Summary
本プロトコルは、ラットにおける鎖骨下静脈から血液を採取するための簡便かつ効率的な方法を記載する。麻酔なしで迅速、タイムリー、簡単に識別できるサンプリングを可能にし、繰り返しのサンプル収集を通じて高品質の血液を取得します。
Abstract
ラットは、薬物曝露を検出するために特定の時点で一定量の血液を採取する必要がある薬物動態(PK)およびトキシコキネティクス(TK)研究で広く使用されています。ラット採血法は血漿の質を決定し、さらに試験結果の精度に影響を与えます。このプロトコルに記載されている鎖骨下静脈採血方法は、PKおよびTKテストのニーズを満たすために、動物の意識状態で血液サンプルを繰り返し収集します。拘束操作のスキルと針切開の適切な手順により、採血の成功率が保証されます。プラズマの品質を確保しながら操作が簡単で、同時に動物福祉にも対応しています。ただし、この方法には熟練した操作が必要であり、不適切な方法は動物の脱力感、痛み、跛行、さらには死亡率を引き起こす可能性があります。現在の方法は、TKのSprague Dawley(SD)ラットを対象とした4週間の経口毒性試験の試験施設で使用されています。24時間以内に収集された血液の最大量は、動物の総血液の20%を超えませんでした。.動物の体重は雄と雌で200 g以上でした。データは、動物の体重が毎週着実に増加し、反復サンプル収集後の臨床観察は正常であることを示しました。
Introduction
ヒト用医薬品の登録に関する技術要件の調和に関する国際会議(ICH)ガイドライン1 および国家医療製品局(NMPA)ガイドライン2によると、トキシコキネティック(TK)研究におけるラットの採血時点の数は、動的薬物曝露評価の要件を満たす必要があります。ラットのおおよその総血液量は55-70 mL / kg体重です3。収集時間ポイントは通常、投与後30分以内に集中し、その後減少し、定期検査では48時間以内に10を超える血液サンプルを収集する必要があります4。例えば、血液サンプルは、経口投与薬物のTK研究において、12時点(0分、5分、10分、15分、30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、8時間、および12時間)で収集される。研究者は、TKテスト5用の高品質の血漿を得るために、ラットで200〜250μLの血液を繰り返し採取する必要があります。
ラットの採血部位には、尾血管、眼窩後神経叢静脈、顎下静脈、心臓、腹部大動脈6などがあります。その中で、ラットの尾静脈からの採血は頻繁に使用される方法であり、これは経験豊富で熟練したオペレータを必要とする7,8。眼窩後神経叢静脈から血液を採取することはそれほど複雑ではありません。ただし、この方法はラットの視力を損なう可能性があり9、心臓と腹部大動脈からの血液は最終的な採血にのみ適しているため、推奨されません10。意識のあるラットの顎下静脈から血液を採取する別の方法は、より多くの合併症を引き起こすことが示されており、不十分な血液サンプルの質を明らかにしました11。したがって、研究者はサンプリングの難しさを減らすために動物に麻酔をかけるかもしれません。それでも、麻酔はまた、実験のコストを増加させ、より深刻なことに、それはラット12の代謝状態に影響を及ぼすであろう。本プロトコルは、麻酔なしでラットの鎖骨下静脈で採血する迅速かつ簡単な方法を使用しており、正確な位置決めと両側交互採血を可能にし、タイムリーかつ繰り返し高品質のサンプルを取得します。
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Protocol
記載された全ての動物実験は、広東省ルーウィン製薬研究所株式会社の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認された雄および雌のSprague Dawley(SD)ラットを、~6〜11週間実験に使用した。ラットは、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って飼育されました13。
1.動物の準備
注:この研究で使用されたすべてのSDラットは覚醒しており、麻酔/安楽死されていませんでした。動物の背中の皮膚をつかんで拘束するスキルが必要です。
- ラットの首と前肢の間の鎖骨下三角窩の最下点を見つけます。頭部に向かって~2〜3 mm移動し、採血部位の針先に到達します(図1)。電気かみそりを使用して髪を取り除きます。
注:実験のニーズに応じて、血清または血漿が必要になる場合があります。血漿はこのプロトコルの例として取り上げられており、採血の操作には影響しません。 - 拭き取りと消毒には75%アルコールで染色した綿棒を用意し、拭き取りには乾いた綿棒を用意します。
2.採血
注:採血とラット拘束技術の経験が必要な少なくとも2人がこれらの手順を実行する必要があります。
- 片手で首の後ろの皮膚をつかみ、ラットの頭、首、胸を直立させ、注射部位を露出させます(ビデオ1)。注射部位の側面の前肢をまっすぐにして、そのレベルを維持します。
- もう一方の手で注射器をラットの頭と平行に保ち、先端が腹側に傾くように注射器を外側に5°〜10°傾けます。
- 針を前腔に完全に挿入します。シリンジを引き戻して、チューブ内の負圧を維持します。
- 針をゆっくりと深いものから浅いところに動かし、同じ経路に戻ります。血液が注射針に入ったら、針の位置を固定します(ビデオ2)。
注意: 図 2A (正面図)および 図2B (側面図)に示すように、血液はシリンジ内で一定の速度で充填されます。 - 施設の動物管理および使用委員会によって設定された基準に従って、最大血液量を監視します。これは動物の体重と健康状態によって異なります。他の要件がない場合は、24時間以内に動物の総血液量の20%以上を除去しないでください、これは~3週間の回復を必要とします14。
- 十分な血液サンプルが採取されたら、すぐにシリンジを引き出し、血液治療の準備をします(ステップ3)。
- ラットの注射部位を~1〜2分間加圧して、出血を止めます。採取部位は首の下部にあるため、鎖骨下静脈の皮膚をつまんで押して出血を止めます(図3)。
注:繰り返し採血が必要な場合は、両側鎖骨下静脈から交互に採血することができます。 - ラットをケージに戻し、その状態を観察します。
3.血液サンプルの処理
- 注射器から針を取り外し、鋭利な道具容器に捨てます。シリンジから1.5mLチューブに血液をゆっくりと移します。シリンジを壁に押し付けて、気泡の形成を防ぎます。
注意: 圧力によって赤血球が破裂する可能性があるため、溶血を防ぐために針を外してください14。 - 微量遠心チューブを覆い、そっとフリックし、少なくとも5回逆さまにして、血液と抗凝固剤を完全に混合します。
- 血漿を収集してから120分以内に、全血サンプルを室温で2000 x g で~10〜15分間遠心分離します。
- ピペットガン( 材料表を参照)を使用して、上部プラズマを空のマイクロ遠心チューブに移します。下部の全血でピペットヘッドに触れないでください。赤血球で汚染された血漿を廃棄または再遠心分離します。.
- サンプルはすぐに使用するか、-30°Cで保管してください。
注:薬の特性が貯蔵時間を決定します。鎖骨下静脈から得られた血漿標本は半透明で淡黄色である。溶血は血漿を赤くすることがあります。
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Representative Results
鎖骨下静脈からの良好な血漿サンプルは、半透明の淡黄色であった(図4、左管)。不適切な採血または操作により溶血を引き起こしました(図4、右管)。
試験施設のデータによると、TKのSDラットの点眼薬の4週間の経口毒性試験では、血液サンプルが最初(1日目)と最後の投与日(28日目)の間の9つの時点(0時間、0.167時間、0.5時間、1時間、2時間、4時間、8時間、12時間、および24時間)で2回収集されました。TKB、TKC、TKDラットの投与量はそれぞれ10 mg/kg、30 mg/kg、100 mg/kgであり、投与量は10 mL / kgでした。.最初の採取時の採血量は~0.2mL,年齢は~6-7週,雄の体重は~268-297g,雌の体重は~214-239gであった。最終採取時の血液量は~0.3 mL、年齢は~10-11週、雄の体重は~376-462 g、雌の体重は~254-300 gであった。TK採血の2回の間に28日の間隔がありました。動物の体重は毎週着実に増加し、臨床観察は正常でした。250gラットの総血液量は約16mL15であり、24時間以内に収集された血液の最大量は動物の全血液の20%を超えなかった。雌動物の体重データを表 1に、雄動物の体重データを 表2に示す。
図1:採血部位の針先の描写。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:採血プロセス。 血液はスムーズに得られました。(A)正面図。(B)側面図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:止血法の表現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:遠心分離後の検体外観。 左のチューブは、適格なプラズマ画像を示した。右管は溶血試料を示した。プラズマはピンクまたは赤に見えました。色が濃いほど、溶血率は高くなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:鎖骨下静脈の解剖学的構造。 この静脈は鎖骨の下にあり、針は鎖骨下の三角形の窩を0.5 cm以下通過しただけでそれに達することができます。内頸静脈、椎骨静脈、外頸静脈を結合して頭蓋静脈を形成します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:雌動物の体重データ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:雄動物の体重データ。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:ラットの採血プロセスのトップダウンビュー。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:ラットの採血プロセスの側面図。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
鎖骨下静脈から血液を採取することには一定の利点があります。(1)採血部位は容易に解離し、ラットの姿勢が異なるために静脈叢が規則的ではないため、記載された方法は、ラットの安定した快適な姿勢を維持しながら静脈叢の位置を容易に局在化することができる。(2)操作が簡単で、技術者のスキルの急速な発達に有利であり、動物への苦痛が少ない。(3)動物を快適にするための動作モードは、落ち着きのない行動を大幅に減らし、血しぶきを防ぎます。(4)高速(20秒)、高効率、低コスト、麻酔なしの採血方法であり、動物麻酔のリスクと動物福祉の観点から拘束時間を軽減します。
このプロトコルでは、ラットは拘束の過程で快適に保たれ、取り扱い時に適度にリラックスし、長時間の接触を避けます。取り扱いが緩いと、ラットが素早く動くことができ、動物や人に偶発的な怪我を引き起こす可能性があります。それどころか、それはラットに低酸素症を引き起こす可能性があります。サンプリング部位を押しながら出血を止めることが不可欠です。オペレーターは動物を腕に抱き、暗闇の中で動物を滑らかにします。さらに、採血中は陰圧が高すぎてはいけません。そうしないと、採血不良につながります。PKおよびTK研究は繰り返し採血を必要とするため、血液量は異なる動物の体重および健康状態に応じて制御されなければならない。一方、代替採血サイトは動物福祉に利益をもたらします。動物が小さいか弱い場合は、試験で許可されている条件下でブドウ糖やその他のサプリメントを適切に提供されます。針の入口は滑らかで抵抗がない必要があり、採取する血液がない場合、または抵抗がない場合は、針をわずかに調整した方向に再挿入するか、側面を変更する必要があります。採血工程では、挿入から2回採取した血液を混合しないようにする必要があります。最初の注射のための血液サンプル量が不十分な場合、2回目の注射が必要であり、注射器を交換する必要があり、溶血の場合に再び採取された血液のために交換用チューブを採取する。すぐに採血を終えることをお勧めします。シリンジ内の血液は壁に取り付けられ、プロセス中の気泡を避けるために採血管に注入されます。タイムリーに採血するには、オペレーターは採取の2分前に完全に準備し、その1分前に注射する必要があります。動物が協力的でない、または操作が難しい場合は、事前になだめる必要があります。したがって、資格のある技術者のグループが必要です。
腕神経叢は鎖骨下静脈に対して垂直であり、鎖骨下静脈の背後にあるため、不適切な操作は腕神経叢の損傷、前肢の痛み、跛行、ひるみ、およびその他の有害な症状につながる可能性があります16。この手法はモルモットにも適用でき、モルモット実験での採血ニーズを満たすことができますが、この方法でモルモットから採血するにはさらなる研究が必要です。
鎖骨下静脈の解剖学的構造を 図5に示します。鎖骨下静脈は鎖骨の下にあり、針は鎖骨下三角窩を0.5 cm以下通過するだけで鎖骨下静脈に到達できます。したがって、この方法は危険であり、資格のある専門家が必要です。資格のない専門家は、動物の多動性、制御の困難さ、血液循環不良、動物の衰弱、さらには連続採血後の死亡率をもたらします。誤った手術は胸部や動脈にも損傷を与えます。その結果、実験を成功させるには、資格のある専門家を関与させることが重要です。
結論として、このプロトコルは、ラットの鎖骨下静脈から血液を採取するための代替方法を提示し、PKおよびTK研究に技術サポートを提供します。
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Disclosures
Limei Wang、Jianmin Guo、Xiaoman Zhong、Yali Sheng、Qiwen Lai、Hui Song、Wei Yangは、Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd.に金銭的利害関係を持っていますが、この作業をサポートしていませんでした。他の著者は、競合する利益を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、広東省医薬品非臨床評価研究重点研究所(No.2018B030323024)および広東省重点研究開発計画の主要プログラム「新薬創出」(No.2019B020202001)、広州基礎応用基盤研究プロジェクト(No.202002030249およびNo.202002030156)から資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
