Summary
Настоящий протокол описывает простой и эффективный метод сбора крови из подключичной вены у крыс. Он обеспечивает быстрый, своевременный и легко идентифицируемый отбор проб без анестезии и получение высококачественной крови путем повторного отбора образцов.
Abstract
Крысы широко используются в фармакокинетических (ПК) и токсикокинетических (ТЗ) исследованиях, которые должны собирать определенное количество крови в определенные моменты времени для обнаружения воздействия лекарств. Метод забора крови крыс определяет качество плазмы и дополнительно влияет на точность результатов теста. Метод сбора крови в подключичных вен, описанный в этом протоколе, многократно собирает образцы крови в сознательном состоянии животных для удовлетворения потребностей тестов на ПК и ТЗ. Навыки удерживающего обращения и соответствующая процедура разреза иглы обеспечивают успешность забора крови. Он прост в эксплуатации, обеспечивая при этом качество плазмы и в то же время заботясь о благополучии животных. Однако этот метод требует квалифицированной операции, а неправильный может вызвать у животных слабость, боль, хромоту и даже смертность. Текущий метод был использован в испытательном центре для 4-недельного исследования пероральной токсичности на крысах Sprague Dawley (SD) с ТЗ. Максимальное количество крови, собранной в течение 24 ч, не превышало 20% от общей крови животного. Масса тела животных составляла более 200 г у самцов и самок. Данные показали, что масса тела животных неуклонно увеличивалась каждую неделю, и клиническое наблюдение было нормальным после повторяющегося сбора образцов.
Introduction
В соответствии с руководящими принципами1 Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации лекарственных средств для использования человеком (ICH) и руководящимипринципами 2 Национального управления по медицинским изделиям (NMPA), количество временных точек сбора крови крыс в токсикокинетическом (TK) исследовании должно соответствовать требованиям динамической оценки воздействия лекарственных средств. Приблизительный общий объем крови крысы составляет 55-70 мл/кг массы тела3. Точки времени сбора, как правило, интенсивны в течение 30 минут после дозирования и уменьшаются после этого, и более десяти образцов крови должны быть собраны в течение 48 часов в обычном тестировании4. Например, образцы крови собирают в 12-ти временных точках (0 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч, 8 ч и 12 ч) при исследовании ТЗ перорально вводимых препаратов. Исследователи должны неоднократно собирать 200-250 мкл крови у крыс, чтобы получить высококачественную плазму для тестирования ТЗ5.
Участки сбора крови у крыс включают хвостовые кровеносные сосуды, ретроорбитальную сплетение, подчелюстную вену, сердце, брюшную аорту6 и так далее. Среди них сбор крови из каудальной вены крыс является часто используемым методом, который требует опытных и квалифицированных операторов 7,8. Собрать кровь из ретроорбитального сплетения вены менее сложно; однако этот метод не рекомендуется, так как он может повредить зрение крыс9, а кровь из сердца и брюшной аорты подходит только для окончательного забора крови10. Было показано, что другой метод сбора крови из подчелюстной вены у сознательной крысы приводит к большему количеству осложнений и выявил недостаточное качество образца крови11. Поэтому исследователи могут обезболить животное, чтобы уменьшить сложность отбора проб. Тем не менее, анестезия также увеличивает стоимость эксперимента, и что более серьезно, это повлияет на метаболическое состояние крыс12. Настоящий протокол использует быстрый и простой метод сбора крови в подключичных венах крыс без анестезии, что позволяет точно позиционировать и двусторонний переменный сбор крови для получения высококачественных образцов своевременным и повторным образом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Для экспериментов использовались самцы и самки крыс Sprague Dawley (SD), ~ 6-11 недель. Крысы были выращены в соответствии с рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных13.
1. Подготовка животных
ПРИМЕЧАНИЕ: Все крысы SD, используемые в этом исследовании, бодрствовали и не были обезболены / усыплены. Необходимо умение удерживать обращение, хватаясь за кожу на спине животного.
- Найдите самую нижнюю точку подключичной треугольной ямки между шеей и передней конечностью у крысы. Переместите ~2-3 мм в сторону головы и дойдите до точки иглы в месте сбора крови (рисунок 1). Удалите волосы с помощью электробритвы.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальных потребностей может потребоваться сыворотка или плазма. Плазма берется в качестве примера в этом протоколе, и это не повлияет на операцию забора крови. - Подготовьте ватные палочки, окрашенные 75% спиртом для протирания и дезинфекции и сухие ватные палочки для протирания.
2. Забор крови
ПРИМЕЧАНИЕ: По крайней мере, 2 человека, оба из которых должны иметь опыт в сборе крови и методах сдерживания крыс, должны выполнить эти шаги.
- Захватите кожу на задней части шеи одной рукой, чтобы держать голову, шею и грудь крысы в вертикальном положении и обнажите место инъекции (видео 1). Выпрямите переднюю конечность со стороны места инъекции для поддержания ее уровня.
- Держите шприц параллельно голове крысы другой рукой и наклоните шприц наружу на 5°-10° так, чтобы кончик был наклонен в вентральное направление.
- Вставьте иглу полностью в переднюю полость. Оттяните шприц назад, чтобы поддерживать отрицательное давление внутри трубки.
- Медленно переместите иглу с глубины на мелководье и вернитесь вверх по тому же пути. Когда кровь попала в шприц-иглу, зафиксируйте положение иглы (Видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Затем кровь будет заполнена с постоянной скоростью в шприце, как показано на рисунке 2A (вид спереди) и рисунке 2B (вид сбоку). - Контролировать максимальное количество крови в соответствии со стандартами, установленными комитетом по уходу и использованию животных учреждения. Это зависит от веса и здоровья животного. При отсутствии других требований не удаляйте более 20% от общего объема крови животного в течение 24 ч, что требует ~3 недель восстановления14.
- Когда будет собран достаточный образец крови, немедленно извлеките шприц и подготовьтесь к лечению крови (шаг 3).
- Давление на место инъекции крысы в течение ~ 1-2 мин, чтобы остановить кровотечение. Поскольку место сбора находится в нижней части шеи, защемите кожу подключичной вены, чтобы остановить кровотечение, надавливая на нее (рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь может быть собрана поочередно из двусторонней подключичной вены, когда необходим повторный забор крови. - Верните крысу в клетку и понаблюдайте за ее состоянием.
3. Обработка образца крови
- Извлеките иглу из шприца и выбросьте ее в острый контейнер для инструмента. Медленно перенесите кровь из шприца в пробирку объемом 1,5 мл. Прижмите шприц к стенке, чтобы избежать образования пузырьков, если таковые имеются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку давление может привести к разрыву эритроцитов, удалите иглу, чтобы предотвратить гемолиз14. - Накройте трубку микроцентрифуги, осторожно проведите ею и переверните вверх дном не менее пяти раз, чтобы тщательно смешать кровь с антикоагулянтом.
- Центрифугируют образец цельной крови при 2000 х г в течение ~10-15 мин при комнатной температуре в течение 120 мин после сбора плазмы.
- Используйте пипетку (см. Таблицу материалов) для переноса верхней плазмы в пустую микроцентрифужную трубку. Не прикасайтесь к головке пипетки с нижней цельной кровью. Утилизируйте или повторно центрифугируйте плазму, загрязненную эритроцитами.
- Используйте образцы немедленно или храните их при -30 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики препарата определяют время хранения. Образцы плазмы, полученные из подключичной вены, полупрозрачные и светло-желтые. Гемолиз может превратить плазму в красный цвет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Хорошие образцы плазмы из подключичной жилы были полупрозрачными бледно-желтыми (рисунок 4, левая трубка). Неправильный забор крови или манипуляции привели к гемолизу (рисунок 4, правая трубка).
Данные испытательного центра показали, что в 4-недельном исследовании пероральной токсичности глазной капли у крыс СД с ТЗ образцы крови были собраны дважды в 9-временных точках (0 ч, 0,167 ч, 0,5 ч, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч и 24 ч) между первым (День 1) и последним днем дозирования (День 28). Дозировка для крыс tKB, TKC и TKD составляла 10 мг/кг, 30 мг/кг и 100 мг/кг соответственно, а объем дозы составлял 10 мл/кг. Объем сбора крови первого забора составил ~0,2 мл, возраст животного ~ 6-7 недель, масса тела самца животного ~ 268-297 г, а самки ~ 214-239 г. Объем крови последнего образца составил ~0,3 мл, возраст животного ~ 10-11 недель, масса тела самца животного ~ 376-462 г, а самки животного ~ 254-300 г. Между двумя периодами сбора крови из ТЗ был интервал в 28 дней. Масса тела животных неуклонно увеличивалась каждую неделю, и клиническое наблюдение было нормальным. Общее количество крови крысы весом 250 г составляет около 16 мл15, а максимальное количество крови, собранной в течение 24 ч, не превышало 20% от общей крови животного. Данные о массе тела самок животных приведены в таблице 1, а данные о массе тела самцов животных приведены в таблице 2.
Рисунок 1: Изображение точки иглы сайта сбора крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процесс экстракции крови. Кровь получалась плавно. (А) Вид спереди. (B) Вид сбоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Представление метода гемостаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Внешний вид образца после центрифугирования. Левая трубка показала квалифицированное плазменное изображение. Правая трубка показала образец гемолиза. Плазма выглядела розовой или красной. Чем темнее цвет, тем выше скорость гемолиза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Анатомия подключичной вены. Эта вена расположена под ключицей, и игла может дойти до нее, только что пройдя через подключичную треугольную ямку не более чем на 0,5 см. Он соединяет внутреннюю яремную вену, позвоночную вену и наружную яремную вену, образуя вену черепной вены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Данные о массе тела самок животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Таблица 2: Данные о массе тела самцов животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Видео 1: Вид сверху вниз процесса забора крови крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Видео 2: Вид сбоку процесса забора крови крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существуют определенные преимущества сбора крови из подключичных вен. (1) Поскольку место сбора крови легко диссоциируется, а венозное сплетение не является регулярным из-за различных поз крыс, описанный метод может легко локализовать положение венозного сплетения при сохранении стабильных и удобных поз крыс. (2) Операция проста и благоприятна для быстрого развития навыков техников и меньшей боли для животных. (3) Режим работы, позволяющий животному чувствовать себя комфортно, значительно снижает беспокойное поведение и предотвращает разбрызгивание крови. (4) Это метод забора крови с высокой скоростью (20 с), высокой эффективностью, низкой стоимостью и без анестезии, который снижает риск анестезии животных и время ограничения с точки зрения благополучия животных.
В этом протоколе крысы чувствуют себя комфортно в процессе сдерживания, умеренно расслабляясь при обращении и избегая длительного прикосновения. Свободное обращение позволяет крысам быстро передвигаться и может привести к случайным травмам животных или людей; напротив, это может вызвать гипоксию у крыс. Важно остановить кровотечение при надавливании на место забора проб. Операторы держат животное на руках, чтобы сгладить его в темноте. Кроме того, отрицательное давление не должно быть слишком высоким во время забора крови; в противном случае это приведет к плохому забору крови. Поскольку исследования ФК и ТЗ требуют повторного забора крови, объем крови должен контролироваться в соответствии с различным весом животных и состоянием здоровья; Между тем, альтернативное место сбора крови принесет пользу благополучию животных. Если животные маленькие или слабые, они обеспечиваются глюкозой и другими добавками соответствующим образом в условиях, разрешенных тестом. Входное отверстие иглы должно быть гладким и свободным от сопротивления, и когда нет крови для сбора или нет сопротивления, иглу следует повторно вставить в слегка отрегулированном направлении или изменить стороны. В процессе забора крови необходимо избегать смешивания крови, взятой дважды от введения. Когда объем образца крови для первой инъекции недостаточен, требуется вторая инъекция, шприц нужно заменить, а замещающую трубку взять для крови, собранной повторно в случае гемолиза. Рекомендуется закончить сбор крови сразу. Кровь в шприце прикрепляется к стенке и вводится в трубку для сбора крови, чтобы избежать пузырьков во время процесса. Для своевременного забора крови оператору необходимо быть полностью подготовленным за 2 мин до сбора и вводить за 1 мин до этого. Когда животное менее сговорчиво или сложно работать, его необходимо успокоить заранее. Следовательно, должна быть группа квалифицированных техников.
Плечевое сплетение перпендикулярно и позади подключичной вены, поэтому неправильная операция может привести к травме плечевого сплетения, боли в передней конечности, хромоте, вздрагиванию и другим неблагоприятным симптомам16. Этот метод также может быть применен к морским свинкам и удовлетворить потребности в сборе крови в экспериментах с морскими свинками, но необходимы дальнейшие исследования для забора крови у морских свинок этим методом.
Анатомия подключичной вены показана на рисунке 5. Подключичная вена расположена под ключицей, и игла может дойти до нее, просто пройдя через подключичную треугольную ямку размером не более 0,5 см. Поэтому метод является рискованным и требует квалифицированного специалиста. Неквалифицированный специалист приведет к гиперактивности животных, трудностям в контроле, плохому кровообращению, слабости животных или даже смертности после серийного сбора крови. Неправильная операция также повредит грудную клетку или артерию. В результате крайне важно привлечь квалифицированного специалиста для достижения успешного эксперимента.
В заключение, данный протокол представляет собой альтернативный метод сбора крови из подключичной вены крыс, который обеспечивает техническую поддержку исследований ПК и ТЗ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Лимей Ван, Цзяньминь Го, Сяомань Чжун, Яли Шэн, Цивэнь Лай, Хуэй Сун и Вэй Ян имеют финансовую долю в Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, которая, однако, не поддержала эту работу. Другие авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось Ключевой лабораторией доклинической оценки и исследований лекарственных средств провинции Гуандун (No 2018B030323024) и Ключевой программой «Создание новых лекарств» Плана клинических исследований и разработок Гуандун (No 2019B020202001), Исследовательский проект Фонда фундаментальных и прикладных программ Гуанчжоу (No 202002030249 и No 202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
