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Neuroscience

माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक गुरुत्वाकर्षण खिलाया ट्रांसकार्डियल छिड़काव विधि

Published: January 21, 2022 doi: 10.3791/63386
Automatic Translation
1, 2, 1,3
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, State University of New York Upstate Medical University, 2Department of Neurology, State University of New York Upstate Medical University, 3Department of Neuroscience and Physiology, State University of New York Upstate Medical University

Summary

माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव विधि प्रस्तुत की जाती है। पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन प्रदर्शित किया जाता है। यह काम ट्रांसकार्डियल छिड़काव, विच्छेदन, ऊतक ठंड / एम्बेडिंग, और जमे हुए सेक्शनिंग चरणों का भी व्यापक रूप से वर्णन करता है।

Abstract

चूहों से पृथक मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के नमूनों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण इस मॉडल प्रणाली में विकृति के मूल्यांकन के लिए आम बात है। इन नाजुक ऊतकों की आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए, संवेदनाहारी जानवरों (ट्रांसकार्डियल छिड़काव) में हृदय के कैनुलेशन के माध्यम से पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे रासायनिक फिक्सेटिव को प्रशासित करना नियमित है। माउस दिल के ट्रांसकार्डियल छिड़काव पारंपरिक रूप से इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक खारा और फिक्सेटिव समाधान दोनों देने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप या हवा के दबाव के उपयोग पर निर्भर है। इन विधियों के लिए आसानी से सुलभ विकल्प के रूप में, यह काम इत्र वितरण की गुरुत्वाकर्षण-खिलाया विधि के उपयोग को दर्शाता है जो अधिकांश हार्डवेयर स्टोर में उपलब्ध सामग्रियों का उपयोग करता है।

इस नई छिड़काव विधि को मान्य करने के लिए, यह काम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन के संवेदनशील पता लगाने के लिए आवश्यक सभी बाद के चरणों को प्रदर्शित करता है। इन चरणों में निश्चित मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का विच्छेदन, ऊतकों के तेजी से ठंड / एम्बेडिंग और क्रायोसेक्शनिंग, और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना शामिल हैं। चूंकि इस विधि के परिणामस्वरूप फिक्सेटिव का पूरे शरीर का वितरण होता है, इसलिए इसका उपयोग हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अन्य गैर-न्यूरोनल ऊतकों को तैयार करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में विकृति विज्ञान का हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन एक नियमित तकनीक है जिसका उपयोग न्यूरोडीजेनेरेशन के अध्ययन में किया जाता है। चूंकि मृत्यु के बाद न्यूरोनल ऊतक तेजी से नीचा दिखाते हैं, इसलिए उनकी आकृति विज्ञान 1,2 को संरक्षित करने के लिए सीएनएस ऊतकों को पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे रासायनिक फिक्सेटिव देने के लिए यह आम बात है। रासायनिक निर्धारण या तो एक फिक्सेटिव समाधान के साथ पूरे शरीर के छिड़काव के माध्यम से या ऊतकों के अलगाव और एक फिक्सेटिव समाधान में उनके विसर्जन के माध्यम से किया जा सकता है (जिसे "ड्रॉप फिक्सेशन" कहा जाता है)। छिड़काव फिक्सेटिव डिलीवरी का पसंदीदा तरीका है, क्योंकि ड्रॉप फिक्सेशन गहरी सीएनएस संरचनाओं 3,4,5 में फिक्सेटिव समाधान के तेजी से प्रवेश की अनुमति नहीं दे सकता है। इसके अलावा, चूंकि कशेरुक स्तंभ से अनफिक्स्ड रीढ़ की हड्डी को हटाना मुश्किल है, छिड़काव के माध्यम से फिक्सेटिव समाधान की डिलीवरी रीढ़ की हड्डी के सूक्ष्म और सकल शरीर रचना विज्ञान के सीटू संरक्षण की अनुमति देती है और हटाने के दौरान क्षति को कम करने के लिए ऊतक को कठोर करती है।

निर्धारण के लिए आवश्यक बफर और फिक्सेटिव समाधानों की डिलीवरी आमतौर पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पंपों या हवा के दबाव का उपयोग करके की जाती है। इत्र की गुरुत्वाकर्षण डिलीवरी निम्नलिखित कारणों से पंप डिलीवरी के विकल्प के रूप में काम कर सकती है: (1) पंप या एयर प्रेशर डिलीवरी कुछ मामलों में उपयोगकर्ता को छिड़काव के दौरान सिस्टम में मैन्युअल रूप से दबाव बनाए रखने की आवश्यकता हो सकती है। इत्र की गुरुत्वाकर्षण डिलीवरी उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना बनाए रखी जा सकती है। (2) मानक वैज्ञानिक विक्रेताओं से उपलब्ध सामग्री प्राप्त करके उपयोगकर्ता को कम लागत पर गुरुत्वाकर्षण-वितरित इत्र उपकरण का निर्माण किया जा सकता है। यह काम बताता है कि धोने की बोतलों और विनाइल टयूबिंग का उपयोग करके एक साधारण गुरुत्वाकर्षण छिड़काव डिवाइस का निर्माण कैसे किया जाए। पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल का उपयोग करते हुए, यह काम जमे हुए सेक्शनिंग के लिए उनके अलगाव से पहले मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को सुगंधित करने में इस प्रणाली की प्रभावकारिता को दर्शाता है। यह काम व्यापक रूप से जानवर से बाहर निश्चित ऊतक को विच्छेदित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों, तकनीकों और सामग्रियों का वर्णन करता है, ऊतक को तेजी से फ्रीज / एम्बेड और क्रायोसेक्शन करता है, और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन की उपस्थिति का पता लगाता है।

Protocol

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत डेटा और प्रयोगात्मक कदम सी 57 बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग करके उत्पन्न किए गए थे। जानवरों से जुड़े सभी तरीकों को स्टेट यूनिवर्सिटी ऑफ न्यूयॉर्क अपस्टेट मेडिकल यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. छिड़काव उपकरण और विच्छेदन मंच का निर्माण

  1. जैसा कि चित्रा 1 में दिखाया गया है, एक तेज रेजर ब्लेड के साथ स्क्रू-ऑन कैप के आंतरिक पक्ष में इन फ्लश को काटकर दो 500 एमएल धोने की बोतलों से आंतरिक तिनके को ट्रिम करें। प्रत्येक बफर बोतल के तल में एक 4 सेमी x 4 सेमी वर्ग छेद काट लें। एक तुला, स्टेनलेस स्टील माइक्रोस्पैटुला के पारित होने की अनुमति देने के लिए प्रत्येक बोतल के तल में एक छोटा छेद काटें।
  2. माइक्रोस्पैटुला में एक "एस" आकार का मोड़ बनाएं ताकि उन्हें बफर बोतलों को लटकाने के लिए हुक के रूप में इस्तेमाल किया जा सके। बफर बोतलों में उपयुक्त उद्घाटन में तुला माइक्रोस्पैटुला डालें।
  3. टयूबिंग की दो 25 सेमी लंबाई काटें और इन्हें बाहरी बोतल पुआल आउटलेट के साथ कसकर कनेक्ट करें। वाई कनेक्टर के साथ इन ट्यूबों के सिरों में शामिल हों। ट्यूबिंग के 2 मीटर काट लें और वाई कनेक्टर के मुक्त अंत में इसमें शामिल हों।
  4. 1 मिलीलीटर सिरिंज से सवार निकालें और सिरिंज टिप से लगभग 6 सेमी दूर सिरिंज काट लें। पहले एक रेजर ब्लेड के साथ प्लास्टिक को स्कोर करके सिरिंज को काटें और फिर सिरिंज प्लास्टिक को तेजी से स्नैप करें।
  5. प्लास्टिक टयूबिंग के मुक्त अंत में सिरिंज के कटे हुए चेहरे को डालें। एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त गहराई तक डालें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि छिड़काव तंत्र के भीतर सभी कनेक्शन रिसाव से बचने के लिए पर्याप्त रूप से तंग हैं। ढीले कनेक्शन के मामले में, यदि आवश्यक हो तो एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए वांछित जंक्शनों पर छोटे स्टेनलेस स्टील नली क्लैंप को रखा और कड़ा किया जा सकता है।
  6. पीएफए के रूप में एक बफर बोतल और पीबीएस (बफर) के रूप में एक बोतल लेबल करें। बोतल खोलने से दूर लंबाई के लगभग 1/3 को मापें और इत्रसमाधानों के उचित भरने के स्तर को निरूपित करने के लिए इस बिंदु पर बोतल परिधि के चारों ओर एक रेखा खींचें।
  7. सीधा करें और फिर एक बड़े पेपर क्लिप में एक लूप बनाएं जो ट्यूबिंग की परिधि के चारों ओर फिट हो सकता है। सिरिंज के समीपस्थ ट्यूबिंग के चारों ओर इस लूप को रखें।
  8. ग्लास ट्रे में एक उचित आकार का स्टायरोफोम ब्लॉक रखें। ट्यूबिंग चिपकाने के लिए स्टायरोफोम ब्लॉक में पेपरक्लिप के सिरों को रखें।
  9. पेपर तौलिए का उपयोग करके, ग्लास ट्रे के सामने के छोर को लगभग 2 सेमी तक बढ़ाएं।
    नोट: यह माउस को विच्छेदन के दौरान डायाफ्राम के आसान दृश्य के लिए अनुमति देने और छिड़काव के दौरान तरल पदार्थ की जल निकासी को प्रोत्साहित करने के लिए ट्रेंडेलेनबर्ग स्थिति (पिछड़े झुकाव) के लगभग 20 ° में रखेगा।

Figure 1
चित्रा 1: इकट्ठे छिड़काव तंत्र को दर्शाते हुए आरेख। संक्षिप्त नाम: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान की तैयारी

नोट: पीएफए समाधान छिड़काव के दिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए और प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा निपटान से पहले एक निर्दिष्ट अपशिष्ट कंटेनर में छिड़काव के अंत में त्याग दिया जाना चाहिए। यह प्रोटोकॉल 4% पीएफए समाधान का 1 एल बनाता है, जो लगभग 4 चूहों को सुगंधित करने के लिए पर्याप्त है। पीएफए अत्यधिक विषाक्त है, और पाउडर या तरल रूप में साँस लेना या सीधे त्वचा के संपर्क से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसलिए अधिकांश तैयारी चरण दस्ताने पहनते समय किए जाते हैं, ऊपर चश्मे की रक्षा करते हैं, और एक धूआं हुड के नीचे एक प्रयोगशाला कोट।

  1. आसुत जल का उपयोग करके 1 एल बीकर कुल्ला और 18 एमΩ आणविक-जीव विज्ञान-ग्रेड एच2ओ के लगभग 800 मिलीलीटर के साथ भरें।
  2. एच 2 ओ के बीकर कोमाइक्रोवेवमें 3 मिनट के लिए या पानी का तापमान 65 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक गर्म करें। एक धुएं के हुड में रखी हीटिंग / सरगर्मी प्लेट पर रखें।
  3. आसुत जल के साथ एक सरगर्मी रॉड कुल्ला और इसे गर्म पानी में रखें। हलचल शुरू करें और गर्म प्लेट को मध्यम गर्मी तक घुमाएं। सुनिश्चित करें कि पानी का तापमान 70 डिग्री सेल्सियस से ऊपर न जाए।
  4. सर्जिकल मास्क, दस्ताने, सुरक्षात्मक चश्मे और प्रयोगशाला कोट पहनें और 40 ग्राम पीएफए पाउडर को मापें। इस पाउडर को गर्म पानी में डालें।
  5. एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करके, समाधान के लिए 5 एम एनएओएच की कुछ बूंदें जोड़ें। पीएफए पाउडर को पूरी तरह से भंग करने दें। यदि पाउडर कुछ मिनटों के बाद पूरी तरह से भंग नहीं हुआ है, तो आवश्यकतानुसार 5 एम एनएओएच की बूंदें जोड़ें।
  6. एक बार जब लगभग सभी पीएफए भंग हो जाते हैं (थोड़ा टर्बिड दिखाई देंगे), सरगर्मी / हीटिंग को रोकें और तुरंत 10 एक्स फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 100 एमएल जोड़ें। अंत में, 18 एमΩ आणविक-जीव विज्ञान-ग्रेड एच2ओ का उपयोग करके बीकर पर 1 एल निशान तक पानी को ऊपर उठाएं बीकर को प्लास्टिक की चादर के साथ कवर करें और इसे -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें जब तक कि समाधान कमरे के तापमान (लगभग 45 मिनट) तक न पहुंच जाए।
  7. उचित मानकों का उपयोग करके पीएच मीटर को कैलिब्रेट करें। जबकि बीकर एक सरगर्मी प्लेट पर है, समाधान के पीएच को मापें और पीएच 7.4 तक पहुंचने तक एचसीएल जोड़ें। यदि आवश्यक हो, तो पीएच बढ़ाने के लिए 5 एम एनएओएच जोड़ें यदि यह बहुत कम है।
  8. वैक्यूम फ्लास्क को वैक्यूम से कनेक्ट करें और फ्लास्क में फिल्टर पेपर के साथ एक साफ सिरेमिक बुचनर फ़नल रखें। वैक्यूम चालू करें और 4% पीएफए समाधान से भरे स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करके फिल्टर पेपर को गीला करें।
  9. धीरे-धीरे फिल्टर पेपर पर 4% पीएफए समाधान डालें जब तक कि सभी समाधान फ़िल्टर न हो जाएं।
  10. फ़िल्टर किए गए समाधान को एक साफ, हल्के-संरक्षित कंटेनर में स्थानांतरित करें और उपयोग तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (24 घंटे से अधिक स्टोर न करें)।

3. ट्रांसकार्डियल "पंप मुक्त" छिड़काव

  1. धुएं के हुड में, एक ग्लास ट्रे में एक स्टायरोफोम विदारक ब्लॉक रखें। सुनिश्चित करें कि विदारक ब्लॉक सर्जरी के दौरान माउस को रोकने के लिए 5-6 छोटी सुइयों और छिड़काव टयूबिंग का समर्थन करने के लिए 2 लंबी सुइयों है।
  2. आसुत जल का उपयोग कर छिड़काव उपकरण कुल्ला। छिड़काव उपकरण को लटकाने से पहले सभी पानी को निकालने की अनुमति दें। छिड़काव की बोतलों को सुगंधित जानवर से 1 मीटर ऊपर लटकाएं (20-30 ग्राम माउस के लिए)।
  3. 18 एमΩ आणविक-जीव विज्ञान-ग्रेड एच2ओ के साथ पतला 10x पीबीएस का उपयोग करके 1x पीबीएस का एक गैर-बाँझ समाधान तैयार करें।
  4. जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, हेमोस्टैट का उपयोग करके छिड़काव तंत्र की मुख्य रेखा को दबाएं। पीएफए लाइन को एक और हेमोस्टैट के साथ क्लैंप करें।
    नोट: प्रवाह को पूरी तरह से रोकने के लिए प्रति पंक्ति कई हेमोस्टैट्स के साथ रोड़ा आवश्यक हो सकता है।
  5. कमरे के तापमान पर 1x पीबीएस के साथ बफर कंटेनर भरें।
  6. अपशिष्ट बफर इकट्ठा करने के लिए एक बीकर में छिड़काव तंत्र के सिरिंज अंत रखें और मुख्य लाइन (चित्रा 2, बाएं) को रोकने वाले हेमोस्टैट को हटा दें।
  7. ट्यूब की दीवारों पर सख्ती से दोहन करके फंसी हुई हवा को हटाते हुए पीबीएस को लाइन के माध्यम से प्रवाहकरने की अनुमति दें।
  8. एक बार जब सभी हवा बफर और मुख्य लाइनों से हटा दी जाती है, तो मुख्य लाइन पर एक हेमोस्टैट रखकर प्रवाह को रोक दें।
  9. पीएफए लाइन से हेमोस्टैट निकालें और पीएफए लाइन (चित्रा 2, मध्य) में किसी भी बुलबुले को टैप करते समय पीबीएस को पीएफए बोतल तक प्रतिगामी तरीके से प्रवाहित करने की अनुमति दें। पीबीएस को पीएफए लाइन में अनुमति देना जारी रखें जब तक कि पीबीएस को बोतल के उद्घाटन के ठीक ऊपर नहीं देखा जा सकता है। पीएफए बोतल में प्रवाह को रोकने के लिए हेमोस्टैट के साथ पीएफए लाइन को रोकें।
  10. छिड़काव सिरिंज से बुलबुले को हटाने के लिए लाइन के माध्यम से (मुख्य लाइन हेमोस्टैट खोलकर) तितली जलसेक सुई को छिड़काव सिरिंज से कनेक्ट करें और फ्लश पीबीएस। मेन-लाइन हेमोस्टैट को बंद करें।
  11. सुनिश्चित करें कि पीबीएस की बोतल अब पीबीएस से लगभग 1/3 भरीहुई है। यदि आवश्यक हो, तो मुख्य लाइन के माध्यम से पीबीएस फ्लश करें या अपनी पूरी क्षमता के 1/3तक बफर बोतल में अधिक पीबीएस भरें।
  12. एक बार जब सभी बुलबुले पीबीएस, पीएफए और मुख्य लाइनों से हटा दिए जाते हैं, तो बोतल पर काले निशान तक कमरे के तापमान पर 4% पीएफए समाधान के साथ पीएफए बोतल भरें (लगभग 1/3 पूर्ण ) (चित्रा 2, दाएं)।

Figure 2
चित्रा 2: छिड़काव सर्जरी के लिए छिड़काव उपकरण की तैयारी। सबसे पहले, पीएफए लाइन हेमोस्टैट को बंद करें और पीबीएस लाइन और मुख्य लाइन पर हेमोस्टैट खोलें। पीबीएस भरें और पीबीएस लाइन और मुख्य लाइन से बुलबुले निकालें। अगला, पीएफए लाइन पर हेमोस्टैट खोलकर और मुख्य लाइन पर हेमोस्टैट को बंद करके पीबीएस के साथ पीएफए लाइन भरें। पीएफए लाइन में बुलबुले निकालें। अंत में, पीएफए लाइन पर हेमोस्टैट बंद करें जब पीबीएस पीएफए बोतल के उद्घाटन तक पहुंच जाए। पीएफए बोतल को पीएफएसे भरा 1 /3 भरें। सुनिश्चित करें कि पीबीएस बोतल में पीबीएस का स्तर 1/3 भराहुआ है और यदि आवश्यक हो तो मुख्य लाइन हेमोस्टैट खोलकर पीबीएस या नाली पीबीएस से भरें। संक्षिप्त नाम: पीबीएस = फॉस्फेट-बफर खारा; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. 70% इथेनॉल के बाद पानी के साथ निम्नलिखित उपकरणों की सफाई करके गैर-उत्तरजीविता सर्जरी के लिए तैयार करें: बड़ी कैंची, ठीक विदारक कैंची, त्वचा संदंश, ठीक फेनेस्ट्रेटेड घुमावदार संदंश।
  2. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में धूल मुक्त पोंछे रखकर संज्ञाहरण तैयार करें। एक धूआं हुड में, धूल मुक्त पोंछे को आइसोफ्लूरेन के साथ अच्छी तरह से भिगोएं और खुली ट्यूब को 500 मिलीलीटर बीकर में उल्टा रखें। सुनिश्चित करें कि बीकर के तल पर कोई तरल आइसोफ्लूरेन मौजूद नहीं है और बीकर में माउस रखने से पहले किसी भी तरल आइसोफ्लूरेन को त्याग दें।
  3. बीकर में माउस रखें और संज्ञाहरण शुरू करने के लिए उद्घाटन पर प्लास्टिक की चादर रखें।
  4. संज्ञाहरण का प्रशासन जब तक माउस साँस लेना बंद कर देता है (लगभग 1 मिनट और 30 एस)।
  5. जब श्वास बंद हो जाता है, तो तुरंत बीकर से माउस को हटा दें और 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब पर टोपी को प्रतिस्थापित करें।
  6. जाँच करें कि माउस पैर की अंगुली चुटकी पलटा का उपयोग करके पर्याप्त रूप से संवेदनाहारी है। यदि जानवर पर्याप्त रूप से संवेदनाहारी नहीं है, तो चरण 3.15 में वर्णित अधिक आइसोफ्लूरेन का प्रशासन करें।
  7. जल्दी से काम करते हुए, माउस को स्टायरोफोम ब्लॉक पर रखें और चार छोटी सुइयों (जैसे, 22 जी सिरिंज सुइयों) का उपयोग करके पंजे को बाहर की ओर पिन करें।
  8. त्वचा संदंश के साथ पेट की त्वचा उठाना, पेट की दीवार के माध्यम से कटौती करने के लिए बड़ी कैंची का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि कोई पेट के अंग काटे नहीं जाते हैं!
  9. पेट में कटौती को यकृत की ओर बेहतर तरीके से जारी रखें। पूर्वकाल पेट की दीवार से जिगर को अलग करें और डायाफ्राम की ओर प्रारंभिक चीरा जारी रखें। डायाफ्राम से लगभग 1 सेमी हीन इस चीरा को रोकें। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें कि यकृत कट न जाए!
  10. प्रारंभिक चीरा को "वाई" आकार का चीरा (चित्रा 3 ए) बनाने के लिए डायाफ्राम के दाईं और बाईं ओर पार्श्व रूप से जारी रखें।
  11. जब चीरा डायाफ्राम तक पहुंचता है, तो ठीक विदारक कैंची का उपयोग करके डायाफ्राम में एक छेद करें और जानवर के दाईं ओर पसलियों के माध्यम से काट लें। पसलियों को दाहिने एक्सिला के लगभग आधे रास्ते में काटें।
  12. डायाफ्राम के बाईं ओर के माध्यम से लगभग सभी तरह से बाएं एक्सिला के लिए एक समान लेकिन लंबा चीरा बनाएं।
  13. छाती की दीवार को प्रतिबिंबित करें और इसे स्टायरोफोम ब्लॉक में पिन करें।
  14. यदि आवश्यक हो, तो बाएं वेंट्रिकल को उजागर करने के लिए हृदय के चारों ओर से वसा को विच्छेदित करें। दाएं वेंट्रिकल की तुलना में अपेक्षाकृत हल्के रंग के आधार पर बाएं वेंट्रिकल की पहचान करें।
  15. बाएं वेंट्रिकल की पहचान करने के बाद, ठीक घुमावदार संदंश के साथ हल्के दबाव का उपयोग करके हृदय को स्थिर रखें। पीबीएस को सुई के माध्यम से प्रवाहित करने की अनुमति देने के लिए मुख्य लाइन हेमोस्टैट खोलें। तुरंत बाएं वेंट्रिकल को छेदें और आश्वस्त करें कि सुई वेंट्रिकल में 0.5 सेमी से अधिक नहीं डाली जाती है। यदि आवश्यक हो तो सुई को थोड़ा वापस लें।
    नोट: बाएं वेंट्रिकल में सुई की सटीक नियुक्ति सुई ट्यूबिंग में रक्त के प्रतिगामी प्रवाह द्वारा इंगित की जाती है। यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि सुई वेंट्रिकल में बहुत गहराई से नहीं डाली गई है। इसके परिणामस्वरूप फुफ्फुसीय नसों के माध्यम से प्रतिगामी प्रवाह हो सकता है या इंटरवेंट्रिकुलर सेप्टम को भेदी हो सकता है।
  16. दो बड़े 18 जी सुइयों का उपयोग करके स्टायरोफोम में बने एक्स पर तितली ट्यूबिंग को आराम दें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह छिड़काव के दौरान दिल के भीतर तितली सुई के आंदोलन से बचेगा।
  17. अवर वेना कावा की पहचान करें क्योंकि यह यकृत से बाहर निकलता है और ठीक विदारक कैंची (चित्रा 3 बी) का उपयोग करके इसे ट्रांसेक्ट करता है। वैकल्पिक रूप से, कैंची के साथ सही आलिंद खोलें।
  18. पीबीएस छिड़काव शुरू करने के लिए अनुमति देने के लिए तुरंत मुख्य लाइन खोलें (चित्रा 3 सी)।
  19. आश्वस्त करें कि पीबीएस स्टायरोफोम ब्लॉक और नीचे ग्लास ट्रे में सूखा रहा है। यदि ऐसा नहीं हो रहा है, तो ग्लास ट्रे में तरल पदार्थ की निकासी की अनुमति देने के लिए ट्रे या स्टायरोफोक ब्लॉक के कोण को समायोजित करें।
  20. पीबीएस छिड़काव जारी रखें जब तक कि अवर वेना कावा से बहने वाला तरल रक्त मुक्त (लगभग 3 मिनट) न हो।
    नोट: दिल में सुई के उचित प्लेसमेंट के परिणामस्वरूप यकृत से रक्त का दृश्य समाशोधन होगा, जो लाल से पुआल के रंग में बदल जाएगा। यदि ऐसा नहीं होता है, तो इसे बाएं वेंट्रिकल के भीतर जलसेक सुई को पुनर्स्थापित करके ठीक किया जा सकता है। छिड़काव की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उदर पूंछ आधार में एक छोटा चीरा लगाया जा सकता है। उचित छिड़काव के परिणामस्वरूप पूंछ आधार चीरा से बहने वाले स्पष्ट पीबीएस होंगे।
  21. जल्दी से काम करना, एक हेमोस्टैट के साथ पीबीएस लाइन को रोकें और पीएफए लाइन खोलें।
  22. पीएफए को कुछ मिनटों के लिए छिड़कने दें जब तक कि पूंछ कर्ल करना शुरू न कर दे। एक बार पूंछ कर्ल करना शुरू कर देती है, तो 50 मिनट का टाइमर शुरू करें। यदि पूंछ पीएफए छिड़काव के 5 मिनट के बाद कर्ल नहीं करती है, तो पीएफए छिड़काव के लिए 50 मिनट का टाइमर शुरू करें।
  23. छिड़काव के दौरान बोतल में पीएफए स्तर की लगातार निगरानी करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्तर बहुत कम न हो। बोतल में अधिक पीएफए भरें यदि स्तर बोतल के ढक्कन से 2 सेमी से नीचे चला जाता है।

Figure 3
चित्रा 3: ट्रांसकार्डियल छिड़काव को दर्शाने वाला आरेख( ए) पेट की दीवार को पहले काटा जाता है, इसके बाद एक्सिला की ओर दो पार्श्व रूप से इंगित चीरों को "वाई" बनाते हैं। (बी) वक्ष गुहा में प्रवेश करने और हृदय को उजागर करने के बाद, सुई को बाएं वेंट्रिकल में पारित किया जाता है। अगला, आईवीसी या दाएं आलिंद को शरीर के माध्यम से प्रसारित होने के बाद इत्र के जल निकासी की अनुमति देने के लिए ट्रांसेक्ट किया जाता है। आईवीसी डायाफ्राम से बेहतर कट जाता है। (सी) इत्र के प्रशासन के लिए प्रक्रिया। संक्षिप्त नाम = आईवीसी = अवर वेना कावा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. 50 मिनट बीत जाने के बाद, हेमोस्टैट के साथ मुख्य रेखा को रोकें और बाएं वेंट्रिकल से सुई वापस लें।
    नोट: पूरे माउस इस बिंदु पर कठोर है और अब 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पीएफए के लेबल कंटेनर में रखा जा सकता है। इस स्तर पर, सीएनएस ऊतकों को विच्छेदित करना और उन्हें रात भर फिक्सेटिव में व्यक्तिगत रूप से रखना संभव है। इस काम में, पूरे माउस को फिक्सेटिव में रखा जाता है क्योंकि यह 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्धारण और प्लेसमेंट के बीच के अंतराल को छोटा करता है। यह तंत्रिका ऊतक के किसी भी संभावित यांत्रिक विरूपण से भी बचा जाता है जो तब हो सकता है जब जानवरों को रात भर निर्धारण पूरा होने से पहले पूर्व-विच्छेदित किया जाता है।

4. सीएनएस विच्छेदन

  1. कैंची, त्वचा संदंश, घुमावदार फेनेस्ट्रेटेड संदंश, घुमावदार ठीक संदंश, सीधे ठीक संदंश, ठीक कैंची: पानी के साथ धोने से विच्छेदन के लिए निम्नलिखित उपकरणों तैयार करें।
  2. निम्नानुसार माउस प्रति चार ट्यूबों को लेबल करें और बाँझ 20% सुक्रोज से भरें: माउस आईडी, मस्तिष्क 1, माउस आईडी, मस्तिष्क 2, माउस आईडी, काठ का, माउस आईडी, गर्भाशय ग्रीवा।
  3. पीएफए समाधान से माउस निकालें और अतिरिक्त पीएफए को हटाने के लिए इसे पेपर तौलिया के साथ सूखा दें।
  4. बड़ी कैंची का उपयोग करके, गर्दन पर काटकर माउस के सिर को हटा दें।
  5. शरीर को पीएफए घोल में रखें। खोपड़ी से मस्तिष्क को विच्छेदित करने के लिए सिर को बनाए रखें।
  6. मस्तिष्क को विच्छेदन करने के लिए, पूरे खोपड़ी (चित्रा 4 ए) को उजागर करने के लिए कपाल त्वचा को प्रतिबिंबित करके शुरू करें।
  7. खोपड़ी में प्रवेश पाने के लिए ठीक विदारक कैंची का उपयोग करके श्रवण नहर में एक उथला कटौती करें
  8. अनुप्रस्थ साइनस के साथ इस कटौती को तब तक जारी रखें जब तक कि खोपड़ी दोनों श्रवण नहरों के बीच सभी तरह से कट न जाए।
  9. खोपड़ी के सबसे रोस्ट्रल भाग (लगभग आंखों के बीच) के लिए अनुदैर्ध्य विदर के साथ पिछले कट के लंबवत कटौती करें।
  10. फेनेस्ट्रेटेड घुमावदार संदंश का उपयोग करके, अग्रमस्तिष्क को उजागर करने के लिए खोपड़ी को पार्श्व रूप से प्रतिबिंबित करें। घ्राण बल्ब सहित पूरे अग्रमस्तिष्क के उजागर होने तक खोपड़ी को हटाना जारी रखें।
  11. पश्चकपाल हड्डी के माध्यम से कटौती करके खोपड़ी के दुम क्षेत्र को विच्छेदन शुरू करें और धीरे-धीरे इस कटौती को रंध्र मैग्नम की ओर जारी रखें।
  12. सेरिबैलम और ब्रेनस्टेम कौडली (चित्रा 4 बी) को उजागर करने के लिए खोपड़ी के दो टुकड़ों को पार्श्व रूप से प्रतिबिंबित करें।
  13. पूर्वकाल खोपड़ी से घ्राण बल्बों को अलग करने के लिए अल्ट्राफाइन घुमावदार संदंश का उपयोग करें और घ्राण बल्बों से शुरू होने वाली खोपड़ी के आधार से मस्तिष्क को छीलना शुरू करें।
  14. चूंकि मस्तिष्क खोपड़ी के आधार से दूर छील जाता है, कपाल तंत्रिकाओं को काटने और मस्तिष्क को हटाने की अनुमति देने के लिए अल्ट्राफाइन संदंश का उपयोग करें।
  15. खोपड़ी के आधार से मस्तिष्क को छीलना जारी रखें जब तक कि पूरे बरकरार मस्तिष्क को हटा नहीं दिया जाता है (चित्रा 4 सी, डी)।
  16. एक दूसरे से दाएं और बाएं गोलार्धों को अलग करने के लिए अनुदैर्ध्य विदर के साथ मस्तिष्क को आधे में काटें (चित्रा 4 ई, एफ)।
  17. मस्तिष्क में एक गोलार्द्ध 1 ट्यूब और मस्तिष्क 2 ट्यूब में दूसरा गोलार्द्ध रखें। मस्तिष्क गोलार्धों के डूबने तक इन ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (लगभग रात भर)।

Figure 4
चित्रा 4: निश्चित मस्तिष्क को हटाना( ए) खोपड़ी का शीर्ष। (बी) खोपड़ी के भीतर उजागर मस्तिष्क। (सी) पृथक मस्तिष्क (पृष्ठीय पहलू)। (डी) पृथक मस्तिष्क (उदर पहलू)। (ई) बाएं गोलार्ध (पार्श्व पहलू)। (एफ) बाएं गोलार्ध (औसत दर्जे का पहलू)। स्केल बार = 1 सेमी (ई और एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. रीढ़ की हड्डी को विच्छेदन करने के लिए, पीएफए से माउस शरीर को हटा दें और इसे सूखा दें।
  2. प्रवण स्थिति में एक स्टायरोफोम विदारक ब्लॉक पर माउस रखें और चार सुइयों का उपयोग करके ब्लॉक में पंजे पिन करें।
  3. पूरे पीठ को उजागर करने के लिए गर्दन से पूंछ तक माउस की मध्य रेखा के नीचे त्वचा को काटकर विच्छेदन शुरू करें।
  4. कशेरुक स्तंभ के पीछे के हिस्से को उजागर करने के लिए पीठ पर मांसपेशियों और प्रावरणी को प्रतिबिंबित करें।
  5. सबसे कपाल कशेरुकाओं पर शुरू, रीढ़ की हड्डी (चित्रा 5 ए) से परहेज करते हुए लामिना के माध्यम से कटौती करने के लिए ठीक विदारक कैंची का उपयोग करें।
  6. लामिना के नीचे अल्ट्राफाइन घुमावदार संदंश रखें और रीढ़ की हड्डी (चित्रा 5 बी) को उजागर करने के लिए कशेरुकाओं को फ्रैक्चर करने के लिए ऊपर की ओर खींचें।
  7. खंडित कशेरुकाओं को प्रतिबिंबित करने और रीढ़ की हड्डी के सबसे पार्श्व क्षेत्रों को उजागर करने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें।
  8. लामिना के नीचे अल्ट्राफाइन घुमावदार संदंश रखकर और कशेरुकाओं को फ्रैक्चर करके अगले कशेरुकाओं के लिए इस प्रक्रिया को जारी रखें। पूरे ग्रीवा रीढ़ और वक्ष रीढ़ (चित्रा 5 सी) उजागर कर रहे हैं जब तक कशेरुक फ्रैक्चर करने के लिए जारी रखें।
  9. काठ का रीढ़ की हड्डी (चित्रा 5 डी) के अंत तक रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करना जारी रखें।
  10. एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करके, मिडथोरैसिक रीढ़ की हड्डी के माध्यम से सभी तरह से काट लें।
  11. अल्ट्राफाइन घुमावदार संदंश का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी से रीढ़ की हड्डी और प्रावरणी पूर्वकाल से रीढ़ की हड्डी में धीरे-धीरे ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को अलग करने के लिए रीढ़ की हड्डी से रीढ़ की हड्डी को स्थानांतरित करें।
  12. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को विच्छेदन करना जारी रखें जब तक कि यह कशेरुकाओं (चित्रा 5 ई) से मुक्त न हो। ग्रीवा लेबल वाली ट्यूब में ग्रीवा-मिडथोरेसिक रीढ़ की हड्डी रखें। ग्रीवा रीढ़ की हड्डी डूबने तक इस ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (लगभग रात भर)।
  13. चरण 4.22 से 4.25 में विस्तृत के रूप में कौडा इक्विना के लिए सभी तरह से वक्षीय कशेरुकाओं को फ्रैक्चर करना जारी रखें। जब कौडा इक्विना उजागर होता है, तो काठ का रीढ़ की हड्डी (चित्रा 5 एफ) के नीचे रीढ़ की हड्डी को 1 सेमी काटने के लिए एक तेज रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
  14. चरण 4.26-4.27 में उल्लिखित कशेरुकाओं से दूर काठ का रीढ़ की हड्डी विच्छेदन। काठ का लेबल वाली ट्यूब में काठ का मध्य कौडा इक्विना रीढ़ की हड्डी रखें। काठ का रीढ़ की हड्डी डूबने तक इस ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (लगभग रात भर)।
  15. जब सभी ऊतक 20% सुक्रोज में डूब जाते हैं, तो उन्हें 30% सुक्रोज के लेबल वाली ट्यूबों में स्थानांतरित करें जब तक कि वे डूब न जाएं या 3 दिनों तक।
    नोट: रीढ़ की हड्डी के ऊतक अक्सर 30% सुक्रोज पर डूबते नहीं हैं।

Figure 5
चित्रा 5: निश्चित रीढ़ की हड्डी के खंडों को हटाना( ए) ग्रीवा कशेरुकाओं के लामिना में प्रारंभिक कटौती। (बी) व्यक्तिगत कशेरुकाओं को फ्रैक्चर करने के लिए घुमावदार संदंश की नियुक्ति। (सी) उजागर ग्रीवा रीढ़ की हड्डी। (डी) उजागर ग्रीवा, वक्ष, और काठ का रीढ़ की हड्डी। (ई) रीढ़ की हड्डी की नसों को काटने के बाद ग्रीवा रीढ़ की हड्डी को हटाना। (एफ) त्रिक रीढ़ की हड्डी को काटना। (जी) पृथक ग्रीवा रीढ़ की हड्डी। (एच) पृथक काठ का रीढ़ की हड्डी। स्केल सलाखों = 1 सेमी (जी और एच)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

5. ओसीटी एम्बेडिंग और ऊतक भंडारण

  1. प्रत्येक माउस के लिए, चार आयताकार आकार के क्रायोमोल्ड्स लेबल करें: माउस आईडी, राइट गोलार्ध, एम्बेडिंग की तारीख; माउस आईडी, बाएं गोलार्ध, एम्बेडिंग की तारीख; माउस आईडी, गर्भाशय ग्रीवा, एम्बेडिंग की तारीख; माउस आईडी, काठ का, एम्बेडिंग की तारीख।
  2. एक स्टायरोफोम कंटेनर सेट करें और कंटेनर के ऊपर एक धातु कप लटकाएं।
  3. स्टायरोफोम कंटेनर को तरल नाइट्रोजन के साथ लगभग आधे रास्ते में भरें। धातु के कप को ताजा 2-मिथाइलब्यूटेन के साथ लगभग आधे रास्ते में भरें।
    नोट: 2-मिथाइलब्यूटेन विषाक्त, अत्यधिक अस्थिर और ज्वलनशील है। एक धूआं हुड में और दहन स्रोतों से दूर बाद के चरणों को करके साँस लेना से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
  4. धीरे-धीरे धातु कप को तरल नाइट्रोजन में कम करें और धातु कप में तरल नाइट्रोजन के किसी भी छिड़काव से बचें।
  5. 2-मिथाइलब्यूटेन को ठंड शुरू करने दें। जबकि 2-मिथाइलब्यूटेन ठंड रहा है, वांछित ऊतक को 30% सुक्रोज समाधान से बाहर निकालें और इसे धूल मुक्त पोंछने पर सूखा दें।
  6. मोल्ड के शीर्ष (बिना लेबल वाले) हिस्से की ओर इशारा करने वाले रोस्ट्रल क्षेत्र के साथ एक क्रायोमोल्ड में ऊतक रखें।
  7. क्रायोमोल्ड में ऊतक पर इष्टतम काटने का तापमान एम्बेडिंग माध्यम (ओसीटी) डालें, केवल ऊतक को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त उपयोग करें। अत्यधिक ओसीटी का उपयोग करने से बचें क्योंकि इससे क्रैकिंग हो सकती है। ओसीटी से किसी भी बुलबुले को हटा दें।
  8. जब जमे हुए 2-मिथाइलब्यूटेन ने धातु कप की आंतरिक सतह को पूरी तरह से कवर किया है, तो क्रायोमोल्ड को 12 एस के लिए ओवरलेइंग तरल चरण 2-मिथाइलब्यूटेन में पूरी तरह से विसर्जित करें। 12 एस के बाद, क्रायोमोल्ड को लेबल एल्यूमीनियम पन्नी वर्ग में निकालने के लिए रखें और पूरे क्रायोमोल्ड को लपेटें। तुरंत सूखी बर्फ पर लिपटे क्रायोमोल्ड रखें और विगलन से बचें। सुनिश्चित करें कि जमे हुए ओसीटी / क्रायोमोल्ड हमेशा सूखी बर्फ से ढके होते हैं।
  9. सभी ऊतकों के लिए 5.8 के माध्यम से चरण 5.6 दोहराएँ। एक सील बंद छोटे प्लास्टिक बैग में एक माउस के लिए ऊतक रखें और फिर एक क्रायो-सुरक्षित, सील कंटेनर में रखें। इस कंटेनर को -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर में स्टोर करें जब तक कि अनुभाग काट न लें।

6. क्रायोसेक्शनिंग

  1. क्रायोसेक्शनिंग से पहले, सुनिश्चित करें कि क्रायोस्टैट चैंबर तापमान और नमूना सिर उपयुक्त सेटिंग्स पर सेट हैं।
    नोट: -20 डिग्री सेल्सियस का एक कक्ष तापमान, -20 डिग्री सेल्सियस का एक नमूना सिर का तापमान, और 30 μm की एक खंड मोटाई मस्तिष्क वर्गों को काटने के लिए उपयोग की जाती है। रीढ़ की हड्डी के वर्गों को काटने के लिए, -23 डिग्री सेल्सियस का एक कक्ष तापमान, -30 डिग्री सेल्सियस का एक नमूना सिर का तापमान और 30 μm की एक खंड मोटाई का उपयोग किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ऊतक की गुणवत्ता के साथ समस्याओं को हल करने के लिए सेक्शनिंग के दौरान क्रायोस्टैट सेटिंग्स (विशेष रूप से नमूना सिर का तापमान) को समायोजित करने की आवश्यकता होगी। आम तौर पर, नमूना सिर का तापमान ऊतक स्मीयरिंग के लिए सही करने के लिए कम हो जाता है। इसके विपरीत, नमूना सिर का तापमान अत्यधिक ऊतक कर्लिंग के लिए सही करने के लिए बढ़ाया जाता है।
  2. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से वांछित ओसीटी ब्लॉक निकालें और क्रायोस्टैट चैंबर में अनचाहे क्रायोमोल्ड /
  3. ओसीटी ब्लॉक को 30 मिनट के लिए कक्ष के तापमान के अनुकूल होने दें।
  4. 70% इथेनॉल के साथ एक चक को साफ करें और इसे धूल मुक्त पोंछने के साथ सूखा पोंछ लें। साफ किए गए चक को क्रायोस्टैट चैंबर में रखें और चक पर ओसीटी का सिक्का आकार का सर्कल बनाएं। ओसीटी को फ्रीज करने की अनुमति दें (लगभग 1-2 मिनट)।
  5. जब ओसीटी जम जाता है, तो चक पर ताजा ओसीटी का एक मटर के आकार का डॉट रखें और तुरंत चक पर ऊतक ओसीटी ब्लॉक रखें। सुनिश्चित करें कि ओसीटी पूरी तरह से जमने से पहले ऊतक चक के लिए पूरी तरह से लंबवत है।
    नोट: आम तौर पर, मस्तिष्क के सबसे रोस्ट्रल क्षेत्र को चक की ओर रखा जाता है ताकि पुच्छल अंत से सेक्शनिंग शुरू हो। रीढ़ की हड्डी के लिए, आम तौर पर, सबसे अधिक दुम क्षेत्र को चक पर रखा जाता है ताकि रोस्ट्रल छोर से सेक्शनिंग शुरू हो।
  6. जब ओसीटी कठोर हो जाता है, तो सेक्शनिंग के दौरान संरचनात्मक समर्थन के रूप में कार्य करने के लिए ओसीटी ब्लॉक के आधार के चारों ओर अधिक ओसीटी रखें। जब यह समर्थन थोड़ा कठोर हो जाता है, तो चक को नमूना सिर पर रखें और ओसीटी ब्लॉक को 30 मिनट के लिए नमूना सिर के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दें।
  7. ब्लेड धारक में एक माइक्रोटोम ब्लेड रखें और एंटीरोल प्लेट को साफ करें। यह सुनिश्चित करने के लिए एंटीरोल प्लेट दूरी को समायोजित करें कि ऊतक सेक्शनिंग के दौरान प्लेट के ठीक नीचे से गुजर रहा है। एंटीरोल प्लेट की सही स्थिति के बारे में अधिक जानकारी के लिए, क्रायोस्टैट मैनुअल से परामर्श करें।
  8. ओसीटी ब्लॉक नमूना सिर के तापमान के आदी होने के बाद, ऊतक तक पहुंचने तक ओसीटी ब्लॉक को ट्रिम करना शुरू करें। जब ऊतक दिखाई देता है, तो ट्रिमिंग से सेक्शनिंग पर स्विच करें और 30 μm वर्गों को काटना शुरू करें। एंटीरोल प्लेट को एक तरफ ले जाएं और माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करके, अनुभाग उठाएं।
  9. वर्गों के शारीरिक स्थान से संतुष्ट होने तक वर्गों को काटना और इकट्ठा करना जारी रखें या सभी ऊतक काट दिए गए हैं। स्लाइड को 1-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर सूखने के लिए रखें। सूखने के बाद, स्लाइड्स को स्लाइड बॉक्स में रखें और इस बॉक्स को एक सीलबंद प्लास्टिक बैग में रखें। -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर में स्लाइड रखने से पहले माउस आईडी और ऊतक जानकारी के साथ बैग लेबल।

7. इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना

  1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइड को पिघलाएं।
  2. स्लाइड्स को एक क्षैतिज स्लाइड जार में रखें और एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में अनुभागों को 3 बार धो लें।
  3. अवरुद्ध बफर (2% बीएसए + 0.3% ट्राइटन-एक्स -100 1एक्स पीबीएस में) तैयार करें। प्रति स्लाइड लगभग 1 मिलीलीटर का उपयोग करें।
  4. तल पर पानी जोड़कर एक आर्द्र कक्ष बनाएं। स्लाइड्स को क्षैतिज रूप से सामना करें और उन्हें सूखने न दें। प्रत्येक स्लाइड में अवरुद्ध बफर के 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. एंटीबॉडी बफर (0.7% बीएसए + 0.3% ट्राइटन-एक्स -100 1एक्स पीबीएस में) में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    नोट: फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन एंटीबॉडी के लिए, 1: 500 के कमजोर पड़ने वाले कारक का उपयोग किया गया था।
  6. प्रति स्लाइड प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 200-300 μL जोड़ें। एंटीबॉडी फैलाने के लिए एक कवरस्लिप के साथ कवर करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  7. अगले दिन, आर्द्र कक्ष से स्लाइड्स को हटा दें और उन्हें कवरस्लिप को गिरने की अनुमति देने के लिए 1x पीबीएस से भरे एक ऊर्ध्वाधर कोप्लिन जार में रखें। प्रत्येक स्लाइड के लिए व्यक्तिगत रूप से ऐसा करें और ध्यान रखें कि कवरस्लिप को हटाते समय ऊतक अनुभाग को परेशान न करें।
  8. स्लाइड्स को एक क्षैतिज स्लाइड जार में रखें और एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में अनुभागों को 3 बार धो लें।
    नोट: फ्लोरोफोर को फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए बाद के सभी चरणों को रोशनी बंद करने के साथ किया जाना चाहिए!
  9. एंटीबॉडी बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें।
    नोट: फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन का पता लगाने के लिए, एंटीबॉडी बफर में 1: 500 के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ एलेक्सा 488 के लिए संयुग्मित एंटी-खरगोश माध्यमिक (0.7% बीएसए + 0.3% ट्राइटन-एक्स -100 1एक्स पीबीएस में) का उपयोग किया गया था।
  10. आर्द्र कक्ष में क्षैतिज रूप से स्लाइड रखें और प्रति स्लाइड माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 200-300 μL जोड़ें। एंटीबॉडी को फैलाने के लिए कवरस्लिप के साथ कवर करें। कम से कम 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  11. आर्द्र कक्ष से स्लाइड निकालें और उन्हें कवरस्लिप को गिरने की अनुमति देने के लिए 1x पीबीएस से भरे एक ऊर्ध्वाधर कोप्लिन जार में रखें। प्रत्येक स्लाइड के लिए व्यक्तिगत रूप से ऐसा करें और ध्यान रखें कि कवरस्लिप को हटाते समय ऊतक अनुभाग को परेशान न करें।
  12. स्लाइड्स को एक क्षैतिज स्लाइड जार में रखें और एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर प्रत्येक धोने के लिए 10 मिनट के लिए पीबीएस में अनुभागों को 3 बार धो लें।
  13. एक तौलिया पर स्लाइड के किनारे को ब्लॉट-ड्राई करें और अतिरिक्त पीबीएस को हिलाएं।
  14. प्रत्येक स्लाइड में बढ़ते माध्यम की 3 बूंदें जोड़ें। कवरस्लिप जोड़ें और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग से पहले कवरस्लिप को दबाकर संदंश की एक जोड़ी के साथ धीरे-धीरे बुलबुले को धक्का दें।

Representative Results

उच्च गुणवत्ता छिड़काव जिगर, रीढ़ की हड्डी, और गहरी सीएनएस संरचनाओं (चित्रा 4 सी और चित्रा 5 जी, एच) में रक्त की अनुपस्थिति से संकेत मिलता है। ड्यूरा मेटर के नीचे रक्त को बनाए रखा (उदाहरण के लिए, शिरापरक साइनस के भीतर) या ड्यूरा मेटर और खोपड़ी के बीच समस्याग्रस्त नहीं है क्योंकि यह रक्त मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर नहीं है। चित्रा 4 ए में देखा गया रक्त खोपड़ी और ड्यूरा पदार्थ के बीच स्थित है और इसलिए खराब गुणवत्ता वाले छिड़काव के समस्याग्रस्त या विचारोत्तेजक नहीं है। ताजा मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी काफी नरम और हैंडलिंग के दौरान आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाती है। तुलनात्मक रूप से पर्याप्त रूप से निश्चित ऊतक दृढ़ हैं। ऊतक की गुणवत्ता और इस छिड़काव विधि द्वारा ऊतकों की आकृति विज्ञान के संरक्षण का आकलन करने के लिए, यह काम 15 महीने के माउस के मिडब्रेन और काठ का रीढ़ की हड्डी में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन का पता लगाने और मानव ए 53 टी α-सिन्यूक्लिन (चित्रा 6) को व्यक्त करने वाले 7 महीने के माउस को दर्शाता है।

ऑटोसोमल प्रमुख पार्किंसंस रोग (पीडी) वाले रोगियों में ए 53 टी उत्परिवर्तन अतिरंजित है। इसके अलावा, ए 53 टी उत्परिवर्तन के साथ मानव α-सिन्यूक्लिन चूहों 6,7 में व्यक्त होने पर मानव पीडी की कई विशेषताओं को पुन: प्राप्त कर सकता है। सेरीन 129 अवशेषों पर α-सिन्यूक्लिन का फॉस्फोराइलेशन विवो और इन विट्रो में α-सिन्यूक्लिन एकत्रीकरण को प्रेरित करने के लिए दिखाया गयाहै 8. लेवी शरीर पीडी या लेवी बॉडी डिमेंशिया9 के रोगियों में मौजूद शास्त्रीय हिस्टोलॉजिकल खोज हैं। लेवी निकायों में मौजूद α-सिन्यूक्लिन का अधिकांश हिस्सा सेरीन 12910,11 पर फॉस्फोराइलेटेड है। नतीजतन, फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन के संचय का उपयोग पीडी पैथोलॉजी की हिस्टोलॉजिकल गंभीरता के मार्कर के रूप में किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में पाया गया है कि फॉस्फोरिलेटेड α-सिन्यूक्लिन मानव ए 53 टी α-सिन्यूक्लिन को व्यक्त करने वाले 7 महीने के स्पर्शोन्मुख चूहों के सापेक्ष 15.5 महीने के रोगसूचक चूहों में काफी उच्च स्तर पर जमा होता है। यह रीढ़ की हड्डी के पूर्वकाल सींग और इन चूहों के मिडब्रेन में साइटोपैथोलॉजी के संवर्धन का वर्णन करने वाली रिपोर्टों के अनुरूप है। 6 इससे, यह निष्कर्ष निकाला गया है कि यहां वर्णित सरलीकृत छिड़काव विधि डाउनस्ट्रीम हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए सीएनएस ऊतकों का उच्च गुणवत्ता निर्धारण प्रदान करती है।

Figure 6
चित्रा 6: पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल से मिडब्रेन और काठ का रीढ़ की हड्डी के ऊतकों में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन के लिए लेबल। वृद्ध (15.5 महीने का) अंत-चरण लकवाग्रस्त माउस की तुलना 7 महीने के स्वस्थ माउस के साथ की जाती है। दोनों चूहे मानव α-सिन्यूक्लिन के एक मिसफोल्डिंग प्रवण उत्परिवर्ती संस्करण (ए 53 टी) को व्यक्त करते हैं जो पार्किंसंस जैसी विकृति को प्रेरित करता है। स्केल बार = 100 μm (ऊपरी पैनल) और 50 μm (निचले पैनल)। संक्षिप्त नाम: α सिंक-ए 53 टी = α-सिन्यूक्लिन का ए 53 टी उत्परिवर्ती; डीएपीआई = 4 ',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; पीएस 129 = α-सिन्यूक्लिन के फॉस्फोराइलेटेड सेरीन 129। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह कार्य ट्रांसकार्डियल छिड़काव करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है। छिड़काव तंत्र (प्रोटोकॉल अनुभाग 1) का निर्माण करते समय, ट्यूबिंग का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो हेमोस्टैट द्वारा पूरी तरह से रोके जाने के लिए पर्याप्त लचीला है। कुछ कठोर टयूबिंग को हेमोस्टैट द्वारा पर्याप्त रूप से रोका नहीं जा सकता है और अभी भी प्रारंभिक पीबीएस छिड़काव के दौरान पीएफए को मुख्य लाइन में रिसाव करने की अनुमति दे सकता है। 4% पीएफए समाधान तैयार करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि पीएच शारीरिक है (7.4)। चूंकि पीएफए समाधान की तैयारी में इसे 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना शामिल है, इसलिए समाधान को पीएच को मापने से पहले 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाना चाहिए क्योंकि यह वह तापमान है जिस पर पीएच मीटर पर कैलिब्रेट किया जाता है।

पेट में प्रारंभिक चीरा बनाते समय, पेट के अंगों (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) के घाव से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। डायाफ्राम की ओर बेहतर विच्छेदन करते समय, यकृत के घाव से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यकृत के लिए पूर्वकाल पेट की दीवार के साथ अनुयायी होना आम है। इस पर काबू पाने के लिए, डायाफ्राम की ओर चीरा जारी रखने से पहले यकृत को सावधानीपूर्वक और स्पष्ट रूप से पूर्वकाल की दीवार से विच्छेदित किया जाता है। डायाफ्राम के माध्यम से वक्ष गुहा में प्रवेश करते समय, हृदय, महान वाहिकाओं और फेफड़ों के घाव से बचना महत्वपूर्ण है। इससे बचने के लिए, कैंची टिप को सतही रूप से और रिबकेज के साथ एक तीव्र कोण पर रखा जाता है।

दिल को बेनकाब करने के लिए प्रारंभिक विच्छेदन प्रारंभिक चीरा से लगभग 2 मिनट लेता है। उम्मीद की जा रही है कि इस दौरान तितली सुई की नोक में कुछ हवा घुस गई है। माउस के परिसंचरण में इस हवा की शुरूआत खराब गुणवत्ता वाले छिड़काव का उत्पादन करेगी। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि मुख्य रेखा खोली जाए और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए दिल के कैनुलेशन से तुरंत पहले पीबीएस को सुई के माध्यम से फ्लश किया जाए। आदर्श रूप से, एलवी पंचर करते समय हवा की पूर्ण अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए एक छोटा पीबीएस ट्रिकल सुई टिप के माध्यम से बहता है, जबकि दिल को कैनुलेट किया जाता है।

जब सुई एलवी में प्रवेश करती है, तो इसे इतनी गहरी नहीं जाना चाहिए कि सुई टिप को दाहिने वेंट्रिकल (आरवी) में पेश किया जा सके। आरवी में या माइट्रल वाल्व से परे सुई की नियुक्ति के परिणामस्वरूप छिड़काव शुरू होने पर फेफड़ों की तत्काल "मुद्रास्फीति" होगी। यह अवांछनीय है, और एलवी प्लेसमेंट सुनिश्चित करने के लिए सुई को थोड़ा वापस लिया जाना चाहिए। यदि सुई को ठीक से रखा जाता है, तो फेफड़े छिड़काव के दौरान सपाट रहेंगे। जब छिड़काव शुरू किया जाता है, तो कभी-कभी यह देखा जाता है कि जानवर के खुले मुंह से एक स्पष्ट तरल उभर रहा है। यह आमतौर पर छिड़काव दबाव के कारण होता है जो बहुत अधिक होता है या हृदय के भीतर सुई के गलत स्थान के कारण होता है। लेखकों का अनुमान है कि ऊंचे छिड़काव दबाव के परिणामस्वरूप धमनी केशिका बिस्तर से इत्र का बहिर्वाह होता है और अन्नप्रणाली और मौखिक गुहा में ब्रोन्कियल पेड़ के माध्यम से पीबीएस का प्रतिगामी प्रवाह होता है।

छिड़काव दबाव को या तो पीबीएस बोतल में पीबीएस के स्तर को कम करके या पीबीएस बोतल की ऊंचाई को कम करके कम किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, यदि सुई को बाएं वेंट्रिकल में बहुत गहराई से रखा जाता है, तो यह माइट्रल वाल्व के माध्यम से यात्रा कर सकता है और बाएं आलिंद में इत्र वितरित कर सकता है। इसके परिणामस्वरूप फुफ्फुसीय नसों के माध्यम से प्रतिगामी प्रवाह हो सकता है और धमनियों में इत्र का बहिर्वाह हो सकता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है। पीबीएस के साथ संचार प्रणाली से रक्त की पूरी तरह से निकासी विशेष रूप से रक्त घटकों के फिक्सेटिव-प्रेरित क्रॉस-लिंकिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जिसके परिणामस्वरूप बाद में फिक्सेटिव छिड़काव पर पोत रोड़ा होता है। उदर पूंछ आधार में चीरा से यकृत और पीबीएस प्रवाह के रंग परिवर्तन द्वारा निकासी का प्रभावी ढंग से मूल्यांकन किया जाता है। रक्त निकासी आम तौर पर पीबीएस के साथ छिड़काव के 3 मिनट से पूरा हो जाता है; हालाँकि, यदि निकासी के दृश्य संकेत कम समय पर होते हैं, तो फिक्सेटिव को 3 मिनट से पहले पेश किया जाता है। लंबे समय तक निकासी समय की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि विलंबित फिक्सेटिव छिड़काव सीएनएस ठीक संरचना में कलाकृतियों की ओर जाताहै 1.

जब पीएफए प्रशासित किया जा रहा है, तो पीएफए बोतल में पीएफए समाधान के स्तर की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। यदि पीएफए का स्तर पीएफए बोतल के मुंह से 4 सेमी से कम हो जाता है तो पीएफए बोतल भरें। छिड़काव पूरा होने के बाद, छिड़काव तंत्र को आसुत जल से अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि मुख्य लाइन में अवशिष्ट पीएफए पीएफए के साथ प्रारंभिक पीबीएस छिड़काव को दूषित कर देगा और इसके परिणामस्वरूप खराब गुणवत्ता वाला छिड़काव होगा। अंत में, 25 जी तितली सुइयों को आम तौर पर 20-30 ग्राम रेंज में औसत आकार के वयस्क चूहों के लिए अनुशंसित किया जाता है। हालांकि, बड़े या छोटे चूहों को इष्टतम प्रवाह दर प्रदान करने के लिए फिक्सेटिव बोतलों के समायोजन के अलावा थोड़ा बड़ा या छोटा गेज सुइयों की आवश्यकता हो सकती है।

सीएनएस विच्छेदन और ओसीटी एम्बेडिंग (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) के लिए, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए 30% सुक्रोज में पूरी तरह से डूबना आम बात है। इसलिए इन ऊतकों को 2 दिनों के लिए सुक्रोज में छोड़ दिया जाता है और फिर ओसीटी में एम्बेडेड किया जाता है, भले ही वे डूब जाएं या नहीं। ओसीटी में ऊतकों को ठंडा करते समय, यह संभव है कि ठंडा 2-मिथाइलब्यूटेन में रखे जाने पर कुछ ऊतक दरार कर सकते हैं। यह मस्तिष्क के साथ अधिक आम है और आमतौर पर तब होता है जब ऊतक पर बहुत अधिक ओसीटी रखा जाता है। इससे बचने के लिए, तत्काल ठंड से पहले ऊतक सतहों को कवर करने के लिए केवल पर्याप्त ओसीटी रखें। कुछ प्रोटोकॉल में, ओसीटी में पूर्ण विसर्जन के बावजूद क्रैकिंग कम आम है। यह आमतौर पर धीमी ठंड विधि के कारण होता है जैसे कि सूखी बर्फ-ठंडा 2-मिथाइलब्यूटेन का उपयोग करते समय या क्रायोमोल्ड को सीधे सूखी बर्फ के ब्लॉक पर रखना। तरल-नाइट्रोजन-ठंडा 2-मिथाइलब्यूटेन इस काम में पसंद किया जाता है क्योंकि ठंड की दर काफी अधिक तेज है और धीमी ठंड विधियों की तुलना में ऊतक आकृति विज्ञान को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकती है।

ऊतक (प्रोटोकॉल अनुभाग 4) क्रायोसेक्शन करते समय, कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचना महत्वपूर्ण है। इसलिए, चयनित क्षेत्रों को विगलन और पुन: फ्रीज करने के बजाय विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र प्राप्त करने के लिए एक एकल ओसीटी ब्लॉक से सभी वर्गों को काटना इष्टतम है। यदि यह व्यवहार्य नहीं है, तो कुछ अनुभागों को प्राप्त करने के बाद, उपयोगकर्ता भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर में ओसीटी ब्लॉक को 1-2 बार फिर से फ्रीज और स्टोर कर सकते हैं।

इत्र के अधिक पारंपरिक पंप या वायु दाब वितरण पर इस पद्धति के प्रमुख लाभ निम्नानुसार हैं: (1) छिड़काव तंत्र की कम लागत और पहुंच। (2) उपयोगकर्ताओं को छिड़काव के दौरान छिड़काव तंत्र में मैन्युअल रूप से दबाव बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है। (3) छिड़काव के लिए अन्य कम लागत वाले विकल्पों की तुलना में कम और अधिक सुसंगत छिड़काव दबाव जैसे सिरिंज वितरण के माध्यम से। बर्नौली के समीकरण का उपयोग करके, यह गणना की जाती है कि यहां निर्मित गुरुत्वाकर्षण-खिलाया छिड़काव उपकरण लगभग 73 मिमी एचजी के छिड़काव दबाव को बनाए रखेगा जब इत्र की बोतलों को सुई के सापेक्ष 1 मीटर ऊंचाई पर रखा जाता है। यह देखते हुए कि यह इन जानवरों के सिस्टोलिक रक्तचाप से काफी नीचे है, संवहनी टूटना12 से बचने के लिए यह छिड़काव दबाव पर्याप्त रूप से कम होने की संभावना है।

लेखकों ने पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए अब तक इस छिड़काव प्रणाली का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। इस समय के दौरान, इस छिड़काव विधि के साथ महत्वपूर्ण सीमाओं का सामना नहीं किया गया है जो पंप छिड़काव वितरण विधि के साथ मौजूद नहीं हैं। इस तकनीक की प्रमुख सीमा छिड़काव बनाम ड्रॉप निर्धारण की समय लेने वाली प्रकृति है। सीएनएस संरचनाओं के लिए फिक्सेटिव के गहरे प्रवेश में छिड़काव परिणामों के रूप में निर्धारण को छोड़ने के लिए यह तकनीक बेहतर है। इस तकनीक की दूसरी सीमा यह है कि इसे प्रदर्शन करने के लिए कुछ सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है, क्योंकि वक्ष गुहा में प्रवेश के बाद हृदय को जल्दी से कैनुलेट किया जाना चाहिए। हालांकि, अनुभव के साथ, प्रशिक्षित उपयोगकर्ता नियमित रूप से पेट में प्रारंभिक चीरा के 1 मिनट के भीतर दिल को कैनुलेट कर सकते हैं।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

लेखक इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में उनकी सहायता के लिए ज़ियाओवेन वांग, लियाम कोयने और जेसन ग्रुलन को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान एजी 061204 और एजी 063499 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific 03551-4
Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound Fisher Scientific NC1029572
Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors Amazon B0752XHK2X "fine scissors"
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G Fisher Scientific 14-826-5D
BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G Fisher Scientific 14-826B
Corning PES Syringe Filters Fisher Scientific 09-754-29
Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Fisher Scientific SH30258
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder Fisher Scientific BP9703100
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps Fisher Scientific 16-100-110 "curved fenestrated forceps"
Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps Fisher Scientific 16-100-123 "curved fine forceps"
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM
Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps Fisher Scientific 12-000-122 "straight fine forceps"
Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends Fisher Scientific 21-401-5
Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates Fisher Scientific FB966J
Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50 Fisher Scientific 12-548-5M
Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel Fisher Scientific 13-820-074 "skin forceps"
Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks Fisher Scientific FB3002000
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-20 "dissecting scissors"
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use Fisher Scientific 14-955-464
Fisherbrand Straight Locking Hemostats Fisher Scientific 16-100-115
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in. Fisher Scientific 14-174-1C
Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles Fisher Scientific 09-790-12F
Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC Fisher Scientific 01-000-686
Garvey Economy Single Edge Cutter Blade Amazon B001GXFAEQ
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 ThermoFisher Scientific 35552
Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps Fisher Scientific 14-198-5A "hose clamps"
IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable Fisher Scientific NC9822467
Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set Fisher Scientific 22-010-137 "butterfly needle"
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply Fisher Scientific 06-666
Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI Fisher Scientific P36962
Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles ThermoFisher Scientific 2425-0506 "buffer bottles"
PAP pen abcam ab2601
Paraformaldehyde Granular Electron Microscopy Systems 19210
Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm Fisher Scientific 15-242D
Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] abcam ab51253
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 221465-2.5kg
Stainless Steel Drinking Cup 18-oz amazon B0039PPO9U
Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1 Us Biological S8010
Triton X-100 Us Biological T8655
Vetone Fluriso Isoflurane USP MWI Animal Health 502017

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 179
माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक गुरुत्वाकर्षण खिलाया ट्रांसकार्डियल छिड़काव विधि
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Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J.… More

Rana, A., Massa, P. T., Chen, X. J. A Gravity-Fed Transcardial Perfusion Method for Histologic Analysis of the Mouse Central Nervous System. J. Vis. Exp. (179), e63386, doi:10.3791/63386 (2022).

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