Summary
O presente protocolo descreve as diretrizes passo a passo para as técnicas de operação rnai em P. americana.
Abstract
Baratas, uma praga sanitária, são espécies essenciais em estudos de desenvolvimento de insetos e metamórficos devido à sua fácil alimentação e características hemimetabólicas. Ao todo com sequências de genomas bem anotadas, essas vantagens fizeram da barata americana Periplaneta americana, um importante modelo de insetos hemimetados. Limitado pela escassez de estratégia de nocaute, o knockdown genético baseado em RNA eficaz (RNAi) torna-se uma técnica indispensável na pesquisa genética funcional da P. americana. O presente protocolo descreve as técnicas de operação RNAi em P. americana. O protocolo inclui (1) seleção do P. americana em estágios de desenvolvimento adequados, (2) preparação para a configuração da injeção, (3) injeção de dsRNA e (4) detecção de eficiência de knockdown genético. RNAi é uma poderosa ferramenta genética reversa em P. americana. A maioria dos tecidos P. americanas são sensíveis ao dsRNA extracelular. Sua simplicidade permite que os pesquisadores obtenham rapidamente fenótipos disfuncionais sob uma ou múltiplas injeções de dsRNA, permitindo que os pesquisadores usem melhor o P. americana para estudos de desenvolvimento e metamórficos.
Introduction
A interferência de RNA (RNAi), um mecanismo evolutivamente conservado, gradualmente se torna uma ferramenta essencial de reversão genética para inibir a expressão genética em muitos organismos1, uma vez que Andrew Fire e Craig Mello2 desenvolveram a estratégia de silêncio genético mediado por duplar (dsRNA). dsRNA é cortado em fragmentos de 21-23 nucleotídeos, pequenas RNAs interferentes (siRNAs), pela enzima Dicer em células para ativar a via RNAi. Em seguida, siRNAs são incorporadas ao complexo de silenciamento induzido pelo RNA (RISC), que casa o mRNA alvo, causa decote mRNA e, finalmente, resulta na perda da função genética 3,4,5. Entre as espécies de insetos, muitos experimentos sistêmicos rnai foram relatados até agora em muitas ordens de insetos, como Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.
As baratas (Blattaria) são uma família essencial de insetos em estudos de desenvolvimento e metamórficos com seus ciclos de crescimento rápido, forte adaptabilidade ao meio ambiente e alta plasticidadede desenvolvimento 9. Antes de descobrir que a RNAi era compatível com baratas, pesquisas anteriores focavam apenas na prevenção e controle de baratas devido à escassez de técnicas de manipulação genética em baratas. A estrutura única da ootheca da barata tornou desafiador realizar o nocaute genético baseado em injeção de embriões com o sistema CRISPR-Cas9. Além disso, a maioria dos tecidos em baratas (como P. americana) apresenta robusta resposta sistêmica RNAi, permitindo a rápida geração de fenótipos disfuncionais injetando um ou mais dsRNAs 9,10,11. Essas características fizeram da RNAi uma técnica indispensável em pesquisa funcional genética em P. americana.
Embora tenha sido relatado o uso de RNAi em pesquisa genética funcional em P. americana , não foi relatada nenhuma descrição detalhada ou passo a passo. Este relatório fornece uma diretriz operacional passo a passo para rnai em P. americana, útil para o estudo da função genética em outras baratas. Além disso, este guia não se limita a Blattodea e pode ser aplicado a muitos outros insetos com pequenas modificações.
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Protocol
A linha de P. americana foi inicialmente fornecida pelo Dr. Huiling Hao. Esta espécie tem sido mantida com endogamia por 30 anos9.
1. Incubação e alimentação de P. americana
- Colete oothecae fresco (imediatamente pós-colocação de ovos) de P. americana e incubar na incubadora escura a 25 °C e 60% de umidade por ~25 dias. Em seguida, aumente a temperatura e a umidade para 30 °C e 75% 3 dias antes do eclosão.
- Use uma peneira com abertura de 4 mm para separar as ninfas eclodidas da oothecae.
- Mantenha as ninfas em recipientes cilíndricos (12 cm de diâmetro e 10 cm de altura) no escuro a 28 °C, 70% de umidade. Escove a borda interna dos recipientes com vaselina para evitar que as baratas escapem. Fornecer comida de rato, água e abrigo (bandejas de ovos). Preste atenção à atividade das ninfas e limpe regularmente as fezes e detritos.
2. Seleção das ninfas em instar adequada
- Use um tubo de vidro para escolher o P. americana recém-moldado (branco na cor do corpo). Mantenha-os em novos recipientes e aguarde o estágio correto para o tratamento.
NOTA: Após ~19 dias sob as condições de alimentação acima, as ninfasnas instars 3 estarão disponíveis para injeção. A cor das baratas recém-moldadas é branca, e as estrelas são esclarecidas por tempos de fusão.
3. Preparação do fragmento de alvo com promotores T7
- Usando o cDNA de P. americana como modelo, projetamos primers emparelhados para executar PCR para obter fragmento de DNA de 300-800 bp do genealvo 9. Em seguida, clone o fragmento PCR em um vetor pTOPO (ver Tabela de Materiais) para sequenciamento.
- Usando o DNA do fragmento de destino como modelo, sintetize um novo par de primers com sequência de promotores T7 (5'-GGATCCTACGACTCACTATAGG-3') nos terminais de 5' e realize outra rodada de PCR para obter o fragmento de destino com promotores T7 em cada lado9.
4. Transcrição e síntese de dsRNA in vitro
- Adicione 10 μL de tampão T7 2X, 2 μL do Enzima Mix, T7 Express (ver Tabela de Materiais) e 2 μg de produto PCR (obtido na etapa 3.2) no sistema de reação e somar o volume total a 20 μL com ddH2O. Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente e incubar a 37 °C por 30 min e 70 °C por 10 min, e, em seguida, esfriar lentamente até a temperatura ambiente.
- Diluir solução RNase A (4 μg/μL) com ddH2O a uma razão de 1:200. Em seguida, adicione 1 μL de DNase RNase-Free RNase (1 U/μL) e 1 μL de solução RNase A diluída ao sistema (ver Tabela de Materiais).
NOTA: Agora, o volume de um único sistema é de 22 μL. - Incubar a 37 °C por 30 min. Em seguida, adicione 10% do volume total (ao realizar reações N simultaneamente, o volume total é N x 22 μL) de acetato de sódio e três volumes do volume total de isopropanol.
- Misture suavemente de cabeça para baixo manualmente, coloque no gelo por 5 minutos e centrífuga a 13.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Retire o supernatante com uma pipeta, lave o resíduo com 75% de etanol (com 25% de pirocarbonato de ditila (DEPC) água tratada e, em seguida, centrífuga a 13.000 x g por 5 min a 4 °C.
- Remova o supernatante novamente. Seque a pelota por 15 minutos em temperatura ambiente. Use ~100 μL de água DEPC para dissolver dsRNA e, em seguida, dilua o dsRNA para os 2 μg/μL finais.
NOTA: O dsRNA pode ser armazenado a -80 °C por 6 meses.
5. Carregar a solução dsRNA na seringa
- Configure o programa na bomba de micro injeção (ver Tabela de Materiais) com antecedência para garantir que o volume de cada injeção seja consistente. Antes de usar a seringa, limpe a seringa preenchendo-a com água DEPC 8-10 vezes.
- Instale a seringa de 10 μL na bomba de micro injeção, inicie a bomba e encha a seringa com 10 μL de solução dsRNA (preparada na etapa 4.6). Injete 1 μL do dsRNA em uma ninfa instar 3rd (ver passo 2) e certifique-se de que ele não vaze para o corpo.
6. Injetando dsRNA para P. americana
- Anestesiar as baratas com uma concentração aumentada de CO2 em um recipiente até que as baratas não se movam mais, e então proceda imediatamente com a injeção.
- Pegue delicadamente a barata com pinças, e entregue a barata em direção à agulha com a mão. Em seguida, insira a agulha através da lacuna entre dois somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme. Sobre a profundidade de inserção, quanto mais rasa, melhor.
- Então, injete a solução dsRNA na barata. Finalmente, puxe a ponta da agulha. Certifique-se de que a ponta da agulha está o mais próxima possível da epiderme para evitar danificar órgãos internos.
NOTA: A injeção deve ser feita sob um microscópio de dissecção. - Coloque as baratas injetadas em recipientes limpos de bioensaio. Espere cerca de 10-20 minutos para deixá-los se recuperar dos efeitos de CO2 . Rotule os recipientes com a data de injeção, tipo e dose de dsRNA e idade do P. americana.
- Coloque as baratas injetadas em um ambiente escuro a 28 °C, 70% de umidade, forneça água, ração e abrigo, e observe possíveis alterações no fenótipo das baratas regularmente.
7. Confirmação de knockdown e análise fenotípica
- Avalie a eficiência da RNAi utilizando quaisquer técnicas de biologia molecular disponíveis, como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e mancha ocidental. Para procedimentos detalhados de qRT-PCR e de manchas ocidentais, consulte Referências 1,12.
- Para observar e analisar fenótipos relacionados à RNAi, utilize o microscópio adequado para animais vivos.
NOTA: O RNAi pode afetar a morfologia, o comportamento, a fusão, a regeneração dos membros e outras atividades fisiológicas das baratas. A frequência específica do fenótipo é calculada de acordo com condições específicas.
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Representative Results
A figura 1 mostra uma injeção bem sucedida. A seringa de microinjeção com uma agulha de micro diâmetro deve ser colocada horizontalmente no propulsor (Figura 1A). A agulha é inserida através da lacuna entre duas somitas abdominais horizontalmente contra a epiderme (Figura 1B). Certifique-se de que o líquido vai para o abdômen P. americana . O ângulo muito íngreme da agulha danificará os órgãos internos (Figura 1C), e a injeção inadequada leva ao vazamento da solução dsRNA para fora do abdômen (Figura 1D). Se algum dsRNA vazar, o animal precisa ser descartado, e outra injeção é realizada. O P. americana precisa ser completamente anestesiado durante a injeção.
Como outros experimentos biológicos, grupos de controle são necessários quando o tratamento RNAi é realizado. As diferenças de tratamento precisam ser confirmadas causadas por RNAi direcionado em vez de devido aos efeitos fora do alvo do dsRNA, o dano durante a injeção ou anestesia de CO2. Aqui os genes Ddc (Dopa decarboxylase) e Dpp (decapentaplégico) foram selecionados como dois exemplos para observar o fenótipo das baratas moladas após a injeção de dsRNA, e um controle negativo dsMock11 que não tem alvo nos animais, foi realizado como um controle negativo, a eficiência rnai foi detectada por qRT-PCR (Figura 2). Tomando a injeção de dsDdc como exemplo (Figura 3A,B), o P. americana com gene Ddc derrubado teria a epiderme branca por um longo tempo desde que a melanização está bloqueada (Figura 3B). No experimento de injeções dsDpp, necessárias para a regeneração dos membros, o RNAi interrompeu a regeneração do membro (Figura 4), que foi relatada anteriormente9.
Figura 1: Operação de injeção de instrumentos e correção. (A) A seringa no instrumento de microinjeção. (B) Posição correta da agulha de injeção; nenhum líquido sai. (C) O ângulo muito íngreme da agulha de injeção pode danificar os órgãos internos. (D) A injeção falha resulta na solução dsRNA ou hemoglifo fluindo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Eficiência RNAi detectada por qRT-PCR. A eficiência knockdown dos genes Ddc e Dpp foi detectada pelo qRT-PCR, e o dsMock foi usado como um controle negativo. Foram utilizadas três réplicas para cada tratamento, e as barras de erro indicam desvio padrão das três réplicas. A significância das diferenças foi analisada pelo teste t do Aluno. *: P < 0,05, **: P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Exemplos de RNAi bem sucedido para interrupção da melanização de epiderme em P. americana. (A) Barata normal após injeção dedsMock com melanização normal. (B) Ddc RNAi mediado p. americana albinística após a fusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Exemplos de RNAi bem sucedido para interrupção da regeneração de membros em P. americana. (A) A P. americana com uma perna traseira amputada. (B-C) P. americana após tratamentos RNAi e fundamento. O hindleg foi regenerado no grupo de controle DSMock (B), mas não quando o gene Dpp (C) foi silenciado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este relatório descreveu uma estratégia metodológica passo a passo da RNAi em P. americana; note-se que também pode ser aplicado a outras baratas (Blattella germanica, por exemplo) e muitos outros insetos com pequenas alterações. No entanto, a eficiência de silenciamento genético da RNAi nem sempre é alta o suficiente, com uma desvantagem óbvia em comparação com a estratégia de nocaute genético13. O seguinte efeito residual do nível genético pode interferir com os fenótipos reais. Para garantir que o tratamento RNAi seja bem sucedido, várias condições essenciais precisam ser consideradas, incluindo a condição física dos animais, seleção do grupo controle, o comprimento e concentração das moléculas de dsRNA, a evitação da possibilidade de efeitos fora do alvo (OTE), e diferente sensibilidade dos tecidos ao dsRNA.
Condição física de P. americana
Animais saudáveis são a premissa para o sucesso da RNAi e diferentes estudos funcionais genéticos em P. americana. Além disso, para manter os experimentos consistentes, apenas baratas que foram criadas nas mesmas condições são escolhidas. E apenas ninfas mais velhas que a3ª instar (cerca de 19 dias após a eclosão) podem ser usadas porque ninfas mais jovens são muito pequenas para injeção no tamanho do corpo.
Seleção do grupo de controle
dsMock11 e dsEGFP e a mesma dose de solução salinabarata 6 têm sido usadas como controles negativos. As sequências de alvos de controles negativos devem ser exógenas e não ter homologia com a sequência genética endógena11. dsMock foi preferido porque o uso de dsEGFP atrasaria o crescimento e o desenvolvimento de P. americana até certo ponto.
comprimento dsRNA
A eficiência do RNAi é afetada pelo comprimento das moléculas de dsRNA. Fragmentos de dsRNA mais longos são mais eficazes no silenciamento mRNA, possivelmente porque produz mais siRNAs, ou fragmentos de dsRNA mais curtos são tomados por células de forma menos eficiente 1. Em P. americana e B. germanica, dsRNA entre 300 bp e 800 bp parece ideal para experimentos RNAi 6,9,10,14. Um dsRNA curto pode ser insuficiente para induzir uma resposta rnai sistêmica, enquanto um dsRNA longo pode aumentar o risco de OTE1.
concentração de dsRNA
A concentração de dsRNA também pode influenciar a eficiência da RNAi 1,15. Paraas 3 ninfas instar de P. americana, 1 μg de dsRNA parece ser uma quantidade razoável, e 4-6 μg é adequado paraadultos 6,9,14,16. A quantidade precisa de dsRNA usada para injeção pode ser ajustada com base nos genes, tecidos e tamanho do corpo do P. americana.
Efeitos fora do alvo
O OTE da RNAi é difícil de evitar ao todo 17,18. Duas regiões não sobrepostas do dsRNA podem ser projetadas para reduzir o efeito do OTE nos fenótipos5. Se as DSRNAs que visam duas regiões distintas produzirem o mesmo efeito, a possibilidade de fenômeno falso positivo induzido pelo OTE poderá ser excluída.
Método para detecção de eficiência RNAi
A análise fenotípica é a abordagem mais intuitiva para avaliar rnai, e qRT-PCR e análise de manchas ocidentais são os dois padrões dourados para medir a eficiência do knockdown. qRT-PCR é um método simples para determinar a eficiência de interferência no nívelmRNA 6,9,10. Os primers devem ser projetados fora da região de alvo dsRNA. A análise de manchas ocidentais é outro método para analisar a interferência no nível da proteína, mas requer anticorpos específicos. No entanto, por vezes não são observados efeitos fenotípicos particulares, mesmo com alta eficiência de silenciamento (>90%). Uma possível explicação para esse efeito residual é a expansão maciça da família genética nas baratas; as redundâncias dos genes controlam muitas funções particulares e fenótipos. Outra explicação possível é que o nível mínimo de expressão genética necessário para funcional o suficiente é extremamente baixo. Estes levam ao fracasso na obtenção de um fenótipo específico, mesmo com alta eficiência RNAi.
Especificidade tecidual para a sensibilidade RNAi
A eficiência de interferência em alguns tecidos de baratas (como o ovário e as glândulas acessórias) não é alta o suficiente, o que pode ser a barreira penetrante para o dsRNA 5,19; também é observada a eficácia rnai diferente em diferentes espécies de insetos, o que depende da degradação enzimática do dsRNA no hemolymph15,20. Algumas ideias são razoáveis para melhorar a eficiência do RNAi nos tecidos P. americana, como digerir dsRNA em siRNAs in vitro21, aumentar a dose dsRNA e tempos de injeção, e usar nanomateriais como portador para entrega.
Em conclusão, a alta eficiência do RNAi juntamente com sequências de genoma bem anotadas9 faz de P. americana um bom modelo para investigar a função genética em uma ampla gama de estudos de desenvolvimento, fisiológicos e comportamentais. Da mesma forma, este relatório pode servir como uma referência valiosa para outros insetos sensíveis ao dsRNA e difíceis de fazer mutações de nocaute.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant No. 32070500, 31620103917, 31330072, e 31572325 à C.R., Sh.L.), pela Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Guangdong (Grant No. 2019B090905003 e 2019A0102006), pelo Departamento de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (Grant No. 202102020110), pelo Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 para Sh.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 701 N 10 µL Syr (26s/51/2) | Hamilton | PN:80300 | Injection |
| Incubator | Ningbo Jiangnan Instrument Factory | RXZ-380A-LED | For cockroaches hatching and feeding |
| Micro-injection pump | Alcott Biotechnology | ALC-IP600 | Injection |
| pTOPO-Blunt Cloning Kit | Aidlab Biotechnology | CV16 | For Gene clonging |
| quantitative Real-Time PCR Systems | Bio-Rad | CFX Connect | For qRT-PCR analysis |
| T7 RiboMAX Express RNAi System | Promega | P1700 | For dsRNA synthesis, which contains Rnase A Solution (4 μg/μL), Sodium Acetate, 3.0M (pH 5.2), Enzyme Mix, T7 Express, Nuclease-Free water, Express T7 2x Buffer, RQ1 RNase-Free DNase |
| Thermal Cyclers | Bio-Rad | S1000 | For DNA amplification |
References
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