Summary
يصف البروتوكول الحالي طفرة M213L واحدة في Gja1 تحتفظ بجيل Connexin43 كامل الطول ولكنها تمنع ترجمة الشكل الأصغر GJA1-20k المترجم داخليا.
Abstract
يتيح نظام تحرير الجينات CRISPR-Cas9 ، القائم على آليات إصلاح الجينوم ، توليد نماذج الفئران المعدلة وراثيا بسرعة وسهولة أكبر مقارنة بإعادة التركيب المتماثل التقليدي. يعد نظام CRISPR-Cas9 جذابا بشكل خاص عند الرغبة في حدوث طفرة أحادية النقطة. يتم ترميز بروتين وصلة الفجوة ، Connexin 43 (Cx43) ، بواسطة الجين Gja1 ، الذي يحتوي على إكسون ترميز واحد ولا يمكن ربطه. ومع ذلك ، فإن Gja1 لا ينتج فقط بروتين Cx43 كامل الطول ولكن ما يصل إلى ستة أشكال متساوية مبتورة من N-terminus من خلال عملية تعرف باسم الترجمة الداخلية ، نتيجة لبدء الترجمة الريبوسومية في مواقع بدء AUG الداخلية (Methionine). GJA1-20k هو الشكل المتماثل المبتور الأكثر شيوعا من Cx43 الذي بدأ في كودون AUG في الموضع 213 من Gja1 mRNA. نظرا لأن البقايا 213 تحدث في نهاية المجال الأخير عبر الغشاء من Cx43 ، فإن GJA1-20k هو فعليا ذيل C-terminus 20 kDa Cx43 كبروتين مستقل. حدد الباحثون السابقون ، في الخلايا ، أن الدور الحاسم ل GJA1-20k هو تسهيل الاتجار بوصلات الفجوة Cx43 كاملة الطول إلى غشاء البلازما. لدراسة هذه الظاهرة في الجسم الحي ، تم إنشاء فأر متحور مع طفرة نقطة Gja1 التي تحل محل ATG (ميثيونين) في بقايا 213 مع TTA (Leucine ، طفرة M213L). نتيجة M213L هي أن Gja1 mRNA و Cx43 كامل الطول لا يزالان يتم إنشاؤهما ، ومع ذلك يتم تقليل ترجمة Gja1-20k بشكل كبير. يركز هذا التقرير على اختيار موقع إنزيم التقييد لتطوير نموذج فأر واحد متحور من الأحماض الأمينية (Gja1 M213L / M213L). يصف هذا البروتوكول الفئران المعدلة وراثيا بواسطة نظام CRISPR-Cas9 والتنميط الجيني السريع من خلال الجمع بين PCR وعلاجات إنزيم التقييد.
Introduction
تم اقتطاع Connexin 43 كامل الطول (Cx43) و N-terminus isoform ، GJA1-20k ، مشفرا بواسطة نفس GJA1 mRNA ولكن باستخدام كودونات بدء مختلفة1 لبدء الترجمة. تحدث ترجمة Cx43 عند أول كودون بدء AUG ، بينما تبدأ ترجمة GJA1-20k في AUG عند البقايا 213. وقد وجد سابقا أن GJA1-20k له أدوار أساسية للاتجار الكامل ب Cx43 ، وتثبيت الأكتين ، وتنظيم مورفولوجيا الميتوكوندريا في المختبر1،2،3.
لفهم دور GJA1-20k في الجسم الحي ، تم إنشاء نموذج الماوس "بالضربة القاضية" GJA1-20k الذي احتفظ بالقدرة على إنشاء Cx43 كامل الطول. كان النهج هو استخدام نظام CRISPR-Cas9 لاستبدال البقايا المفردة عند 213 من الميثيونين (M) إلى الليوسين (L) (Gja1 M213L/ M213L)4. تقلل الطفرة الداخلية من M إلى L بشكل كبير من احتمال حدوث الترجمة الداخلية ولكنها تحتفظ بترجمة ووظيفة البروتين الكامل الطول4. نظرا لأن النوع البري (WT) والأليل المتحور لهما أحجام متطابقة ومنتجات mRNA شبه متطابقة ، فهناك صعوبة كبيرة في تأكيد النمط الوراثي في الفئران. يمكن لتسلسل الحمض النووي تحديد الطفرة ولكنه مكلف للغاية ويستغرق وقتا طويلا للاستخدام الروتيني. بشكل عام ، تم إنشاء العديد من طرق التنميط الجيني الأسرع ، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-PCR) ، والربط المصغر للتسلسل ، وتحليل الذوبان عالي الدقة ، ونظام الطفرة الحرارية للتضخيم رباعي التمهيدي PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطرق البديلة خطوات متعددة وموارد فريدة و / أو العديد من مجموعات التمهيدي المحددة التي يمكن أن تحفز منتجات PCR غير محددة.
يقدم هذا البروتوكول نهجا مفصلا لاستهداف الجينات وتحريرها بواسطة CRISPR-Cas9 لإنشاء طفرة واحدة من الأحماض الأمينية ، ويتم تقديم التنميط الجيني السريع لتأكيد الطفرة. يتضمن تحديد النمط الوراثي الاستخدام الإبداعي لإنزيمات التقييد باستخدام مجموعة واحدة فقط من الاشعال لتحديد الجين المستهدف. تتم إحالة القراء إلى المرجع4 لمراقبة التأثير الكهروفسيولوجي العميق للموت القلبي المفاجئ الناجم عن طفرة استبدال Gja1 M213L/ M213L المتبقية التي لا تزال تولد بروتينا كامل الطول ولكنها تفشل في توليد شكل اقتطاع أصغر مترجم داخليا. سيساعد هذا البروتوكول في جعل نماذج الفئران الأخرى تستخدم طفرة نقطية لتقليل الترجمة الداخلية لشكل متساوي الأهمية مع الاحتفاظ بتعبير البروتين الكامل الطول الداخلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
"تمت الموافقة على جميع بروتوكولات رعاية الحيوانات ودراستها من قبل لجان رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مركز Cedars-Sinai الطبي وجامعة يوتا. تم استخدام إناث الفئران C57BL/6J التي تم الحصول عليها من مصادر تجارية في عمر 8-9 أسابيع (انظر جدول المواد) في التجارب.
1. التحضير لاستهداف الجينات
- حدد التسلسل المستهدف للدليل حول ترميز موقع الطفرة المستهدفة M213 باستخدام خوارزمية الويب CRISPOR 4,9,10 (انظر جدول المواد).
ملاحظة: تم اختيار تسلسل دليل مكون من 20 قاعدة (ATTCAGAGCGAGAGACACCA) ، في الشريط المقابل من تسلسل ترميز GJA1 ، مع درجة MIT11 من 62 حيث يقع موقع الانقسام المحتمل بعد 16 قاعدة في اتجاه مجرى الكودون المراد تحويرها (ATG) (الشكل 1 ؛ يظهر تسلسل crRNA بأكمله في الجدول 1). - توليف crRNA و tracrRNA التي تتفاعل مع Cas9 كدليل RNA12.
ملاحظة: على الرغم من أن درجة معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا للحمض النووي الريبي المرشد هي 62 ، إلا أنه لا يوجد سوى طفرة واحدة محتملة خارج الهدف مع أربعة حالات عدم تطابق على بعد أكثر من 12 قاعدة من PAM. لذلك ، يعتبر هذا الحمض النووي الريبي الدليل آمنا. - تصميم أوليغو مانح مكمل لتسلسل الدليل لإدخال استبدال واحد للأحماض الأمينية (ATG إلى TTA; M213L) مع 60 و 48 قاعدة تماثل الأسلحة في الجانبين 5 'و 3' ، على التوالي.
ملاحظة: يتضمن هذا الأوليغو المانح طفرة نقطية لتعطيل PAM (AGG إلى ACG) عن طريق إدخال طفرة صامتة (TCC إلى TCG; S217S) لتجنب إعادة التحرير بعد الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)13 لإدخال الطفرات المقصودة (الشكل 1 والجدول 1). - استخدم كلوريد الصوديوم (التركيز النهائي 200 مللي متر) لترسيب 10 ميكروغرام من الأوليغوس لتقليل انتقال الملح إلى مخزن مؤقت للحقن المجهري المضاد للنواة (10 ملليمتر من Tris-HCl ، والرقم الهيدروجيني 7.5 ؛ 0.1 mM من EDTA ، و 100 mM من كلوريد الصوديوم بدون spermine و spermidine14).
ملاحظة: لا تغسل حبيبات الحمض النووي بالإيثانول بنسبة 70٪ حيث يمكن إذابة الكريات في المحلول. - امزج 50 نانوغرام/ميكرولتر من أوليغو المانح، و60 نانوغرام/ميكرولتر من مزيج crRNA/tracrRNA (نسبة مولار 1:1) (من الخطوة 1.2)، و50 نانوغرام/ميكرولتر من بروتين eSpCas9 (انظر جدول المواد) لصنع خليط كريسبر في الحجم النهائي 20 ميكرولتر (الجدول 2). قلل من تركيز الأوليغو المتبرع به إذا لوحظت سمية عالية (على سبيل المثال ، 25 نانوغرام / ميكرولتر).
2. تحريض الإباضة الفائقة ، وحصاد البيض ، والحقن المجهري النووي لمزيج كريسبر ، وفحص الكيسة الأريمية
ملاحظة: يتبع هذا الإجراء بروتوكول عام14 تم نشره مسبقا.
- حقن 5 وحدات دولية من PMSG (موجهة الغدد التناسلية في مصل الفرس الحوامل) (انظر جدول المواد) في 100 ميكرولتر من الماء المعقم إلى 5-10 فئران في عمر 8 أسابيع من خلال نهج داخل الصفاق في حوالي الساعة 3:00 ص.m (اليوم الأول).
- حقن 5 وحدة دولية من موجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (hCG) (انظر جدول المواد) في 100 ميكرولتر من الماء المعقم للمتبرعين بالبيض عن طريق نهج داخل الصفاق 46-48 ساعة بعد حقن PMSG (اليوم 3). إعداد 1: 1 تربية مع الذكور مسمار.
- حصاد البيض المخصب في وسط M2 مع الهيالورونيداز ، وغسل ثلاث مرات في 100 ميكرولتر من M2 المتوسطة حوالي الساعة 10:00 صباحا .m ، ثم الاحتفاظ بها في mWM15 أو KSOM16 متوسطة (اليوم 4) (انظر جدول المواد).
- أدخل خليط كريسبر (الخطوة 1.3) في أجنة مرحلة الخلية الواحدة التي تم حصادها من الفئران عن طريق الحقن المجهري النووي14 في 100 ميكرولتر من M2 المغطى بزيت البارافين في طبق بلاستيكي على مجهر مقلوب مع بصريات معززة للتباين في وقت مبكر إلى وقت متأخر من بعد الظهر (فيديو 1).
ملاحظة: تم إجراء الحقن المجهري النووي لخليط كريسبر على أجنة مرحلة خلية واحدة في 14-16 ساعة بعد الجماع (p.c). تم استزراع الأجنة المحقونة في حاضنة 5٪ CO2 لبضع ساعات ونقلها جراحيا في 18-20 h p.c. إلى الفئران ICR المتلقية التي كان لديها قابس الجماع في نفس الصباح. - نقل 20-30 من الأجنة ثنائية الخلايا إلى كل متلق لإنتاج مؤتلفة.
ملاحظة: اتبع البروتوكول العام14 أو استزرع تلك الأجنة في وسط mWM أو KSOM لمدة 4 أيام للتحقق من الكفاءة وفحص السمية. تكون سمية خليط كريسبر مقبولة عندما يصل ثلث الأجنة المحقونة على الأقل في وقت مبكر إلى مرحلة الكيسة الأريمية الموسعة بالكامل مع العديد من المؤتلفات فيما بينها. في الوقت نفسه ، يصل أكثر من 90٪ من الأجنة غير المتلاعبة إلى نفس مرحلة الكيسة الأريمية في ثقافة موازية. اتبع الخطوة 2.6-2.9 لفحص الكيسات الأريمية وهو أمر غير ضروري ولكن يمكن القيام به إذا فضل تحديد معدل نجاح HDR. - التقط بشكل فردي الكيسة الأريمية المبكرة إلى الموسعة بالكامل مع 2 ميكرولتر من وسط الاستزراع باستخدام طرف ماصة ناعم موصول مع ماصة دقيقة في أنابيب PCR واحدة (اليوم 8; فيديو 2).
- كيسات الأريم Lyse في 8 ميكرولتر من خليط الهضم (نفس الخطوة 3.2 ؛ انظر جدول المواد) ومعالجتها عند 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبرد إلى 4 درجات مئوية للتخزين. استخدم 2 ميكرولتر من الليزات كقالب ل PCR في خليط PCR إجمالي 15 ميكرولتر (الخطوة 3).
- فحص فعالية HDR بواسطة الرحلان الكهربائي هلام الأغاروز17 من عينات PCR بعد تقييد الهضم مع NlaIII (الخطوة 3-5).
- تأكد من حالة إعادة التركيب المستهدفة عن طريق تسلسل 668 bp amplicon17 في المؤسسين والنسل اللاحق لتأكيد سلامة الطفرة.
3. استخراج الحمض النووي
ملاحظة: تم استخدام الفئران في اليوم 10 بعد الولادة لهذه التجربة بسبب الموت المفاجئ للفأر GJA1-20k بالضربة القاضية بعد حوالي 2-4 أسابيع من الولادة4. ويمكن أيضا تطبيق بروتوكول أكثر عمومية في أعقاب التقرير18 الذي سبق نشره.
- قطع 1-3 مم من إصبع القدم أو طرف الذيل باستخدام مقص نظيف ونقله إلى أنبوب PCR 8-Strip سعة 0.2 مل. لتجنب التلوث بين عينات أصابع القدم أو الذيل، استخدم مقص تم تنظيفه مسبقا أو شفرة واحدة لكل ماوس أو نظف قبل كل عينة باستخدام 70٪ إيثانول أو 10٪ مبيض. إذا كان الذيل ينزف بعد أخذ العينات ، فقم بالضغط لفترة وجيزة باستخدام الشاش لوقف النزيف. تخزين عينات الذيل في -20 درجة مئوية حتى استخراج لمدة تصل إلى حوالي أسبوع.
- أضف محلول تحلل الأنسجة (انظر جدول المواد) في أنبوب 100 ميكرولتر / أنبوب واخلطه جيدا ، متبوعا بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2200 × g لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة). تأكد من غمر عينات الذيل في المحلول.
- اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري تم تعيينه بواسطة البرنامج التالي ؛ 75 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (تحلل الأنسجة) ، 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (تعطيل) ، و 4 درجات مئوية (عقد). قم بتخزين الأنسجة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع إذا تعذر إجراء PCR على الفور.
4. تضخيم الحمض النووي بواسطة PCR
- قم بإعداد محلول PCR يحتوي على 5 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكليز ، و 0.75 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من الاشعال الأمامي والخلفي ، و 7.5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي PCR (انظر جدول المواد) لكل عينة في أنبوب PCR جديد (انظر الجدول 1 للحصول على تسلسلات التمهيدي). إذا كان هناك عدة عينات ، فقم بقياس المحتويات إلى aliquot 14 ميكرولتر لكل أنبوب.
- أضف 1 ميكرولتر من محللات الأنسجة إلى محلول PCR المعد في الخطوة 3.1. احرص على عدم لمس الذيل.
- اخلطي جيدا وقومي بالدوران باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2200 × جم لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة).
- اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري تم تعيينه بواسطة البرنامج المذكور أدناه. تخزين منتجات PCR في 4 درجة مئوية لمدة 1-2 أشهر أو ~ 1 سنة في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق (الخطوة 1، التخصيص الأولي)، و95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية (الخطوة 2، التمسخ)، و60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية (الخطوة 2، التلدين)، و72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (الخطوة 2، التمديد)، وتكرار الخطوة 2 لمدة 35 دورة، و72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (الخطوة 3، التمديد النهائي)، و4 درجات مئوية (الخطوة 4، الانتظار).
5. الحضانة مع إنزيم تقييد
- قم بتحضير محلول الإنزيم الذي يحتوي على 7 ميكرولتر من H 2 O الخالي من النوكليز ، و2ميكرولتر من المخزن المؤقت 10x CutSmart ، و 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد NlaIII (انظر جدول المواد). إذا كان هناك عدة عينات ، فاضرب كل محتوى لجعل الخليط و aliquot 10 ميكرولتر لكل أنبوب.
- أضف 10 ميكرولتر من منتج PCR الذي تم الحصول عليه في الخطوة 3 إلى محلول الإنزيم لكل أنبوب.
- اخلطي جيدا وقومي بالدوران باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (2200 × جم لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة).
- اضبط الأنابيب على جهاز تدوير حراري أو كتلة حرارية تم تعيينها بواسطة البرنامج المذكور أدناه. قم بتخزين المنتج بعد الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أشهر أو ~ سنة واحدة عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة (2 ساعة على الأقل ؛ قد يؤدي وقت الحضانة القصير إلى انقسام غير كاف) و 4 درجات مئوية للاحتفاظ.
6. الكشف عن نطاق الحمض النووي
- تحضير 1.5٪ هلام الأغاروز يحتوي على وصمة عار هلام الحمض النووي للرحلان الكهربائي.
- أضف 0.75 جم من الأغاروز في 50 مل من المخزن المؤقت 1x TAE متبوعا بالخلط والحرارة في الميكروويف حتى يذوب الأغاروز تماما. بعد التبريد ، أضف 5 ميكرولتر من بقعة الحمض النووي واخلطها بلطف.
- تصب في قالب الجل (25 مل لكل قالب) وتسمح للهلام بالتصلب. للحصول على دقة وفصل أفضل ، قم بزيادة تركيز الأغاروز إلى 2.5٪ -4٪ حسب الحاجة.
- تحميل 10 ميكرولتر من منتج PCR المهضوم إلى البئر. امزج مخزن مؤقت للتحميل بمعدل 6 أضعاف، إذا لزم الأمر.
- قم بتشغيل الجل بجهد 100 فولت لمدة 35 دقيقة.
ملاحظة: قد تحتاج هذه المعلمات إلى التحسين. - صورة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 302 نانومتر).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ينتج نظام تحرير الجينات CRISPR/Cas9 طفرة ATG إلى TTA وطفرة TCC إلى TCG صامتة عند 56,264,279 إلى 56,264,281 وعند 56,264,291 إلى 56,264,293 على كروموسوم الفأر 10، أو عند 869 إلى 871 و881 إلى 883 على Gja1 mRNA، على التوالي. وينتج عن هذه الطفرة طفرة ميثيونين 213 إلى لوسين (M213L) على بروتين GJA1 وطفرة TTC إلى TTG تعطل تسلسل PAM القريب لتجنب إصدار الجينات غير المرغوب فيه (الشكل 1). تم وصف تفاصيل الطفرة في تقرير سابق4.
لتحليل الأنماط الجينية المناسبة ، يجب هضم منتجات PCR بواسطة إنزيم التقييد "NlaIII" قبل الرحلان الكهربائي لهلام agarose (الشكل 2 ، الخطوة 4). وكما هو مبين في الشكل 2 ألف، سيتم تقطيع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري (WT) إلى منتجين مختلفين من زوج القاعدة (227 نقطة أساس و441 نقطة أساس). وعلى النقيض من ذلك، ستكون منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الأليل المتحور سليمة (668 نقطة أساس) بسبب عدم وجود موقع التعرف على NlaIII عن طريق الطفرة (الشكل 2B). يمكن إجراء الرحلان الكهربائي العام للأغاروز باستخدام منتجات PCR المهضومة (الخطوة 5). تشير النطاقات المحددة في هلام الأغاروز إلى كل نمط وراثي (WT ، النوع البري. هيت ، متغاير الزيجوت. Hm ، متماثل الزيجوت). بسبب التقييد المذكور أعلاه ، ينتج عن كل نمط وراثي عدة نطاقات بأحجام مختلفة (الشكل 2C). وستكون النطاقات نطاقين في WT (227 نقطة أساس و441 نقطة أساس)، وثلاثة نطاقات في Het (227 نقطة أساس و441 نقطة أساس و668 نقطة أساس)، ونطاق واحد في Hm (668 نقطة أساس)، على التوالي. وفقا لتصوير الجل باستخدام إنزيم تقييد واحد ، يمكن تمييز الأنماط الجينية المناسبة للفئران.
في تجربتنا ، تم إنتاج واحد وعشرين مؤسسا في البداية ، تسعة منهم كانوا غير متجانسة الزيجوت أو الفسيفساء. توفي اثنان من أصل تسعة مؤسسين قبل أن يكبروا حتى سن التكاثر ، على الأرجح بسبب الفسيفساء عالية المحتوى للخلايا الجسدية المتحولة ثنائية الأليل. تم إنشاء خطين متحولين مستقلين في وقت لاحق من المؤسسين السبعة المتبقين عن طريق العبور إلى الفئران C57BL / 6J من النوع البري لمدة جيلين على الأقل. نظرا لأن الطفرة المستهدفة قاتلة عندما تكون متماثلة الزيجوت ، كان علينا الحفاظ على الخط كغير متجانس الزيجوت لمزيد من التخفيف من الطفرات المحتملة خارج الهدف. تم إنتاج تجريبية متماثلة الزيجوت عن طريق تقاطع الأجيال اللاحقة.
وتجدر الإشارة إلى أن السمية الجنينية العالية نسبيا مع الأوليغوس المانحة عند 50 نانوغرام/ميكرولتر كانت من ذوي الخبرة لحقن الأوليغوس المانحة في الأجنة. ومع ذلك ، فإن تركيز المتبرع البالغ 12.5 نانوغرام / ميكرولتر لم يحفز إعادة التركيب المستهدفة في الجراء الناتجة. بالإضافة إلى ذلك ، وجد أن هطول الأمطار المضافة للإيثانول من oligos ساعد على إزالة الملوثات وسمح بتحريض تحرير الجينوم الفعال والمستهدف. لاحظ أن غسل حبيبات الحمض النووي بنسبة 70٪ من الإيثانول يذوب الكريات في محلول. لذلك ، تم استخدام كلوريد الصوديوم عند التركيز النهائي 200 mM لترسيب 10 ميكروغرام من oligos لتقليل ترحيل الملح إلى مخزن مؤقت للحقن المجهري pronuclear . تمت محاولة حقن الاختبار مع تحليل الكيسة الأريمية باستخدام 50 أو 25 نانوغرام / ميكرولتر من أوليجوس المانحة مع هطول الأمطار الإيثانول. وكان معدل نجاح كل حالة 76.9 في المائة (10 من أصل 13 عينة بسعة 50 نانوغرام/ميكرولتر) و 25.0 في المائة (3 من أصل 12 عينة بسعة 25 نانوغرام/ميكرولتر) (الشكل 3 ألف إلى جيم). على الرغم من أن 50 نانوغرام / ميكرولتر من أوليغو مع هطول الأمطار الإيثانول لا تزال سامة إلى حد ما ، إلا أن العديد من البيض يحتاج إلى حقن ، وتم إنتاج المؤتلفات بمعدل نجاح مرتفع. لذلك ، تم أخيرا حقن 50 نانوغرام / ميكرولتر من أوليجوس المتبرع مع هطول الأمطار الإيثانول والحصول على الحيوانات المؤسسة بمعدل نجاح 50.0 ٪ (16 من 32 الجراء لديهم إعادة التركيب بما في ذلك 21 الناجين و 11 وفاة بعد الولادة). تم استخدام اثنين من الحيوانات المؤسسة التي لديها انتقال جرثومي لطفرة موحدة أو طفرة أحادية الأليلية أو متطابقة مع انتقال مستقر مؤكد عن طريق التسلسل لإنشاء خطوط مستقلة. الإجماع هو أن العبور الخلفي لجيلين مع الحيوانات البرية واستخدام بروتين Cas9 المحسن الدقة يلغي الأحداث الرئيسية خارج الاستهداف. لا يمكن تمييز عدد هذه الأحداث إحصائيا عن المعدل الأساسي للطفرات الجديدة 19,20.
الحيوانات ذات الأنماط الجينية غير المرغوب فيها (النوع البري أو المؤتلفات غير السليمة) المستخدمة في التجارب وفي ختام الدراسة تم قتلها الرحيم عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون2 متبوعا بخلع عنق الرحم وفقا لبروتوكول IACUC.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لاستهداف الجينات بواسطة CRISPR/Cas9 . (A) التسلسلات المستهدفة لإعادة تركيب المتجانسات. تظهر الأحماض الأمينية المكونة من حرف واحد بين التسلسلات. تشير الإبرازات الملونة إلى ذراع التماثل (رمادي) ، كودون طفرة (أخضر) ، تسلسل PAM (برتقالي) ، وتسلسل هدف gRNA (أزرق). يشير السهم الأزرق إلى gRNA. يتم تسطير موقع تقييد NlaIII بواسطة خط منقط. (ب) أدت التسلسلات التخطيطية ل WT والأليل المتحور وأوليغو المتبرع للطفرة النقطية إلى طفرة M213L. TCC إلى TCG هي طفرة صامتة لتعطيل PAM غير المرغوب فيه.
الشكل 2: منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التخطيطي وموقع تقييد WT والأليل المتحور (A,B) مخطط تفاعل البوليميراز المتسلسل والهضم بواسطة NlaIII. تعمل الاشعال على تضخيم 668 نقطة أساس من الحمض النووي Gja1 حول موقع الطفرة. تم هضم منتجات WT أليل PCR إلى حجمين مختلفين بواسطة NlaIII. في المقابل ، لا يتم هضم الأليل المتحور ويحافظ على منتجات PCR سليمة. (ج) تشير الصورة التمثيلية لهلام الأغاروز إلى WT والأليل المتحول. كان لكل نمط وراثي للفأر حجم نطاق محدد. WT (حارة 1 و 3 و 5) ، Het (حارة 2) ، و Hm (حارة 4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كفاءة إعادة التركيب في جرعتين مختلفتين من الأوليغوس المانحة في خليط كريسبر. (أ) نتائج التنميط الجيني للمورولا أو الكيسة الأريمية المحقونة بجرعات مختلفة (25 أو 50 نانوغرام/ميكرولتر) من أوليغوس المتبرع بها تظهر النوع البري (WT؛ حارة #10، 12، 14)، غير متجانسة/فسيفساء (هيت/فسيفساء؛ حارة رقم 1، 2، 3، 6، 8، 9، 11 ، و 13) ، متماثل الزيجوت (hom ؛ حارة # 4 و 5) أو لم يتم تضخيمها (حارة # 7). تم تحميل التحكم الإيجابي من النوع البري و H2O كتحكم سلبي بين الحارة # 17 و # 18. (ب-د) تمثل المخططات الدائرية كفاءة إعادة تركيب مخاليط كريسبر في جرعتين مختلفتين من الأوليغوس المانحة (B,C) والحيوانات المؤسسة التي يتم حقنها ب 50 نانوغرام/ميكرولتر من أوليغوس المتبرع (D). لاحظ أن 11 من أصل 32 حيوانا ولدوا إما قتلوا من قبل الأمهات أو ماتوا قبل الفطام. تم استبعاد العينات التي فشلت في تضخيم PCR في حساب كفاءة إعادة التركيب. ويشار إلى معدل النمط الوراثي الفردي من جميع العينات في الجدول 3 والجدول 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | تسلسل | التعليقات | |||
| crRNA | 5' أوكاغاغغاغاغاكاكاغو UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' |
يشير التسطير إلى تسلسل هدف CRSPR | |||
| أوليغو دونار الحمض النووي | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTTCT TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCGCTCT GAATATCATTGAGCTCTTCTATGTCTTCTTC 3' |
يشير التسطير إلى الكودونات المتحورة. قبضة 60 نقطة أساس قبل TTA mutaion و 48 نقطة أساس بعد TCG mutaion هي ذراع التماثل | |||
| التنميط الجيني التمهيدي إلى الأمام | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| التنميط الجيني التمهيدي عكس | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
الجدول 1: معلومات التسلسل.
| مكون | حلول الأسهم | مبلغ | التركيز النهائي |
| أوليغو مانح | 1μg/μL في H2O الخالي من الرناس | 1.0 ميكرولتر | 50 نانوغرام/ميكرولتر |
| GJA1 crRNA | 1μg/μL في H2O الخالي من الرناس | 0.4 ميكرولتر | 20 نانوغرام/ميكرولتر |
| tracrRNA | 1μg/μL في H2O الخالي من الرناس | 0.8 ميكرولتر | 40 نانوغرام/ميكرولتر |
| بروتين eSpCas9 | 1μg/μL في H2O الخالي من الرناس | 1.0 ميكرولتر | 50 نانوغرام/ميكرولتر |
| مخزن مؤقت للحقن خال من الحمض النووي الريبي | 0.1 ملليمتر EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0 | 16.8 ميكرولتر | |
| 10 ملليمتر تريس هيدروكلورايد درجة الحموضة 7.5 | |||
| 100 مللي متر كلوريد الصوديوم | |||
| الحجم الإجمالي | 20.0 ميكرولتر |
الجدول 2: وصفة خليط كريسبر.
| حارة # (الشكل 3) | المتبرع أوليغو conc. | حالة | لم يتم تضخيمه | النوع البري | هيت / فسيفساء | هوم | ملاحظه |
| 1 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | حذف | |||
| 2 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | ||||
| 3 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | ||||
| 4 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هوم | ||||
| 5 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هوم | ||||
| 6 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | حذف | |||
| 7 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | غير متوفر | ||||
| 8 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | ||||
| 9 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | ||||
| 10 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | النوع البري | ||||
| 11 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | ||||
| 12 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | النوع البري | ||||
| 13 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | هيت / فسيفساء | إدخال | |||
| 14 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | النوع البري | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | غير متوفر | ||||
| 16 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | غير متوفر | ||||
| 17 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | غير متوفر | ||||
| 18 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | غير متوفر | ||||
| 19 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | النوع البري | ||||
| 20 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | غير متوفر | ||||
| 21 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | النوع البري | ||||
| 22 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | مورلي | النوع البري | ||||
| 23 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | غير متوفر | ||||
| 24 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | النوع البري | ||||
| 25 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | هيت / فسيفساء | ||||
| 26 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | النوع البري | ||||
| 27 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | غير متوفر | ||||
| 28 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | النوع البري | ||||
| 29 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | النوع البري | ||||
| 30 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | هيت / فسيفساء | الإدراج/الحذف | |||
| 31 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | النوع البري | ||||
| 32 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | هيت / فسيفساء | إدخال | |||
| 33 | 25 نانوغرام/ميكرولتر | الكيسه | النوع البري | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
الجدول 3: نتائج التنميط الجيني من المورولا والكيسة الأريمية.
| الحيوان # | المتبرع أوليغو conc. | حالة | لم يتم تضخيمه | النوع البري | هيت / فسيفساء | هوم | ملاحظه |
| د1 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | النوع البري | ||||
| د2 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هيت / فسيفساء | ||||
| د3 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هيت / فسيفساء | حذف | |||
| د4 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | النوع البري | ||||
| د5 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هيت / فسيفساء | ||||
| د6 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | النوع البري | ||||
| د7 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هيت / فسيفساء | ||||
| د8 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هيت / فسيفساء | ||||
| 34 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | ||||
| 35 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 36 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 37 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | تستخدم كخط مستقل | |||
| 38 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 39 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 40 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 41 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | ||||
| 42 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 43 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 44 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 45 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| د1 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هوم | ||||
| د2 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | النوع البري | ||||
| د3 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو ميت | هيت / فسيفساء | ||||
| 46 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | ||||
| 47 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | إدخال | |||
| 48 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | إدخال | |||
| 49 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | ||||
| 50 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 51 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | تستخدم كخط مستقل | |||
| 52 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 53 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | هيت / فسيفساء | الإدراج/الحذف | |||
| 54 | 50 نانوغرام/ميكرولتر | جرو حي | النوع البري | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
الجدول 4: نتائج التنميط الجيني من الحيوانات المؤسسة.
فيديو 1: حقن كريسبر للأجنة. يتم حقن خليط كريسبر في أجنة مرحلة 1 خلية الموصوفة في الخطوة 2.4. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
فيديو 2: التقاط الكيسات الأريمية. الفيديو التمثيلي الذي يظهر الكيسة الأريمية تلتقط في الخطوة 2.6. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج الفأر المعدل جينيا هو نهج شائع لفهم وظيفة الجينات. ومع ذلك ، نظرا لأن الشكل المتماثل المترجم داخليا GJA1-20k مترجم من نفس Gja1 mRNA مثل Cx43 كامل الطول ، فقد تم وضع استراتيجية إبداعية للاحتفاظ بتعبير Cx43 كامل الطول مع قمع تعبير GJA1-20k. يعتمد النهج على طفرة في كودون البدء الداخلي ل GJA1-20k. مع طفرة نقطة واحدة ، تم تحويل M213 إلى L على Gja1 mRNA ، والتي نجحت في قمع تعبير GJA1-20k ولكنها احتفظت بتعبير Cx43 كامل الطول4.
ومع ذلك، فإن الطفرة النقطية لموقع بدء ترجمة داخلي واحد تمثل صعوبة أخرى: تحديد الأنماط الوراثية للفئران. استبدال بقايا واحدة صغير جدا لصنع الاشعال محددة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أليلات WT والطفرات لها أزواج قاعدة متطابقة. تمت إضافة خطوة أخرى إلى بروتوكول التنميط الجيني لحل هذه المشاكل. منذ أن تم التعرف على كودون البداية من GJA1-20k (موقع الطفرة المستهدفة) بواسطة إنزيم التقييد ، NlaIII ، تم تحور الموقع الذي لم يتم التعرف عليه بواسطة NlaIII (الشكل 1; CATG إلى CTTA). بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم الاشعال لإنشاء منتج PCR لا يحتوي على أي موقع مناسب آخر NlaIII. تم إنشاء بروتوكول التنميط الجيني المناسب لخط الفأر المتحور بإضافة خطوة هضم الإنزيم مع إنزيم التقييد. بشكل عام ، يتم هضم الإنزيم عن طريق الحضانة قصيرة الوقت (0.5-2.0 ساعة عند 37 درجة مئوية) ؛ يوصى بالحضانة بين عشية وضحاها (~ 16 ساعة) لهضم منتج PCR بالكامل بالكامل. يؤدي إدخال الطفرة في التسلسل المستهدف إلى سوء التعرف بين WT والأليلات المتحولة. لذلك ، يوصى بالحضانة بين عشية وضحاها من أجل هضم كاف في هذا البروتوكول ما لم يكن إنزيم التقييد المفضل لديه نشاط النجم21.
يهدف المشروع الحالي إلى تعطيل موقع بدء الترجمة الثاني عن طريق تغيير ATG (ميثيونين) إلى TTA (Leucine). NlaIII هو إنزيم تقييد مناسب للفحص السريع لأنه يتعرف على CATG في موقع الاستهداف. غالبا ما يرتبط السيتوزين (C) بتسلسل KOZAK مباشرة قبل موقع بدء الترجمة. NcoI (C / CATGG) و NdeI (CA / TATG) هما إنزيمات تقييد أخرى متعددة الاستخدامات للفحص في هذه المنطقة إذا كانت هناك حاجة إلى استخدام كودونات بديلة لإنشاء / حذف مواقع التقييد هذه. إذا لم يكن إدخال الطفرات الصامتة متساهلا للفحص القائم على موقع التقييد ، فستكون هناك حاجة إلى تسلسل العينات الفردية22,23. في هذا المشروع ، كانت إعادة التركيب المستهدفة فعالة للغاية.
يمكننا خط الماوس المتحور M213L هذا من تحليل وظيفة GJA1-20k. في الآونة الأخيرة ، باستخدام خط الماوس هذا ، تم تحديد أن GJA1-20k ضروري للاتجار وتشكيل تقاطعات فجوة Cx43 كاملة الطول في القلب4. ومن المثير للاهتمام ، أن طفرة M213L متماثلة الزيجوت (Gja1 M213L/ M213L) ، لأنها لا تستطيع توليد GJA1-20k ، تؤدي دائما إلى الموت المفاجئ بعد 2-4 أسابيع من الولادة لأن القلوب المعنية لا تشكل تقاطعات فجوة في القرص المتداخل القلبي. في المقابل ، تكشف طفرة M213L غير المتجانسة عن قرب من وظيفة القلب الطبيعية ، والفئران لها عمر افتراضي مماثل لتلك الخاصة بحيوانات WT4. وقد أظهرت دراسة سابقة في المختبر أيضا أن طفرة M213L تعطل تشكيل تقاطع الفجوة المناسبة1. علاوة على ذلك ، يتم إنقاذ اضطراب تقاطع الفجوة هذا عن طريق نقل GJA1-20k الخارجي. استنادا إلى تكوين وصلة الفجوة الطبيعية في قلب الفأر المتحور M213L غير المتجانس تحت الحالة القاعدية4 والدراسة المختبرية 1 ، يمكن استنتاج أن Cx43 كامل الطول مع طفرة M213L يحافظ على الوظيفة المناسبة كبروتين تقاطع الفجوة.
بالإضافة إلى الدور الأساسي ل GJA1-20k في الاتجار ب Cx43 ، يثري GJA1-20k الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، مما يحفز انشطار الميتوكوندريا الواقي والتكوين الحيوي3،24،25. من حيث وظيفة الميتوكوندريا ، فإن الفئران ذات الطفرة غير المتجانسة الزيجوت من GJA1-20k (Gja1M213L / WT) لديها حساسية شديدة لإصابة نقص التروية / التروية. عند تعرضها لنقص التروية / التروية ، فإن الفئران البالغة Gja1M213L / WT لديها حجم احتشاء أكبر بكثير وميتوكوندريا أكثر تعطلا من نظيراتها WT25.
باختصار ، فإن خط الماوس الجديد الذي يحتوي على طفرة M213L مفيد لتحليل GJA1-20k المترجم داخليا. تجدر الإشارة إلى أن كلا من Cx43 كامل الطول و GJA1-20k الأصغر يتم التعبير عنه في جميع أنظمة أعضاء الثدييات. ومن المتوقع أن تستكشف الدراسات المستقبلية دور GJA1-20k خارج القلب أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم المشروع من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01HL152691 و R01HL138577 و R01HL159983) إلى RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine.
- Mayer, H.
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
