Summary
该协议描述了快速高尔基体方法的修改，该方法可以适应神经系统的任何部分，用于染色大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的神经元。
Abstract
高尔基体浸渍，使用具有轻微适应的高尔基染色试剂盒，用于浸渍大鼠海马体和内侧前额叶皮层中的树突状棘。这种技术比以前的高尔基体浸渍方法有了显着的改进，因为预混合的化学物质使用起来更安全，神经元始终浸渍良好，背景碎片少得多，并且对于给定的区域，实验之间的脊柱密度存在极小的偏差。此外，大脑可以在某一点后积累并保持冷冻，直到进一步处理。使用这种方法可以研究任何感兴趣的大脑区域。一旦染色并覆盖滑动，树突状脊柱密度通过计算树突长度的棘数量来确定，并表示为每10μm树突的脊柱密度。
Introduction
使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法首先由Camillo Golgi1，2 描述，随后由Santiago Ramon y Cajal使用，以产生大量区分神经元和神经胶质亚型的工作。最近出版的一本附有他的插图的书现已出版3.在100多年前发表的Ramon y Cajal的研究之后，很少使用高尔基体浸渍。高尔基体浸渍是一个费力的过程，允许用光学显微镜对神经元进行三维可视化。多年来，高尔基体方法进行了多次修改，使方法更容易，染色更一致4。1984年，Gabbott和Somogyi5 描述了单段高尔基体浸渍程序，该程序允许更快速的加工。这种高尔基体浸渍方法需要用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸灌注，固定后，然后振动切片到3%重铬酸钾浴中。切片安装在载玻片上，盖玻片的四个角粘合在一起，以便当浸入硝酸银中时，扩散是渐进的。然后将盖玻片弹出，部分脱水，并最终用安装介质永久滑落盖板。该技术被成功地用于标记海马体中的神经元和神经胶质细胞6，7，8 。这里描述的快速高尔基体方法是一种改进，因为重铬酸钾和硝酸银的暴露要少得多，并且不使用多聚甲醛和苦味酸。此外，尽管可以使用Gabbott和Somogyi5 方法的修饰来浸渍的细胞进行分析，但在脱水步骤中，切片通常过度或未充分暴露或从载玻片上掉落，并且通常必须合并几个实验以具有足够的细胞进行分析。
本方案描述了使用高尔基染色试剂盒（见 材料表）来标记大鼠海马体和内侧前额叶皮层（mPFC）中的树突和树突状棘。与以前的方法相比，这种方法的优点是它速度快，研究人员接触有毒化学物质较少，并且神经元染色一致。在许多研究中，下面描述的方案已被用于进行微小的修改，以评估大鼠海马体和mPFC中的树突状脊柱密度9，10，11，12，13，14，15。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验程序均由圣心大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合NIH动物护理和使用指南。
1. 脑组织的分离和浸润
- 使用前24小时高尔基体染色试剂盒的预混溶液A和B，并保存在深色瓶中和/或黑暗中。制作约80 mL溶液A和B混合物，足以在24小时后更换溶液。存放在密封瓶中。
注意：不需要用盐水或多聚甲醛灌注。 - 在二氧化碳安乐死后通过断头台处死老鼠，并在几秒钟内切除大脑。如果需要，用盐水冲洗大脑，但不是必需的。
- 将大脑皮层向下放置，使下丘脑可见，因为切口是在无孔表面上的前后部形成的。切成前部（包含前额叶皮层）和后部（包含海马体）块，如图 1所示。
- 将块放入A和B的预混合溶液中，确保它们很好地浸入溶液中。确保溶液 A 和 B 的体积足以浸入块中。将块存放在棕色瓶子或覆盖有铝箔的透明瓶子中（以保持光线昏暗）在室温下。
- 24小时后更换溶液，并在室温下在黑暗中再保持13天。
注意：如果与小鼠大脑一起使用，则无需阻塞，并且可以将整个大脑放置在溶液中。如果染色大小不同的大脑区域，则溶液A和B中的时间可能必须通过反复试验来确定。 - 两周后，组织用溶液A和B很好地浸润，将块转移到冷冻保护剂溶液（高尔基体染色试剂盒中的溶液C）中，并在4°C下放置48-72小时。
注意：冷冻保护后，块可能会被冷冻，直到进一步处理。另外，请注意，该套件中的所有溶液都作为危险废物进行收集和处置。 - 冷冻大脑，皮层向下，在干冰上的玻璃载玻片上。冷冻后，要么在低温恒温器上切割或储存在-80°C，直到使用低温恒温器切片。
注意：不要在液氮中冻结，因为这会在组织中产生裂缝。
2. 脑组织切片
- 将少量组织培养基放在预冷的低温恒温器卡盘上。将块安装在低温恒温卡盘上，方法是将块的一侧稍微放在手中（戴上手套）并将其放在组织培养基上。
注意：没有必要包埋组织。包含海马体的块比具有前额叶皮层的块更容易切割，因为后者位于胼胝体的前面，并且两半是分开的。 - 在 -22 °C 的低温恒温器上切割 100 μm 切片，并安装在床下载玻片上。可以使用厚度达 150 μm 的切片。尝试每张载玻片安装3-4个日冕段，因为这会减少需要处理的载玻片数量。使用以下技术之一使各部分保持冻结状态，直到它们进入幻灯片。
注意：这些部分没有以通常的方式固定，因此它们往往会很快融化。让各部分在载玻片上融化。如果它们在被放置在载玻片上之前开始融化，则不可能使它们在载玻片上平放。有几种技术可以做到这一点。- 在刀和块上使用冷冻喷雾。根据房间的温度和湿度，每个部分都可能需要这样做。使用防卷板或刷子在切割时保持截面平坦。
注意：确保有足够的冷冻喷雾。切割20块时可以使用几个罐头。 - 如果可能的话，通过使用室温载玻片将其解冻，并将其快速应用到该部分。通过练习，可以一次安装多个部分。如果这不起作用，请将载玻片保存在低温恒温器中，使其非常冷，并用冷镊子或冷画笔转移该部分，然后解冻安装座。
- 在刀和块上使用冷冻喷雾。根据房间的温度和湿度，每个部分都可能需要这样做。使用防卷板或刷子在切割时保持截面平坦。
- 用纸巾擦拭刀片之间的刀。如果刀具需要更多清洁，请使用100%乙醇（EtOH），并在切割下一片之前使其干燥。
- 一旦安装到载玻片上，将载玻片平放在纸板载玻片托盘上，并允许部分在室温下干燥（几个小时到最多48小时）在黑暗中。不要盖住幻灯片托盘。确保在高尔基体浸渍之前部分完全干燥。平放在黑暗中，放在滑动托盘上，直到高尔基体浸渍。
注：干燥各部分不会造成任何损坏。
3.脑组织染色脱水
- 在玻璃染色皿中进行染色。在染色前立即混合溶液D和E。根据协议，加入溶液D的一部分，溶液E的一部分和蒸馏水的两部分。对于玻璃染色皿，制作200 mL溶液以完全淹没切片。对于Koplin罐，这需要更少的体积。
- 将载玻片放在间隔足够远的机架中，以便解决方案能够进入各个部分。
- 将切片在蒸馏水中放置4分钟（2x），然后将其放入高尔基体浸渍染色溶液中10分钟。每70段更换一次染色液。当蒸馏水变黄时，更换蒸馏水。
注：染色步骤的时机至关重要。太短不允许足够的染色，太长会导致染色过度，使树突难以在进行分析时分离。一旦从染色溶液中出来，时间就不那么重要了。 - 按如下方式使切片脱水：70%乙氧乙烷（5分钟），95%乙氧乙烷（5分钟;2倍），100%乙氧烷醇（5分钟;2倍），清除剂（5分钟;3倍）。经常更换所有溶液，特别是100%EtOH和清除剂，以确保切片保持无水。
注意：没有必要经历50%的EtOH步骤。细胞可视化不需要复染，因为高尔基体浸渍提供了足够的对比度。其他清除剂的使用效果不如此处使用的清除剂（见 材料表）。 - 带玻璃盖夹的盖玻片，长 60 mm，具有大量的安装介质。确保有尽可能少的气泡。如果需要，请小心取下并重做盖玻片（甚至可以在几周后完成）。这样做非常慢，以免损坏部分（由于安装介质量大，可以这样做）。
注意：大量的安装介质有些凌乱，但仍然是必要的，因为必须使用足够的安装介质来覆盖厚厚的100μm部分。 - 为确保各部分上只放置一个盖玻片，请在处理之前将盖玻片分开。
- 一旦盖子滑落，干燥的幻灯片平放在任何无孔纸上3-5天，稍微移动它们，特别是在第一天之后，以避免粘连。3-5天后，将载玻片转移到载玻片支架上，理想情况下，在检查之前至少干燥载玻片3周。保持滑块平坦，以减少形成气泡的可能性。
4. 树突状脊柱密度的测定
- 为了分析mPFC和海马体CA1区域锥体神经元的树突状脊柱密度，检查最外侧的次级基底树突和最外侧的三级顶端树突，如步骤4.1.1中所述（图2）。
- 选择树突，使用图像分析程序测量树突的长度，使用手动计数器计算树突上的棘，并记录棘的长度和数量。
- 研究和分析每个大脑每个区域六个细胞（mPFC，CA1）。如前所述，每组至少量化六个大脑7，8。选择符合以下分析标准的神经元：细胞体和树突浸渍良好;树突可与相邻细胞区分开来，并且是连续的。
- 用光学显微镜手动计数，以1000倍（油浸）计数棘刺，并使用图像分析程序测量树枝长度。通过将脊柱数量除以树突的长度来计算脊柱密度，并将数据表示为棘数/ 10μm树突。
注意：有更复杂的方法来区分脊柱亚型和树突状结构，但用1000x的光学显微镜进行手工计数可以给出快速的结果，然后可以确定是否需要进一步研究。尽管我们尽一切努力对相似的枝晶进行一致采样，但厚度的变化可能会影响计数。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
使用快速高尔基体方法，细胞始终被很好地浸渍，以便有足够的细胞进行分析。与以前的方法相比，这是一个显着的改进，在以前的方法中，必须将实验合并以具有足够的数据进行分析。因此，可以一次处理更多的样品，并且可以冷冻储存大脑直到处理。 图3显示了海马体CA1区域中高尔基体浸渍细胞在低功率和高功率下的例子。对给定区域中的棘进行计数可以产生具有小标准误差的一致结果。这也很重要，因为人们可以在实验之间进行比较。 图4 说明了一个实验，其中在CA1和mPFC中进行环境富集（EE）后，青春期雄性和雌性大鼠的锥体细胞上的基底树突状脊柱密度增加。简而言之，雄性和雌性大鼠在产后日（PND）21断奶，并被分配到对照组或富集组。EE组在PND 24~42的富集房中度过2 h/d，而对照组在此期间被安置在普通笼子里。EE在两性青少年中均诱导CA1和mPFC中基底树突状脊柱密度的增加。请注意所有树突状脊柱值中均值 （SEM） 的小标准误。
图1：大鼠大脑的腹侧表面。 新鲜大鼠大脑腹侧表面的照片，指示在将块浸入初始溶液之前切入前方和后方块的位置。 请点击此处查看此图的大图。
图2：典型的锥体细胞。 锥体细胞示意图，说明顶端和基部树突，分析树突脊柱密度。 请点击此处查看此图的大图。
图3：高尔基体浸渍神经元。 高尔基体在大鼠海马体的CA1区域浸渍神经元的例子。 左：几个浸渍的锥体细胞。比例尺 = 25 μm。右上：基底树突。比例尺 = 12.5 μm。右下角：次级基底枝晶示例。箭头表示棘。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图4：脊柱密度。 一组数据，说明环境富集（EE）后海马体（CA1）的mPFC和CA1区域的基底和顶端树突状脊柱密度与雄性（M）和雌性大鼠（F）的对照（CON）相比。直方图显示平均棘数/10 μm枝晶+SEM.使用统计分析软件分析数据（见 材料表）。使用双向（性别X EE）ANOVA来测试组差异，并使用Fisher的LSD测试进行事后分析。显著效应为p<0.05。t 表示显著差异。 请点击此处查看此图的大图。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本方案描述了一种高尔基体浸渍方法，该方法允许快速同时处理许多切片。这是对前面描述的5 种劳动密集型方法的改进，并且始终产生浸渍神经元进行分析。此外，接触高尔基体浸渍中使用的有毒化学物质较少。该过程中最具挑战性的部分是使切片在幻灯片上保持平坦，这需要大量的练习。使用冷冻喷雾保持所有东西尽可能冷是至关重要的。
一旦载玻片干燥并且可以进行分析，在选择计数的细胞时保持一致非常重要。海马锥体细胞从CA1中选择。对于具有多个亚部分的mPFC，使用来自下边缘皮层的锥体细胞。由于尚不清楚的原因，mPFC中的细胞染色比海马体的CA1区域少。此外，当由于后勤原因无法将所有部分一起处理时，可以合并实验。为了保持一致性，同一个人应该计算一组给定的单元格。
这种方法的局限性类似于所有高尔基体浸渍方法。只有少量细胞被染色的事实是一个优势。浸渍的少量细胞允许在三维空间中可视化整个细胞。高尔基体方法的缺点是不清楚标记了哪个细胞亚群。因此，在实验中，必须假设为对照组和实验组浸渍的细胞是相同的。尽管这种方法比以前的方法产生更好的染色效果，但总有一些细胞无法分析，因为它们被碎片，气泡或具有破碎的树突覆盖。
总之，这里描述的快速高尔基体方法是一种快速，安全的方法，用于一致且可重复的神经元标记，可用于任何大脑区域。除了标记前额叶皮层17，18 和海马体10，12，19中的细胞外，它还被用于杏仁核20，小脑21和皮质22。假设一个人熟悉解剖学并且可以快速识别细胞，脊柱密度的手计数可以提供快速的结果，但它不能提供有关树突状亚型的信息，这需要更复杂的分析方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了圣心大学本科生研究计划Grants的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , Abrams. 208 (2017).
- Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
