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Biology

Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63445
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Mycology, Department of Earth and Environmental Sciences, University of Pavia

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para el cribado de la biodiversidad del suelo para buscar cepas de hongos involucradas en la degradación de materiales recalcitrantes. En primer lugar, se aíslan cepas fúngicas capaces de crecer con ácidos húmicos o lignocelulosa. Su actividad se prueba tanto en ensayos enzimáticos como en contaminantes como hidrocarburos y plásticos.

Abstract

La contaminación ambiental es un problema creciente, y la identificación de hongos involucrados en el proceso de biorremediación es una tarea esencial. El suelo alberga una increíble diversidad de vida microbiana y puede ser una buena fuente de estos hongos biorremediativos. Este trabajo tiene como objetivo la búsqueda de hongos del suelo con potencial de biorremediación mediante el uso de diferentes pruebas de cribado. Los medios de cultivo minerales suplementados con sustancias recalcitrantes como única fuente de carbono se utilizaron como pruebas de crecimiento. En primer lugar, las diluciones del suelo se enchaparon en placas de Petri con medio mineral modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa. Las colonias de hongos en crecimiento se aislaron y probaron en diferentes sustratos, como mezclas complejas de hidrocarburos (vaselina y aceite de motor usado) y polvos de diferentes polímeros plásticos (PET, PP, PS, PUR, PVC). Las pruebas enzimáticas cualitativas se asociaron con las pruebas de crecimiento para investigar la producción de esterasas, lacasas, peroxidasas y proteasas. Estas enzimas están involucradas en los principales procesos de degradación del material recalcitrante, y su secreción constitutiva por las cepas fúngicas examinadas podría tener el potencial de ser explotada para la biorremediación. Se aislaron y probaron más de 100 cepas, y se encontraron varios aislados con buen potencial de biorremediación. En conclusión, las pruebas de detección descritas son un método fácil y de bajo costo para identificar cepas de hongos con potencial de biorremediación del suelo. Además, es posible adaptar las pruebas de detección de diferentes contaminantes, de acuerdo con los requisitos, agregando otras sustancias recalcitrantes a los medios de cultivo mínimos.

Introduction

El suelo es un componente fundamental de la vida en la Tierra y es la base de muchos ecosistemas. Los minerales, la materia orgánica y los microorganismos en el suelo pueden considerarse como un sistema, con asociaciones e interacciones cercanas que ocurren entre ellos. Las interacciones de estos compuestos tienen un impacto importante en los procesos terrestres, la calidad ambiental y la salud de losecosistemas 1. La contaminación del suelo plantea graves problemas ambientales en todo el mundo. La aplicación indiscriminada, a largo plazo y excesiva de sustancias recalcitrantes y tóxicas, como pesticidas, productos derivados del petróleo, plásticos y otros productos químicos, tiene graves efectos en la ecología del suelo y, como resultado, puede alterar la microbiota del suelo. Las comunidades microbianas en los suelos están compuestas por una amplia gama de organismos en diferentes estados fisiológicos, siendo la mayoría bacterias y hongos. Muchos de los contaminantes en los suelos tienen estabilidad a mediano y largo plazo, y su persistencia puede conducir al desarrollo de mecanismos adaptativos que permitan a los microorganismos utilizar sustancias recalcitrantes como nutrientes 2,3. Estos microorganismos pueden, por lo tanto, ser considerados para las técnicas de biorremediación.

La biorremediación trata de mitigar los efectos de la contaminación mediante el uso de microorganismos y sus enzimas para la degradación o transformación de residuos en compuestos menos tóxicos o no tóxicos. Varias especies de arqueas, bacterias, algas y hongos poseen esta capacidad de biorremediación4. Como resultado de sus particulares acciones biodegradativas, los hongos son organismos especialmente prometedores para la biorremediación. Pueden atacar diferentes sustratos utilizando su red hifal, lo que les permite penetrar en la matriz del suelo de manera más eficiente que otros microorganismos. Además, pueden alcanzar intersticios inaccesibles donde los contaminantes son difíciles de eliminar5, y también pueden sobrevivir a bajos niveles de humedad6. Además, los hongos sintetizan diferentes casetes de enzimas inespecíficas, generalmente para degradar sustancias recalcitrantes naturales como la celulosa, la lignina y los ácidos húmicos. Aquellos que carecen del sustrato objetivo pueden estar involucrados en la degradación de una amplia gama de contaminantes recalcitrantes, como hidrocarburos, plásticos y pesticidas 7,8,9,10. Por lo tanto, aunque muchas especies de hongos ya han sido reportadas como agentes de biorremediación, existe un creciente interés en explorar especies que aún no se han estudiado para seleccionar candidatos para la biorremediación de sustancias contaminantes recalcitrantes. Las especies ya conocidas por tener propiedades de biorremediación pertenecen al filo Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 y Mucoromycota. Por ejemplo, los géneros Penicillium y Aspergillus son bien conocidos por estar involucrados en la degradación de hidrocarburos alifáticos13, diferentes polímeros plásticos 16,17,18, metales pesados19 y colorantes20. Del mismo modo, estudios realizados sobre hongos basidiomicetos, como Phanerochaete chrysosporium y Trametes versicolor, han revelado su implicación en la oxidación de materiales recalcitrantes como hidrocarburos aromáticos13 y plásticos21. Otro ejemplo de hongos implicados en los procesos de biodegradación son los zygomycetes Rhizopus spp., Mucor spp. y Cunninghamella spp.22,23. En particular, Cunninghamella es capaz de oxidar hidrocarburos aromáticos y se considera un organismo modelo para estudiar la desintoxicación de productos de una amplia gama de xenobióticos13.

Existen varias enzimas fúngicas implicadas en los principales procesos degradativos de materiales recalcitrantes 24,25, como la esterasa, la lacasa, la peroxidasa y la proteasa. Las lacasas son oxidasas que contienen cobre producidas en la célula y posteriormente secretadas, que permiten la oxidación de una variedad de compuestos fenólicos y aromáticos. Pueden degradar orto y para difenoles, los fenoles que contienen el grupo amino, la lignina y las diaminas que contienen el grupo arilo26. Las peroxidasas utilizan peróxido de hidrógeno como mediador para degradar la lignina y otros compuestos aromáticos. Hay muchas peroxidasas diferentes, pero las que tienen el mayor potencial para degradar sustancias tóxicas son la lignina peroxidasa y la manganeso peroxidasa27.

Las esterasas y proteasas pertenecen al grupo de las enzimas extracelulares o ectocelulares, que actúan fuera de sus células de origen pero que aún están unidas a ellas. Estas enzimas pueden catalizar la hidrólisis de moléculas recalcitrantes grandes en otras más pequeñas. Debido a su baja especificidad de sustrato, estas enzimas pueden desempeñar un papel clave en la biorremediación de diversos contaminantes, como colorantes textiles, efluentes liberados de las industrias de pulpa y papel y curtido de cuero, productos derivados del petróleo, plásticos y pesticidas 28,29,30.

Ya se han publicado varios métodos de cribado para seleccionar cepas fúngicas biorremediativas. Por ejemplo, el medio de agar a base de paja se ha utilizado para detectar hongos de podredumbre blanca con alto potencial en la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP)31; y se han colocado pequeños trozos de madera podrida sobre agar de extracto de malta (MEA) para aislar los hongos que pudren la madera32. Sin embargo, la mayoría de los métodos que ya se han propuesto seleccionan hongos muy específicos para su actividad de interés. Esta investigación propone un enfoque más amplio para seleccionar hongos del suelo con un rango de acción más amplio. El método se basa en el recubrimiento inicial de diluciones en serie de muestras de suelo en un medio modificado con ácidos húmicos o lignocelulosa mezclada con antibióticos para seleccionar hongos con la capacidad de degradar estas sustancias recalcitrantes naturales. Los ácidos húmicos y la lignocelulosa, de hecho, son sustancias que son extremadamente resistentes a la biodegradación ya que tienen estructuras moleculares muy complejas, y esto les permite ser excelentes indicadores de la capacidad degradativa de los hongos probados33,34. Posteriormente, los hongos seleccionados en las primeras pruebas se examinan para identificar aquellos con el potencial de degradar contaminantes específicos como la vaselina, el aceite de motor usado y los plásticos. Finalmente, se realizan pruebas enzimáticas cualitativas para detectar cepas fúngicas capaces de producir enzimas implicadas en los procesos de biodegradación de sustancias recalcitrantes. Para ello se realizan ensayos de proteasa y esterasa, mientras que el ácido gálico y el guaiacol se utilizan como indicadores de la producción de lacasa y otras enzimas ligninolíticas35,36. Estos sustratos se utilizan porque se ha encontrado una fuerte correlación entre la capacidad de los hongos para oxidarlos a su forma de color marrón y la posesión de la capacidad ligninolítica 37,38,39.

A través de estos protocolos, es posible aislar cepas fúngicas con alto potencial degradativo y un amplio espectro de acción directamente de muestras de suelo. El aislamiento de estas cepas fúngicas podría ayudar a encontrar nuevos candidatos para fines de biorremediación.

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Protocol

1. Selección de cepas de hongos capaces de degradar materiales recalcitrantes del suelo

  1. Preparación de solución antibiótica.
    1. Ponga penicilina (50 mg/L), estreptomicina (40 mg/L), clortetraciclina (40 mg/L), neomicina (100 mg/L) y cloranfenicol (100 mg/L) en 250 ml de agua estéril desionizada.
    2. Antes de agregar cloranfenicol a la solución antibiótica, disolverlo en 3 ml de etanol ≥99%.
    3. Coloque la solución antibiótica en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro de la solución durante 10 minutos. Guárdelo a 4 °C.
  2. Preparación de medios de crecimiento.
    1. Ponga 1 g de ácido húmico comercial, 3,26 g de caldo Bushnell-Haas (BH) y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y hágalo en autoclave durante 20 min a 121 °C (agar de ácido húmico).
    2. Coloque el agar de ácido húmico en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
    3. Poner 4 g de lignocelulosa, 3,26 g de BH y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (agar lignocelulosa).
    4. Coloque el agar de lignocelulosa en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
    5. Bajo un gabinete de flujo laminar, después de que los medios se hayan solidificado en las placas de Petri, transfiera 1 ml de la solución antibiótica a las placas preparadas utilizando una jeringa estéril con un filtro de 0,2 μm para esterilizarla.
    6. Distribuya la solución antibiótica uniformemente en las superficies de la placa utilizando un esparcidor celular desechable estéril en forma de L y déjela secar al aire debajo del gabinete de flujo laminar.
    7. Poner 20 g de caldo de extracto de malta y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y autoclave durante 20 min a 121 °C (agar de extracto de malta - MEA).
    8. Coloque el MEA en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
  3. Muestreo de suelos y diluciones de suelos.
    1. Muestree el suelo de interés a una profundidad de 10 cm, eliminando cualquier planta, hierba y hojas muertas de la capa superior, y colóquelo en bolsas estériles de polietileno.
    2. Después de llegar al laboratorio, tamice el suelo con una malla de 2 mm, eliminando las raíces y los restos de plantas.
    3. Si no es posible proceder con el análisis aguas abajo de inmediato, almacene las muestras de suelo tamizadas a 4 °C.
    4. Trabajando bajo un gabinete de flujo laminar, coloque 1 g del suelo tamizado en un tubo estéril de 15 ml con 10 ml de agua desionizada estéril (1 x 10-1 dilución). Agite el tubo horizontalmente durante 30 min.
    5. Debajo de un gabinete de flujo laminar, antes de que la suspensión se asiente, tome 1 ml de la dilución 1 x 10-1 con una pipeta estéril y transfiérala a 9 ml de agua desionizada en blanco (1 x 10-2 dilución). Vórtice a fondo.
    6. Antes de que la suspensión se asiente, tome 1 ml de la dilución 1 x 10-2 con una pipeta estéril y transfiérala a 9 ml de agua desionizada en blanco (1 x 10-3 dilución). Vórtice a fondo.
  4. Diluciones de suelo de chapado en medios selectivos.
    1. Trabajando bajo un gabinete de flujo laminar, recolecte 100 μL de la dilución 1 x 10-3 usando una micropipeta con un punto estéril y transfiérala a una placa de Petri de agar húmico. Haga esto durante al menos 4 o 5 placas de Petri.
    2. Distribuya la dilución uniformemente en la superficie de la placa de Petri utilizando un esparcidor celular desechable estéril en forma de L.
    3. Deje que se seque al aire durante 10-15 minutos debajo del gabinete de flujo laminar.
    4. Repita los pasos 1.4.1.-1.4.3. utilizando placas de Petri de lignocelulosa.
    5. Incubar a 25 °C en la oscuridad durante un máximo de 15 días.
  5. Aislamiento de colonias de hongos cultivadas de medios selectivos a medios de crecimiento.
    1. A partir de 3 días después de la preparación, revise las placas de Petri de medios selectivos preparadas diariamente para detectar cualquier crecimiento de colonias de hongos durante un máximo de 15 días.
    2. Verifique todas las colonias de hongos presentes para ver si hay similitudes. Si es necesario, prepare una diapositiva para ser observada bajo un microscopio de luz.
      NOTA: El objetivo es aislar el mayor número de colonias de hongos, pero es necesario evitar aislar siempre la misma cepa fúngica de diferentes placas, por lo que esta comprobación es muy importante. Busca colonias con diferente macro y micromorfología.
    3. Debajo de un gabinete de flujo laminar o en un quemador Bunsen, aísle cada cepa fúngica elegida retirando suavemente una pequeña parte del micelio de la colonia con una aguja de inoculación estéril y transfiriéndola a una nueva placa de Petri MEA.
      NOTA: En esta fase, es muy importante ser delicado y preciso porque existe un alto riesgo de contaminación de las otras colonias de hongos presentes en la placa de Petri original. Si crece más de una cepa fúngica en la placa MEA inoculada, repita el Paso 1.5.3.
    4. Incubar a 25 °C en la oscuridad durante 7 días. Estas son las cepas de hongos que se probarán más a fondo en sustancias recalcitrantes específicas.

2. Pruebas de crecimiento de sustancias recalcitrantes

  1. Prueba de crecimiento en vaselina.
    1. Transfiera 20 ml de BH líquido (3,26 g/L de BH) a viales de 50 ml y esterilícelos en autoclave a 121 °C durante 20 min.
    2. Transfiera 7 ml de agua desionizada a viales de vidrio de 15 ml y agregue algunos trozos de hojas de vidrio rotas en cada vial.
    3. Esterilizarlos en autoclave a 121 °C durante 20 min.
    4. Debajo del gabinete de flujo laminar, agregue 1 ml de vaselina a cada vial de BH de 50 ml con una pipeta estéril. Mantenga algunos viales con solo BH como control negativo.
    5. Debajo del gabinete de flujo laminar, retire el micelio en la superficie del medio de las placas MEA con las cepas de hongos elegidas (preparadas en el paso 1.5.3.) con una aguja estéril y transfiéralo a viales de vidrio de 15 ml con las hojas de cubierta rotas.
    6. Agite cada vial en un mezclador de vórtice durante 2 minutos, permitiendo que las hojas de cubierta rotas corten el cubo de la colonia de hongos, haciendo una suspensión de hongos.
    7. Inocular cada vial de vaselina con 200 μL de suspensión fúngica. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica.
    8. Para el control negativo, coloque 200 μL de suspensión fúngica en viales con solo BH líquido. Además, mantenga un par de viales con vaselina sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio.
    9. Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad y revisarlos después de 15 días y 30 días desde el inóculo.
  2. Prueba de crecimiento en aceite de motor usado.
    1. Poner 3,26 g de BH y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y autoclave durante 20 min a 121 °C (BHA).
    2. Coloque el BHA en placas de Petri debajo de un gabinete de flujo laminar.
    3. Cuando se haya solidificado, transfiera 500 μL de aceite de motor usado a las placas de Petri BHA y distribúyalo uniformemente en las superficies de la placa utilizando un esparcidor de células desechable estéril en forma de L.
    4. Inocular cada placa BHA de aceite de motor usado con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el Paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación. Haga dos réplicas para cada cepa fúngica.
    5. Para el control negativo, inocule las placas de Petri solo con BHA. Además, mantenga un par de placas de Petri BHA de aceite de motor usado sin ninguna inoculación fúngica para verificar si hay contaminación en el medio.
    6. Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 15 días y 30 días desde el inóculo.
  3. Prueba de crecimiento en plásticos.
    1. Transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) a una placa de 96 micropocillos. Haga tres réplicas de la combinación de cepa fúngica y plástico.
    2. A cada pozo con la suspensión fúngica, agregue 10 mg de un tipo diferente de polvo plástico (tereftalato de polietileno - PET, cloruro de polivinilo - PVC, polietileno de alta densidad - HDPE, poliestireno - PS, poliuretano - PUR).
    3. Para el control negativo, en lugar de agregar el polvo de plástico, agregue 200 μL de solución BH esterilizada al pozo con la suspensión de hongos. Además, para cada tipo de polvo plástico, llene un pozo con 200 μL de solución BH esterilizada y 10 mg de cada polvo plástico para verificar la contaminación del medio.
    4. Incubar las placas de micropocillos a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 15 días y 30 días desde el inóculo.

3. Pruebas enzimáticas cualitativas

  1. Prueba colorimétrica cualitativa de enzimas ligninolíticas.
    1. Poner 27 g de caldo de dextrosa de patata (PD) y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (PDA).
    2. Cuando el medio se haya enfriado un poco pero todavía esté líquido, agregue ácido gálico (5 g / L) debajo de una campana de flujo laminar y coloque el medio en placas de Petri.
    3. Inocular las placas de PDA + ácido gálico con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar la contaminación.
    4. Como controles negativos, prepare placas de Petri con solo PDA (sin ácido gálico) e inocularlas con las cepas de hongos (una por cada cepa de hongos), así como una placa de Petri con PDA + ácido gálico y sin inoculación de hongos.
    5. Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 7 días desde el inóculo.
  2. Prueba colorimétrica cualitativa de lacasas.
    1. Poner 27 g de PD y 15 g de agar en 1 L de agua desionizada y esterilizarlo en autoclave durante 20 min a 121 °C (PDA).
    2. Cuando el medio se haya enfriado un poco pero todavía esté líquido, agregue guaiacol (400 μL / L) debajo de una campana de flujo laminar y colóquelo en placas de Petri.
    3. Inocular las placas PDA + guaiacol con cada cepa fúngica, recogiendo el micelio de las placas preparadas en el paso 1.5.3. Trabaje en un quemador Bunsen o debajo de una campana de flujo laminar para evitar cualquier contaminación.
    4. Como controles negativos, preparar placas de Petri con solo PDA (sin guaiacol) e inocularlas con las cepas de hongos (una por cada cepa de hongos), así como una placa de Petri con PDA + guaiacol y sin inoculación de hongos.
    5. Incubar las placas de Petri a 25 °C en la oscuridad y comprobarlas después de 7 días desde el inóculo.
  3. Prueba cualitativa de proteasas.
    1. Prepare el medio SÍ añadiendo K2HPO4 (1 g/L), KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L), y gelatina/peptona (0,02 g/L) al agua desionizada.
    2. Coloque el medio YES en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro del medio durante 10 minutos.
    3. Cuando todas las sales se hayan disuelto en el medio, transfiera 5 ml de la solución a viales de vidrio estéril de 20 ml y hágalos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C.
    4. Para el control negativo, preparar unos viales de vidrio estéril de 20 ml con 5 ml de solución de BH y autoclave durante 20 min a 121 °C.
    5. Bajo un gabinete de flujo laminar, transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa a los viales esterilizados del medio YES (haga al menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, agregue 200 μL de la misma suspensión fúngica a los viales esterilizados BH para tener un control negativo.
    6. Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad durante 21 días y revisarlos cada 7 días.
  4. Prueba cualitativa de esterasas.
    1. Prepare el medio Tween 80 agregando peptona (10 g / L), NaCl (5 g / L), CaCl2 (0.1 g / L) y 10 ml de Tween 80 a 1 L de agua desionizada.
    2. Coloque el medio Tween 80 en un agitador magnético (sin calor) con una barra de agitación magnética dentro del medio durante 10 minutos.
    3. Cuando todo esté fundido dentro del medio, transfiera 5 ml de la solución a viales de vidrio estéril de 20 ml y hágalos en autoclave durante 20 minutos a 121 °C.
    4. Para el control negativo, preparar unos viales de vidrio estéril de 20 ml con 5 ml de solución de BH y autoclave durante 20 min a 121 °C.
    5. Bajo un gabinete de flujo laminar, transfiera 200 μL de suspensión fúngica (Pasos 2.1.5.-2.1.6.) para cada cepa a los viales esterilizados medianos Tween 80 (haga al menos 2 réplicas por cepa fúngica). Para cada cepa fúngica, agregue 200 μL de la misma suspensión fúngica a los viales esterilizados BH para un control negativo.
    6. Incubar los viales a 25 °C en la oscuridad durante 21 días y revisarlos cada 7 días.

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Representative Results

Los métodos de medios selectivos (Sección 1 del protocolo) permitieron cribar la rica biodiversidad del suelo y seleccionar los hongos con alto potencial de biorremediación. Con el ácido húmico y los medios de lignocelulosa, se aislaron más de 100 cepas de hongos. Estos hongos produjeron enzimas involucradas en la biodegradación de materiales recalcitrantes naturales, que tienen una estructura química que se asemeja a muchos contaminantes. Sin embargo, las cepas fúngicas aisladas con los medios selectivos necesitaron un cribado adicional. Específicamente, las pruebas selectivas aislaron las cepas capaces de degradar los ácidos húmicos y la lignocelulosa, las pruebas de crecimiento examinaron los hongos aislados para aquellos capaces de usar un contaminante específico como su única fuente de carbono, y las pruebas enzimáticas cualitativas describieron sus actividades metabólicas.

Las pruebas de crecimiento se centraron en la capacidad fúngica para degradar hidrocarburos (vaselina y aceite de motor usado) y plásticos (PET, PVC, HDPE, PS, PUR). Cada una de estas sustancias se utilizó en una prueba como la única fuente de carbono para las cepas de hongos seleccionadas. La capacidad fúngica para explotar estas sustancias se evaluó como la diferencia en el crecimiento de colonias entre las muestras con la sustancia añadida y las muestras de control con solo un medio mínimo (BH o BHA, dependiendo de la prueba). Se utilizó una escala cualitativa para describir los resultados (Figura 1), que van desde la ausencia de diferencia de crecimiento con el control (0) hasta niveles bajos (+), medios (++) y altos (+++) de diferencia en el crecimiento.

Figure 1
Figura 1: Tasa de éxito de crecimiento de cepas fúngicas en las pruebas de crecimiento. El porcentaje de cepas fúngicas capaces de crecer en vaselina, aceite de motor usado y polvos plásticos (tereftalato de polietileno, PET; cloruro de polivinilo, PVC; polietileno de alta densidad, HDPE; poliestireno, PS; poliuretano, PUR) como su única fuente de carbono con diferentes grados de éxito (sin crecimiento, 0; bajo crecimiento, +; crecimiento medio, ++; crecimiento alto, +++). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las pruebas de vaselina y aceite de motor usado evaluaron el potencial de biodegradación de hidrocarburos de las cepas fúngicas seleccionadas. La vaselina, una mezcla de alcanos de cadena larga (>C25), se utilizó como única fuente de carbono. La capacidad fúngica para explotar esta sustancia se evaluó como la diferencia en el crecimiento de colonias entre viales con BH + vaselina y viales de control con solo BH (Figura 2). Casi el 75% de las cepas fúngicas probadas pudieron usar vaselina como su única fuente de carbono, y el 21% de las cepas exhibieron un crecimiento máximo (+++, Figura 1).

Figure 2
Figura 2: Imágenes de la escala cualitativa de crecimiento en vaselina como única fuente de carbono. La escala cualitativa se basa en la diferencia de crecimiento entre las muestras tratadas y el control de BH. Varía desde la ausencia de diferencia de crecimiento (0), hasta niveles bajos (+), medios (++) y altos (+++) de diferencia de crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El aceite de motor usado es una mezcla compleja de hidrocarburos, aditivos para motores y metales. Se utilizó en las pruebas de crecimiento para evaluar la capacidad fúngica de utilizar una mezcla de hidrocarburos compleja y tóxica como fuente de carbono. Al igual que las otras pruebas de crecimiento, el crecimiento se evaluó comparando el crecimiento de hongos en placas con el aceite de motor con el crecimiento en las placas de control que contienen solo BHA (Figura 3). Los resultados de crecimiento confirmaron la eficacia de los medios selectivos (Sección 1 del protocolo). De hecho, casi el 90% de las cepas fúngicas aisladas pudieron crecer con aceite de motor usado, y el 39% mostró un crecimiento máximo (+++, Figura 1).

Figure 3
Figura 3: Imágenes de la escala cualitativa de crecimiento en el aceite de motor usado como única fuente de carbono. La escala cualitativa se basa en la diferencia de crecimiento entre las muestras tratadas y el control bha. Varía desde la ausencia de diferencia de crecimiento (0), hasta niveles bajos (+), medios (++) y altos (+++) de diferencia de crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se utilizaron pruebas de crecimiento en polvos plásticos para seleccionar las cepas de hongos que podrían usar polímeros plásticos específicos como su principal fuente de carbono; por lo tanto, estas cepas tienen un alto potencial de biorremediación plástica. El crecimiento en placas multipozo se observó mediante estereomicroscopio y se evaluó mediante una escala cualitativa, que va desde la ausencia de crecimiento (0) hasta la alta producción de hifas (+++). PUR fue el polvo plástico que tuvo el mayor porcentaje de cepas de hongos que mostraron crecimiento (92%), con el 31% de las cepas mostrando un crecimiento máximo (+++). Aproximadamente el 70% de las cepas aisladas de ácido húmico y medios de lignocelulosa crecieron en polvo de PS, mientras que casi el 60%-65% de ellas pudieron usar HDPE, PVC y PET como su única fuente de carbono. Por lo tanto, un gran porcentaje de hongos pudieron crecer en los diferentes polvos plásticos en placas multipozo, pero un número muy bajo de ellos mostró una alta colonización de plásticos. De hecho, solo el 10% de las cepas pudieron prosperar con PET y HDPE, y el 13% pudieron prosperar con PS. El único plástico donde se observó regularmente un alto crecimiento de hongos fue PUR, en el que aproximadamente el 30% de las cepas de hongos lograron crecer muy abundantemente.

Se realizaron pruebas enzimáticas cualitativas para detectar cepas fúngicas que pueden producir enzimas implicadas en los procesos de biodegradación de sustancias recalcitrantes. Las peroxidasas y lacasas son enzimas ligninolíticas cuya producción está indicada por un halo marrón en la parte inferior del medio en las pruebas de ácido gálico y guaiacol (Paso 3.1. y Paso 3.2. del protocolo). En ambas pruebas, el aumento de la intensidad del color indicó una mayor producción de estas enzimas (Figura 4).

Figure 4
Figura 4: Imágenes de la escala cualitativa de enzimas ligninolíticas cualitativas. La escala cualitativa se basa en la producción de un halo rojo/marrón alrededor de la colonia. 0 = ninguna actividad, + = alguna actividad, ++ = alta actividad, +++ actividad muy alta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aproximadamente el 60% de los hongos analizados fueron capaces de producir enzimas ligninolíticas, lo que indica el éxito de los medios selectivos. Además, el 12% de las cepas fúngicas aisladas produjeron un halo oscuro intenso alrededor de la colonia (+++) en medio ácido gálico, y el 17% lo hizo en medio guaiacol (lacasas), lo que indica una alta secreción fúngica de estas enzimas (Figura 5).

Figure 5
Figura 5: Tasa de actividad enzimática por cepas fúngicas durante las pruebas enzimáticas cualitativas. El porcentaje de cepas fúngicas capaces de producir enzimas ligninolíticas, lacasas, proteasas y esterasas con diferentes niveles de éxito (0 = sin actividad, + = actividad, ++ = alta actividad, +++ muy alta actividad) durante sus correspondientes pruebas enzimáticas cualitativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Otra prueba de detección utilizada para analizar la actividad fúngica fue la prueba de proteasas, que se basó en la diferencia en el crecimiento de hongos entre los viales medios de YES y los viales de control con BH. Sin embargo, aproximadamente el 70% de las cepas de hongos en el medio YES mostraron un crecimiento similar al de los controles, o incluso una disminución del crecimiento. Ninguna cepa fúngica alcanzó el nivel máximo de diferencia (+++). Estos resultados sugieren que esta prueba puede no ser adecuada para la detección de la actividad de la proteasa.

Finalmente, la actividad de las esterasas se evaluó mediante la formación de un precipitado blanco en el medio Tween 80 (Figura 5). Casi el 60% de las cepas fúngicas seleccionadas mostraron actividad esterasa, y el 13% mostró una alta formación del precipitado (+++), lo que sugiere que las cepas en el 13% deben seleccionarse para examinar su potencial de biodegradación (Figura 5).

En cuanto a todas las pruebas de crecimiento y enzimáticas, las cepas más exitosas (es decir, las que obtuvieron +++ en al menos una prueba) fueron las más interesantes. Estas cepas fúngicas fueron capaces de utilizar eficientemente sustancias recalcitrantes como su única fuente de carbono, o produjeron un alto nivel de enzimas involucradas en la biodegradación de sustancias recalcitrantes. De hecho, 39 de las 115 cepas de hongos probadas pudieron prosperar (+++) en fuentes de hidrocarburos (vaselina o aceite de motor usado), y 58 tuvieron un alto crecimiento en al menos un polímero plástico. Solo 32 mostraron una actividad enzimática muy alta (+++) en al menos una de las pruebas enzimáticas realizadas. Estos resultados muestran la alta eficacia de todas las pruebas de detección reportadas, aparte de la prueba de proteasas, que no seleccionó ninguna cepa de alto rendimiento.

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Discussion

La rica biodiversidad del suelo es una fuente abundante de hongos que poseen numerosas capacidades metabólicas, algunas de las cuales podrían ser candidatos potenciales para la biorremediación. Las pruebas selectivas de medios (Sección 1 del protocolo) son métodos fáciles de realizar y efectivos para aislar hongos capaces de crecer en polímeros complejos naturales como su única fuente de carbono. Los hongos pueden producir hidrolasas extracelulares, inespecíficas y oxidorreductasas30 como las enzimas ligninolíticas lacasas y peroxidasas31. Estas enzimas pueden degradar la lignocelulosa y los ácidos húmicos, pero también muchos xenobióticos diferentes, incluidos hidrocarburos, compuestos aromáticos y compuestos orgánicos clorados32.

Los métodos descritos producen resultados que son fáciles de interpretar y de bajo costo para llevar a cabo. Estas características permiten que sean utilizados por no expertos. Sin embargo, ciertos aspectos, como la esterilidad y la identificación morfológica, requieren una atención especial. Por ejemplo, la agitación de 30 minutos de la suspensión del suelo (Paso 1.3.4.) es necesaria para que las esporas de hongos y los propágulos se liberen de la microestructura del suelo y puedan suspenderse en la solución. De esta manera, al enchapar las diluciones de esta suspensión del suelo, es posible aislar el máximo número de cepas de hongos. La identificación morfológica macro y microscópica de cepas fúngicas es importante para diferenciar entre cepas y evitar aislar la misma cepa fúngica varias veces. Además, la esterilidad y la evitación de contaminaciones microbianas son cruciales porque la presencia de otras cepas fúngicas activas podría tergiversar la actividad de las colonias estudiadas.

Después de las pruebas selectivas, se realizaron una serie de pruebas de crecimiento en diferentes sustancias recalcitrantes, como vaselina, aceite de motor usado y diferentes polímeros plásticos. Esta etapa se puede personalizar de acuerdo con las sustancias recalcitrantes de interés. El paso importante es agregar la sustancia seleccionada a BH o BHA como única fuente de carbono y verificar el crecimiento de hongos contra un control sin la sustancia recalcitrante agregada.

El objetivo de las pruebas de crecimiento en plásticos e hidrocarburos fue evaluar si el hongo podría usar estas sustancias como su única fuente de carbono observando cualitativamente su crecimiento en el material. Desafortunadamente, debido a la extrema recalcitrancia de estos materiales, es muy difícil cuantificar la disminución real en el peso del sustrato y el aumento en el peso de la biomasa fúngica, especialmente después de un período de tiempo relativamente corto. Si una cepa fúngica funciona muy bien en estas pruebas de crecimiento de cribado, se deben realizar más estudios para cuantificar la degradación de la sustancia recalcitrante.

Las pruebas enzimáticas utilizadas (Sección 3 del protocolo) se eligieron porque demostraron ser eficientes y rápidas de realizar, pero solo producen resultados cualitativos. Destacan el potencial de degradación de una cepa fúngica, pero no pueden cuantificarlo con precisión. Si se aísla una cepa de particular interés, se podrían realizar más pruebas, como ensayos cuantitativos espectrofotométricos de enzimas, para describir la actividad metabólica con mayor precisión. La única prueba enzimática que mostró una eficacia subóptima fue la prueba cualitativa de proteasas, con un bajo número de cepas capaces de crecer en el medio YES. De hecho, el alto porcentaje de cepas capaces de crecer en PUR sugiere que los hongos produjeron proteasas involucradas en la ruptura de los enlaces amida y uretano, con la esterasa apuntando a los enlaces éster40. La ausencia casi completa de hongos productores de proteasa sugiere que puede haber habido un problema en el método utilizado. Se podrían adoptar otras pruebas para la actividad de la proteasa, como la caseína41, la leche desnatada42 o las pruebas de placa deagar de leche en polvo 43. La prueba de ácido gálico demostró ser muy útil para detectar la producción de enzimas ligninolíticas, pero, desafortunadamente, no fue muy específica y no pudo distinguir el tipo de enzima ligninolítica producida (ya sea peroxidasas o lacasas).

Los resultados de este trabajo sugieren que el uso de lignocelulosa o ácidos húmicos como medios selectivos permite aislar cepas fúngicas con potencial de biorremediación de la rica biodiversidad del suelo. De hecho, más del 70% de las cepas de hongos aisladas por los métodos selectivos pudieron crecer en vaselina o aceite de motor usado, y el 60% pudieron crecer en diferentes polímeros plásticos como única fuente de carbono. Además, las pruebas enzimáticas cualitativas describieron la actividad metabólica de estos hongos vinculada a procesos de biodegradación. Se recomienda la selección de cepas fúngicas que muestren actividad +++ en una o más pruebas porque aumenta las posibilidades de encontrar una cepa fúngica que sea muy activa en la biorremediación. Las pruebas que utilizan cromatografía de masa gaseosa (GC-MS) en las sustancias recalcitrantes después de un contacto prolongado con las cepas fúngicas seleccionadas con nuestras pruebas de detección han demostrado una biodegradación real de los materiales 9,44. El uso de estas sencillas pruebas de cribado en diferentes ecosistemas permitirá la investigación de la biodiversidad fúngica en diferentes suelos. La búsqueda de hongos que puedan degradar materiales recalcitrantes aumentará el número de cepas identificadas que tienen el potencial de biorremediación y ayudará a abordar el creciente problema de la contaminación ambiental.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos a la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) de la Universidad de Pavía y al profesor Solveig Tosi por brindar la oportunidad de este trabajo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 microwell plate Greiner bio-one 650185
Agar VWR 84609.05
Bushnell-Haas Broth Fluka B5051
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Chloroamphenicol Eurobio GABCRL006Z
Chlortetracycline Sigma-Aldrich Y0001451
CoCl2·6H2O Sigma-Aldrich C8661
CuCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3279
Ethanol VWR Chemicals 20821.296
FeCl3·6H2O Sigma-Aldrich 236489
Filter 0.2 µm Whatman 10462200
gallic acid Sigma-Aldrich G7384
Glass cover slips Biosigma VBS634
Glass vials 15 mL SciLabware P35467
guaiacol Sigma-Aldrich G5502
High-density polyethylene (HDPE) Sigma-Aldrich 434272
Humic acids Aldrich Chemistry 53680
K2HPO4 Sigma-Aldrich P8281
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lignocellulose / / Sterilized bioethanol production waste
L-shaped cell spreader Laboindustria S.p.a 21133
magnetic stirrer A.C.E.F 8235
Malt Extract Broth Sigma-Aldrich 70146
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M2643
Micropipette 1000 μL Gilson FA10006M
Micropipette 200  μL Gilson FA10005M
MnCl2·4H2O Sigma-Aldrich M5005
Na2MoO4·2H2O Sigma-Aldrich M1651
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neomycin Sigma-Aldrich N0401000
Penicillin Sigma-Aldrich 1504489
peptone Sigma-Aldrich 83059
Polyethylene terephthalate (PET) Goodfellow ES306031
Petri dishes Laboindustria S.p.a 21050
Petrolatum (Paraffin liquid) A.C.E.F 009661
Potato Dextrose Broth Sigma-Aldrich P6685
Polystyrene (PS) Sigma-Aldrich 331651
Polyurethane (PUR) Sigma-Aldrich GF20677923
Polyvinyl chloride (PVC) Sigma-Aldrich 81388
Sterile falcon tube Greiner bio-one 227 261
Sterile glass vials 20 mL Sigma-Aldrich SU860051
Sterile point 1000  μL Gilson F172511
Sterile point 200  μL Gilson F172311
Sterile polyethylene bags WHIRL-PAK B01018
sterile syringe Rays 5523CM25
Streptomycin Sigma-Aldrich S-6501
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754
Used engine oil / / complex mixture of hydrocarbons, engine additives, and metals, provided by an Italian private company
Vials 50 mL Sigma-Aldrich 33108-U
ZnCl2 Sigma-Aldrich Z0152

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References

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Aislamiento y cribado de la biodiversidad del suelo para hongos involucrados en la degradación de materiales recalcitrantes
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Temporiti, M. E. E., Daccò, C., Nicola, L. Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials. J. Vis. Exp. (183), e63445, doi:10.3791/63445 (2022).

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