Summary
Den nåværende protokollen beskriver en enkelt M213L mutasjon i Gja1 som beholder connexin43-generasjonen i full lengde, men forhindrer oversettelse av den mindre GJA1-20k internt oversatt isoform.
Abstract
CRISPR-Cas9 genredigeringssystem, basert på genomreparasjonsmekanismer, muliggjør generering av genmodifiserte musemodeller raskere og enklere i forhold til tradisjonell homolog rekombinasjon. CRISPR-Cas9-systemet er spesielt attraktivt når en enkeltpunktmutasjon ønskes. Gapkryssproteinet, Connexin 43 (Cx43), er kodet av gen Gja1, som har en enkelt kodeekson og ikke kan skjøtes. Gja1 produserer imidlertid ikke bare Cx43-protein i full lengde, men opptil seks N-terminus avkortede isoformer ved en prosess kjent som intern oversettelse, resultatet av ribosomal oversettelsesinitiering på interne AUG (Methionine) startsteder. GJA1-20k er den mest genererte avkortede isoformen til Cx43 initiert ved AUG-kodon i posisjon 213 av Gja1 mRNA. Fordi rester 213 oppstår på slutten av det siste transmembrane domenet til Cx43, er GJA1-20k effektivt 20 kDa C-terminus hale av Cx43 som et uavhengig protein. Tidligere etterforskere identifiserte, i celler, at en kritisk rolle i GJA1-20k er å lette smugling av Cx43 gapkryss hemichannels i full lengde til plasmamembranen. For å undersøke dette fenomenet in vivo ble det generert en mutantmus med en Gja1-punktmutasjon som erstatter ATG (Metionin) ved rest 213 med TTA (Leucine, M213L mutasjon). Resultatet av M213L er at Gja1 mRNA og Cx43 i full lengde fortsatt genereres, men oversettelsen av Gja1-20k er betydelig redusert. Denne rapporten fokuserer på å velge begrensningen enzym stedet for å utvikle en aminosyre mutert (Gja1M213L / M213L) musemodell. Denne protokollen beskriver genmodifiserte mus av CRISPR-Cas9-systemet og rask genotyping ved å kombinere PCR og begrensning av enzymbehandlinger.
Introduction
Connexin 43 i full lengde (Cx43) og N-terminus avkortet isoform, GJA1-20k, kodet av samme GJA1 mRNA, men bruker forskjellige start codons1 for å starte oversettelse. Cx43 oversettelse skjer ved første AUG start codon, mens GJA1-20k oversettelse initierer på AUG på rester 213. Det ble tidligere funnet at GJA1-20k har viktige roller for Cx43-handel i full lengde, aktinstabilisering og regulering av mitokondriemorfologi in vitro 1,2,3.
For å forstå rollen som GJA1-20k in vivo, ble det generert en GJA1-20k "knock-out" musemodell som beholdt muligheten til å lage Cx43 i full lengde. Tilnærmingen var å bruke CRISPR-Cas9-systemet til å erstatte enkeltrester ved 213 fra en metionin (M) til en Leucine (L) (Gja1M213L/M213L)4. En intern mutasjon fra M til L reduserer dramatisk sannsynligheten for at intern oversettelse skjer, men beholder oversettelsen og funksjonen til protein4 i full lengde. Fordi den ville typen (WT) og mutert allel har identiske størrelser og nesten identiske mRNA-produkter, er det betydelige vanskeligheter med å bekrefte genotype i musene. DNA-sekvensering kan identifisere mutasjonen, men er for dyr og tidkrevende for rutinemessig bruk. Generelt er det etablert flere raskere genotypingsmetoder, for eksempel Sanntids Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), minisequencing-ligation, høyoppløselig smelteanalyse og tetra-primer forsterkningsrefraktasjonssystem PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Likevel krever disse alternative metodene flere trinn, unike ressurser og / eller flere spesifikke primersett som kan indusere ikke-spesifikke PCR-produkter.
Denne protokollen introduserer en detaljert genmålrettings- og redigeringstilnærming av CRISPR-Cas9 for å skape en enkelt aminosyremutasjon, og rask genotyping presenteres for å bekrefte mutasjonen. Genotypeidentifikasjon innebærer kreativ bruk av restriksjonsenzymer som bare bruker et enkelt sett med primere for å identifisere målgenet. Leserne henvises til referanse4 for å observere den dype elektrofysiologiske effekten av plutselig hjertedød forårsaket av en rest Gja1M213L/M213L substitusjonsmutasjon som fortsatt genererer protein i full lengde, men som likevel ikke klarer å generere en mindre internt oversatt avkortings-isoform. Denne protokollen vil bidra til at andre musmodeller bruker en punktmutasjon for å redusere den interne oversettelsen av en isoform av interesse samtidig som uttrykket av det endogene proteinet i full lengde beholdes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
«Alle dyrepleie- og studieprotokoller ble godkjent av Institusjonell dyrepleie- og brukskomiteer ved Cedars-Sinai medisinske senter og Universitetet i Utah. C57BL/6J kvinnelige mus hentet fra kommersielle kilder ved 8-9 ukers alder (se Materialfortegnelser) ble brukt til forsøkene.
1. Forberedelse for genmålretting
- Velg ledelinjemålsekvensen rundt den målrettede mutasjonsstedkodingen M213 ved hjelp av CRISPOR-nettalgoritmen 4,9,10 (se Tabell over materialer).
MERK: En 20-base guide sekvens (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), i motsatt tråd fra GJA1 koding sekvens, med en MIT score11 av 62 ble valgt der den potensielle spalting området ligger etter 16 baser nedstrøms av codon å bli mutert (ATG) (Figur 1; hele crRNA sekvensen er vist i tabell 1). - Syntetiser crRNA og tracrRNA som samhandler med Cas9 som guide RNA12.
MERK: Selv om MIT-poengsummen til guiden RNA er 62, er det bare en potensiell off-target mutasjon med fire uoverensstemmelser mer enn 12 baser unna PAM. Derfor anses denne guiden RNA som trygg. - Design en donor oligo komplementær til guidesekvensen for å introdusere en enkelt aminosyreerstatning (ATG til TTA; M213L) med 60 og 48 baser homologi armer i henholdsvis 5'- og 3'-sider.
MERK: Denne donor oligo inkluderer en punktmutasjon for forstyrrelse av PAM (AGG til ACG) ved å introdusere en stille mutasjon (TCC til TCG; S217S) for å unngå ny redigering etter CRISPR-homologistyrt reparasjon (HDR)13 for innføring av de tiltenkte mutasjonene (figur 1 og tabell 1). - Bruk NaCl (200 mM endelig konsentrasjon) for å utfelle 10 μg oligos for å minimere saltoverheng i pronukleær mikroinjeksjonsbuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA og 100 mM NaCl uten spermin og spermidin14).
MERK: Ikke vask DNA-pelletsen med 70 % etanol, da pelletsen kan oppløses i oppløsningen. - Bland 50 ng/μL donor oligo, 60 ng/μL crRNA/tracrRNA-blanding (1:1 molarforhold) (fra trinn 1,2) og 50 ng/μL eSpCas9-protein (se Materialtabell) for å lage CRISPR-blanding i sluttvolum 20 μL (tabell 2). Reduser konsentrasjonen av donor oligo hvis høy toksisitet observeres (f.eks. 25 ng/μL).
2. Induksjon av superovulering, høsting av egg, pronukleær mikroinjeksjon av CRISPR-blanding og blastocystscreening
MERK: Denne prosedyren følger en tidligere publisert generell protokoll14.
- Injiser 5 IE PMSG (gravid mare's serum gonadotropin) (se Materialtabellen) i 100 μL sterilt vann til 5-10 mus ved 8 ukers alder ved en intraperitoneal tilnærming ved ca. 3:00 p.m. (dag 1).
- Injiser 5 IE hCG (human chorionisk gonadotropin) (se materialtabellen) i 100 μL sterilt vann til eggdonorene ved en intraperitoneal tilnærming 46-48 timer etter PMSG-injeksjon (dag 3). Sett opp 1:1 avl med stud menn.
- Høst befruktede egg i M2 medium med hyaluronidase, vask tre ganger i 100 μL M2 medium rundt 10:00 a.m., og hold deretter i mWM15 eller KSOM16 medium (dag 4) (se Tabell over materialer).
- Introduser CRISPR-blandingen (trinn 1.3) i 1-cellers stadium embryoer høstet fra musene ved pronukleær mikroinjeksjon14 i 100 μL M2 dekket med parafinolje i en plastfat på et invertert mikroskop med kontrastforbedrende optikk tidlig til sen ettermiddag (video 1).
MERK: Pronukleær mikroinjeksjon av CRISPR-blandingen ble utført på 1-cellers stadium embryoer ved 14-16 h postcoitum (p.c.). De injiserte embryoene ble dyrket i en 5% CO2 inkubator i noen timer og kirurgisk overført ved 18-20 h p.c. til mottaker ICR-mus som hadde en kopieringsplugg samme morgen. - Overfør 20-30 2-cellers embryoer til hver mottaker for å produsere rekombinante dyr.
MERK: Følg den generelle protokollen14 eller kultur disse embryoene i mWM eller KSOM medium i 4 dager for å validere effektiviteten og undersøke toksisitet. Toksisitet av CRISPR-blandingen er akseptabelt når minst en tredjedel av de injiserte embryoene når tidlig til det fullt utvidede blastocyststadiet med flere rekombinanter blant dem. Samtidig når mer enn 90% av umanipulerte embryoer det samme blastocyststadiet i en parallell kultur. Følg trinn 2.6-2.9 for blastcyst screening som ikke er viktig, men kan gjøres hvis du foretrekker å kvantifisere suksessraten for HDR. - Plukk opp tidlig til fullt utvidede blastocyster med 2 μL kulturmedium ved hjelp av en plugget fin pipettespiss med en mikropipetter i enkle PCR-rør (dag 8; Video 2).
- Lyse blastocysts i 8 μL fordøyelsesblanding (samme som trinn 3.2; se Materialbord) og behandle ved 75 °C i 10 minutter, 95 °C i 5 minutter, og avkjøl deretter ned til 4 °C for oppbevaring. Bruk 2 μL av lysatet som mal for PCR i en total 15 μL PCR-blanding (trinn 3).
- Undersøk effekten av HDR ved agarose gelelektroforese17 av PCR-prøvene etter begrensningsfordøyelse med NlaIII (trinn 3-5).
- Bekreft statusen for målrettet rekombinasjon ved å sekvensere 668 bp amplicon17 i grunnleggerne og påfølgende avkom for å bekrefte mutasjonens integritet.
3. DNA-ekstraksjon
MERK: Mus på barseldag 10 ble brukt til dette eksperimentet på grunn av plutselig død av GJA1-20k knock-out mus rundt 2-4 uker etter fødselen4. En mer generell protokoll kan også brukes etter tidligere publisert rapport18.
- Klipp 1-3 mm av tåen eller halespissen med ren saks og overfør den til et 0,2 ml 8-stripet PCR-rør. For å unngå kontaminering blant tå- eller haleprøvene, bruk forhåndsrengjort saks eller ett blad per mus eller rengjør før hver prøve ved hjelp av 70% etanol eller 10% blekemiddel. Hvis halen blør etter prøvetaking, bruk kort trykk med gasbind for å stoppe blødningen. Oppbevar haleprøvene ved -20 °C til ekstraksjonen i opptil en uke.
- Tilsett vevslysoppløsning (se Materialtabell) i et 100 μL/rør og bland godt, etterfulgt av spin-down med en mini-sentrifuge med bordplate (2200 x g i 10 s ved romtemperatur). Forsikre deg om at haleprøvene er nedsenket i løsningen.
- Sett rørene på en termisk syklist satt av følgende program; 75 °C i 10 minutter (vevslys), 95 °C i 5 minutter (inaktivering) og 4 °C (holder). Oppbevar vevslyset ved 4 °C i opptil en uke hvis PCR-er ikke kan utføres umiddelbart.
4. DNA-forsterkning av PCR
- Forbered en PCR-løsning som inneholder 5 μL nukleasefri H2O, 0,75 μL 10 μM forover og bakover Primers, og 7,5 μL PCR master mix (se Materialtabell) per prøve i nytt PCR-rør (se tabell 1 for primersekvenser). Hvis det er flere prøver, skalerer du innholdet til aliquot 14 μL per rør.
- Tilsett 1 μL av vevslyset til PCR-løsningen fremstilt i trinn 3.1. Vær forsiktig så du ikke berører halen.
- Bland godt og spinn ned med en bordplate mini-sentrifuge (2200 x g i 10 s ved romtemperatur).
- Sett rørene på en termisk syklist satt av det nedenfor nevnte programmet. Oppbevar PCR-produktene ved 4 °C i 1-2 måneder eller ~1 år ved -20 °C.
MERK: 95 °C i 3 minutter (trinn 1, Første denaturering), 95 °C i 15 s (trinn 2, Denaturering), 60 °C i 15 s (trinn 2, Annealing), 72 °C i 45 s (trinn 2, Forlengelse), gjenta trinn 2 i 35 sykluser, 72 °C i 10 minutter (trinn 3, Endelig forlengelse) og 4 °C (trinn 4, Hold).
5. Inkubasjon med begrensningsenzym
- Forbered enzymoppløsningen som inneholder 7 μL nukleasefri H2O, 2 μL 10x CutSmart-buffer og 1 μL NlaIII-begrensningsenzym (se materialtabellen). Hvis det er flere prøver, multipliser hvert innhold for å lage blandingen og aliquot 10 μL per rør.
- Tilsett 10 μL PCR-produkt oppnådd i trinn 3 til enzymoppløsningen per rør.
- Bland godt og spinn ned med en bordplate mini-sentrifuge (2200 x g i 10 s ved romtemperatur).
- Sett rørene på en termisk syklist eller varmeblokk satt av det nedenfor nevnte programmet. Oppbevar produktet etter inkubasjonen ved 4 °C i 1-2 måneder eller ~1 år ved -20 °C.
MERK: 37 °C i 16 timer (minst 2 timer, kort inkubasjonstid kan føre til utilstrekkelig spalting) og 4 °C for oppbevaring.
6. DNA-bånddeteksjon
- Forbered en 1,5% agarose gel som inneholder DNA gel flekk for elektroforese.
- Tilsett 0,75 g agarose i 50 ml 1x TAE buffer etterfulgt av blanding og varme i mikrobølgeovn til agarose oppløses helt. Etter avkjøling, tilsett 5 μL DNA-flekk og bland forsiktig.
- Hell i gelformen (25 ml per mugg) og la gelen størkne. For å oppnå bedre oppløsning og separasjon, øk agarosekonsentrasjonen til 2,5% -4% etter behov.
- Last 10 μL for fordøyd PCR-produkt til brønnen. Bland om nødvendig 6x lastebuffer.
- Kjør gelen med 100 V i 35 min.
MERK: Disse parameterne kan trenge optimalisering. - Bilde under UV-lys (302 nm bølgelengde).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR/Cas9 genredigeringssystem produserer en ATG til TTA-mutasjon og en stille TCC til TCG-mutasjon ved 56 264 279 til 56 264 281 og ved 56 264 291 til 56 264 293 på musekromosom 10, eller ved henholdsvis 869 til 871 og 881 til 883 på Gja1 mRNA. Disse mutasjonene resulterer i en Methionine 213 til Leucine (M213L) mutasjon på GJA1 protein og TTC til TTG mutasjon forstyrrer en nærliggende PAM-sekvens for å unngå uønsket genutgave (figur 1). Detaljene i mutasjonen er beskrevet i en tidligere rapport4.
For å analysere riktige genotyper må PCR-produktene fordøyes av begrensningsenzymet "NlaIII" før agarose gelelektroforese (figur 2, trinn 4). Som vist i figur 2A, vil wild-type (WT) allele PCR-produkter bli kuttet i to forskjellige basisparprodukter (227 bp og 441 bp). I motsetning vil mutant allele PCR-produkter være intakte (668 bp) på grunn av mangel på NlaIII-anerkjennelsessted ved mutasjon (figur 2B). Generell agarose elektroforese kan utføres ved hjelp av de fordøyde PCR-produktene (trinn 5). Spesifikke bånd i agarosegelen indikerer hver genotype (WT, vill type; Het, heterozygot; Hm, homozygot). På grunn av begrensningen nevnt ovenfor resulterer hver genotype i flere bånd av forskjellige størrelser (figur 2C). Bandene vil være to band i WT (227 bp og 441 bp), tre band i Het (227 bp, 441 bp og 668 bp), og ett band i henholdsvis Hm (668 bp). Ifølge gelavbildningen ved hjelp av et enkelt begrensningsenzym kan riktige genotyper av musene skille seg ut.
I vårt eksperiment ble tjueen grunnleggere opprinnelig produsert, hvorav ni var heterozygote eller mosaikkdyr. To av de ni grunnleggerne døde før de vokste opp til avlsalder, mest sannsynlig på grunn av høyinnholds mosaikk av bi-allelic mutant somatiske celler. To uavhengige mutantlinjer ble senere etablert fra de resterende syv grunnleggerne ved å backcrossing til wild-type C57BL /6J mus i minst to generasjoner. Fordi den målrettede mutasjonen er dødelig når den er homozygot, måtte vi opprettholde linjen som heterzygot for ytterligere fortynning av mulige off-target mutasjoner. Homozygote eksperimentelle dyr ble produsert ved å intercrossing etterfølgende generasjoner.
Det er verdt å merke seg at relativt høy embryonal toksisitet med donor oligos ved 50 ng / μL ble opplevd for injeksjon av donor oligos i embryoene. En donorkonsentrasjon på 12,5 ng/μL induserte imidlertid ikke den målrettede rekombinasjonen i de resulterende valpene. I tillegg ble det funnet at tilsatt etanolnedbør av oligos bidro til å fjerne forurensninger og tillot induksjon av effektiv, målrettet genomredigering. Vær oppmerksom på at vasking av DNA-pellets med 70% etanol løser pelletsen i en løsning. Derfor ble NaCl brukt ved 200 mM endelig konsentrasjon for å utfelle 10 μg oligos for å minimere saltoverbæring i pronukleær mikroinjeksjonsbuffer. Testinjeksjon med blastocystanalyse ble forsøkt brukt 50 eller 25 ng/μL av donor oligos med etanol nedbør. Suksessraten for hver tilstand var 76,9 % (10 av 13 prøver med 50 ng/μL) og 25,0 % (3 av 12 prøver med 25 ng/μL) (figur 3A-C). Selv om 50 ng/μL oligo med etanolnedbør fortsatt var noe giftig, måtte mange egg injiseres, og rekombinanter ble produsert med høy suksessrate. Derfor ble 50 ng/μL av donor oligos endelig injisert med etanol nedbør og oppnådd grunnlegger dyr med en 50,0% suksessrate (16 av 32 valper hadde rekombinasjon inkludert 21 overlevende og 11 død etter fødselen). To av grunnleggerne som hadde bakterieoverføring av ensartet mutasjon eller monoallelic eller identisk mutasjon med stabil overføring bekreftet ved sekvensering ble brukt til å etablere uavhengige linjer. Konsensus er at backcrossing to generasjoner med vill-type dyr og ved hjelp av forbedret-troskap Cas9 protein eliminerer store off-targeting hendelser. Antallet slike hendelser kan ikke statistisk skilles fra bakgrunnsfrekvensen for de novo-mutasjonerpå 19,20.
Dyr med uønskede genotyper (villtype eller upassende rekombinanter) som brukes til eksperimenter og ved studiens konklusjon ble avlivet av CO 2-innånding etterfulgt av livmorhalsdislokasjon i henhold til IACUC-protokollen.
Figur 1: Skjematisk representasjon for genmålrettingen av CRISPR/Cas9. (A) De målrettede sekvensene for homologer-rekombinasjon. Aminosyrer med én bokstav vises mellom sekvensene. Fargede uthevinger indikerer homologiarm (grå), mutasjonskodon (grønn), PAM-sekvens (oransje) og gRNA-målsekvens (blå). Den blå pilen indikerer gRNA. NlaIII-begrensningsområdet understrekes av en prikket linje. (B) De skjematiske sekvensene av WT og mutant allele og donor oligo for punktmutasjonen resulterte i M213L mutasjon. TCC til TCG er en stille mutasjon for forstyrrelse av uønsket PAM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematiske PCR-produkter og begrensningssted for WT og mutant allelen. (A,B) PcR-ordningen og fordøyelsen av NlaIII. Primerne forsterker 668 bp Gja1 DNA rundt mutasjonsstedet. WT allele PCR-produktene ble fordøyd til to forskjellige størrelser av NlaIII. I motsetning til dette fordøyes ikke mutant allelen og opprettholder intakte PCR-produkter. (C) Det representative bildet av agarosegelen indikerer WT og mutant allele. Hver musegenotype hadde en bestemt båndstørrelse. WT (bane 1, 3 og 5), Het (bane 2) og Hm (bane 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Rekombinasjonseffektiviteten i to forskjellige doser donor oligos i CRISPR-blandingen. (A) Genotyping resultater av morulae eller blastocysts injisert med ulike doser (25 eller 50 ng/μL) av donor oligos viser vill type (WT; lane # 10, 12, og 14), heterozygot / mosaikk (het / mosaikk; lane # 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11 og 13), homozygot (hom; lane #4 og 5) eller ikke forsterket (bane #7). Wild Type positiv kontroll og H2O som negativ kontroll ble lastet mellom kjørefelt #17 og #18. (BD) Sektordiagrammene representerer rekombinasjonseffektiviteten til CRISPR-blandinger i to forskjellige doser donor oligos (B,C) og grunnleggerdyr injisert med 50 ng/μL donor oligos (D). Legg merke til at 11 av 32 dyr født enten ble drept av mødrene eller døde før avvenning. Prøver som ikke klarte å forsterke i PCR ble utelukket i beregningen av rekombinasjonseffektivitet. Den enkelte genotypehastigheten fra alle prøver er angitt i tabell 3 og tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Navn | Sekvenser | Kommentarer | |||
| crRNA | 5' AUUCAGAGCGAGAGACACCAGU UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' |
Understreking angir CRSPR-målsekvens | |||
| Oligo donar DNA | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCTCTTCT TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCGCTCT GAATATCATTGAGCTCTTCTATGTCTTCTTC 3' |
Understreking angir muterte codons. Knyttneve 60 bp før TTA mutaion og 48 bp etter TCG mutaion er homologi arm | |||
| Genotyping primer fremover | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| Genotyping primer omvendt | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
Tabell 1: Sekvensinformasjon.
| Komponent | Lagerløsning | Beløp | Endelig konsentrasjon |
| Donor oligo | 1μg/μL i Rnase-fri H2O | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| GJA1 crRNA | 1μg/μL i Rnase-fri H2O | 0,4 μL | 20 ng/μL |
| tracrRNA | 1μg/μL i Rnase-fri H2O | 0,8 μL | 40 ng/μL |
| eSpCas9-protein | 1μg/μL i Rnase-fri H2O | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| RNAsefri injeksjonsbuffer | 0,1 mM EDTA pH 8,0 | 16,8 μL | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7,5 | |||
| 100 mM NaCl | |||
| Totalt volum | 20,0 μL |
Tabell 2: Oppskrift av CRISPR-blandingen.
| Lane # (figur 3) | Donor oligo conc. | Status | Ikke forsterket | Vill type | Het/mosaikk | Hom | Notat |
| 1 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | Sletting | |||
| 2 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | ||||
| 3 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | ||||
| 4 | 50 ng/μl | Morula | Hom | ||||
| 5 | 50 ng/μl | Morula | Hom | ||||
| 6 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | Sletting | |||
| 7 | 50 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 8 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | ||||
| 9 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | ||||
| 10 | 50 ng/μl | Morula | Vill type | ||||
| 11 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | ||||
| 12 | 50 ng/μl | Morula | Vill type | ||||
| 13 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaikk | Innsetting | |||
| 14 | 50 ng/μl | Morula | Vill type | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 16 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 17 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 18 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 19 | 25 ng/μl | Morula | Vill type | ||||
| 20 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 21 | 25 ng/μl | Morula | Vill type | ||||
| 22 | 25 ng/μl | Morula | Vill type | ||||
| 23 | 25 ng/μl | Blastocyst | N/A | ||||
| 24 | 25 ng/μl | Blastocyst | Vill type | ||||
| 25 | 25 ng/μl | Blastocyst | Het/mosaikk | ||||
| 26 | 25 ng/μl | Blastocyst | Vill type | ||||
| 27 | 25 ng/μl | Blastocyst | N/A | ||||
| 28 | 25 ng/μl | Blastocyst | Vill type | ||||
| 29 | 25 ng/μl | Blastocyst | Vill type | ||||
| 30 | 25 ng/μl | Blastocyst | Het/mosaikk | Innsetting/sletting | |||
| 31 | 25 ng/μl | Blastocyst | Vill type | ||||
| 32 | 25 ng/μl | Blastocyst | Het/mosaikk | Innsetting | |||
| 33 | 25 ng/μl | Blastocyst | Vill type | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
Tabell 3: Genotyping resultater fra Morula og Blastocyst.
| Dyr # | Donor oligo conc. | Status | Ikke forsterket | Vill type | Het/mosaikk | Hom | Notat |
| d1 | 50 ng/μl | Død valp | Vill type | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Død valp | Het/mosaikk | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Død valp | Het/mosaikk | Sletting | |||
| d4 | 50 ng/μl | Død valp | Vill type | ||||
| d5 | 50 ng/μl | Død valp | Het/mosaikk | ||||
| d6 | 50 ng/μl | Død valp | Vill type | ||||
| d7 | 50 ng/μl | Død valp | Het/mosaikk | ||||
| d8 | 50 ng/μl | Død valp | Het/mosaikk | ||||
| 34 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | ||||
| 35 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 36 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 37 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | Brukes som uavhengig linje | |||
| 38 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 39 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 40 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 41 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | ||||
| 42 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 43 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 44 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 45 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| d1 | 50 ng/μl | Død valp | Hom | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Død valp | Vill type | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Død valp | Het/mosaikk | ||||
| 46 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | ||||
| 47 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | Innsetting | |||
| 48 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | Innsetting | |||
| 49 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | ||||
| 50 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 51 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | Brukes som uavhengig linje | |||
| 52 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 53 | 50 ng/μl | Levende valp | Het/mosaikk | Innsetting/sletting | |||
| 54 | 50 ng/μl | Levende valp | Vill type | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
Tabell 4: Genotyping er et resultat av stifterdyr.
Video 1: CRISPR injeksjon til embryoene. CRISPR-blandingen injiseres i 1-cellers stadium embryoer beskrevet i trinn 2.4. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Blastocysts plukker opp. Den representative videoen som viser blastocysts plukke opp i trinn 2.6. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En genmodifisert musemodell er en vanlig tilnærming for å forstå genfunksjon. Men siden GJA1-20k internt oversatt isoform er oversatt fra samme Gja1 mRNA som full lengde Cx43, ble en kreativ strategi utviklet for å beholde Cx43-uttrykket i full lengde, men undertrykke GJA1-20k-uttrykk. Tilnærmingen er basert på en mutasjon av den interne startkodonen til GJA1-20k. Med en enkelt punktmutasjon ble M213 byttet til L på Gja1 mRNA, som lyktes i å undertrykke GJA1-20k-uttrykk, men beholdt Cx43-uttrykk i full lengde4.
Punktmutasjonen til et enkelt internt oversettelsesstartsted presenterte imidlertid en annen vanskelighet: å bestemme musens genotyper. En enkelt resterstatning er for liten til å lage spesifikke primere. I tillegg har WT og mutasjonsallerler identiske basispar. Et trinn til ble lagt til genotypingprotokollen for å løse disse problemene. Siden starten codon av GJA1-20k (målrettet mutasjonssted) er anerkjent av begrensningen enzymet, NlaIII, stedet ikke å bli anerkjent av NlaIII ble mutert (Figur 1; CATG til CTTA). I tillegg ble primerne for å generere et PCR-produkt designet som ikke har noe annet NlaIII passende nettsted. En riktig genotypingsprotokoll ble etablert for den punktmuterte muselinjen ved å legge til enzym fordøyelsestrinnet med begrensningsenzymet. Generelt gjøres enzym fordøyelse ved korttid inkubasjon (0,5-2,0 h ved 37 °C); overnatting inkubasjon (~ 16 h) anbefales å fordøye hele PCR-produktet helt. Innføringen av mutasjon i målsekvensen resulterer i feilgjenkjennelse mellom WT og mutante alleler. Derfor anbefales nattinkubasjon for tilstrekkelig fordøyelse i denne protokollen med mindre begrensningsenzymet for valg har stjerneaktiviteten21.
Det nåværende prosjektet hadde som mål å forstyrre det andre oversettelsesinitieringsstedet ved å endre ATG (Methionine) til TTA (Leucine). NlaIII er et praktisk begrensningsenzym for rask screening, da det gjenkjenner CATG på målrettingsstedet. Cytosin (C) er ofte forbundet med KOZAK-sekvensen umiddelbart før nettstedet for oversettelsesinitiering. NcoI (C/CATGG) og NdeI (CA/TATG) er andre allsidige begrensningsenzymer for screening i denne regionen hvis alternative codons må brukes til opprettelse/sletting av disse begrensningsstedene. Hvis innføringen av stille mutasjoner ikke er tillatt for begrensning av stedsbasert screening, er sekvensering av individuelle prøver nødvendigmed 22,23. I dette prosjektet var målrettet rekombinasjon ganske effektiv.
Denne M213L mutantmuselinjen gjør det mulig for oss å analysere funksjonen til GJA1-20k. Nylig, ved hjelp av denne muselinjen, ble det identifisert at GJA1-20k er avgjørende for menneskehandel og dannelse av Cx43-gapkryss i full lengde i hjertet4. Interessant nok resulterer den homozygote M213L-mutasjonen (Gja1M213L / M213L), fordi den ikke kan generere GJA1-20k, resulterer alltid i plutselig død 2-4 uker etter fødselen fordi de respektive hjertene ikke danner gapkryss ved den hjertekalibrerte platen. I kontrast avslører en heterozygot M213L-mutasjon nær normal hjertefunksjon, og musene har en lignende levetid som for WT-dyr4. Tidligere in vitro-studie har også vist at M213L-mutasjon forstyrrer riktig gapkryssdannelse1. Videre er dette gapet krysset forstyrrelser reddet av eksogen GJA1-20k transfeksjon. Basert på normal gapkryssdannelse i heterozygot M213L mutantmushjerte under basal tilstand4 og in vitrostudien 1, kan det konkluderes med at Cx43 i full lengde med M213L-mutasjon opprettholder riktig funksjon som et gapkryssprotein.
I tillegg til den essensielle rollen til GJA1-20k i Cx43-menneskehandel, beriker GJA1-20k mitokondrie ytre membran, og induserer beskyttende mitokondriefisjon og biogenese 3,24,25. Når det gjelder mitokondriefunksjon, har mus med heterozygot mutasjon av GJA1-20k (Gja1M213L / WT) ekstrem følsomhet for iskemi / reperfusjonsskade. Når de utsettes for iskemi/reperfusjon, har voksne Gja1M213L/WT-mus en mye større infarktstørrelse og mer forstyrrede mitokondrier enn deres WT-kolleger25.
Oppsummert er den nye muselinjen som inneholder M213L-mutasjonen nyttig for analyse av internt oversatt GJA1-20k. Det skal bemerkes at både Cx43 i full lengde og den mindre GJA1-20k uttrykkes i alle pattedyrorgansystemer. Fremtidige studier forventes å utforske rollen som extracardiac GJA1-20k også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble støttet av National Institutes of Health grants (R01HL152691, R01HL138577 og R01HL159983) til RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine.
- Mayer, H.
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
