Summary
Een handige zwaartekracht-gevoede perfusiemethode voor histologische analyse van het centrale zenuwstelsel van de muis wordt gepresenteerd. Immunofluorescentie detectie van gefosforyleerd α-synucleïne wordt aangetoond in een muismodel van de ziekte van Parkinson. Dit werk beschrijft ook uitgebreid de transcardiale perfusie, dissectie, weefselbevriezing / inbedding en bevroren sectiestappen.
Abstract
De histologische analyse van hersen- en ruggenmergmonsters geïsoleerd uit muizen is gebruikelijk voor de beoordeling van pathologie in dit modelsysteem. Om de morfologie van deze delicate weefsels te behouden, is het routine om een chemisch fixatief zoals paraformaldehyde toe te dienen via cannulatie van het hart bij verdoofde dieren (transcardiële perfusie). Transcardiale perfusie van het muizenhart is van oudsher afhankelijk van het gebruik van peristaltische pompen of luchtdruk om zowel de zoutoplossing als fixatieve oplossingen te leveren die nodig zijn voor dit proces. Als een gemakkelijk toegankelijk alternatief voor deze methoden, demonstreert dit werk het gebruik van een zwaartekracht-gevoede methode van perfusaatlevering die materialen gebruikt die beschikbaar zijn in de meeste bouwmarkten.
Om deze nieuwe perfusiemethode te valideren, toont dit werk alle volgende stappen die nodig zijn voor de gevoelige detectie van gefosforyleerd α-synucleïne in zowel de hersenen als het ruggenmerg. Inbegrepen in deze stappen zijn de dissectie van de vaste hersen- en ruggenmergweefsels, snelle bevriezing / inbedding en cryosectie van de weefsels en immunofluorescente kleuring. Aangezien deze methode resulteert in de levering van het fixatief door het hele lichaam, kan het ook worden gebruikt om andere niet-neuronale weefsels voor te bereiden op histologische analyse.
Introduction
Histologische karakterisering van pathologie in het centrale zenuwstelsel van de muis (CZS) is een routinetechniek die wordt gebruikt in studies van neurodegeneratie. Omdat neuronale weefsels na de dood snel afbreken, is het gebruikelijk om een chemisch fixatief zoals paraformaldehyde aan de CZS-weefsels af te leveren om hun morfologie te behouden 1,2. Chemische fixatie kan worden uitgevoerd door perfusie van het hele lichaam met een fixatieve oplossing of door de isolatie van weefsels en hun onderdompeling in een fixatieve oplossing (genaamd "druppelfixatie"). Perfusie is de voorkeursmethode voor fixatieve toediening, omdat druppelfixatie mogelijk geen snelle penetratie van de fixatieve oplossing in diepe CZS-structurenmogelijk maakt 3,4,5. Bovendien, omdat het moeilijk is om het niet-gefixeerde ruggenmerg uit de wervelkolom te verwijderen, zorgt de toediening van de fixatieve oplossing via perfusie voor het in situ behoud van het microscopische en grove anatomie van het ruggenmerg en verstijft het weefsel om schade tijdens verwijdering te minimaliseren.
Levering van de buffer- en fixatieve oplossingen die nodig zijn voor fixatie wordt gewoonlijk uitgevoerd met behulp van in de handel verkrijgbare pompen of luchtdruk. Zwaartekrachtafgifte van perfusaat kan om de volgende redenen dienen als alternatief voor pompafgifte: (1) Pomp- of luchtdrukafgifte kan in sommige gevallen vereisen dat een gebruiker handmatig de druk in het systeem handhaaft gedurende de perfusie. De zwaartekrachtafgifte van perfusaat kan worden gehandhaafd zonder tussenkomst van de gebruiker. (2) Een door de zwaartekracht geleverd perfusaatapparaat kan tegen lage kosten voor de gebruiker worden gebouwd door materialen te verkrijgen die beschikbaar zijn bij standaard wetenschappelijke verkopers. Dit werk beschrijft hoe u een eenvoudig zwaartekrachtperfusieapparaat kunt bouwen met behulp van wasflessen en vinylbuizen. Met behulp van een muismodel van de ziekte van Parkinson toont dit werk de werkzaamheid van dit systeem aan bij het doordrenken van de hersenen en het ruggenmergweefsel voorafgaand aan hun isolatie voor bevroren secties. Dit werk beschrijft uitgebreid alle stappen, technieken en materialen die nodig zijn om het vaste weefsel uit het dier te ontleden, het weefsel snel te bevriezen / in te bedden en te cryosectie en de aanwezigheid van gefosforyleerd α-synucleïne in zowel de hersenen als het ruggenmerg te detecteren via indirecte immunofluorescentiemicroscopie.
Protocol
De gegevens en experimentele stappen in dit protocol zijn gegenereerd met behulp van C57BL/6J-muizen. Alle methoden met dieren zijn goedgekeurd door de State University of New York Upstate Medical University Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Bouw van perfusieapparatuur en dissectieplatform
- Zoals te zien is in figuur 1, snijdt u de binnenste rietjes uit twee wasflessen van 500 ml door deze met een scherp scheermesje gelijk aan de binnenkant van de schroefdop te snijden. Snijd een vierkant gat van 4 cm x 4 cm in de bodem van elke bufferfles. Snijd een klein gaatje in de bodem van elke fles om de doorgang van een gebogen, roestvrijstalen microspatula mogelijk te maken.
- Maak een "S" vormige bocht in de microspatula's, zodat ze kunnen worden gebruikt als haken voor het ophangen van de bufferflessen. Steek de gebogen microspatula's in de juiste openingen in de bufferflessen.
- Snijd twee buizen van 25 cm en verbind deze goed met de buitenste flessenstrouitlaten. Verbind de uiteinden van deze buizen met de Y-connector. Knip 2 m buizen en voeg deze samen met het vrije uiteinde van de Y-connector.
- Verwijder de zuiger uit de spuit van 1 ml en snijd de spuit op ongeveer 6 cm afstand van de punt van de spuit. Snijd de spuit door het plastic eerst te scoren met een scheermesje en vervolgens het spuitplastic scherp te breken.
- Steek het gesneden vlak van de spuit in het vrije uiteinde van de plastic slang. Plaats op voldoende diepte om een strakke afdichting te garanderen.
OPMERKING: Het is belangrijk dat alle aansluitingen in het perfusieapparaat voldoende strak zijn om lekkage te voorkomen. In het geval van losse verbindingen kunnen kleine roestvrijstalen slangklemmen worden geplaatst en naar wens op kruispunten worden vastgedraaid om indien nodig een strakke afdichting te garanderen. - Label één bufferfles als PFA en één fles als PBS (buffer). Meet ongeveer 1/3rd van de lengte weg van de flesopening en teken op dit punt een lijn rond de flesomtrek om het juiste vulniveau van de perfusaatoplossingen aan te geven.
- Maak recht en maak vervolgens een lus in een grote paperclip die rond de omtrek van de buis past. Plaats deze lus rond de slang net proximaal aan de spuit.
- Plaats een piepschuimblok van de juiste grootte in de glazen bak. Plaats de uiteinden van de paperclip in het piepschuimblok om de slang aan te brengen.
- Gebruik papieren handdoeken en verhoog de voorkant van de glazen lade met ongeveer 2 cm.
OPMERKING: Dit plaatst de muis in ongeveer 20° van de Trendelenburg-positie (achterwaartse kanteling) om het diafragma tijdens de dissectie gemakkelijker te kunnen visualiseren en de afvoer van vloeistoffen tijdens perfusie aan te moedigen.
Figuur 1: Diagram met de geassembleerde perfusieapparatuur. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PFA = paraformaldehyde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bereiding van paraformaldehyde (PFA) oplossing
OPMERKING: PFA-oplossing moet vers worden bereid op de dag van de perfusie en aan het einde van de perfusie worden weggegooid in een aangewezen afvalcontainer voordat deze door opgeleid personeel wordt verwijderd. Dit protocol maakt 1 L van 4% PFA-oplossing, wat voldoende is om ongeveer 4 muizen te perfuseren. PFA is zeer giftig en er moet voor worden gezorgd dat inademing of direct huidcontact in poedervorm of vloeibare vorm wordt vermeden. De meeste voorbereidingsstappen worden daarom uitgevoerd met handschoenen, een beschermbril en een laboratoriumjas onder een zuurkast.
- Spoel een bekerglas van 1 L met gedestilleerd water en vul met ongeveer 800 ml van 18 mΩ moleculair-biologisch-kwaliteit H2O.
- Verwarm het bekerglas van H2O in een magnetron gedurende 3 minuten of totdat de watertemperatuur 65 °C bereikt. Plaats op een verwarmings-/roerplaat in een zuurkast.
- Spoel een roerstaaf af met gedestilleerd water en leg deze in het hete water. Start de roerder en zet de hete plaat op middelhoog vuur. Zorg ervoor dat de watertemperatuur niet boven de 70 °C komt.
- Draag een chirurgisch masker, handschoenen, beschermende bril en laboratoriumjas en meet 40 g PFA-poeder. Giet dit poeder in het verwarmde water.
- Voeg met een transferpipet een paar druppels van 5 M NaOH toe aan de oplossing. Laat het PFA poeder volledig oplossen. Als het poeder na een paar minuten nog niet volledig is opgelost, voeg dan indien nodig druppels van 5 M NaOH toe.
- Zodra bijna alle PFA is opgelost (zal enigszins troebel lijken), stop het roeren / verwarmen en voeg onmiddellijk 100 ml 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe. Vul ten slotte het water aan tot de 1 L-markering op het bekerglas met behulp van 18 mΩ moleculair-biologische kwaliteit H2O. Bedek het bekerglas met plasticfolie en plaats het in een vriezer van -20 °C totdat de oplossing kamertemperatuur bereikt (ongeveer 45 min).
- Kalibreer een pH-meter volgens de juiste normen. Terwijl het bekerglas op een roerplaat ligt, meet u de pH van de oplossing en voegt u HCl toe totdat de pH 7,4 bereikt. Voeg indien nodig 5 M NaOH toe om de pH te verhogen als deze te laag is.
- Sluit een vacuümfles aan op stofzuigen en plaats een schone keramische Büchner-trechter met filterpapier in de kolf. Zet het vacuüm aan en maak het filterpapier nat met een transferpipet gevuld met de 4% PFA-oplossing.
- Giet langzaam de 4% PFA-oplossing op het filtreerpapier totdat alle oplossing is gefilterd.
- Breng de gefilterde oplossing over in een schone, lichtbeschermde container en bewaar deze bij 4 °C tot gebruik (niet langer dan 24 uur bewaren).
3. Transcardiale "pompvrije" perfusie
- Plaats in de zuurkast een piepschuimontleffingsblok in een glazen bakje. Zorg ervoor dat het ontleedblok 5-6 korte naalden heeft voor het in bedwang houden van de muis tijdens de operatie en 2 lange naalden voor het ondersteunen van de perfusieslang.
- Spoel het perfusieapparaat af met gedestilleerd water. Laat al het water weglopen voordat u het perfusieapparaat ophangt. Hang de perfusieflessen 1 m boven het doordrenkte dier (voor een muis van 20-30 g).
- Bereid een niet-steriele oplossing van 1x PBS met 10x PBS verdund met 18 mΩ moleculair-biologische kwaliteit H2O.
- Zoals te zien is in figuur 2, klemt u de hoofdlijn van het perfusieapparaat vast met behulp van een hemostat. Klem de PFA-lijn vast met een andere hemostat.
OPMERKING: Occlusie met meerdere hemostaten kan per lijn nodig zijn om stroming volledig te voorkomen. - Vul de buffercontainer met 1x PBS bij kamertemperatuur.
- Plaats het uiteinde van de spuit van het perfusieapparaat in een bekerglas om afvalbuffer te verzamelen en verwijder de hemostaat die de hoofdlijn afsluit (figuur 2, links).
- Laat PBS door de lijn stromen terwijl u opgesloten lucht verwijdert door krachtig op de wanden van de buis te tikken.
- Zodra alle lucht uit de buffer- en hoofdleidingen is verwijderd, sluit u de stroom af door een hemostat op de hoofdlijn te plaatsen.
- Verwijder de hemostaat uit de PFA-lijn en laat de PBS retrograde naar de PFA-fles stromen terwijl u eventuele bubbels in de PFA-lijn uittikt (figuur 2, midden). Blijf de PBS in de PFA-lijn toelaten totdat PBS net boven de opening van de fles te zien is. Sluit de PFA-lijn af met een hemostaat om de stroom in de PFA-fles te stoppen.
- Sluit de vlinderinfuusnaald aan op de perfusiespuit en spoel PBS door de lijn (door de hoofdlijnzoomostat te openen) om belletjes uit de perfusiespuit te verwijderen. Sluit de hoofdlijn hemostaat.
- Zorg ervoor dat de PBS-fles nu ongeveer 1/3rd vol is met PBS. Spoel PBS indien nodig door de hoofdlijn of vul meer PBS in de bufferfles tot 1/3rd van de volledige capaciteit.
- Zodra alle bubbels uit de PBS, PFA en hoofdlijnen zijn verwijderd, vult u de PFA-fles met 4% PFA-oplossing bij kamertemperatuur tot de zwarte markering op de fles (ongeveer 1/3rd vol) (figuur 2, rechts).
Figuur 2: Voorbereiding van het perfusieapparaat voor perfusiechirurgie. Sluit eerst de PFA-lijnhemostaat en open de hemostaat op de PBS-lijn en de hoofdlijn. Vul PBS en verwijder bubbels van de PBS-lijn en hoofdlijn. Vul vervolgens de PFA-lijn met PBS door de hemostat op de PFA-lijn te openen en de hemostaat op de hoofdlijn te sluiten. Verwijder bubbels in de PFA-lijn. Sluit ten slotte de hemostat op de PFA-lijn wanneer de PBS de opening van de PFA-fles bereikt. Vul de PFA fles 1/3rd vol met PFA. Zorg ervoor dat het niveau van PBS in de PBS-fles 1/3rd vol is en vul met PBS of laat PBS leeglopen door indien nodig de hoofdlijnzoom te openen. Afkortingen: PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PFA = paraformaldehyde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Bereid je voor op een niet-overlevingsoperatie door de volgende instrumenten met water te reinigen, gevolgd door 70% ethanol: grote schaar, fijne ontleedschaar, huidtang, fijne fenestrated gebogen tang.
- Bereid de anesthesie voor door stofvrije doekjes in een conische buis van 50 ml te plaatsen. Week in een zuurkast de stofvrije doekjes grondig met isofluraan en plaats de geopende buis ondersteboven in een bekerglas van 500 ml. Zorg ervoor dat er geen vloeibaar isofluraan aanwezig is aan de onderkant van het bekerglas en gooi alle vloeibare isofluraan weg voordat u een muis in het bekerglas plaatst.
- Plaats de muis in het bekerglas en plaats plasticfolie over de opening om de anesthesie te starten.
- Dien anesthesie toe totdat de muis stopt met ademen (ongeveer 1 min en 30 s).
- Wanneer de ademhaling is gestopt, verwijdert u de muis onmiddellijk uit het bekerglas en vervangt u de dop op de conische buis van 50 ml.
- Controleer of de muis voldoende verdoofd is met behulp van de teenknijflex. Als het dier niet voldoende verdoofd is, dien dan meer isofluraan toe zoals beschreven in stap 3.15.
- Werk snel, plaats de muis op het piepschuimblok en pin de poten naar buiten met vier korte naalden (bijv. Spuitnaalden van 22 G).
- Til de buikhuid op met een huidtang, gebruik de grote schaar om door de buikwand te snijden. Zorg ervoor dat er geen buikorganen worden doorgesneden!
- Zet de buiksnede superieur voort in de richting van de lever. Maak de lever los van de voorste buikwand en zet de initiële incisie superieur voort in de richting van het diafragma. Stop deze incisie ongeveer 1 cm inferieur aan het diafragma. Zorg ervoor dat de lever niet wordt gesneden!
- Vervolg de initiële incisie zijdelings naar de rechter- en linkerkant van het diafragma om een "Y" -vormige incisie te maken (figuur 3A).
- Wanneer de incisie het diafragma bereikt, maakt u een gat in het diafragma met behulp van de fijne ontleedschaar en snijdt u door de ribben aan de rechterkant van het dier. Snijd de ribben ongeveer halverwege de rechter oksel.
- Maak een vergelijkbare maar langere incisie door de linkerkant van het diafragma bijna helemaal tot aan de linker oksel.
- Reflecteer de borstwand en speld deze vast aan het piepschuimblok.
- Ontleed indien nodig het vet weg van rond het hart om de linker ventrikel bloot te leggen. Identificeer de linker ventrikel op basis van de relatief lichtere kleur in vergelijking met de rechter ventrikel.
- Nadat u de linker ventrikel hebt geïdentificeerd, houdt u het hart stabiel met behulp van lichte druk met de fijne gebogen tang. Open de hoofdlijnzoom om de PBS door de naald te laten stromen. Prik onmiddellijk de linker ventrikel door en zorg ervoor dat de naald niet meer dan 0,5 cm in de ventrikel wordt ingebracht. Trek de naald indien nodig iets terug.
OPMERKING: Nauwkeurige plaatsing van de naald in de linker ventrikel wordt aangegeven door een retrograde bloedstroom in de naaldslang. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de naald niet te diep in de ventrikel wordt ingebracht. Dit kan resulteren in retrograde stroom door de longaders of het doorboren van het interventriculaire septum. - Laat de vlinderbuis rusten op een X gemaakt in het piepschuim met behulp van twee grote naalden van 18 G.
OPMERKING: Dit is van cruciaal belang omdat het beweging van de vlindernaald in het hart tijdens perfusie zal voorkomen. - Identificeer de inferieure vena cava als deze de lever verlaat en transect het met behulp van de fijne ontleedschaar (figuur 3B). U kunt ook het rechter atrium openen met een schaar.
- Open onmiddellijk de hoofdlijn zodat de PBS-perfusie kan starten (figuur 3C).
- Zorg ervoor dat de PBS van het piepschuimblok afvloeit en in de glazen bak eronder terechtkomt. Als dit niet gebeurt, past u de hoek van de lade of het piepschuimblok aan zodat vloeistoffen in de glazen lade kunnen worden afgevoerd.
- Ga door met de PBS-perfusie totdat de vloeistof die uit de inferieure vena cava stroomt bloedvrij is (ongeveer 3 min).
OPMERKING: Een juiste plaatsing van de naald in het hart zal resulteren in de visuele zuivering van bloed uit de lever, die van rood naar strokleurig zal veranderen. Als dit niet gebeurt, kan dit worden verholpen door de infusienaald in de linker ventrikel te verplaatsen. Een kleine incisie kan worden gemaakt in de ventrale staartbasis om de kwaliteit van de perfusie te beoordelen. Een goede perfusie zal resulteren in duidelijke PBS die uit de incisie van de staartbasis stroomt. - Snel werkend, sluit de PBS-lijn af met een hemostat en open de PFA-lijn.
- Laat PFA een paar minuten doordringen totdat de staart begint te krullen. Zodra de staart begint te krullen, begint u met een timer van 50 minuten. Als de staart niet krult na 5 minuten PFA-perfusie, begin dan met een timer van 50 minuten voor de PFA-perfusie.
- Controleer het PFA-niveau in de fles continu gedurende de perfusie om ervoor te zorgen dat het niveau niet te laag wordt. Vul meer PFA in de fles als het niveau onder de 2 cm boven het deksel van de fles daalt.
Figuur 3: Diagram met transcardiale perfusie. (A) De buikwand wordt eerst doorgesneden, gevolgd door twee zijdelings wijzende incisies naar de oksel die een "Y" vormen. (B) Na het betreden van de thoracale holte en het blootstellen van het hart, wordt de naald in de linker ventrikel gebracht. Vervolgens wordt het IVC of rechteratrium getransecteerd om drainage van perfusaten mogelijk te maken nadat ze door het lichaam zijn gecirculeerd. De IVC is superieur gesneden aan het membraan. C) Procedure voor de toediening van perfusaten. Afkorting = IVC = inferior vena cava. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Sluit na 50 minuten de hoofdlijn af met een hemostat en trek de naald uit de linker ventrikel.
OPMERKING: De hele muis is op dit punt stijf en kan nu 's nachts bij 4 °C in een gelabelde container van 4% PFA worden geplaatst. In dit stadium is het mogelijk om de CZS-weefsels te ontleden en die individueel 's nachts in fixatief te plaatsen. In dit werk wordt de hele muis in fixatief geplaatst, omdat dit het interval tussen fixatie en plaatsing bij 4 °C verkort. Dit voorkomt ook mogelijke mechanische vervorming van zenuwweefsel die kan optreden als dieren worden voorgesneden voordat de nachtelijke fixatie is voltooid.
4. CNS-dissectie
- Bereid de volgende instrumenten voor op dissectie door te wassen met water gevolgd door 70% ethanol: schaar, huidtang, gebogen fenestrated tang, gebogen fijne tang, rechte fijne tang, fijne schaar.
- Label vier buisjes per muis als volgt en vul met steriele 20% sucrose: Muis ID, Brein 1, Muis ID, Hersenen 2, Muis ID, Lumbaal, Muis ID, Cervicaal.
- Verwijder de muis uit de PFA-oplossing en dep deze droog met een papieren handdoek om overtollige PFA te verwijderen.
- Verwijder met de grote schaar de kop van de muis door in de nek te knippen.
- Plaats het lichaam in de PFA-oplossing. Houd het hoofd vast om de hersenen van de schedel te ontleden.
- Om de hersenen te ontleden, begin je met het naar voren reflecteren van de schedelhuid om de hele schedel bloot te leggen (figuur 4A).
- Maak een ondiepe snede in de gehoorgang met behulp van de fijne ontleedschaar om toegang te krijgen tot de schedel
- Ga door met deze snede langs de dwarse sinus totdat de schedel helemaal tussen beide gehoorgangen is gesneden.
- Maak een snede loodrecht op de vorige snede langs de longitudinale spleet helemaal tot aan het meest rostrale deel van de schedel (ongeveer tussen de ogen).
- Gebruik de gebogen tang met behulp van de gebogen tang om de schedel zijdelings te reflecteren om de voorhersenen bloot te leggen. Ga door met het verwijderen van de schedel totdat de hele voorhersenen, inclusief de olfactorische bollen, zijn blootgesteld.
- Begin met het ontleden van het caudale gebied van de schedel door een snee te maken door het achterhoofdsbeen en deze snede langzaam voort te zetten naar het foramen magnum.
- Reflecteer de twee stukken schedel zijdelings om het cerebellum en de hersenstam caudally bloot te leggen (figuur 4B).
- Gebruik de ultrafijne gebogen tang om de olfactorische bollen van de voorste schedel te scheiden en begin met het afpellen van de hersenen van de schedelbasis, te beginnen bij de olfactorische bollen.
- Terwijl de hersenen worden afgepeld van de schedelbasis, gebruikt u een ultrafijne tang om de hersenzenuwen door te snijden en verwijdering van de hersenen mogelijk te maken.
- Blijf de hersenen van de schedelbasis afpellen totdat de volledige intacte hersenen zijn verwijderd (figuur 4C, D).
- Snijd de hersenen in tweeën langs de lengtespleet om de rechter- en linkerhersenhelft van elkaar te scheiden (figuur 4E, F).
- Plaats één hemisfeer in de hersenbuis 1 buis en de tweede hemisfeer in de hersenbuis 2 . Bewaar deze buisjes bij 4 °C totdat de hersenhelften zinken (ongeveer een nacht).
Figuur 4: Verwijdering van vaste hersenen. (A) Bovenkant van de schedel. (B) Blootgestelde hersenen in de schedel. (C) Geïsoleerde hersenen (dorsaal aspect). (D) Geïsoleerde hersenen (ventraal aspect). (E) Linkerhersenhelft (lateraal aspect). (F) Linkerhersenhelft (mediaal aspect). Schaalbalken = 1 cm (E en F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Om het ruggenmerg te ontleden, verwijdert u het muizenlichaam van de PFA en dept u het droog.
- Plaats de muis op een piepschuim ontledend blok in buikligging en pin de poten in het blok met behulp van vier naalden.
- Begin de dissectie door de huid langs de middellijn van de muis van nek tot staart te snijden om de hele achterkant bloot te leggen.
- Reflecteer de spier en fascia op de rug om het achterste deel van de wervelkolom bloot te leggen.
- Begin bij de meest schedelwervels en gebruik de fijne ontleedschaar om door de lamina te snijden terwijl u het ruggenmerg vermijdt (figuur 5A).
- Plaats de ultrafijne gebogen tang onder de lamina en trek omhoog om de wervels te breken om het ruggenmerg bloot te leggen (figuur 5B).
- Gebruik de gebogen tang om de gebroken wervels te reflecteren en de meest laterale gebieden van het ruggenmerg bloot te leggen.
- Ga door met dit proces voor de volgende wervels door de ultrafijne gebogen tang onder de lamina te plaatsen en de wervels te breken. Blijf wervels breken totdat de gehele cervicale wervelkolom en thoracale wervelkolom zijn blootgesteld (figuur 5C).
- Blijf het ruggenmerg blootleggen tot het einde van het lumbale ruggenmerg (figuur 5D).
- Snijd met een scherp scheermesje helemaal door het midthoracale ruggenmerg.
- Met behulp van de ultrafijne gebogen tang transeccteert u de spinale zenuwen lateraal van de wervelkolom en de fascia anterior naar het ruggenmerg om het cervicale ruggenmerg langzaam van de wervelkolom te scheiden.
- Blijf het cervicale ruggenmerg ontleden totdat het vrij is van de wervels (figuur 5E). Plaats het cervicale-midthoracale ruggenmerg in de buis met het label cervical. Bewaar deze buis bij 4 °C totdat het cervicale ruggenmerg zinkt (ongeveer een nacht).
- Blijf de borstwervels breken tot aan de cauda equina zoals beschreven in stap 4.22 tot en met 4.25. Wanneer de cauda equina wordt blootgesteld, gebruikt u een scherp scheermesje om het ruggenmerg 1 cm onder het lumbale ruggenmerg af te snijden (figuur 5F).
- Ontleed het lumbale ruggenmerg weg van de wervels zoals beschreven in stap 4.26-4.27. Plaats het lumbale-midden cauda equina ruggenmerg in de buis met het label lumbaal. Bewaar deze buis bij 4 °C totdat het lumbale ruggenmerg zinkt (ongeveer een nacht).
- Wanneer alle weefsels zijn gezonken in 20% sucrose, breng ze dan over in gelabelde buizen van 30% sucrose totdat ze zijn gezonken of gedurende 3 dagen.
OPMERKING: Spinale weefsels zinken vaak niet bij 30% sucrose.
Figuur 5: Verwijdering van vaste ruggenmergsegmenten. (A) Initiële snede in de lamina van de halswervels. (B) Plaatsing van gebogen tangen om individuele wervels te breken. (C) De blootgestelde cervicale wervelkolom. (D) Blootgestelde cervicale, thoracale en lumbale wervelkolom. (E) Verwijdering van de cervicale wervelkolom na het snijden van spinale zenuwen. (F) Het snijden van de sacrale wervelkolom. (G) Geïsoleerde cervicale wervelkolom. (H) Geïsoleerde lumbale wervelkolom. Schaalbalken = 1 cm (G en H). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Inbedding van de LGO en weefselopslag
- Label voor elke muis vier rechthoekige cryomolds: muis-ID, rechterhersenhelft, datum van inbedding; Muis-ID, linkerhersenhelft, datum van inbedding; Muis-ID, Cervicaal, Datum van inbedding; Muis-ID, lumbaal, datum van insluiting.
- Zet een piepschuimen container op en hang een metalen beker boven de container.
- Vul de piepschuimcontainer ongeveer halverwege met vloeibare stikstof. Vul de metalen beker ongeveer halverwege met vers 2-methylbutaan.
OPMERKING: 2-methylbutaan is giftig, zeer vluchtig en ontvlambaar. Er moet voor worden gezorgd dat inademing wordt voorkomen door volgende stappen uit te voeren in een zuurkast en uit de buurt van verbrandingsbronnen. - Laat de metalen beker langzaam in de vloeibare stikstof zakken en voorkom spatten van de vloeibare stikstof in de metalen beker.
- Laat het 2-methylbutaan beginnen met invriezen. Terwijl de 2-methylbutaan bevriest, haalt u het gewenste weefsel uit de 30% sucrose-oplossing en dep u het droog op een stofvrij doekje.
- Plaats het weefsel in een cryomold met het rostrale gebied naar het bovenste (ongelabelde) deel van de mal gericht.
- Giet spaarzaam een optimale snijtemperatuur insluitmedium (OCT) over het weefsel in de cryomold en gebruik slechts genoeg om het weefsel volledig te bedekken. Vermijd het gebruik van overmatige OCT, omdat dit scheuren kan veroorzaken. Verwijder eventuele bubbels uit de LGO.
- Wanneer bevroren 2-methylbutaan het binnenoppervlak van de metalen beker volledig heeft bedekt, dompelt u de cryomold gedurende 12 s volledig onder in de bovenliggende vloeistof fase 2-methylbutaan. Plaats na 12 s de cryomold om af te tappen in een gelabeld aluminiumfolie vierkant en wikkel de hele cryomold. Plaats de ingepakte cryomold onmiddellijk op droogijs en vermijd ontdooien. Zorg ervoor dat de bevroren OCT/cryomold altijd bedekt zijn met droogijs.
- Herhaal stap 5.6 tot en met 5.8 voor alle weefsels. Plaats het weefsel voor één muis in een verzegeld klein plastic zakje en vervolgens in een cryoveilige, verzegelde container. Bewaar deze container in de -80 °C diepvriezer totdat de secties zijn gesneden.
6. Cryosectie
- Zorg er voorafgaand aan cryosectie voor dat de temperatuur van de cryostaatkamer en de monsterkop op de juiste instellingen zijn ingesteld.
OPMERKING: Een kamertemperatuur van -20 °C, een monsterkoptemperatuur van -20 °C en een sectiedikte van 30 μm worden gebruikt voor het snijden van hersensecties. Voor het snijden van ruggenmergsecties wordt een kamertemperatuur van -23 °C, een monsterkoptemperatuur van -30 °C en een sectiedikte van 30 μm gebruikt. Het is belangrijk op te merken dat de cryostaatinstellingen (met name de temperatuur van het monsterhoofd) tijdens de sectie moeten worden aangepast om problemen met de weefselkwaliteit aan te pakken. Over het algemeen wordt de temperatuur van het monsterhoofd verlaagd om te corrigeren voor weefseluitstrijkjes. Omgekeerd wordt de hoofdtemperatuur van het monster verhoogd om te corrigeren voor overmatige weefselkrulling. - Haal het gewenste OCT-blok uit de -80 °C vriezer en plaats het onverpakte cryomold/OCT-blok in de cryostaatkamer.
- Laat het OCT-blok gedurende 30 minuten wennen aan de kamertemperatuur.
- Reinig een klauwplaat met 70% ethanol en veeg deze droog met een stofvrij doekje. Plaats de gereinigde klauwplaat in de cryostaatkamer en maak een cirkel ter grootte van een muntstuk van OCT op de klauwplaat. Laat de OCT bevriezen (ongeveer 1-2 min).
- Wanneer de OCT is ingevroren, plaats je een puntje verse OCT ter grootte van een erwt op de klauwplaat en plaats je onmiddellijk het tissue OCT-blok op de klauwplaat. Zorg ervoor dat het weefsel perfect loodrecht op de klauwplaat staat voordat de OCT volledig bevriest.
OPMERKING: Over het algemeen wordt het meest rostrale gebied van de hersenen in de richting van de klauwplaat geplaatst, zodat de sectie begint vanaf het caudale einde. Voor het ruggenmerg wordt over het algemeen het meest caudale gebied op de klauwplaat geplaatst, zodat de sectie begint vanaf het rostrale uiteinde. - Wanneer de LGO is verhard, plaatst u meer LGO rond de basis van het OCT-blok om als structurele ondersteuning te fungeren tijdens de splitsing. Wanneer deze steun enigszins is uitgehard, plaatst u de klauwplaat op de kop van het monster en laat u het OCT-blok gedurende 30 minuten de temperatuur van de monsterkop bereiken.
- Plaats een microtoommes in de meshouder en reinig de antirollplaat. Pas de afstand van de antirollplaat aan om ervoor te zorgen dat het weefsel tijdens het snijden net onder de plaat passeert. Voor meer informatie over de juiste positionering van de antirollplaat raadpleegt u de cryostaathandleiding.
- Nadat het OCT-blok is gewend aan de hoofdtemperatuur van het monster, begint u met het trimmen van het OCT-blok totdat het weefsel is bereikt. Wanneer weefsel zichtbaar is, schakel dan over van trimmen naar secties en begin met het snijden van secties van 30 μm. Schuif de antirollplaat opzij en pak met behulp van een microscoopglaasje het gedeelte op.
- Blijf secties knippen en verzamelen totdat u tevreden bent met de anatomische locatie van de secties of al het weefsel is gesneden. Plaats de dia's te drogen bij kamertemperatuur gedurende 1-3 dagen. Plaats na het drogen de dia's in een schuifdoos en plaats deze doos in een afgesloten plastic zak. Label de zak met de muis-ID en weefselinformatie voordat u de dia's in de -80 °C diepvriezer plaatst.
7. Immunofluorescente kleuring
- Ontdooi de dia's gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Plaats de dia's in een horizontale schuifpot en was de secties 3 keer in PBS gedurende 10 minuten elke wasbeurt op kamertemperatuur op een shaker.
- Bereid de blokkeringsbuffer voor (2% BSA + 0,3% Triton-X-100 in 1x PBS). Gebruik ongeveer 1 ml per dia.
- Creëer een bevochtigde kamer door water aan de bodem toe te voegen. Leg de dia's horizontaal naar boven en laat ze niet uitdrogen. Voeg 1 ml blokkeerbuffer toe aan elke dia en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur.
- Bereid primaire antilichaamoplossing door het primaire antilichaam in antilichaambuffer te verdunnen (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 in 1x PBS).
OPMERKING: Voor het gefosforyleerde α-synucleïne-antilichaam werd een verdunningsfactor van 1:500 gebruikt. - Voeg 200-300 μL primaire antilichaamoplossing per dia toe. Dek af met een deklip om het antilichaam te verspreiden en 's nachts bij 4 °C te incuberen.
- Verwijder de volgende dag de dia's uit de bevochtigde kamer en plaats ze in een verticale Coplin-pot gevuld met 1x PBS om de coverslip eraf te laten vallen. Doe dit voor elke dia afzonderlijk en zorg ervoor dat u het weefselgedeelte niet verstoort bij het verwijderen van de coverslip.
- Plaats de dia's in een horizontale schuifpot en was de secties 3 keer in PBS gedurende 10 minuten elke wasbeurt op kamertemperatuur op een shaker.
OPMERKING: Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd met de lichten uit om te voorkomen dat de fluorofoor fotobleacheert! - Bereid de secundaire antilichaamoplossing door het secundaire antilichaam in antilichaambuffer te verdunnen.
OPMERKING: Voor de detectie van gefosforyleerd α-synucleïne werd anti-konijn secundair geconjugeerd aan Alexa 488 met een verdunningsfactor van 1:500 in antilichaambuffer (0,7% BSA + 0,3% Triton-X-100 in 1x PBS) gebruikt. - Leg de dia's horizontaal in de bevochtigde kamer en voeg 200-300 μL secundaire antilichaamoplossing per dia toe. Dek af met een coverslip om het antilichaam te verspreiden. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur.
- Verwijder de dia's uit de bevochtigde kamer en plaats ze in een verticale Coplin-pot gevuld met 1x PBS om de coverslip eraf te laten vallen. Doe dit voor elke dia afzonderlijk en zorg ervoor dat u het weefselgedeelte niet verstoort bij het verwijderen van de coverslip.
- Plaats de dia's in een horizontale schuifpot en was de secties 3 keer in PBS gedurende 10 minuten elke wasbeurt op kamertemperatuur op een shaker.
- Dep de zijkant van de dia's op een handdoek en schud overtollige PBS af.
- Voeg 3 druppels montagemedium toe aan elke dia. Voeg de coverslip toe en duw bubbels voorzichtig uit met een tang door op de coverslip te drukken voordat u ze afbeeldt door confocale microscopie.
Representative Results
Hoogwaardige perfusie wordt aangegeven door de afwezigheid van bloed in de lever, het ruggenmerg en diepe CZS-structuren (figuur 4C en figuur 5G, H). Achtergebleven bloed onder de dura mater (bijvoorbeeld in de veneuze sinussen) of tussen de dura mater en de schedel is niet problematisch geweest omdat dit bloed zich niet in het hersenparenchym bevindt. Het bloed in figuur 4A bevindt zich tussen de schedel en de dura-materie en is daarom niet problematisch of suggestief voor perfusie van slechte kwaliteit. De frisse hersenen en het ruggenmerg zijn vrij zacht en gemakkelijk beschadigd tijdens het hanteren. Voldoende gefixeerde weefsels zijn in vergelijking stevig. Om de kwaliteit van weefsel en het behoud van morfologie van weefsels met deze perfusiemethode te beoordelen, toont dit werk de detectie van gefosforyleerd α-synucleïne in de middenhersenen en het lumbale ruggenmerg van een 15 maanden oude muis en een 7 maanden oude muis die menselijke A53T-α-synucleïne tot expressie brengt (figuur 6).
De A53T-mutatie is oververtegenwoordigd bij patiënten met de autosomaal dominante ziekte van Parkinson (PD). Bovendien kan humaan α-synucleïne met de A53T-mutatie veel van de kenmerken van menselijke PD recapituleren wanneer het tot expressie komt in muizen 6,7. Fosforylering van α-synucleïne in het Serine 129-residu is in vivo en in vitro aangetoond dat het α-synucleïneaggregatieinduceert 8. Lewey-lichamen zijn de klassieke histologische bevinding die aanwezig is bij patiënten met PD of Lewey-lichaamdementie9. Een meerderheid van de α-synucleïne die in Lewey-lichamen aanwezig is, wordt gefosforyleerd bij Serine 12910,11. Als gevolg hiervan wordt de accumulatie van gefosforyleerd α-synucleïne gebruikt als een marker van de histologische ernst van PD-pathologie. Uit de huidige studie blijkt dat gefosforyleerd α-synucleïne zich op een significant hoger niveau ophoopt bij 15,5 maanden oude symptomatische muizen in vergelijking met 7 maanden oude asymptomatische muizen die menselijke A53T-α-synucleïne tot expressie brengen. Dit komt overeen met rapporten die een verrijking van cytopathologie beschrijven in de voorste hoorns van het ruggenmerg en de middenhersenen van deze muizen. 6 Hieruit wordt geconcludeerd dat de hier beschreven vereenvoudigde perfusiemethode hoogwaardige fixatie van CZS-weefsels biedt voor downstream histologische karakterisering.
Figuur 6: Label voor gefosforyleerd α-synucleïne in middenhersenen en lumbale ruggenmergweefsels van een muismodel van de ziekte van Parkinson. De oudere (15,5 maanden oude) eindstadium verlamde muis wordt vergeleken met de 7 maanden oude gezonde muis. Beide muizen drukken een misvouwbare mutante variant (A53T) van menselijke α-synucleïne uit die Parkinson-achtige pathologie induceert. Schaalbalken = 100 μm (bovenste panelen) en 50 μm (onderste panelen). Afkorting: α syn-A53T = A53T mutant van α-synuclein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindool; PS129 = gefosforyleerd serine 129 van α-synucleïne. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Dit werk beschrijft de kritieke stappen voor het uitvoeren van transcardiale perfusie. Bij het bouwen van het perfusieapparaat (protocol paragraaf 1) is het belangrijk om slangen te gebruiken die flexibel genoeg zijn om volledig te worden afgesloten door een hemostat. Sommige stijve buizen worden mogelijk niet voldoende afgesloten door een hemostat en kunnen PFA nog steeds in de hoofdlijn laten lekken tijdens de initiële PBS-perfusie. Bij het bereiden van de 4% PFA-oplossing is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de pH fysiologisch is (7,4). Aangezien de bereiding van de PFA-oplossing gepaard gaat met verhitting tot 65 °C, moet de oplossing vóór het meten van de pH worden afgekoeld tot 25 °C, aangezien dit de temperatuur is waarbij de pH op de meter wordt gekalibreerd.
Bij het maken van de eerste incisie in de buik moet ervoor worden gezorgd dat scheuren van de buikorganen worden voorkomen (protocol sectie 2). Bij het superieur ontleden naar het middenrif, is het belangrijk om scheuring van de lever te voorkomen, omdat het gebruikelijk is dat de lever zich hecht aan de voorste buikwand. Om dit te ondervangen, wordt de lever zorgvuldig en botweg weggesneden van de voorste wand voordat een incisie naar het diafragma wordt voortgezet. Bij het betreden van de thoracale holte via het diafragma, is het belangrijk om scheuren van het hart, grote bloedvaten en de long te voorkomen. Om dit te voorkomen, wordt de schaarpunt oppervlakkig en onder een scherpe hoek met de ribbenkast gehouden.
De initiële dissectie om het hart bloot te leggen duurt ongeveer 2 minuten vanaf de eerste incisie. Verwacht wordt dat gedurende deze tijd wat lucht in de punt van de vlindernaald is gekomen. De introductie van deze lucht in de circulatie van de muis zal perfusie van slechte kwaliteit opleveren. Daarom is het van cruciaal belang dat de hoofdlijn wordt geopend en PBS onmiddellijk voorafgaand aan de cannulatie van het hart door de naald wordt gespoeld om luchtbellen te verwijderen. Idealiter wordt het hart gecannuleerd terwijl een klein PBS-straaltje door de naaldpunt stroomt om de volledige afwezigheid van lucht bij het doorboren van de LV te garanderen.
Wanneer de naald in de LV komt, mag deze niet zo diep gaan dat de naaldpunt in de rechter ventrikel (RV) wordt gebracht. Plaatsing van de naald in de RV of voorbij de mitralisklep zal resulteren in onmiddellijke "inflatie" van de longen wanneer perfusie wordt gestart. Dit is ongewenst en de naald moet enigszins worden teruggetrokken om LV-plaatsing te garanderen. Als de naald goed wordt geplaatst, blijven de longen plat tijdens de perfusie. Wanneer perfusie wordt geïnitieerd, wordt soms waargenomen dat er een heldere vloeistof uit de open mond van het dier komt. Dit komt meestal door een te hoge perfusiedruk of door misplaatsing van de naald in het hart. De auteurs speculeren dat verhoogde perfusiedrukken resulteren in extravasatie van het perfusaat uit het arteriolar capillaire bed en retrograde stroom van PBS via de bronchiale boom in de slokdarm en mondholte.
De perfusiedruk moet worden verlaagd door het PBS-niveau in de PBS-fles te verlagen of door de hoogte van de PBS-fles te verlagen. Als alternatief, als de naald te diep in de linker ventrikel wordt geplaatst, kan deze door de mitralisklep reizen en perfusaat afgeven aan het linkeratrium. Dit kan resulteren in retrograde stroom door de longaders en extravasatie van perfusaat in de arteriolen, zoals hierboven beschreven. Grondige klaring van bloed uit de bloedsomloop met PBS is vooral belangrijk om fixatief geïnduceerde cross-linking van bloedbestanddelen te voorkomen, wat resulteert in vaatocclusie bij daaropvolgende fixatieve perfusie. Klaring wordt effectief beoordeeld door een kleurverandering van de lever en PBS-stroom van een incisie in de ventrale staartbasis. De bloedklaring is over het algemeen voltooid na 3 minuten perfusie met PBS; als visuele tekenen van klaring echter op kortere tijdstippen optreden, wordt fixatief eerder dan 3 minuten geïntroduceerd. Langere klaringstijden worden niet aanbevolen omdat vertraagde fixatieve perfusie leidt tot artefacten in de fijne structuur van het CZS1.
Wanneer PFA wordt toegediend, is het belangrijk om het niveau van PFA-oplossing in de PFA-fles te controleren. Vul de PFA-fles als het PFA-niveau daalt tot minder dan 4 cm boven de mond van de PFA-fles. Nadat de perfusie is voltooid, moet het perfusieapparaat grondig worden gespoeld met gedestilleerd water. Dit is belangrijk omdat resterende PFA in de hoofdlijn de initiële PBS-perfusie met PFA zal besmetten en zal resulteren in perfusie van slechte kwaliteit. Ten slotte worden vlindernaalden van 25 G over het algemeen aanbevolen voor volwassen muizen van gemiddelde grootte in het bereik van 20-30 g. Grotere of kleinere muizen kunnen echter iets grotere of kleinere naalden nodig hebben naast de aanpassing van de fixatieve flessen om optimale stroomsnelheden te bieden.
Voor CNS-dissectie en OCT-inbedding (protocolsectie 3) is het gebruikelijk dat ruggenmergweefsels niet volledig in 30% sucrose zinken. Deze weefsels worden daarom 2 dagen in sucrose gelaten en vervolgens ingebed in OCT, ongeacht of ze zinken of niet. Bij het invriezen van weefsels in OCT is het mogelijk dat bepaalde weefsels kunnen barsten wanneer ze in gekoeld 2-methylbutaan worden geplaatst. Dit komt vaker voor bij de hersenen en treedt meestal op wanneer er te veel OCT op het weefsel wordt geplaatst. Om dit te voorkomen, plaatst u slechts voldoende OCT om de weefseloppervlakken te bedekken voordat u onmiddellijk invriest. In sommige protocollen komt kraken minder vaak voor, ondanks volledige onderdompeling in OCT. Dit komt meestal door een langzamere vriesmethode, zoals bij het gebruik van droogijsgekoeld 2-methylbutaan of het direct plaatsen van de cryomold op een blok droogijs. Vloeibaar-stikstofgekoeld 2-methylbutaan heeft de voorkeur in dit werk omdat de snelheid van invriezen aanzienlijk sneller is en de weefselmorfologie beter kan behouden dan langzamere vriesmethoden.
Bij cryosectie van het weefsel (protocol sectie 4) is het belangrijk om meerdere vries-dooicycli te vermijden. Daarom is het optimaal om alle secties uit een enkel OCT-blok te snijden om een specifiek hersengebied voor analyse te verkrijgen in plaats van geselecteerde gebieden te ontdooien en opnieuw te bevriezen. Als dit niet haalbaar is, kunnen gebruikers na het verkrijgen van een paar secties de OCT-blokken opnieuw invriezen en nog 1-2 keer in de -80 ° C diepvriezer opslaan voor toekomstig gebruik.
De belangrijkste voordelen van deze methode ten opzichte van meer traditionele pomp- of luchtdruktoevoer van perfusaat zijn als volgt: (1) lage kosten en toegankelijkheid van het perfusieapparaat. (2) Gebruikers hoeven de druk in het perfusieapparaat tijdens de perfusie niet handmatig te handhaven. (3) Lagere en consistentere perfusiedruk dan andere goedkope alternatieven voor perfusie, zoals via spuitafgifte. Met behulp van de vergelijking van Bernoulli wordt berekend dat het hier geconstrueerde perfusieapparaat met zwaartekracht gevoede perfusie een perfusiedruk van ongeveer 73 mm Hg zal handhaven wanneer de perfusaatflessen op 1 m hoogte ten opzichte van de naald worden geplaatst. Aangezien dit aanzienlijk lager is dan de systolische bloeddruk van deze dieren, is deze perfusiedruk waarschijnlijk voldoende laag om vasculaire breuk te voorkomen12.
De auteurs hebben dit perfusiesysteem tot nu toe met succes gebruikt om de aanwezigheid van gefosforyleerd α-synucleïne in een muismodel van de ziekte van Parkinson te detecteren. Gedurende deze tijd zijn er geen significante beperkingen met deze perfusiemethode aangetroffen die niet aanwezig zijn bij een pompperfusieafgiftemethode. De belangrijkste beperking van deze techniek is het tijdrovende karakter van perfusie versus druppelfixatie. Deze techniek heeft de voorkeur boven het laten vallen van fixatie, omdat perfusie resulteert in de diepere penetratie van fixatief op de CZS-structuren. Een tweede beperking van deze techniek is dat het enige chirurgische vaardigheid vereist om uit te voeren, omdat het hart snel moet worden gecannuleerd na binnenkomst in de thoracale holte. Met ervaring kunnen getrainde gebruikers het hart echter routinematig binnen 1 minuut na de eerste incisie in de buik uleren.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Xiaowen Wang, Liam Coyne en Jason Grullon voor hun hulp bij het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door de NIH-subsidies AG061204 en AG063499.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutane (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | 03551-4 | |
| Andwin Scientific Tissue-Tek O.C.T Compound | Fisher Scientific | NC1029572 | |
| Artman Instruments 4.5" Straight Castroveijo Spring Action Scissors | Amazon | B0752XHK2X | "fine scissors" |
| BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 18 G | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles, 22 G | Fisher Scientific | 14-826B | |
| Corning PES Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-754-29 | |
| Cytiva HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Scientific | SH30258 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | "curved fenestrated forceps" |
| Fisherbrand Curved Very Fine Precision Tip Forceps | Fisher Scientific | 16-100-123 | "curved fine forceps" |
| Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Fisherbrand High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | "straight fine forceps" |
| Fisherbrand Micro Spatulas with Rounded Ends | Fisher Scientific | 21-401-5 | |
| Fisherbrand Porcelain Buchner Funnels with Fixed Perforated Plates | Fisher Scientific | FB966J | |
| Fisherbrand Premium Cover Glass, 24 x 50 | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| Fisherbrand Premium Tissue Forceps 1X2 Teeth 5 in. German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | "skin forceps" |
| Fisherbrand Reusable Heavy-Wall Filter Flasks | Fisher Scientific | FB3002000 | |
| Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | "dissecting scissors" |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use | Fisher Scientific | 14-955-464 | |
| Fisherbrand Straight Locking Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherbrand Vinyl Tubing and Connector Kits, 1/4 in. | Fisher Scientific | 14-174-1C | |
| Fisherbrand Wet-Strengthened Qualitative Filter Paper Circles | Fisher Scientific | 09-790-12F | |
| Fisherbrand Y Connector with 1/4 in. ID - Polypropylene - QC | Fisher Scientific | 01-000-686 | |
| Garvey Economy Single Edge Cutter Blade | Amazon | B001GXFAEQ | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 488 | ThermoFisher Scientific | 35552 | |
| Ideal Clamp Stant High-Pressure Clamps | Fisher Scientific | 14-198-5A | "hose clamps" |
| IMEB, Inc Sakura Accu-Edge Low Profile Microtome Blades, Dispoisable | Fisher Scientific | NC9822467 | |
| Kawasumi 25 Gauge Standard Winged Blood Collection Set | Fisher Scientific | 22-010-137 | "butterfly needle" |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Molecular Probes ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36962 | |
| Nalgene Narrow-Mouth Right-to-Know LDPE Wash Bottles | ThermoFisher Scientific | 2425-0506 | "buffer bottles" |
| PAP pen | abcam | ab2601 | |
| Paraformaldehyde Granular | Electron Microscopy Systems | 19210 | |
| Pyrex Glass Drying Dishes, 34.9 x 24.9 x 6 cm | Fisher Scientific | 15-242D | |
| Recombinant Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] | abcam | ab51253 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5kg | |
| Stainless Steel Drinking Cup 18-oz | amazon | B0039PPO9U | |
| Sucrose for Molecular Biology CAS: 57-50-1 | Us Biological | S8010 | |
| Triton X-100 | Us Biological | T8655 | |
| Vetone Fluriso Isoflurane USP | MWI Animal Health | 502017 |
References
- Tao-Cheng, J. H., Gallant, P. E., Brightman, M. W., Dosemeci, A., Reese, T. S. Structural changes at synapses after delayed perfusion fixation in different regions of the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 501 (5), 731-740 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- McFadden, W. C., et al. Perfusion fixation in brain banking: a systematic review. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 146 (2019).
- Lamberts, R., Goldsmith, P. C. Fixation, fine structure, and immunostaining for neuropeptides: perfusion versus immersion of the neuroendocrine hypothalamus. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (3), 389-398 (1986).
- Adickes, E. D., Folkerth, R. D., Sims, K. L. Use of perfusion fixation for improved neuropathologic examination. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 121 (11), 1199-1206 (1997).
- Giasson, B. I., et al. Neuronal alpha-synucleinopathy with severe movement disorder in mice expressing A53T human alpha-synuclein. Neuron. 34 (4), 521-533 (2002).
- Martin, L. J., et al. Parkinson's disease alpha-synuclein transgenic mice develop neuronal mitochondrial degeneration and cell death. Journal of Neuroscience. 26 (1), 41-50 (2006).
- Fujiwara, H., et al.
- Kalia, L. V., Lang, A. E.
- Anderson, J. P., et al. Phosphorylation of Ser-129 is the dominant pathological modification of alpha-synuclein in familial and sporadic Lewy body disease. Journal of Biological Chemistry. 281 (40), 29739-29752 (2006).
- Kahle, P. J., et al. Hyperphosphorylation and insolubility of alpha-synuclein in transgenic mouse oligodendrocytes. EMBO Reports. 3 (6), 583-588 (2002).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14, 405-408 (2001).
