Summary
이 논문의 전반적인 목표는 닭 배아에 외인성 물질의 난소 세포 내 주사를 수행하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 접근법은 닭 배아의 발달 생물학을 연구하는 데 매우 유용합니다.
Abstract
배아 생물학의 고전적인 모델 시스템으로서, 닭 배아는 배아 발달과 분화를 조사하는 데 사용되었습니다. 외인성 물질을 닭 배아에 전달하는 것은 배아 발달 동안 유전자 기능, 형질전환 육종 및 키메라 준비를 연구하는 데 큰 이점이 있습니다. 여기서 우리는 플라스미드 벡터 또는 변형 된 원발성 생식 세포 (PGCs)와 같은 외인성 물질이 초기 발달 단계에서 공여체 닭 배아로 옮겨 질 수있는 난 소 혈관 내 주사의 방법을 보여줍니다. 결과는 등쪽 대동맥과 머리를 통한 혈관 내 주사가 주입 된 물질이 혈액 순환계를 통해 전체 배아로 확산 될 수 있음을 보여줍니다. 제시된 프로토콜에서, 외인성 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터의 효능은 수용자 생식선에 주입된 외인성 PGCs의 도입, 및 콜로니화, 배아에서의 형광을 관찰함으로써 결정되었다. 이 기사는이 방법의 상세한 절차를 설명함으로써 유전자 기능, 배아 및 발달 생물학 및 생식선 키메라 닭 생산을 연구하는 데 탁월한 접근 방식을 제공합니다. 결론적으로,이 기사는 연구자가 큰 성공과 재현성으로 닭 배아에 외인성 물질의 난소 혈관 내 주사를 수행 할 수있게 해줄 것입니다.
Introduction
닭 배아는 발달, 면역학적, 병리학적 및 기타생물학적 응용1,2,3에서 수세기 동안 널리 사용되어 왔다. 그들은 독성학 및 세포 생물학 연구에서 다른 동물 모델에 비해 많은 고유 한 이점을 가지고있습니다 4. 닭 배아는 쉽게 접근 할 수 있으며 시험관 내에서 조작 할 수 있으며 모든 발달 단계에서 직접 관찰 할 수있어 편리한 배아 연구 모델 시스템을 제공합니다.
일반적으로 전기 형질감염 및 아발아강 주입과 같은 현재의 닭 배아 전달 방법은 전문 장비 및 설계 프로그램의 요구 사항, 노른 자 및 알부민 5,6,7의 존재로 인한 비효율과 같은 한계를 가지고 있습니다. 여기서 우리는 외인성 물질을 닭 배아에 전달하기위한 간단하고 효율적인 처리 방법을 보여줍니다. 이것은 발달 생물학 연구에 사용되는 강력한 도구가 될 수 있습니다. 주입 된 물질은 혈액 순환을 통해 배아 전체로 퍼졌습니다. 닭 배아의 초기 발달 동안, PGCs는 혈액을 통해 이동하고, 생식기 능선을 식민지화한 다음, 외인성 물질을 전달할 수 있는 귀중한 가능한 경로를 제공하는 가메테로 발전할 수 있다8. 이제, 이 방법은 유전자 기능, 배아 및 발달 생물학, 키메라 및 형질전환 닭 생산9,10,11의 연구에서 널리 이용되고 있다.
닭 배아에서의 난소 혈관 내 주사는 잘 확립되고 일반적으로 사용되는 방법12,13,14이다. 이 논문에서는 주사 물질, 부위, 복용량 및 대표적인 결과를 포함하여이 프로토콜에 대한 포괄적 인 설명을 보여줍니다.
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Protocol
동물의 보살핌과 사용과 관련된 모든 절차는 미국 국립 보건원 지침 (NIH Pub. No. 85-23, 개정 1996)과 닭 배아 프로토콜을 준수하여 중국 양저우 대학의 실험실 동물 관리 및 실험 동물 윤리위원회 (No.201803124)의 승인을 받았습니다.
1. 수정란 수집 및 준비
참고 : 포유류와 달리 닭은 단일 난소에 수백만 개의 난포를 가지고 있지만,이 난포 중 일부만이 배란하기에 충분히 성숙합니다. 각 여포에는 하나의 난모세포 또는 생식 세포가 들어 있습니다. 난포가 성숙하고 노른자를 방출하자마자 나팔관의 깔때기에 통합됩니다. 난관의 경정맥 복부에 들어가면 정액이 암탉의 몸에있는 난자에 결합하고 암탉의 몸에있는 칼슘은 수정 된 난자를 감싸는 껍질을 형성하여 몸에 부드러운 껍질을 가진 난자를 형성합니다. 칼슘 껍질은 계란이 생성 될 때까지 점차적으로 두꺼워집니다.
- 현지 공급 업체 또는 기관에서 수정 된 난자를 수집하여 16 ° C에서 1 주 동안 보관할 수 있습니다.
참고 : 높은 저장 온도는 배아가 발달하는 데 도움이되며 저온은 배아의 생존력을 감소시킵니다. 저장 시간이 너무 길면 배아가 발달하지 못합니다. - 계란을 인큐베이터로 옮기기 전에 달걀 껍질을 75 % 에탄올로 부드럽고 천천히 문지릅니다.
- 계란을 옆으로 놓고 37.8 ° C 및 60 % 습도의 인큐베이터의 랙에 깔끔하게 놓습니다. 60 시간의 배양 (HH 단계 17) 후에, 배아는 가시적 인 혈관을 개발할 것이고 심장은15를 치기 시작합니다.
참고 : 잠복기 2 일 후, 심장의 초기 단계 인 작은 원시적 인 점이 나타납니다. 이 과정을 체리 비딩이라고합니다. ~ 2.5 일에 심장 및 기타 신체 세그먼트가 가시적 인 혈관으로 형성됩니다.
2. 주사 전 준비
- 바늘로 사용될 유리 모세 혈관을 준비하십시오. 주입하기 전에 풀러를 사용하여 외경이 1mm이고 내경이 0.6mm인 90mm 유리 모세혈관을 당깁니다. 포셉 (유리 모세관의 각도는 일반적으로 45 °)을 사용하여 팁을 깨고 자외선으로 모세 혈관을 2 시간 동안 살균하십시오.
- 플라스미드, 패키징된 렌티바이러스 및 PGC와 같은 외인성 물질을 준비한다.
- 플라스미드 pEGFP-N1(향상된 GFP 발현 플라스미드, 1μg/μL)을 리포솜과 1:3 비율(m/v)로 부드럽게 혼합한다. 물을 첨가하여 10 ng/μL의 최종 DNA 농도를 얻습니다. DNA 혼합물을 주사 전에 20분 동안 37°C에서 앉히십시오.
- 주사하기 전에 얼음에 바이러스를 해동하십시오. 주사에 사용되는 렌티 바이러스의 역가는 5 x 106 Tu / mL 이상이어야합니다.
- 부모 또는 변형된 생식선 PGC(E4.5, HH 단계 24)를 2,000-5,000 세포/μL로 희석합니다.
참고 : 여기에서는 trypan blue를 사용하여 주입 절차를 보여주었습니다.
3. 윈도우
- 배아를 노출시키기 전에 면봉을 사용하여 75 % 알코올로 달걀 껍질 표면을 부드럽고 부드럽게 닦아 내고 계란의 무딘 가장자리를 철저히 살균하십시오.
- 살균 후, 포셉으로 무딘 끝을 부드럽게 두드려 달걀 껍질 표면에 작은 창 (0.5cm x 0.5cm)을 만들어 배아를 노출시킵니다. 배아 막을 제거한 다음 해부 현미경으로 홀더에 난자를 놓습니다.
4. 주입
- 현미경으로 혈관을 찾고 해부 현미경의 초점을 조정하여 배아를 찾은 다음 주사 준비가 된 혈관을 찾으십시오.
- 피펫을 사용하여 유리 바늘을 외인성 용액 (플라스미드, 렌티 바이러스 또는 PGCs)으로 천천히 채우고 바늘의 기포를 피하십시오.
- 혈관에 외인성 용액으로 바늘을 조준하고 바늘이 주입되는 혈관과 평행합니다.
- 채워진 바늘을 용기에 부드럽게 넣고 펌프를 켜서 현미경으로 용액 (일반적으로 주입 된 부피는 ~ 1-5 μL)을 배출합니다. 공기 펌프 압력은 지나치게 높은 기압으로 인해 혈관이 손상되어 고속 흐름으로 이어지기 때문에 혈관의 파괴를 방지하기에 충분히 낮아야합니다.
- 외인성 용액이 용기에 주입되면 용기의 색이 용액 색으로 변하고 2-5 초 내에 적색으로 회복되어 외인성 용액이 용기에 성공적으로 전달되었음을 나타냅니다. 이 시점에서 용액은 동맥에 들어가고 심장의 박동과 함께 동맥을 통해 배아로 다시 순환 된 다음 정맥으로 순환됩니다.
참고: 혈관 주사를 위한 두 개의 주사 부위가 있습니다(그림 1B): 하나는 머리이며, 여기서 외인성 용액은 배아의 머리에 있는 정맥에서 혈류를 통해 심장으로 주입된 다음 심장이 뛰는 배아 전체로 순환합니다(그림 1B, 화살표 1). 또 다른 하나는 배아 혈액의 등쪽 대동맥을 통한 것입니다. 외인성 용액이 주입되어 전체 배아로 퍼진다(도 1B. 화살표 2) 배아 심장의 박동과 함께.
- 외인성 용액이 용기에 주입되면 용기의 색이 용액 색으로 변하고 2-5 초 내에 적색으로 회복되어 외인성 용액이 용기에 성공적으로 전달되었음을 나타냅니다. 이 시점에서 용액은 동맥에 들어가고 심장의 박동과 함께 동맥을 통해 배아로 다시 순환 된 다음 정맥으로 순환됩니다.
- 주사 후, 스테레오 현미경에서 계란을 제거하고 달걀 껍질 안에 페니실린 용액 200 μL를 떨어 뜨립니다. 3cm 길이의 의료용 테이프 조각을 자르고 창을 밀봉하십시오. 가위로 테이프를 부드럽게 긁어 기포를 짜낸 다음 다른 조각을 잘라 개구부를 밀봉합니다.
- 주입 된 난자를 라벨을 붙이고 인큐베이터에 다시 넣고 필요한 발달 단계 또는 부화 될 때까지 배양하십시오.
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Representative Results
우리는 여기에 닭 배아의 난소 혈관 내 주사를 보여줍니다. 혈관내 주사의 개략적인 과정은 도 1에 도시되어 있다; 우리의 연구에서, 우리는 주사를 테스트하고 확인하기 위해 다양한 외인성 솔루션을 사용했습니다.
주입된 물질을 더 잘 시각화하기 위해, 트리판 블루(0.4%)를 배아에 트레이서로서 주입하였다. 트레이서(파란색)는 등쪽 대동맥 또는 두부 주사에 의한 혈액 순환을 통해 배아 전체로 확산되는 것으로 관찰되었다(도 2). 두 개의 다른 부위에 주입된 물질은 배아 전체로 확산될 수 있었으며, 이는 혈액 순환을 통한 확산을 나타낸다. 파란색의 시각화는 주사의 성공을 확인합니다.
pEGFP-N1 벡터는 1 μg/μL의 농도를 달성하기 위해 PEI로 감싸고, 렌티바이러스 벡터 pLVX-EGFP는 PEI로 감싸고 적정 후 희석하여 5 x 106 Tu/μL의 바이러스 농도를 달성하였다. 2.5일 배아(HH 단계 14-15)에는 감싸인 pEGFP-N1 또는 pLVX-EGFP를 주입하였다. 4.5일(HH 단계 24)에서, 배아를 입체 형광 현미경을 사용하여 관찰하였다. 녹색 형광은 배아에서 관찰되었고 주사 후 벡터 발현을 나타낸다. 결과는 리포솜(PEI) 및 패키징된 렌티바이러스에 의해 캡슐화된 플라스미드가 주사 후 2일 후에 닭 배아에서 발현되었음을 보여준다(도 3). 플라스미드 및 렌티바이러스 벡터 주입 결과는 배아에서 외인성 유전자 발현을 입증하였고, 이는 유전자 전달에 가능한 적용을 암시한다.
PGCs를 배아의 생식기 융기(E4.5, HH 단계 24)로부터 단리하고, 이전 간행물16에서와 같이 정제를 위해 배양하였다. 주입된 PGCs를 적색 형광 단백질(RFP)로 표지하였다. E6.0일 (HH 단계 28)에서, 수용자 배아의 생식선을 단리하고 관찰하였다. 결과는 공여체 PGC (적색 점)가 수혜자의 생식선에 효과적으로 들어가고 식민지화 할 수 있음을 보여주었습니다 (그림 4).
그림 1 : 혈관 내 주사의 개략도. (a) 혈관내 주사의 타임라인; (b) 검은 화살표로 표시된 두 개의 주사 부위, 머리 (1) 및 등쪽 대동맥 (2); (c) 혈관내 주사의 과정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 상이한 주입 부위에서의 추적 염료의 확산. 상단: 등쪽 대동맥; 하단 : 머리. 배율 막대 = 50mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 렌티바이러스 벡터 및 캡슐화된 플라스미드 주사 2일 후 배아에서 GFP의 발현. 배율 막대 = 100mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 수용자 닭 배아에 주입된 적색 형광 표지된 PGCs의 시각화 . (E6.0, HH 단계 28) 생식선. 배율 막대 = 500μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
닭 배아의 난자 혈관내 주사의 방법은 외인성 물질(벡터, 바이러스, 또는 PGCs)이 배아 내로 전달되도록 최적화된다. 이 방법을 바탕으로 안정적인 유전자 과발현 또는 간섭 (SpinZ, JUN, UBE2I 등)을 가진 닭 배아 모델을 구축했습니다. 17,18,19. 이러한 잘 정립 된 모델은이 접근법의 실현 가능성을 증명합니다. 또한, 우리는 분리 된 PGC를 수용자의 배아 생식선으로 옮길 수있을뿐만 아니라 유도 된 PGC로 이식 된 배아 생식선으로 생존 가능한 자손을 성공적으로 생산했으며, 이는 향후20에서이 방법의 대대적 인 적용을 의미합니다.
이 방법의 중요한 단계는 주사입니다. 외인성 물질은 너무 깊거나 너무 얕지 않고 혈관에 직접 주입해야합니다. 따라서 닭 배아 작업 경험과 연습을 통해 쉽게 얻을 수있는 높은 주입 기술이 필요합니다. 공기 세포 주입에 비해, 높은 주입 효능 및 정확도는이 방법을 사용하여 더 쉽게 달성 할 수 있습니다. 높은 비용과 복잡한 단계의 한계 외에도, 전기 트랜스펙션은 낮은 생존율을 초래할 수 있기 때문에 큰 창이 만들어질 때 적용되지 않습니다.
닭 배아에서 유전자 조작을 위한 방법으로서, 상기 방법은 또한 몇 가지 한계를 갖는다. 계란의 약 절반은 40 % -60 %의 생존율로 주사 후 배양 중에 사망했습니다. 한편, 전달 효율은 특히 PGC 주사의 경우 고려해야 할 또 다른 중요한 요소입니다 (우리의 경우 플라스미드 및 렌티 바이러스 주사의 효율은 ~ 50 % -60 %, PGC 주사의 효율은 ~ 30 % -40 %입니다). 앞으로, 프로토콜이 최적화될 수 있고 생존율이 상당히 증가될 수 있고, 이 방법의 적용 분야가 더욱 개선될 수 있다.
결론적으로,이 프로토콜은 난소 닭 배아 혈관 내 주사가 배아로 전달되는 외인성 물질 (벡터 또는 PGCs)에 특이적이라는 것을 입증합니다. 또한,이 방법은 많은 분야에서 쉽게 배우고 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
이해 상충은 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31972547)의 지원을 받았다. 우리는 Jing Wang의 카피 편집과 미국 워싱턴 주립 대학의 Malik Donlic의 목소리에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
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