Summary
L’hypophyse est le régulateur clé du système endocrinien du corps. Cet article décrit le développement d’organoïdes à partir de l’hypophyse de souris comme un nouveau modèle in vitro 3D pour étudier la population de cellules souches de la glande dont la biologie et la fonction restent mal comprises.
Abstract
L’hypophyse est le maître de la glande endocrine régulant les processus physiologiques clés, y compris la croissance du corps, le métabolisme, la maturation sexuelle, la reproduction et la réponse au stress. Il y a plus de dix ans, des cellules souches ont été identifiées dans l’hypophyse. Cependant, malgré l’application d’approches transgéniques in vivo , leur phénotype, leur biologie et leur rôle restent flous. Pour s’attaquer à cette énigme, un nouveau modèle organoïde in vitro innovant est développé pour démêler en profondeur la biologie des cellules souches hypophysaires. Les organoïdes représentent des structures cellulaires 3D qui, dans des conditions de culture définies, s’auto-développent à partir des cellules souches (épithéliales) d’un tissu et récapitulent de multiples caractéristiques de ces cellules souches et de leurs tissus. Il est montré ici que les organoïdes dérivés de l’hypophyse de souris se développent à partir des cellules souches de la glande et récapitulent fidèlement leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles in vivo . Entre autres, ils reproduisent l’état d’activation des cellules souches comme in vivo se produisant en réponse à des dommages locaux infligés transgéniquement. Les organoïdes sont extensibles à long terme tout en conservant solidement leur phénotype de tige. Le nouveau modèle de recherche est très précieux pour déchiffrer le phénotype et le comportement des cellules souches dans des conditions clés du remodelage hypophysaire, allant de la maturation néonatale à la décoloration associée au vieillissement, en passant par les glandes saines et malades. Ici, un protocole détaillé est présenté pour établir des organoïdes dérivés de l’hypophyse de souris, qui fournissent un outil puissant pour plonger dans le monde encore énigmatique des cellules souches hypophysaires.
Introduction
L’hypophyse est une minuscule glande endocrine située à la base du cerveau, où elle est reliée à l’hypothalamus. La glande intègre des entrées périphériques et centrales (hypothalamiques) pour générer une libération hormonale réglée et coordonnée, régulant ainsi les organes endocriniens cibles en aval (tels que les glandes surrénales et les gonades) pour produire des hormones appropriées au bon moment. L’hypophyse est le régulateur clé du système endocrinien et est donc appelée à juste titre la glande maîtresse1.
L’hypophyse de la souris se compose de trois lobes (Figure 1), c’est-à-dire le lobe antérieur (AL), le lobe intermédiaire (IL) et le lobe postérieur (PL). La principale AL endocrinienne contient cinq types de cellules hormonales, y compris les somatotropes qui produisent l’hormone de croissance (GH); lactotropes générant de la prolactine (PRL); corticotropes qui sécrètent l’hormone adrénocorticotrope (ACTH); thyrotropes responsables de la production d’hormone stimulant la thyroïde (TSH); et les gonadotrophes qui fabriquent l’hormone lutéinisante (LH) et l’hormone folliculo-stimulante (FSH). Le PL est constitué de projections axonales de l’hypothalamus dans lesquelles sont stockées les hormones ocytocine et vasopressine (hormone antidiurétique). L’IL est situé entre l’AL et le PL et abrite des mélanotropes qui produisent l’hormone stimulant les mélanocytes (MSH). Dans l’hypophyse humaine, l’IL régresse au cours du développement et les mélanotropes se propagent dans l’AL1. En plus des cellules endocriniennes, l’hypophyse contient également un pool de cellules souches, essentiellement marquées par le facteur de transcription SOX2 2,3,4,5,6. Ces cellules SOX2+ sont situées dans la zone marginale (MZ), la paroi épithéliale de la fente (un reste de lumière embryonnaire entre l’AL et l’IL), ou sont réparties en grappes dans tout le parenchyme de l’AL, proposant ainsi deux niches de cellules souches dans la glande (Figure 1)2,3,4,5,6.
Compte tenu de la nature indispensable de l’hypophyse, un dysfonctionnement de la glande est associé à une morbidité grave. L’hyperpituitarisme (caractérisé par une sursécrétion d’une ou de plusieurs hormones) et l’hypopituitarisme (production défectueuse ou manquante d’une ou de plusieurs hormones) peuvent être causés par des tumeurs neuroendocrines hypophysaires (PitNET; par exemple, tumeurs productrices d’ACTH conduisant à la maladie de Cushing) ou par des défauts génétiques (par exemple, une carence en GH entraînant un nanisme)7. En outre, la chirurgie hypophysaire (par exemple, pour enlever des tumeurs), les infections (par exemple, la tuberculose hypothalamo-hypophysaire ou les infections consécutives à une méningite bactérienne ou à une encéphalite), le syndrome de Sheehan (nécrose due à un flux sanguin insuffisant dû à une perte de sang importante à la naissance), l’apoplexie hypophysaire et les lésions cérébrales traumatiques sont d’autres causes importantes d’hypofonction hypophysaire8 . Il a été démontré que l’hypophyse de la souris possède la capacité de régénération, étant capable de réparer les dommages locaux introduits par l’ablation transgénique des cellules endocriniennes 9,10. Les cellules souches SOX2+ réagissent de manière aiguë à la lésion infligée en montrant un phénotype activé, marqué par une prolifération accrue (entraînant une expansion des cellules souches) et une expression accrue des facteurs et des voies liés à la souche (par exemple, WNT / NOTCH). De plus, les cellules souches commencent à exprimer l’hormone ablée, ce qui entraîne finalement une restauration substantielle de la population cellulaire épuisée au cours des mois suivants (5 à 6) 9,10. En outre, pendant la phase de maturation néonatale de la glande (les 3 premières semaines après la naissance), les cellules souches hypophysaires prospèrent dans un état activé 6,11,12,13, tandis que le vieillissement de l’organisme est associé à une diminution de la fonctionnalité des cellules souches in situ, en raison d’un (micro-) environnement inflammatoire croissant au vieillissement (ou « inflammatoire »)10,14 . En outre, la tumorigenèse dans la glande est également associée à l’activation des cellulessouches 7,15. Bien que l’activation des cellules souches ait été détectée dans plusieurs situations de remodelage hypophysaire (examinées dans 7,16), les mécanismes sous-jacents restent incertains. Étant donné que les approches in vivo (telles que le traçage de la lignée chez les souris transgéniques) n’ont pas fourni une image claire ou complète des cellules souches hypophysaires, le développement de modèles in vitro fiables pour explorer la biologie des cellules souches dans l’hypophyse normale et malade est essentiel. La culture in vitro standard de cellules souches hypophysaires primaires reste inadéquate en raison de la capacité de croissance très limitée et des conditions non physiologiques (2D) avec perte rapide du phénotype (pour un aperçu plus détaillé, voir16). Des cultures de sphères 3D (pituisphères) ont été établies à partir de cellules souches hypophysaires identifiées par la population latérale et le phénotypeSOX2+ 2,3,4. Les pituisphères se développent clonalement à partir des cellules souches, expriment des marqueurs de souche et montrent une capacité de différenciation dans les types de cellules endocriniennes. Cependant, ils ne s’étendent pas considérablement tout en ne montrant qu’une capacité de passage limitée (2-3 passages)3,4. Des structures en forme de sphère ont également été obtenues à partir de grappes de cellules souches hypophysaires non dissociées lorsqu’elles ont été cultivées dans du Matrigel dilué à 50% pendant 1 semaine, mais l’extensibilité n’a pas été montrée17. L’approche de la pituisphère est principalement utilisée comme outil de lecture du nombre de cellules souches, mais d’autres applications sont limitées par une capacité d’expansion inférieure16.
Pour remédier et surmonter ces lacunes, un nouveau modèle 3D a récemment été mis en place, c’est-à-dire des organoïdes, à partir de l’AL endocrinien majeur de souris contenant la MZ et des cellules souches parenchymateuses. Il a été démontré que les organoïdes sont en effet dérivés des cellules souches de l’hypophyse et récapitulent fidèlement leur phénotype18. De plus, les organoïdes sont extensibles à long terme, tout en conservant solidement leur nature de tige. Par conséquent, ils fournissent une méthode fiable pour développer les cellules souches hypophysaires primaires pour une exploration profonde. Une telle exploration n’est pas réalisable avec le nombre limité de cellules souches qui peuvent être isolées d’une hypophyse, qui ne sont pas non plus extensibles dans des conditions 2D16. Il a été démontré que les organoïdes sont des outils précieux et fiables pour découvrir de nouvelles caractéristiques des cellules souches hypophysaires (traduisibles en in vivo)14,18. Il est important de noter que le modèle organoïde reflète fidèlement le statut d’activation des cellules souches hypophysaires tel qu’il se produit lors de lésions tissulaires locales et de maturation néonatale, montrant une efficacité de formation améliorée et reproduisant des voies moléculaires régulées à la hausse14,18. Par conséquent, le modèle organoïde dérivé de l’hypophyse est un modèle de recherche innovant et puissant sur la biologie des cellules souches hypophysaires ainsi qu’un outil de lecture de l’activation des cellules souches.
Ce protocole décrit en détail l’établissement d’organoïdes dérivés de l’hypophyse de souris. À cette fin, l’AL est isolée et dissociée en cellules uniques, qui sont incorporées dans matrigel imitant la matrice extracellulaire (ci-après dénommé ECM). L’assemblage cellule-ECM est ensuite cultivé dans un milieu défini, contenant essentiellement des facteurs de croissance des cellules souches et des régulateurs embryonnaires hypophysaires (ci-après dénommés « milieu organoïde hypophysaire » (PitOM)18; Tableau 1). Une fois que les organoïdes sont complètement développés (après 10 à 14 jours), ils peuvent être élargis par un passage séquentiel et soumis à une exploration approfondie en aval (par exemple, immunofluorescence, RT-qPCR et transcriptomique en vrac ou unicellulaire; Figure 1). À plus long terme, on s’attend à ce que les organoïdes de cellules souches hypophysaires ouvrent la voie à des approches de réparation des tissus et à la médecine régénérative.
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Protocol
Les expériences sur les animaux pour cette étude ont été approuvées par le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale de la KU Leuven (P153/2018). Toutes les souris ont été hébergées dans les animaleries de l’université dans des conditions normalisées (température constante de 23 ± 1,5 °C, humidité relative de 40 % à 60 % et cycle jour/nuit de 12 h), avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum.
1. Souris
- Utilisez des souches de souris disponibles dans le commerce, telles que les souris C57BL / 6J, d’âge jeune adulte (8-12 semaines). En général, 2-3 souris fournissent un nombre suffisant de cellules AL pour le protocole.
2. Isolement et dissociation de l’AL de la souris
NOTE: Les moyens A, B et C sont préparés à l’avance19,20. Les compositions sont présentées dans le tableau 2.
- Isolement de la souris AL
- Euthanasier les souris par asphyxie au CO2 , suivie d’une décapitation (Figure 2A). Lavez les têtes de souris avec de l’eau désionisée pour éliminer le sang et vaporisez-les avec 70% d’EtOH pour générer un environnement stérile.
- À l’aide d’outils chirurgicaux stériles, enlever la peau de la tête entre les oreilles (Figure 2B).
- Ouvrez le crâne et retirez le cerveau.
- Briser le « pont du nez » (c.-à-d. la partie antérieure de l’os frontal; Figure 2B) avec des ciseaux stériles.
- Ouvrez davantage le crâne avec des ciseaux, en partant de l’arête nasale cassée vers les oreilles, des deux côtés (Figure 2C).
- Retirez le crâne et le cerveau avec une pince à épiler stérile, sans toucher l’hypophyse (Figure 2D).
- Retirez les diaphragmes avec une pince à épiler émoussée, sans endommager l’hypophyse. Jetez le PL et l’IL de l’AL sous un stéréomicroscope.
REMARQUE: Le PL et l’IL sont liés et donc supprimés simultanément. Ces parties apparaissent sous forme de tissu blanc, par rapport à l’AL de couleur rose (Figure 2D). - Isolez soigneusement l’AL avec une pince à épiler émoussée et rassemblez-la dans une fiole d’Erlenmeyer de 10 mL, remplie de 3 mL de milieu A (voir tableau 2). Placer la fiole sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit traitée ultérieurement.
- Dissociation de la souris AL
- Retirer le milieu surnageant (SN) A de la fiole d’Erlenmeyer contenant l’AL isolé. Ajouter 2 mL de solution de trypsine préavertie (37 °C) à 2,5 % et incuber à 37 °C pendant 15 min.
- Sans retirer la solution de trypsine, ajouter 2 mL de solution de DNase préaverdie (37 °C) (2 μg/mL dans le milieu A; filtré stérile à travers un maillage de 0,22 μm) et faire tourbillonner la fiole d’Erlenmeyer 10 fois. Laissez l’hypophyse couler au fond (~1 min) et retirez le SN.
- Ajouter 2 mL de solution d’inhibiteur de la trypsine préavertissée (37 °C) (0,1 mg/mL dans le milieu A; filtré stérile à travers une maille de 0,22 μm) et incuber à 37 °C pendant 10 min. Laissez les sédiments hypophysaires au fond et retirez le SN.
- Ajouter 2 mL de milieu préavertissé (37 °C) B (voir tableau 2) et incuber à 37 °C pendant 5 min. Sans retirer le SN, ajouter 2 mL de milieu préavertis (37 °C) C (voir tableau 2) et incuber à 37 °C pendant 15 min.
- Laissez l’hypophyse couler au fond et retirez le SN. Rincer l’hypophyse trois fois avec un milieu préavertissé (37 °C).
- Dissocier l’hypophyse en cellules uniques.
- Ajouter 2 mL de milieu préavertissé (37 °C) C. Aspirer et expulser l’hypophyse avec une pipette Pasteur stérile polie à la flamme plusieurs fois, jusqu’à ce que les fragments ne soient plus visibles.
- Transférer la suspension dans un tube de 15 mL avec 4,5 mL de solution de DNase préavertée (37 °C) (2 μg/mL en milieu A; filtré stérile à travers un maillage de 0,22 μm). Rincer l’Erlenmeyer trois fois avec 2 mL de milieu préavertissé (37 °C) C et transférer la suspension dans le tube de 15 mL.
- Mélanger la suspension cellulaire recueillie et la filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un tube de 30 mL. Rincez trois fois le tube de 15 mL et la crépine à cellules avec 2 mL de C moyen et transférez la suspension dans le tube de 30 mL.
- Placer l’extrémité d’une pipette Pasteur en verre, remplie de 2 mL de solution d’albumine sérique bovine (BSA) à 3 % (en milieu A; filtrée stérilement à travers un maillage de 0,22 μm), au fond du tube et pipeter doucement pour former une couche de densité visible. Centrifuger à 190 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Retirez le SN en inversant le tube en un seul mouvement fluide et retirez les gouttelettes SN restantes avec une pointe P1000. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DMEM/F12 Avancé glacé (Adv DMEM/F12) et quantifiez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules.
3. Établissement et culture d’organoïdes dérivés de l’AL
REMARQUE: Décongeler l’ECM sur la glace à l’avance (2-3 h pour 1 mL) et le garder sur la glace pendant toute la durée du protocole.
- Ensemencement et culture organoïdes
- Centrifuger la suspension de la cellule AL à 190 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le SN. Remettez en suspension la pastille de cellule dans Adv DMEM/F12 en utilisant le volume spécifique calculé pour atteindre une densité cellulaire de 1,1 x 106 cellules/mL.
REMARQUE: Par exemple, si la suspension cellulaire contient 500 000 cellules / mL, il faut remettre en suspension la pastille de cellule dans 454,54 μL d’Adv DMEM / F12 pour atteindre la densité souhaitée de 1,1 x 106 cellules / mL. - Retirez le volume de suspension cellulaire nécessaire au placage (selon le nombre souhaité de puits à ensemencer pour le développement organoïde) et ajoutez l’ECM dans un rapport de 30:70 (suspension cellulaire à 30% (dans Adv DMEM / F12) et 70% ECM). Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
REMARQUE: Par exemple, pour une gouttelette de 30 μL (voir l’étape 3.1.3), il faut (doucement) mélanger 9 μL de suspension cellulaire (contenant ~ 10 000 cellules lorsqu’elles sont prélevées dans la suspension de 1,1 x 106 cellules / mL) avec 21 μL d’ECM. - Par puits, déposer une goutte de 30 μL du mélange suspension cellulaire/ECM (voir étape 3.1.2) sur une plaque préchauffée (37 °C) de 48 puits. Tournez la plaque à l’envers et laissez l’ECM se solidifier à 37 °C pendant 20 min.
REMARQUE: Préchauffer les plaques de culture pendant au moins 24 h à 37 °C. - Remettre la plaque dans sa bonne orientation et ajouter soigneusement 250 μL de PitOM préavertissé (37 °C) (voir tableau 1) complété par un inhibiteur de roche de 10 μM (Y-27632).
- Continuez à cultiver les organoïdes en changeant le milieu (dépourvu de Y-27632) tous les 2-3 jours jusqu’à ce que les organoïdes soient complètement développés, ce qui prend entre 10 et 14 jours (Figure 3A). Ensuite, passez les organoïdes.
REMARQUE: Lorsque vous aspirez le support, assurez-vous de ne pas perturber le dôme ECM. Inclinez légèrement la plaque de culture et retirez le milieu du bord inférieur du puits. Un milieu frais (préavertissé à 37 °C) doit être ajouté doucement sur le côté du puits. Si les gouttelettes de gel se détachent, collectez les organoïdes et remettez-les en suspension et cultivez-les à nouveau dans une nouvelle gouttelette ECM.
- Centrifuger la suspension de la cellule AL à 190 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le SN. Remettez en suspension la pastille de cellule dans Adv DMEM/F12 en utilisant le volume spécifique calculé pour atteindre une densité cellulaire de 1,1 x 106 cellules/mL.
- Passage organoïde
- Aspirer doucement le milieu et ajouter 400 μL d’Adv DMEM/F12 glacé pour désintégrer l’ECM et recueillir les organoïdes dans un tube de microcentrifugation. Laver une fois avec 400 μL d’Adv DMEM/F12 EM glacé. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Retirez soigneusement le SN et ajoutez 400 μL d’enzyme TrypLE Express préavertissée (37 °C) (1X). Mélanger en inversant le tube plusieurs fois, et incuber à 37 °C pendant 5 min.
- Ajouter 400 μL d’Adv DMEM/F12 glacé et centrifuger à 200 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le SN.
- Remettre en suspension la pastille avec 100 μL d’Adv DMEM/F12 glacé et ensuite briser les organoïdes en pipetant vigoureusement de haut en bas avec une pointe P200 rétrécie (c’est-à-dire pousser la pointe vide contre le fond du tube de microcentrifugation, pour réduire son diamètre d’ouverture) jusqu’à ce que des fragments organoïdes (d’un diamètre d’environ 50 μm) soient obtenus (figure 3B).
REMARQUE: Le mélange de dissociation doit contenir principalement des fragments organoïdes et seulement quelques cellules individuelles. La dissociation sévère des organoïdes en cellules individuelles a un impact négatif sur la repousse des organoïdes. - Ajouter 800 μL d’Adv DMEM/F12 et centrifuger à 190 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez le SN.
- Passage des organoïdes dans un rapport de 1:2 à 1:4. Remettez en suspension la pastille dans un volume adéquat d’Adv DMEM/F12 au besoin pour le placage et ajoutez l’ECM dans un rapport de 30:70 (suspension de cellule de 30% et 70% d’ECM). Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
- Semer et cultiver les organoïdes comme décrit ci-dessus aux étapes 3.1.3-3.1.5.
NOTE: En moyenne, 20 organoïdes se développent par puits à partir des 10 000 cellules AL entières ensemencées (0,2%). Ces organoïdes de passage 0 peuvent être divisés dans un rapport de 1:2, ce qui entraîne >50 organoïdes se développant par puits (passage 1). Les organoïdes peuvent ensuite être divisés dans un rapport de 1:2 à 1:4 lors des passages suivants. La repousse des organoïdes ralentit après ~10 passages (correspondant à 3 mois de culture), concrétisés progressivement en organoïdes de moins en moins nombreux et plus petits.
4. Cryoconservation d’organoïdes dérivés de l’AL et décongélation
- Cryoconservation d’organoïdes
- Suivez le protocole de passaging de l’étape 3.2.1 à l’étape 3.2.5.
- Remettre en suspension la pastille organoïde (contenant des fragments et des cellules) avec 1 mL de milieu de cryoconservation (tableau 3). Transférer la suspension dans un cryovial et la placer sur de la glace.
REMARQUE: Les organoïdes (c.-à-d. les fragments et les cellules résultants) provenant d’un maximum de quatre puits de la plaque de 48 puits peuvent être combinés en un seul cryovial. - Placer les cryoviaux dans un récipient de congélation et les transférer à -80 °C.
- Après 24 h, transférer les échantillons dans une cryobox et les stocker dans de l’azote liquide (-196 °C) pour un stockage à long terme.
- Décongélation des organoïdes cryoconservés
- Retirez le cryovial du réservoir d’azote liquide et placez-le sur la glace. Procédez immédiatement au protocole de décongélation.
- Décongeler la solution avec les fragments organoïdes cryoconservés et les cellules individuelles à 37 °C (bain-marie).
REMARQUE: Ne conservez pas la solution plus de 2 minutes à 37 °C pour éviter la toxicité cellulaire par le DMSO. - Transférer le contenu dans un tube de 15 mL contenant 10 mL d’Adv DMEM/F12 glacé avec 30 % de sérum fœtal bovin (FBS). Rincer le cryovial avec 1 mL d’Adv DMEM/F12 avec 30% de FBS.
- Centrifuger à 190 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettre la pastille avec 1 mL d’Adv DMEM/F12 glacé et transférer la suspension dans un tube de microcentrifugation.
- Centrifuger à 190 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettez en suspension la pastille dans un volume adéquat d’Adv DMEM/F12 au besoin pour le placage et ajoutez l’ECM dans un rapport de 30:70. Bien mélanger en pipetant de haut en bas.
- Semer et cultiver les organoïdes comme décrit ci-dessus aux étapes 3.1.3-3.1.5.
5. Validation des organoïdes dérivés de l’AL
- Collecte et lyse d’organoïdes pour l’isolement de l’ARN
- Recueillir et centrifuger les organoïdes comme décrit ci-dessus (étape 3.2.1).
- Retirer le SN et ajouter 350 μL de tampon de lyse avec 1 % de 2-mercapto-éthanol. Vortex pendant 30 s et stockage à -80 °C ou procéder immédiatement à l’isolement de l’ARN.
ATTENTION : Attention, le 2-mercapto-éthanol est un composé toxique. Tout le travail doit être effectué dans une hotte à fumée chimique tout en portant des gants en nitrile, un masque anti-poussière et des lunettes de sécurité. Le 2-mercapto-éthanol peut causer des dommages irréversibles aux yeux et à la peau.
- Fixation et incorporation d’organoïdes pour la coloration immuno-histochimie/fluorescence
- Recueillir et centrifuger les organoïdes comme décrit ci-dessus (étape 3.2.1).
- Retirer le SN, ajouter 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et incuber pendant 30 min à température ambiante (RT) sur un agitateur orbital (100 tr/min).
ATTENTION : Le PFA est un cancérogène connu pour l’homme qui peut causer des dommages irréversibles à la cornée. Tous les travaux doivent être effectués dans une hotte chimique. Les gants en nitrile et les lunettes de sécurité doivent toujours être portés. - Centrifuger à 200 x g pendant 5 min et retirer le SN. Ajouter 1 mL de PBS, incuber 10 min à RT sur un agitateur orbital (100 tr/min) et centrifuger à 90 x g pendant 3 min à 4 °C. Répétez l’étape de lavage deux fois. Conserver dans pbS à 4 °C.
- Pour le traitement des tissus et la déshydratation, retirez le SN et ajoutez 150 μL de gel d’agarose à 2% (en PBS) à la pastille organoïde à l’aide d’une pointe p200 élargie préaverdie (faite en coupant un petit morceau de la pointe). Pipetez immédiatement tout le volume et éjectez-le dans le couvercle du tube de microcentrifugation.
REMARQUE: Il est important de travailler rapidement, car le gel contenant les organoïdes se solidifiera rapidement. - Laissez le gel se solidifier fermement pendant 30 min et déplacez le disque de gel sur une cassette d’histologie. Immerger et conserver dans 50% d’EtOH, jusqu’à déshydratation dans le processeur de tissu.
- Pour l’incorporation de paraffine, placez le disque de gel (à l’aide d’une pince) dans un moule d’enrobage et remplissez-le de paraffine chaude (60 °C). Placer les moules à 4 °C jusqu’à ce que la paraffine soit solide (environ 45 min). Ces échantillons peuvent être stockés à 4 °C ou peuvent être immédiatement soumis à un sectionnement.
- Microtome les blocs de paraffine contenant des organoïdes à 5 μm d’épaisseur et prélever les échantillons sur des lames de verre. Ajouter une goutte d’eau désionisée sous chaque section pour permettre un étirement correct de la section et placer les glissières sur une plaque chauffante plate à 37 °C pendant la nuit. Conservez les lames avec des sections à 4 °C ou continuez directement avec une coloration immunohistochimique ou immunofluorescence.
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Representative Results
Après isolement et dissociation de l’AL, les cellules individuelles obtenues sont ensemencées en ECM et cultivées dans PitOM (Figure 1, Tableau 1). La figure 3A montre la culture cellulaire et la densité au moment de l’ensemencement (jour 0). Quelques petits débris peuvent être présents (Figure 3A, pointes de flèches blanches), mais disparaîtront au passage. Quatorze jours après l’ensemencement, les organoïdes dérivés de l’AL sont complètement développés (Figure 3A). Les organoïdes présentent une morphologie kystique, avec une couche épithéliale qui entoure une lumière. À ce stade, les organoïdes atteignent un diamètre de 500 μm et doivent être passés. La figure 3B montre la culture organoïde dérivée de l’AL après le passage au moment indiqué après le réensemencement des fragments organoïdes dissociés.
Parfois, une ou plusieurs structures denses peuvent apparaître dans la culture organoïde (Figure 3A, Défavorable). Lors du passage, les organoïdes denses ont tendance à prendre le relais, se retrouvant dans des cultures avec seulement des structures denses après quelques passages (Figure 3B, Défavorable). Par conséquent, il est recommandé de ne pas procéder avec des puits contenant des organoïdes denses (passage 0). Alternativement, les organoïdes denses peuvent être éliminés par sédimentation, ce qui laisse les organoïdes kystiques continuer. L’origine de ces organoïdes denses n’est pas claire à l’heure actuelle, mais ils présentent une nature hypophysaire moins prononcée18. Si les organoïdes ne repoussent pas, ou moins efficacement après le passage, les procédures de dissociation doivent être optimisées. En particulier, il faut faire attention à ne pas se dissocier trop durement; les organoïdes doivent être divisés en fragments, et non en cellules individuelles (Figure 3B, Jour 0, encadré).
L’analyse de coloration par immunofluorescence confirme le caractère épithélial des organoïdes dérivés de l’AL, car ils expriment les marqueurs épithéliaux E-cadhérine (E-Cad) et cytokératine 8/18 (CK8/18; Figure 3C), qui, de plus, ont été décrits comme des marqueurs de cellules souches dans l’hypophyse18. La nature de la tige des organoïdes est également démontrée par l’expression de SOX2 et DE TROP2, qui ont également été identifiées comme des marqueurs de cellules souches hypophysaires (Figure 3C)14,18. LHX3, un facteur de transcription spécifiquement exprimé dans l’hypophyse (en développement précoce), valide le phénotype hypophysaire des organoïdes (Figure 3C). Certaines des cellules organoïdes constitutives sont dans un état prolifératif, exprimant le marqueur de prolifération Ki67 (Figure 3C).
Une exploration et une validation plus poussées du phénotype hypophysaire (tige) des organoïdes dérivés de l’AL sont effectuées avec la transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR). Une expression élevée des marqueurs de tige Sox2, Cdh1 (codant E-Cad), Krt8, Krt18 et Trop2 est présente dans les organoïdes, nettement plus élevée que dans l’AL primaire, ce qui indique que les organoïdes enrichissent pour les cellules souches et représentent ainsi le compartiment des cellules souches AL, comme décrit précédemment (Figure 3D)18. Notamment, les facteurs de transcription développementale Pitx1 et Pitx2 restent exprimés après le développement dans plusieurs types de cellules hormonales dans l’AL, et donc leur expression élevée dans l’AL ainsi. Les cultures conservent solidement leur phénotype de tige, comme le démontre l’expression soutenue (élevée) de ces marqueurs après de multiples passages (Figure 3D).
Figure 1 : Aperçu de l’établissement, de l’entretien, de la caractérisation et du potentiel d’application des organoïdes de l’hypophyse saine et malade. AL, lobe antérieur; IL, lobe intermédiaire; PL, lobe postérieur; MZ, zone marginale; PitOM, milieu organoïde hypophysaire (créé avec BioRender.com). Les niches de cellules souches dans l’AL sont indiquées en violet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Isolement de l’hypophyse de la souris euthanasiée adulte. Images représentatives prises consécutivement après (A) la décapitation, (B) l’ablation de la peau de la tête (le pont nasal est encerclé), (C) l’ouverture du crâne et (D) l’ablation du cerveau, exposant l’hypophyse (encerclée). La flèche pointe vers le PL, qui est rejeté (avec l’IL associé), laissant l’AL pour l’isolement et la dissociation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Établissement et validation d’organoïdes dérivés de l’AL. (A) Ensemencement des cellules AL et développement organoïde dans PitOM aux jours indiqués (passage 0). La rangée supérieure montre une croissance organoïde favorable, avec seulement des structures kystiques en développement. La rangée du bas montre une croissance défavorable avec une grande structure dense apparaissant (encadrée). Les pointes de flèches blanches indiquent les débris, les pointes de flèches noires indiquent les cellules uniques (agrandies en médaillon). (B) Fragments organoïdes (agrandis en médaillon) ensemencés au passage (Jour 0) et repousse des organoïdes observée 7 jours plus tard. La rangée supérieure montre une repousse organoïde favorable, avec seulement des structures kystiques en croissance. La rangée du bas montre une repousse défavorable avec des organoïdes denses prenant le contrôle de la culture. (C) Coloration par immunofluorescence de E-Cad, SOX2, TROP2 (tous rouges), CK8/18, LHX3 et Ki67 (tous verts) dans les organoïdes dérivés de l’AL. Les noyaux sont marqués avec Hoechst33342 (bleu). Les pointes de flèche indiquent les cellules Ki67+. Les barres d’échelle sont indiquées. (D) Analyse de l’expression génique des marqueurs de stemness (Sox2, Cdh1, Krt8, Krt18, Trop2) et des facteurs de transcription du développement (Pitx1, Pitx2) dans les organoïdes primaires al et dérivés de l’AL (passage 0 signifie 14 jours après l’ensemencement cellulaire) déterminés par RT-qPCR (moyenne ± SEM). Les points de données représentent des répliques biologiques. Les valeurs du seuil du cycle delta (dCT) sont affichées, calculées à l’aide de la formule: CT (gène d’intérêt) - CT (gène d’entretien Actb). Plus la valeur dCT (qui est présentée sur l’axe Y en dessous de l’axe X zéro) est positive, plus le niveau d’expression du gène d’intérêt est bas. Plus la valeur dCT est faible (ou négative), plus le niveau d’expression 14,18,21,22 est élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Milieu organoïde hypophysaire (PitOM) | |
| Composant | Concentration |
| DMEM/F12 avancé | |
| Hepes | 1% |
| Pénicilline-Streptomycine | 1% |
| Glutamax | 1% |
| Supplément B-27 (50X), moins vitamine A | 1X |
| L-Glutamine (200 mM) | 2 mM |
| Protéine FGF humaine recombinante de base/FGF2/bFGF (157 aa) | 20 ng/mL |
| IGF-1 humain recombinant | 100 ng/mL |
| Supplément N-2 (100X) | 1X |
| N-acétyl-cystéine | 1,25 mM |
| FGF-8b humain/murin recombinant | 200 ng/mL |
| FGF-10 humain recombinant | 100 ng/mL |
| A83-01 (inhibiteur de la kinase 4/5/7 de type récepteur de l’activine) | 0,50 μM |
| Souris recombinante Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | 100 ng/mL |
| Protéine EGF humaine recombinante, FK | 50 ng/mL |
| SB202190 (inhibiteur de la protéine kinase activé par le mitogène p38) | 10 μM |
| Noggin humain recombinant | 100 ng/mL |
| Toxine cholérique de Vibrio cholerae | 100 ng/mL |
| R-Spondine-1 humaine recombinante | 200 ng/mL |
| IL-6 humain recombinant | 20 ng/mL |
Tableau 1. Composition de PitOM. PitOM est filtré à travers un filtre maillé de 0,22 μm et stocké à 4 °C pendant un maximum de 2 semaines.
| Moyenne A | |
| Composant | Quantité |
| DMEM, poudre, glucose élevé | 13,38 g |
| HEPES | 5,96 g |
| Pyruvate de sodium (C3H3NaO3) | 0,11 g |
| Sel de sodium de pénicilline G | 35,00 mg |
| Sel de sulfate de streptomycine | 50,00 mg |
| Chlorure de sodium (NaCl) | 0,50 g |
| Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) | 1,00 g |
| Albumine bovine (qualité de culture cellulaire) | 3,00 g |
| Eau stérile | 1,00 L |
| Moyen C | |
| Composant | Quantité |
| Chlorure de sodium (NaCl) | 7,50 g |
| Chlorure de potassium (KCl) | 0,40 g |
| Di-hydrogénophosphate de sodium 1-hydrate | 0,14 g |
| D-glucose | 1,00 g |
| HEPES | 4,76 g |
| Sel de sulfate de streptomycine | 50,00 mg |
| Sel de sodium de pénicilline G | 35,00 mg |
| Phénol rouge | 10,00 mg |
| Albumine bovine (qualité de culture cellulaire) | 3,00 g |
| Hydrogénocarbonate de sodium (NaHCO3) | 1,00 g |
| Eau stérile | 1,00 L |
| Moyen B | |
| Composant | Quantité |
| Titriplex III (Sel disodique d’édétate dihydraté) | 0,74 g |
| Moyen C | 100 mL |
Tableau 2. Composition des milieux A, B et C. Tous les milieux sont filtrés à travers un filtre maillé de 0,22 μm et stockés à 4 °C pendant un maximum de 4 mois. Le pH des milieux A et C doit être ajusté à 7,3.
| Milieu de cryoconservation | |
| Composant | Concentration |
| DMEM/F12 avancé | 60% |
| FBS (en anglais seulement) | 30% |
| DMSO | 10% |
Tableau 3. Composition du milieu de cryoconservation.
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Discussion
Les organoïdes dérivés de l’AL, tels que décrits ici, représentent un modèle de recherche puissant pour étudier les cellules souches hypophysaires in vitro. À l’heure actuelle, cette approche organoïde est le seul outil disponible pour développer et développer de manière fiable et robuste les cellules souches hypophysaires primaires. Un modèle organoïde hypophysaire dérivé de cellules souches embryonnaires (ESC) ou de cellules souches pluripotentes induites (IPSC) a été rapporté précédemment, qui récapitule étroitement l’organogenèse embryonnaire hypophysaire23; cependant, bien que très utile pour étudier le développement de l’hypophyse ou modéliser la maladie hypophysaire 23,24,25, le protocole rapporté, à partir de l’ESC / iPSC, prend beaucoup de temps par rapport au protocole décrit ici, et les organoïdes résultants ne sont pas non plus extensibles.
La culture réussie d’organoïdes de cellules souches hypophysaires dépend de certaines étapes critiques du protocole. Il est important de plaquer un nombre approprié de cellules lors de l’ensemencement initial des cellules. Un nombre très élevé donnera lieu à des cultures surpeuplées, ce qui détériore la viabilité des organoïdes et obstrue l’expansion complète des organoïdes, tandis qu’un très faible nombre de cellules entraînera une formation limitée d’organoïdes. De plus, il est important de ne pas perturber l’intégrité du dôme ECM une fois en culture. L’ajout et le retrait du milieu doivent être effectués très soigneusement, sans toucher la gouttelette de gel. De plus, le préchauffage du milieu de culture réduit le risque de dépolymérisation du gel. Enfin, le passage correct des organoïdes (c’est-à-dire la dissociation en fragments et non en cellules individuelles) est crucial pour une expansion efficace des cultures.
Ces organoïdes de cellules souches hypophysaires peuvent être exploités pour répondre à des questions concernant le phénotype, la biologie et la fonction des cellules souches. Ils se sont déjà avérés utiles pour découvrir de nouvelles caractéristiques des cellules souches ainsi que des marqueurs de l’activation des cellules souches associées aux dommages hypophysaires et comme outil de lecture de l’activité des cellules souches (Figure 1)14,18. Les efforts actuels comprennent leur dérivation de l’hypophyse malade, comme l’hypopituitarisme et les PitNET (Figure 1). Finalement, les organoïdes peuvent également être engagés dans une plate-forme de dépistage de médicaments, comme cela a été établi avec succès pour d’autres maladies26,27. Par conséquent, une mise à l’échelle supplémentaire des cultures organoïdes pour atteindre une analyse à haut débit sera nécessaire. Il a déjà été remarqué que les organoïdes dérivés de l’AL peuvent être cultivés efficacement dans un format à 96 puits, ce qui donne également des cultures plus homogènes.
Il a été observé qu’après ~10 passages (correspondant à 3 mois de culture), l’efficacité de la croissance organoïde diminuait progressivement avec des organoïdes repoussant à un nombre inférieur et à une taille plus petite. Ce déclin de croissance peut être inhérent à la nature intrinsèque des cellules souches hypophysaires, qui peuvent ne pas avoir besoin de s’auto-renouveler plusieurs fois dans la glande in vivo, qui ne se retourne que lentement, s’épuisant ainsi après quelques rondes de division16,28. Bien que ce déclin éventuel de la croissance puisse être considéré comme une limitation, le modèle est très utile puisque l’expansion organoïde au cours des passages précédents est plus que suffisante pour des analyses approfondies en aval.
Un autre aspect qui pourrait être considéré comme une limitation est que les organoïdes de cellules souches hypophysaires ne présentent pas une capacité de différenciation importante vers les types de cellules endocriniennes de l’AL, même après la xénogreffe sous la capsule rénale de souris immunodéficientes (ce qui a entraîné un nombre limité de cellules GH+ et PRL+ comme décrit en détail dans la référence18). Soit les conditions in vitro appropriées pour conduire les cellules souches à la différenciation ne sont pas encore identifiées, soit le rôle majeur des cellules souches (en particulier dans la glande adulte) n’est pas situé dans la génération de nouvelles cellules endocriniennes (car probablement pas nécessaire dans la glande paresseuse, mais seulement dans des conditions perturbées ou contestées)9,10,14, 18. Au lieu de cela, la fonction principale peut être située dans d’autres aspects biologiques (p. ex., signalisation paracrine au progéniteur hormonal/précurseur ou aux cellules matures dans des conditions basiques, mais probablement plus actives (développement, réparation, maladie)13,16. En effet, bien qu’il ait été démontré que les cellules souches hypophysaires possèdent une capacité de différenciation multipotente, en particulier pendant la période embryonnaire et néonatale, il est concevable que les cellules souches de la glande adulte ne maintiennent pas (doivent) maintenir cette capacité, étant donné le très faible renouvellement de la glande adulte16,28. Il est possible que les cellules souches hypophysaires adultes agissent davantage comme un centre de signalisation paracrine, impliqué dans la stimulation ou la régulation des cellules progénitrices/précurseurs/endocriniennes environnantes13,16. Par conséquent, une différenciation robuste des organoïdes de cellules souches hypophysaires aboutissant à la sécrétion d’hormones peut être une attente erronée qui ne sera jamais atteinte.
Pris ensemble, le protocole présenté ici offre un outil rapidement applicable et fiable pour étendre de manière robuste les cellules souches hypophysaires primaires dans un cadre 3D in vitro. Le protocole donne naissance à des organoïdes qui capturent fidèlement le phénotype des cellules souches hypophysaires. Le système a déjà été appliqué avec succès pour étudier la biologie et l’activation des cellules souches hypophysaires 14,18, et les résultats sont hautement traduisibles à la situation in vivo.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du Ku Leuven Research Fund et du Fund for Scientific Research (FWO) - Flandre. E.L. (11A3320N) et C.N. (1S14218N) sont soutenus par une bourse de doctorat de la FWO / FWO-SB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
References
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