Summary
这里描述了一种使植物组织透明同时保持荧光蛋白稳定性的方法。该技术有助于对清除的植物组织进行深度成像，而无需物理切片。
Abstract
在显微镜下直接观察多层和不透明植物标本的内部结构而不进行解剖是具有挑战性的。此外，归因于叶绿素的自发荧光阻碍了植物中荧光蛋白的观察。长期以来，各种清除试剂已被用于使植物透明。然而，传统的清除试剂会减少荧光信号;因此，已经不可能用荧光蛋白观察细胞和细胞内结构。开发的试剂可以通过去除叶绿素来清除植物组织，同时保持荧光蛋白的稳定性。这里提供了详细的方案，用于使用清除试剂ClearSee（CS）或ClearSeeAlpha（CSA）对植物组织进行光学清除。清除的植物组织的制备包括三个步骤：固定，洗涤和清除。固定是维持荧光蛋白的细胞结构和细胞内稳定性的关键步骤。清除的孵育时间取决于组织类型和种类。在 拟南芥中，用CS清除叶和根所需的时间为4天，幼苗7天，雌蕊1个月。CS还需要相对较短的4天时间才能使 Physcomitrium patens 的配子叶透明。相比之下，烟草和托里尼亚中的雌蕊由于CS处理过程中的氧化而产生棕色色素。CSA通过防止氧化来减少棕色色素，并且可以使烟草和托里尼亚雌蕊透明，尽管这需要相对较长的时间（1或2个月）。CS和CSA还与使用化学染料的染色兼容，例如用于DNA的DAPI（4'，6-二氨基-2-苯基吲哚）和用于细胞壁的Hoechst 33342，以及用于细胞壁的Calcofluor White，SR2200和Direct Red 23。该方法可用于全植物成像，以揭示完整的形态，发育过程，植物 - 微生物相互作用和线虫感染。
Introduction
细胞结构的可视化和蛋白质在生物体中的定位对于阐明它们在 体内的功能非常重要。然而，由于活体不透明，因此在不解剖的情况下观察活体的内部结构具有挑战性。特别是，在植物组织中，它们具有不同形状的细胞的多层，由其结构和吸光色素的存在引起的指数不匹配是有问题的。例如，植物叶子具有复杂的结构，使它们能够有效地利用进入体内的光进行光合作用1，而该结构也会导致折射率不匹配，使它们难以观察。然而，叶子有许多吸光色素，如叶绿素，它们会发出强烈的红色荧光，并且氧化会产生褐色色素2，3。这些色素也阻碍了植物中全安装荧光显微镜观察。因此，为了观察植物的内部结构，长期以来一直使用酒精脱色和固定以及使用水合氯醛清除，以消除折射率不匹配和自发荧光4，5。这些常规方法已经采用了很多年，但它们的缺点是同时消除了荧光蛋白的荧光6，7。这是有问题的，因为荧光蛋白在当前的荧光成像中已成为不可或缺的。
因此，ClearSee（CS）和ClearSeeAlpha（CSA）已被开发为植物组织的光学清除试剂。两种试剂均可降低叶绿素自发荧光，同时保持荧光蛋白的稳定性7，8。当由于组织氧化而产生棕色颜料时，CSA特别有用。使用这些清除试剂，可以在不进行物理切片的情况下观察植物体内的细胞结构和蛋白质定位。
Protocol
1. 准备清算解决方案
- 要制备CS溶液，将10%（w / v）木糖醇，15%（w / v）脱氧胆酸钠和25%（w / v）尿素溶解在磁力搅拌器上的蒸馏水中。
注意：脱氧胆酸钠粉末应在通风室中称量，因为它很容易漂浮在空气中。CS可以在室温下在黑暗中储存超过1年。 - 为了制备CSA溶液，将亚硫酸钠（50mM终浓度）加入到上述获得的CS溶液中。
注意：使用前将亚硫酸钠加入CS溶液中，因为还原剂很容易失活。
2. 固定液的制备
- 将40毫升无菌水转移到锥形管中，加入2克多聚甲醛。加入200μL的2 N NaOH以增加溶液的pH值。关闭并用parafilm密封管后，在60°C下孵育，偶尔倒置，直到所有东西都溶解。
- 将溶液冷却至室温后，加入5mL10x磷酸盐缓冲盐水（PBS）以将pH值调节至7.4。加入灭菌水以补充体积至50 mL。
注意：最好使用新鲜制备的固定溶液。该溶液也可以在-30°C下储存数月。
3. 样品固定
- 将植物样品浸入微管的固定溶液中（图1A），确保固定溶液的体积是样品体积的五倍以上。
- 用石膏膜密封微管，并用针头打孔。不要将试管打开，因为在真空减压过程中存在样品溢出的风险。
- 将微管置于干燥器中，并缓慢调节真空度（〜690mmHg），以便从样品中逐渐出现气泡（图1B-C）。抽真空干燥器后关闭真空泵。在室温下保持微管不受干扰30分钟。
- 小心地通风干燥器，以防止干扰样品。再次打开真空泵，并在抽空干燥器后将其关闭。在室温下保持微管不受干扰30分钟。
注意：在通风干燥器时应注意防止损坏样品。通过两次真空处理，固定溶液对样品的渗透得到增强。进一步的真空处理有助于将固定溶液渗透到较厚的样品中。 - 小心打开干燥器，不要将固定溶液撞到微管中。使用微量移液管，取出固定溶液并加入1x PBS。储存1分钟后，将旧的PBS更换为新的1x PBS（图1D）。
4. 清算
- 除去PBS后，加入五倍于澄清溶液的样品体积。
- 用石膏膜密封微管，并用针头打孔。将样品放入干燥器中，如步骤3.3中抽真空，然后关闭真空泵。在室温下保持微管不受干扰60分钟。
- 轻轻打开干燥器。用parafilm关闭微管，并将其储存在室温下的黑暗中，以避免荧光蛋白的光漂白。每1-2天倒置微管以加速清除过程。
- 当清除溶液变为绿色时，用新的清除溶液替换它，直到溶液保持无色（图1E-H）。
图1：CS处理程序（A）拟南芥幼苗在4%PFA（多聚甲醛）溶液中。（B）将样品放入干燥器中。（C）将幼苗固定在真空下。（D）将幼苗真空处理后浸泡在PFA溶液中。（五）所得3天清除溶液处理的幼苗。请注意清除溶液的绿色。（F）处理后3天更换清除溶液。（七）所得5天清除溶液处理的幼苗。（H）处理后5天更换清除溶液。比例尺：1 厘米（A，C-H）和 5 厘米（B）。请点击此处查看此图的放大版本。
5. 化学染料染色
- 加入微管中，加入Hoechst 33342（终浓度为10μg/ mL）进行核染色或Calcofluor White（终浓度为1mg / mL）用于细胞壁染色并等待1小时。除去染料溶液后，用新鲜的清除溶液洗涤样品1小时。
注意：过夜染色和洗涤可以改善荧光染料对组织的渗透并减少背景荧光。各种荧光染料与CS溶液相容，例如碱性紫红素9（木质素），Auramine O9（木质素，苏伯林和角质素），Nile Red9（苏贝林），Direct Yellow 969，Direct Red 239和SR220010，11（细胞壁）。
6. 观察
- 用剃须刀片切割硅橡胶板，为垫片准备框架（图2A）。
注：根据样品的厚度调整硅橡胶片的厚度。由于用清除溶液处理的样品是软的，如果它们直接用盖玻片覆盖，它们将被损坏。 - 将硅胶框架放在盖玻片上（例如，25 x 60 mm）（图2B）。将处理后的样品置于框架内，并加入约100μL清除溶液以除去框架中的任何气泡。用另一个盖板玻璃（18 x 18 mm或24 x 24 mm）盖住，以防止清除溶液蒸发（图2C）。
- 在荧光显微镜下观察样品。观察后，将样品返回微管中取出的澄清溶液，并在室温下在黑暗中储存。
图2：用于显微镜观察的样品制备。 （A）将0.2毫米厚的硅胶片切割成框架。（B）将硅胶片框架放在盖板玻璃上。（C）将用清除溶液（用虚线边框标记）处理的样品放在框架内，并用盖玻片盖住。比例尺：5 毫米。 请单击此处查看此图的放大版本。
Representative Results
CS可以清除各种物种的叶子（图3A-H）。CS溶液很难穿透稻叶，因为该植物的叶面被角质层蜡覆盖。然而，在通过浸入氯仿10秒提取角质层蜡后，CS可以清除稻叶（图3H）。然而，CS无法穿透对CS渗透性较差的暗萼叶（图3I，J）。在菊花叶片中，在CS处理的叶片中观察到多酚氧化诱导的棕色色素沉着（图3K，L）。同样，烟草和托伦尼亚雌蕊在CS治疗期间表现出棕色色素沉着（图3M，O）。由于CSA中的亚硫酸钠成分由于还原作用而防止多酚氧化，CSA可以清除烟草和托里尼亚雌蕊，而没有任何棕色色素沉着（图3N，P）。
图4B 显示，与PBS孵育相比，CS处理减少了 拟南芥 H2B-mClover叶片的淡绿色（明场），并增强了H2B-mClover的荧光强度（图4A）。除开花植物外，CS也适用于苔藓植物（图4C）;CS处理4天后，在叶绿素自发荧光降低的情况下，整个配子团的H2B-mRFP荧光被清晰地检测到。 图4D，E 显示了使用CSA清除的 尼古蒂安侧 侧的H2B-mClover雌蕊的3D重建图像。样品深度为440μm。正如深度编码的最大强度投影图像所示，CSA允许对具有挑战性的组织（如烟草雌蕊）进行深度成像。
CS和CSA也与荧光染料染色相容。 图5 显示CS可以同时用于观察荧光蛋白（H2B-mClover）和有机荧光染料染色（Calcofluor White）。从z-stack图像进行3D重建后，可以观察到任何部分。
图3：使用清除溶液对叶子和雌蕊进行光学清除。（A-L）将各种物种的固定叶子在PBS（A，C，E，G，I，K）或CS（B，D，F，H，J，L）中孵育8天，CS（M，O）或CSA（N，P）孵育2天。（A，B，O，P）Torenia fournieri， （C，D） Nicotiana tabacum， （E，F） Cucumis sativus， （G，H） Oryza sativa， （I，J） Chamaecyparis obtusa， （K，L） 菊花， （M，N） Nicotiana benthamiana.比例尺：1厘米，请点击此处查看此图的放大版本。
图4：用清除溶液处理的组织荧光成像。 （A，B） UBQ10pro：：H2B-mClover叶用PBS（A）或CS（B）处理3天。（C）H2B-mRFP叶状配子体用CS 处理4 d。细胞核用H2B-mRFP（绿色）标记。CS处理降低了叶绿素自发荧光（洋红色）。在H2B-mRFP和自发荧光或明场的合并图像中，可以清楚地观察到顶端区域的H2B-mRFP信号。（D，E）UBQ10pro：：H2B-mClover对沁沁的柱头在CSA治疗了1个月。最大强度投影（D）和深度编码最大强度投影（E）以5μm的间隔从88个z-stack图像中生成。比例尺：100 μm。使用宽视场（A，B），共聚焦（C）和双光子激发（D，E）显微镜拍摄图像。请点击此处查看此图的放大版本。
图 5：荧光染料染色与 CS 兼容。 （A）CS处理的叶子通过双光子激发显微镜观察，激发波长为950nm。细胞壁用钙氟白（青色）染色。细胞核用UBQ10pro：：H2B-mClover（黄色）标记。yz （B） 和 xz （C） 图像是位于 （A） 中白色虚线指示的位置处的横截面。比例尺：100 μm .请点击此处查看此图的放大版本。
图6：脱氧胆酸钠的透明度（A）各种15%脱氧胆酸钠的颜色（列在材料表中）。（B）每个15%脱氧胆酸钠的荧光光谱与380nm激发。请点击此处查看此图的放大版本。
Discussion
这种方法包括固定，洗涤和清洁。固定是该协议中的关键步骤。如果在PFA固定后未观察到荧光蛋白，则在用清除溶液处理后不会观察到荧光蛋白。PFA溶液渗透到组织中至关重要，但不建议进行高真空处理，因为它会破坏细胞结构。应针对每种类型的组织和物种优化真空条件和固定期。建议即使在固定后也要检查荧光蛋白。虽然样品通常在室温下固定30-60分钟，但它们可以在4°C下固定更长的时间（过夜或更长时间）。
如图 6A所示，一些脱氧胆酸钠在溶解时呈淡黄色。这种脱氧胆酸钠溶液在380nm处激发后，在400-600nm区域显示出强烈的自发荧光（图6B）。这种自发荧光会阻止光学清除和荧光成像。用户应检查脱氧胆酸钠溶液的颜色，因为试剂的质量可能由于纯度，批次间变化或其他原因而有所不同。
这里使用的清除溶液含有高浓度的脱氧胆酸钠，这可能会破坏膜结构。即使在CS处理后也观察到质膜标志物（RPS5Apro：：tdTomato-LTI6b）7。然而，根据感兴趣的结构和组织，降低脱氧胆酸钠的浓度可能更好。事实上，对于具有改性CS的 拟南芥 雌蕊，获得了具有更高清晰度的图像，其中脱氧胆酸钠的浓度降低了一半;然而，降低浓度的脱氧胆酸钠需要延长治疗时间（例如， 拟南芥 雌蕊花1个月）。
CS可以减少红色自发荧光（>610nm）以去除处理样品中的叶绿素。然而，即使在CS处理的样品中，500-600 nm范围的自发荧光（黄色至橙色）仍然存在7。这种自发荧光被认为来源于细胞壁和其他细胞成分，如木质素12，13。因此，通过CS处理很难使组织（例如具有发育的次级壁的茎）完全透明。
除了这里使用的那些之外，还开发了几种清除试剂，以使用荧光显微镜观察植物中的荧光蛋白14，15，16，17。与这些方法相比，CS和CSA去除叶绿素并减少自发荧光，使植物组织更加透明。最近，Sakamoto等人开发了一种改进的方法iTOMEI，用于固定，洗涤剂清除和安装以调整折射率不匹配18。在 拟南芥 幼苗中，iTOMEI在26小时内清除组织。
CS 适用于多种植物，如拟南芥、芫荠属7、苜蓿、黄瓜、桔梗、烟粉虱、芫荠属、芫荽荽20、鳄梨21、大麦 22、芸苔属 23、卡利特里奇24，桉树25，玉米26，Marchantia polymorpha27，Monophyllaea glabra28，Orobanche minor29，petunia30，rice31，Solanum lycopersicum32，soybean33，strawberry34，wheat35和Wolffiella hyalina36。对于较厚的组织，CS还可以使振动切片透明37，38。该方法允许研究植物中的细胞结构和基因表达模式37，38。此外，在CS处理的组织深处还观察到线虫感染20，39，真菌感染和共生19，40，41。因此，这种方法可用于从微观到宏观尺度的全组织成像，并有助于发现各种细胞，组织，器官和生物体之间的新相互作用。
Disclosures
ClearSee已商业化（Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation，日本）。名古屋大学拥有清除试剂ClearSee的专利（JP6601842）。D. Kurihara是专利发明人。作者声明没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会（创新领域科学研究补助金（JP16H06464，JP16H06280至T.H.），科学研究补助金（B，JP17H03697至D.K.），挑战性探索性研究补助金（JP18K19331至D.K.），创新领域科学研究补助金（D.K.为JP20H05358）和日本科学技术厅（PRESTO计划（JPMJPR15QC至Y.M）的支持。 JPMJPR18K4 至 D.K.））。作者感谢名古屋大学转化生物分子研究所（WPI-ITbM）的现场成像中心支持微观研究和编辑（www.editage.com）进行英语编辑。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
| ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
| Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
| Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
| Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
| Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
| Needle | TERUMO | NN-2238S | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
| Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
| Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
| Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
| Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
| Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
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