de référence précieuse pour d’autres insectes sensibles à l’ARNds et difficiles à faire des mutations knockout.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions n° 32070500, 31620103917, 31330072 et 31572325 à C.R., Sh.L.), par la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (subvention n° 2021B1515020044 et 2020A1515011267 à C.R.), par le Département des sciences et de la technologie de la province du Guangdong (subventions n° 2019B0905003 et 2019A0102006), par le Département des sciences et de la technologie de Guangzhou (subvention n° 202102020110), par le Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 à Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
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