Summary
O objetivo geral deste artigo é descrever como se apresentar na injeção intracelular ovo de materiais exógenos em embriões de frango. Essa abordagem é muito útil para estudar a biologia do desenvolvimento de embriões de frango.
Abstract
Como um sistema modelo clássico de biologia de embriões, o embrião de frango tem sido usado para investigar o desenvolvimento e diferenciação embrionária. A entrega de materiais exógenos em embriões de frango tem uma grande vantagem para estudar a função genética, a reprodução transgênica e a preparação da quimera durante o desenvolvimento embrionário. Aqui mostramos o método de injeção intravascular ovo em que materiais exógenos, como vetores plasmídeos ou células germinativas primordiais modificadas (PGCs) podem ser transferidos para embriões de frango doadores em estágios iniciais de desenvolvimento. Os resultados mostram que a injeção intravascular através da aorta dorsal e da cabeça permite que materiais injetados se difundam em todo o embrião através do sistema circulatório sanguíneo. No protocolo apresentado, a eficácia da introdução do vetor plasmídeo exógeno e lentiviral, e a colonização de PGCs exógenos injetados na gônada receptora, foram determinadas pela observação da fluorescência nos embriões. Este artigo descreve procedimentos detalhados deste método, fornecendo assim uma excelente abordagem para estudar a função genética, embrião e biologia do desenvolvimento, e a produção de frango gônd-quimérico. Em conclusão, este artigo permitirá que os pesquisadores realizem na injeção intravascular de ovo de materiais exógenos em embriões de frango com grande sucesso e reprodutibilidade.
Introduction
Os embriões de frango têm sido amplamente utilizados por séculos em aplicações biológicas, de desenvolvimento, imunológicos, patológicos e outrasaplicações biológicas 1,2,3. Eles têm muitas vantagens inerentes a outros modelos animais no estudo da toxicologia e biologia celular4. Os embriões de frango são facilmente acessíveis e podem ser manipulados in vitro e diretamente observados em qualquer estágio de desenvolvimento, o que fornece um sistema de modelo de pesquisa de embriões útil.
Em geral, os métodos atuais de entrega de embriões de frango, como eletrotransfesão e injeção subgerminal-cavidade, têm limitações como a exigência de equipamentos especializados e um programa projetado, e ineficiência devido à presença de gema e albumina 5,6,7. Aqui mostramos um método de manuseio simples e eficiente para entregar materiais exógenos em embriões de frango. Esta pode ser uma ferramenta poderosa usada no estudo da biologia do desenvolvimento. Os materiais injetados se espalharam para todo o embrião através da circulação sanguínea. Durante o desenvolvimento precoce de embriões de frango, os PGCs poderiam migrar através do sangue, colonizar a crista genital e, em seguida, desenvolver-se em gametas, que fornecem um caminho valioso possível para entregar materiais exógenos8. Agora, este método tem sido amplamente utilizado no estudo da função genética, embrião e biologia do desenvolvimento, e a produção quimrica e transgênica de frango 9,10,11.
Em ovo a injeção intravascular em embriões de frango é um método bem estabelecido e comumente utilizado 12,13,14. Neste artigo, mostramos uma descrição abrangente deste protocolo, incluindo materiais de injeção, locais, dosagem e resultados representativos.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo o cuidado e o uso de animais conformes às diretrizes do Instituto Nacional de Saúde dos EUA (NIH Pub. nº 85-23, revisado em 1996) e os protocolos de embrião de frango foram aprovados pelo Comitê de Manejo Animal laboratorial e experimental animal da Universidade de Yangzhou, China (No.201803124).
1. Coleta e preparação de óvulos fertilizados
NOTA: Ao contrário dos mamíferos, a galinha tem milhões de folículos em um único ovário, mas apenas alguns desses folículos são maduros o suficiente para ovular. Cada folículo contém um oócito ou célula germinadícula. Assim que o folículo amadurece e libera sua gema, ele é incorporado ao funil do tubo falópio. À medida que o folículo entra no abdômen jugular do oviduto, o sêmen se liga ao ovo no corpo da galinha, e o cálcio no corpo da galinha forma uma concha que envolve o óvulo fertilizado, formando um ovo de casca macia no corpo. A casca de cálcio engrossa gradualmente até que o ovo seja produzido.
- Coletar ovos fertilizados de um fornecedor local ou instituição, que pode ser armazenado a 16°C por 1 semana.
NOTA: A alta temperatura de armazenamento ajudará o embrião a se desenvolver, enquanto a baixa temperatura diminuirá a viabilidade do embrião. Os embriões não se desenvolverão se o tempo de armazenamento for muito longo. - Esfregue a casca de ovo suavemente e lentamente com 75% de etanol antes de transferir os ovos para a incubadora.
- Coloque os ovos de lado, bem em um rack em uma incubadora a 37,8 °C e 60% de umidade. Após 60 h de incubação (estágio 17 de HH), os embriões desenvolverão vasos sanguíneos visíveis e o coração começa a bater15.
NOTA: Após 2 dias de incubação, pequenos pontos primordiais, o estágio inicial do coração, aparecem. Esse processo é chamado de cereja. Em ~2,5 dias, o coração e outros segmentos corporais são formados com vasos visíveis.
2. Preparação antes da injeção
- Prepare capilares de vidro que serão usados como agulhas. Antes da injeção, puxe capilares de vidro de 90 mm com diâmetro externo de 1 mm e diâmetro interno de 0,6 mm utilizando o puxador. Quebrar pontas usando fórceps (o ângulo do capilar de vidro geralmente é 45°) e esterilizar os capilares sob luz UV por 2 h.
- Prepare materiais exógenos, como plasmídeos, lentivírus embalados e PGCs.
- Misture suavemente o pEGFP-N1 plasmídeo (um plácido aprimorado expressando plasmídeo, 1μg/μL) com lipossomo a uma proporção de 1:3 (m/v). Adicione água para obter uma concentração final de DNA de 10 ng/μL. Deixe a mistura de DNA ficar a 37 °C por 20 minutos antes da injeção.
- Descongelar vírus no gelo antes da injeção. O título de lentivírus usado para injeção deve ser superior a 5 x 106 Tu/mL.
- Diluir os PGCs de gôndada parental ou modificados (E4.5, HH estágio 24) para 2.000-5.000 células/μL.
NOTA: Aqui mostramos o procedimento de injeção usando azul trypan.
3. Janelas
- Antes de expor os embriões, esterilize-os limpando suavemente e suavemente a superfície das cascas de ovos com 75% de álcool usando uma bola de algodão, garantindo esterilizar completamente a borda cega dos ovos.
- Após a esterilização, bata suavemente a extremidade sem cortes com fórceps para criar uma pequena janela (0,5 cm x 0,5 cm) na superfície da casca de ovo para expor o embrião. Remova a membrana do embrião e coloque o ovo no suporte sob o microscópio de dissecção.
4. Injeção
- Procure vasos sanguíneos sob o microscópio e ajuste o foco do microscópio de dissecção para localizar o embrião, e então encontre o vaso sanguíneo pronto para injeção.
- Encha a agulha de vidro com a solução exógena (plasmídeo, lentivírus ou PGCs) usando uma pipeta lentamente, evitando bolhas de ar na agulha.
- Mire a agulha com solução exógena no vaso sanguíneo, com a agulha paralela ao vaso sanguíneo sendo injetada.
- Insira suavemente a agulha preenchida no vaso e ligue a bomba para ejetar a solução (geralmente o volume injetado é ~1-5 μL) sob o microscópio. A pressão da bomba de ar deve ser baixa o suficiente para evitar a destruição dos vasos, pois a pressão excessivamente alta do ar danificaria os vasos sanguíneos que levam ao fluxo de alta velocidade.
- Uma vez que a solução exógena seja injetada no vaso, certifique-se de que a cor do vaso se transforme na cor da solução e se recupere para vermelho em 2-5 s, indicando que a solução exógena é entregue com sucesso à embarcação. Neste ponto a solução entra na artéria, e com a batida do coração é circulado de volta para o embrião através da artéria, e depois para a veia.
NOTA: Existem dois locais de injeção para injeção vascular (Figura 1B): um é a cabeça, onde a solução exógena é injetada da veia na cabeça do embrião e no coração através do fluxo sanguíneo, em seguida, circula para todo o embrião com o batimento cardíaco (Figura 1B, Seta 1). Outra é através da aorta dorsal do sangue de embrião; a solução exógena é injetada e se espalha para todo o embrião (Figura 1B). Seta 2) com a batida do coração embrionário.
- Uma vez que a solução exógena seja injetada no vaso, certifique-se de que a cor do vaso se transforme na cor da solução e se recupere para vermelho em 2-5 s, indicando que a solução exógena é entregue com sucesso à embarcação. Neste ponto a solução entra na artéria, e com a batida do coração é circulado de volta para o embrião através da artéria, e depois para a veia.
- Após a injeção, remova o ovo do microscópio estéreo e solte 200 μL de solução de penicilina dentro da casca de ovo. Corte um pedaço de fita médica de 3 cm de comprimento e sele a janela. Raspe suavemente a fita com uma tesoura para espremer quaisquer bolhas de ar e, em seguida, corte outra peça para selar a abertura.
- Rotule e coloque o ovo injetado de volta na incubadora e incubar até o estágio de desenvolvimento ou eclosão necessário.
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Representative Results
Mostramos aqui a injeção intravascular in ovo de embriões de frango. Um processo esquemático da injeção intravascular é mostrado na Figura 1; em nosso estudo, usamos várias soluções exógenas para testar e verificar a injeção.
Para melhor visualizar os materiais injetados, o Trypan Blue (0,4%) foi injetado como um rastreador no embrião. O rastreador (azul) foi observado para difundir todo o embrião através da circulação sanguínea por aorta dorsal ou injeção de cabeça (Figura 2). Materiais injetados em dois locais diferentes foram capazes de se espalhar para todo o embrião, indicando a difusão através da circulação sanguínea. A visualização da cor azul confirma o sucesso da injeção.
O vetor pEGFP-N1 foi embrulhado com PEI para alcançar uma concentração de 1 μg/μL, enquanto o vetor lentiviral pLVX-EGFP foi embrulhado com PEI e diluído após a titulação para alcançar uma concentração de vírus de 5 x 106 Tu/μL. Os embriões de 2,5 dias (estágio HH 14-15) foram injetados com pEGFP-N1 embrulhado ou pLVX-EGFP. Aos 4,5 dias (estágio 24 de HH), os embriões foram observados utilizando-se microscopia de fluorescência estereoscópica. A fluorescência verde foi observada no embrião indicando a expressão vetorial após a injeção. Os resultados mostram que plasmídeos encapsulados por lipossomos (PEI) e lentivírus embalados foram expressos no embrião de frango 2 dias após a injeção (Figura 3). Os resultados da injeção vetorial plasmídeo e lentiviral comprovaram a expressão genética exógena no embrião, implicando a possível aplicação na transferência genética.
Os PGCs foram isolados da crista genital dos embriões (E4.5, HH estágio 24) e cultivados para purificação como na publicação anterior16. Os PGCs injetados foram rotulados com a proteína fluorescente vermelha (RFP). Aos dias de E6.0 (estágio 28 de HH), a gônada dos embriões receptores foi isolada e observada. Os resultados mostraram que os PGCs doadores (pontos vermelhos) foram capazes de efetivamente entrar e colonizar as gônnadas do receptor (Figura 4).
Figura 1: O esquema da injeção intravascular. (A) A linha do tempo da injeção intravascular; (B) Dois locais de injeção indicados por setas pretas, a cabeça (1) e a aorta dorsal (2); (C) O processo da injeção intravascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Difusão do corante de rastreamento em diferentes locais de injeção. Topo: aorta dorsal; Cabeça. Barra de escala = 50 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expressão de GFP em embriões 2 dias após vetor lentiviral e injeção plasmida encapsulada. Barra de escala = 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Visualização de PGCs rotulados de fluorescência vermelha injetada no embrião de frango receptor. (E6.0, HH estágio 28) gônadas. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de injeção intravascular de embriões de frango é otimizado para que materiais exógenos (vetor, viral ou PGCs) sejam transferidos para o embrião. Com base neste método, construímos modelos de embrião de frango com superexpressão ou interferência genética estável (SpinZ, JUN, UBE2I, etc.) 17,18,19. Esses modelos bem estabelecidos comprovam a viabilidade dessa abordagem. Além disso, não apenas transferimos PGCs isolados para a gônada de embriões do receptor, mas também produzimos com sucesso a prole viável com gônada de embrião transplantada com PGCs induzidos, o que implica a grande aplicação desse método no futuro20.
O passo crítico do método é a injeção. Os materiais exógenos devem ser injetados diretamente nos vasos sanguíneos, não muito profundos ou muito rasos. Assim, requer experiência trabalhando com embriões de frango e altas habilidades de injeção que poderiam ser facilmente obtidas através da prática. Em comparação com a injeção de células de ar, a alta eficácia da injeção e a precisão são mais facilmente alcançadas usando este método. Além das limitações de alto custo e passos complicados, a eletrotransfesão não é aplicada quando uma grande janela é feita, pois pode levar a uma baixa taxa de sobrevivência.
Como método de manipulação genética em embriões de frango, o método também tem algumas limitações. Cerca de metade dos ovos morreram durante a incubação após a injeção com uma taxa de sobrevivência de 40%-60%. Enquanto isso, a eficiência de entrega é outro fator importante a considerar, especialmente para a injeção de PGC (no nosso caso, a eficiência da injeção de plasmídeo e lentivírus é de ~50%-60%, e a da injeção de PGC é ~30%-40%). No futuro, o protocolo pode ser otimizado e a taxa de sobrevivência pode ser aumentada consideravelmente, melhorando ainda mais o campo de aplicação deste método.
Em conclusão, este protocolo demonstra que a injeção intravascular de embrião de frango em ovo é específica para materiais exógenos (vetores ou PGCs) a serem transferidos para os embriões. Além disso, esse método pode ser facilmente aprendido e aplicado em muitos campos.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses foi declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31972547). Agradecemos a cópia de Jing Wang e a narração de Malik Donlic na Universidade estadual de Washington, EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
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