Summary
Il protocollo descrive una modifica del metodo rapido Golgi, che può essere adattato a qualsiasi parte del sistema nervoso, per la colorazione dei neuroni nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale del ratto.
Abstract
L'impregnazione di Golgi, utilizzando il kit di colorazione Golgi con piccoli adattamenti, viene utilizzata per impregnare le spine dendritiche nell'ippocampo del ratto e nella corteccia prefrontale mediale. Questa tecnica è un netto miglioramento rispetto ai precedenti metodi di impregnazione di Golgi perché le sostanze chimiche premiscelate sono più sicure da usare, i neuroni sono costantemente ben impregnati, ci sono molti meno detriti di fondo e, per una data regione, ci sono deviazioni estremamente piccole nella densità della colonna vertebrale tra gli esperimenti. Inoltre, i cervelli possono essere accumulati dopo un certo punto e mantenuti congelati fino a un'ulteriore elaborazione. Usando questo metodo qualsiasi regione del cervello di interesse può essere studiata. Una volta macchiata e la copertura scivolata, la densità della colonna vertebrale dendritica viene determinata contando il numero di spine per una lunghezza di dendrite ed espressa come densità della colonna vertebrale per dendrite da 10 μm.
Introduction
Il metodo di utilizzo del dicromato di potassio e del nitrato d'argento per etichettare i neuroni è stato descritto per la prima volta da Camillo Golgi 1,2 e successivamente utilizzato da Santiago Ramon y Cajal per produrre un immenso corpo di lavoro che differenzia i sottotipi neuronali e gliali. Un libro pubblicato di recente con le sue illustrazioni è ora disponibile3. Seguendo gli studi di Ramon y Cajal, pubblicati più di 100 anni fa, è stata utilizzata pochissima impregnazione di Golgi. L'impregnazione di Golgi è un processo laborioso che consente la visualizzazione tridimensionale dei neuroni con un microscopio ottico. Ci sono state numerose modifiche del metodo Golgi nel corso degli anni per rendere il metodo più facile e la colorazione più coerente4. Nel 1984, Gabbott e Somogyi5 descrissero la procedura di impregnazione del Golgi a sezione singola che consentiva un'elaborazione più rapida. Questo metodo di impregnazione del Golgi richiede la perfusione con il 4% di paraformaldeide e l'1,5% di acido picrico, post-fissazione seguita da sezionamento del vibratoma in un bagno di dicromato di potassio al 3%. Le sezioni sono montate su vetrini, i quattro angoli dei coperchi incollati in modo che quando immersi nel nitrato d'argento, la diffusione sia graduale. Le coperture vengono quindi staccate, le sezioni vengono disidratate e alla fine la copertura scivola permanentemente con il mezzo di montaggio. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per etichettare neuroni e glia 6,7,8 nell'ippocampo. Il metodo rapido Golgi qui descritto è un miglioramento perché c'è molta meno esposizione sia al dicromato di potassio che al nitrato d'argento e non vengono utilizzati paraformaldeide e acido picrico. Inoltre, sebbene le cellule che sono state impregnate utilizzando modifiche del metodo Gabbott e Somogyi5 potessero essere analizzate, spesso le sezioni erano sovra o sottoesposte o cadevano dai vetrini durante la fase di disidratazione e, in generale, diversi esperimenti dovevano essere raggruppati per avere abbastanza cellule per l'analisi.
Il presente protocollo descrive l'uso del kit di colorazione Golgi (vedi Tabella dei materiali) per etichettare dendriti e spine dendritiche nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale (mPFC) del ratto. I vantaggi di questo metodo rispetto ai precedenti sono che è rapido, c'è meno esposizione a sostanze chimiche nocive per il ricercatore e c'è una colorazione costante dei neuroni. Il protocollo descritto di seguito è stato utilizzato con piccole modifiche per valutare la densità della colonna vertebrale dendritica nell'ippocampo e nella mPFC del ratto in molti studi 9,10,11,12,13,14,15.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali sono approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sacro Cuore e sono conformi alla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali.
1. Isolamento e infiltrazione del tessuto cerebrale
- Soluzioni premiscelate A e B del kit di colorazione Golgi 24 ore prima dell'uso e conservare in flaconi scuri e/o al buio. Effettuare circa 80 mL di soluzione A e B miscela che è sufficiente per cambiare la soluzione dopo 24 ore. Conservare in bottiglie ermetiche.
NOTA: La perfusione con soluzione salina o paraformaldeide non è necessaria. - Sacrifica i ratti con la ghigliottina dopo l'eutanasia di anidride carbonica e rimuovi il cervello in pochi secondi. Risciacquare il cervello in soluzione salina se necessario, ma non è necessario.
- Posizionare il cervello, la corteccia verso il basso in modo che l'ipotalamo sia visibile perché i tagli sono fatti anteriormente e posteriormente ad esso, su una superficie non porosa. Tagliare in un blocco anteriore (contiene la corteccia prefrontale) e posteriore (contiene l'ippocampo) come mostrato nella Figura 1.
- Posizionare i blocchi nelle soluzioni premiscelate di A e B, assicurandosi che siano ben immersi nella soluzione. Assicurarsi che il volume delle soluzioni A e B sia sufficiente per immergere i blocchi. Conservare i blocchi in bottiglie marroni o bottiglie trasparenti coperte di lamina (per tenere fuori la luce) al buio a temperatura ambiente.
- Sostituire la soluzione dopo 24 ore e conservare al buio per altri 13 giorni a temperatura ambiente.
NOTA: Se utilizzato con cervelli di topo, non è necessario bloccare e l'intero cervello può essere inserito nella soluzione. Se si colorano aree cerebrali, che sono di dimensioni diverse, il tempo nelle soluzioni A e B potrebbe dover essere determinato per tentativi ed errori. - Dopo due settimane il tessuto viene infiltrato bene con le soluzioni A e B, trasferire i blocchi alla soluzione crioprotettiva (soluzione C nel kit di colorazione Golgi) e lasciarli per 48-72 ore a 4 °C.
NOTA: Dopo la crioprotezione, i blocchi possono essere congelati fino a un'ulteriore elaborazione. Inoltre, si noti che tutte le soluzioni del kit vengono raccolte e smaltite come rifiuti pericolosi. - Congelare il cervello, la corteccia verso il basso, su un vetrino su ghiaccio secco. Una volta congelato, tagliare sul criostato o conservare a -80 °C fino al sezionamento con un criostato.
NOTA: non congelare in azoto liquido in quanto ciò produce crepe nel tessuto.
2. Sezionamento dei tessuti cerebrali
- Posizionare una piccola quantità di tessuto medio su un mandrino criostato pre-raffreddato. Montare i blocchi su mandrini criostati scongelando leggermente un lato del blocco leggermente in mano (guantato) e posizionandolo sul mezzo tissutale.
NOTA: Non è necessario incorporare il tessuto. Il blocco contenente l'ippocampo è un po 'più facile da tagliare rispetto al blocco con la corteccia prefrontale perché quest'ultimo è anteriore al corpo calloso e le due metà sono separate. - Tagliare sezioni da 100 μm su un criostato a -22 °C e montarle su vetrini sottobed. È possibile utilizzare sezioni fino a 150 μm di spessore. Prova a montare 3-4 sezioni coronali per diapositiva in quanto ciò riduce il numero di diapositive che richiedono l'elaborazione. Utilizzare una delle seguenti tecniche per mantenere le sezioni congelate fino a quando non arrivano sulla diapositiva.
NOTA: Queste sezioni non sono fissate nel solito modo e quindi tendono a sciogliersi rapidamente. Lasciare che le sezioni si sciolgano sulla diapositiva. Se iniziano a sciogliersi prima di essere posizionati sul vetrino, è impossibile farli essere piatti sulla diapositiva. Ci sono diverse tecniche per farlo.- Utilizzare uno spray congelante sul coltello e sul blocco. A seconda della temperatura e dell'umidità nella stanza, questo può essere necessario per ogni sezione. Utilizzare la piastra antirollio o una spazzola per mantenere la sezione piatta durante il taglio.
NOTA: Assicurarsi di avere abbastanza spray congelante. Diverse lattine possono essere utilizzate quando si tagliano 20 blocchi. - Scongelare, se possibile, utilizzando una slitta a temperatura ambiente e appostarla rapidamente alla sezione. Con la pratica, si possono montare più sezioni contemporaneamente. Se questo non funziona, tenere le diapositive nel criostato in modo che siano molto fredde e trasferire la sezione con una pinza fredda o un pennello freddo e quindi scongelare il montaggio.
- Utilizzare uno spray congelante sul coltello e sul blocco. A seconda della temperatura e dell'umidità nella stanza, questo può essere necessario per ogni sezione. Utilizzare la piastra antirollio o una spazzola per mantenere la sezione piatta durante il taglio.
- Pulire il coltello con salviette di carta tra le fette. Se il coltello richiede una maggiore pulizia, utilizzare etanolo al 100% (EtOH) e lasciarlo asciugare prima di tagliare la fetta successiva.
- Una volta montato sul vetrino, posizionare il vetrino piatto su vassoi di cartone e lasciare asciugare le sezioni a temperatura ambiente (per diverse ore fino a un massimo di 48 h) al buio. Non coprire il vassoio scorrevole. Assicurarsi che le sezioni siano completamente asciutte prima dell'impregnazione del Golgi. Conservare in piano, al buio, su vassoi scorrevoli fino all'impregnazione di Golgi.
NOTA: l'asciugatura delle sezioni non causa alcun danno.
3. Colorazione e disidratazione del tessuto cerebrale
- Eseguire la colorazione in piatti di colorazione del vetro. Mescolare le soluzioni D ed E immediatamente prima della colorazione. Secondo il protocollo, aggiungere una parte della soluzione D, una parte della soluzione E e due parti di acqua distillata. Per i piatti di colorazione del vetro, fare una soluzione da 200 ml per immergere completamente le sezioni. Per i barattoli Koplin, questo richiede meno volume.
- Posizionare le diapositive in rack distanziati sufficientemente da consentire l'accesso della soluzione alle sezioni.
- Mettere le sezioni in acqua distillata per 4 minuti (2x) prima di metterle nella soluzione di colorazione dell'impregnazione di Golgi per 10 minuti. Cambiare la soluzione colorante ogni 70 sezioni. Cambia l'acqua distillata quando diventa gialla.
NOTA: la tempistica per la fase di colorazione è fondamentale. Troppo corto non consente abbastanza macchie e cause troppo lunghe di colorazione, rendendo i dendriti difficili da separare durante l'analisi. Una volta usciti dalla soluzione di colorazione, i tempi sono meno critici. - Disidratare le sezioni come segue: 70% EtOH (5 min), 95% EtOH (5 min; 2x), 100% EtOH (5 min; 2x), agente di compensazione (5 min; 3x). Cambia spesso tutte le soluzioni, in particolare l'EtOH al 100% e l'agente di compensazione per garantire che le sezioni rimangano anidre.
NOTA: non è necessario passare attraverso un passaggio EtOH del 50%. La controcolorazione non è necessaria per la visualizzazione cellulare perché l'impregnazione di Golgi fornisce un contrasto sufficiente. L'uso di altri agenti di compensazione non ha funzionato altrettanto bene di quello utilizzato qui (vedi Tabella dei materiali). - Coverslip con coverslip in vetro lunghi 60 mm con una generosa quantità di mezzo di montaggio. Assicurati che ci siano, il minor numero possibile di bolle d'aria. Se necessario, rimuovere con cura e rifare il coverslip (può essere fatto anche settimane dopo). Fallo molto lentamente per non danneggiare la sezione (può essere fatto a causa della grande quantità di mezzo di montaggio).
NOTA: una grande quantità di terreno di montaggio è un po 'disordinata ma ancora necessaria perché è necessario utilizzare un mezzo di montaggio sufficiente per coprire le sezioni spesse di 100 μm. - Per garantire che sulle sezioni sia posizionato un solo coverslip, separare i coverslip prima del processo.
- Una volta scivolata la copertina, asciugare i vetrini piatti su qualsiasi carta non porosa per 3-5 giorni, spostandoli leggermente, soprattutto dopo il primo giorno, per evitare di attaccarsi. Dopo 3-5 giorni trasferire le diapositive sui portafili e, idealmente, asciugare le diapositive per almeno 3 settimane prima di esaminarle. Mantenere le diapositive piatte per ridurre la possibilità di formazione di bolle d'aria.
4. Determinazione della densità della colonna vertebrale dendritica
- Per l'analisi della densità della colonna vertebrale dendritica nei neuroni piramidali sia della regione mPFC che della regione CA1 dell'ippocampo, esaminare i dendriti basali secondari più laterali e i dendriti apicali terziari più laterali come descritto nel passo 4.1.1 (Figura 2).
- Scegli un dendrite, misura la lunghezza del dendrite usando un programma di analisi delle immagini, conta le spine sui dendriti usando un contatore a mano e registra sia la lunghezza che il numero di spine.
- Studia e analizza sei cellule per regione (mPFC, CA1) per cervello. Quantificare un minimo di sei cervelli per gruppo come descritto in precedenza 7,8. Scegli i neuroni che soddisfano i seguenti criteri per l'analisi: i corpi cellulari e i dendriti sono ben impregnati; i dendriti sono distinguibili dalle cellule adiacenti e sono continui.
- Conta le spine a 1000x (immersione in olio) contando a mano con un microscopio ottico e misura la lunghezza dendritica utilizzando un programma di analisi delle immagini. Calcola la densità della colonna vertebrale dividendo il numero della colonna vertebrale per la lunghezza del dendrite ed esprimi i dati come il numero di spine / dendrite da 10 μm.
NOTA: Esistono metodi molto più sofisticati per differenziare i sottotipi della colonna vertebrale e l'architettura dendritica che possono essere utilizzati, ma il conteggio a mano con un microscopio ottico a 1000x può dare un risultato rapido che può quindi determinare se sono necessarie ulteriori indagini. Sebbene venga fatto ogni sforzo per campionare costantemente dendriti simili, ci sono variazioni di spessore che possono influenzare il conteggio.
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Representative Results
Utilizzando il metodo rapido di Golgi, le cellule sono costantemente ben impregnate in modo che ci siano molte cellule da analizzare. Questo è un netto miglioramento rispetto ai metodi precedenti in cui gli esperimenti dovevano essere raggruppati per avere dati sufficienti per l'analisi. Pertanto, più campioni possono essere elaborati contemporaneamente e i cervelli possono essere conservati congelati fino all'elaborazione. Esempi di cellule impregnate di Golgi nella regione CA1 dell'ippocampo sono mostrati a bassa e alta potenza nella Figura 3. Il conteggio delle spine in una determinata regione produce risultati coerenti con piccoli errori standard. Questo è importante anche perché si possono fare confronti tra gli esperimenti. La Figura 4 illustra un esperimento in cui la densità della colonna vertebrale dendritica basale è stata aumentata sulle cellule piramidali in ratti adolescenti maschi e femmine dopo arricchimento ambientale (EE) sia nel CA1 che nell'mPFC. In breve, ratti maschi e femmine sono stati svezzati al giorno postnatale (PND) 21 e assegnati a gruppi di controllo o arricchiti. Il gruppo EE ha trascorso 2 ore al giorno in alloggi arricchiti da PND 24-42 mentre il gruppo di controllo è stato alloggiato in gabbie ordinarie durante questo periodo. L'EE ha indotto, negli adolescenti di entrambi i sessi, un aumento della densità della colonna vertebrale dendritica basale sia nel CA1 che nell'mPFC. Si noti il piccolo errore standard della media (SEM) in tutti i valori della colonna vertebrale dendritica.
Figura 1: Superficie ventrale del cervello di ratto. Fotografia della superficie ventrale di un cervello di ratto fresco che indica dove tagliare in blocchi anteriori e posteriori prima di immergere i blocchi in soluzioni iniziali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Tipica cella piramidale. Schema di una cellula piramidale, che illustra i dendriti apicali e basali che vengono analizzati per la densità della colonna vertebrale dendritica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Neurone impregnato di Golgi. Esempi di neuroni impregnati di Golgi nella regione CA1 dell'ippocampo del ratto. A sinistra: diverse cellule piramidali impregnate. Barra della scala = 25 μm. In alto a destra: Dendriti basali. Barra della scala = 12,5 μm. In basso a destra: Esempio di dendrite basale secondario. Le frecce denotano le spine. Barra della scala = 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Densità della colonna vertebrale. Un set di dati che illustra la densità della colonna vertebrale dendritica basale e apicale nella regione mPFC e CA1 dell'ippocampo (CA1) a seguito di arricchimento ambientale (EE) rispetto al controllo (CON) nei ratti maschi (M) e femmine (F). Gli istogrammi mostrano il numero medio di spine /dendrite da 10 μm + SEM. I dati sono stati analizzati utilizzando un software di analisi statistica (vedi Tabella dei materiali). Gli ANOVA bidirezionali (sesso X EE) sono stati utilizzati per testare le differenze di gruppo e i test LSD di Fisher sono stati utilizzati per analisi post-hoc. Gli effetti significativi sono p<0.05. t denota una differenza significativa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il presente protocollo descrive un metodo di impregnazione del Golgi che consente una rapida elaborazione simultanea di molte sezioni. È un miglioramento rispetto ai5 metodi più laboriosi descritti in precedenza e produce costantemente neuroni impregnati per l'analisi. Inoltre, c'è meno esposizione alle sostanze chimiche tossiche utilizzate nell'impregnazione di Golgi. La parte più impegnativa del processo è ottenere che le sezioni siano piatte sulle diapositive, il che richiede una notevole pratica. Mantenere tutto il più freddo possibile con l'uso di spray congelante è essenziale.
Una volta che le diapositive sono asciutte e l'analisi può essere eseguita, è molto importante essere coerenti nella selezione delle celle che vengono contate. Le cellule piramidali ippocampali sono scelte da CA1. Per l'mPFC, che ha diverse sottoparti, vengono utilizzate cellule piramidali dalla corteccia infralimbica. Per ragioni che non sono chiare, meno cellule nell'mPFC sono macchiate rispetto alla regione CA1 dell'ippocampo. Inoltre, è possibile combinare esperimenti quando tutte le sezioni non possono essere elaborate insieme per motivi logistici. Per coerenza, la stessa persona dovrebbe contare un determinato insieme di celle.
I limiti di questo metodo sono simili a tutti i metodi di impregnazione di Golgi. Il fatto che solo un piccolo numero di cellule sia macchiato è un vantaggio. Il piccolo numero di cellule impregnate consente la visualizzazione dell'intera cella in tre dimensioni. Lo svantaggio del metodo Golgi è che non è chiaro quale sottoinsieme di cellule sia etichettato. Pertanto, negli esperimenti, si deve presumere che le cellule impregnate sia per i gruppi di controllo che per quelli sperimentali siano le stesse. Anche se questo metodo si traduce in una colorazione di gran lunga migliore rispetto ai metodi precedenti, ci sono sempre cellule che non possono essere analizzate perché sono coperte da detriti, una bolla d'aria o hanno dendriti rotti.
In conclusione, il metodo rapido golgi qui descritto è un metodo veloce e sicuro per l'etichettatura coerente e riproducibile dei neuroni che può essere utilizzato per qualsiasi regione del cervello. Oltre a etichettare le cellule nella corteccia prefrontale17,18 e nell'ippocampo 10,12,19, è stato utilizzato anche nell'amigdala 20, nel cervelletto21 e nella corteccia22. Supponendo che si abbia familiarità con l'anatomia e si possano identificare rapidamente le cellule, il conteggio manuale della densità della colonna vertebrale può fornire un risultato rapido, ma non fornisce informazioni sui sottotipi dendritici che richiedono metodi di analisi più sofisticati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da Sacred Heart University Undergraduate Research InitiativeGrants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
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