Summary
इस पेपर का समग्र लक्ष्य यह वर्णन करना है कि चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्रियों के ओवो इंट्रासेल्युलर इंजेक्शन में कैसे प्रदर्शन किया जाए। यह दृष्टिकोण चिकन भ्रूण के विकासात्मक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी है।
Abstract
भ्रूण जीव विज्ञान की एक शास्त्रीय मॉडल प्रणाली के रूप में, चिकन भ्रूण का उपयोग भ्रूण के विकास और भेदभाव की जांच करने के लिए किया गया है। चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्री वितरित करने से भ्रूण के विकास के दौरान जीन फ़ंक्शन, ट्रांसजेनिक प्रजनन और चिमेरा तैयारी का अध्ययन करने के लिए एक बड़ा लाभ है। यहां हम ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की विधि दिखाते हैं जिससे प्लास्मिड वैक्टर या संशोधित आदिम रोगाणु कोशिकाओं (पीजीसी) जैसी बहिर्जात सामग्रियों को प्रारंभिक विकास चरणों में दाता चिकन भ्रूण में स्थानांतरित किया जा सकता है। परिणाम बताते हैं कि पृष्ठीय महाधमनी और सिर के माध्यम से इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन इंजेक्टेड सामग्रियों को रक्त संचार प्रणाली के माध्यम से पूरे भ्रूण में फैलाने की अनुमति देता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, बहिर्जात प्लास्मिड और लेंटिवायरल वेक्टर परिचय की प्रभावकारिता, और प्राप्तकर्ता गोनाड में इंजेक्ट किए गए बहिर्जात पीजीसी के उपनिवेशीकरण को भ्रूण में प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करके निर्धारित किया गया था। यह लेख इस विधि की विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, जिससे जीन फ़ंक्शन, भ्रूण और विकासात्मक जीव विज्ञान, और गोनाड-चिमेरिक चिकन उत्पादन का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट दृष्टिकोण प्रदान किया जाता है। अंत में, यह लेख शोधकर्ताओं को बड़ी सफलता और पुनरुत्पादन के साथ चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्री के ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन में प्रदर्शन करने की अनुमति देगा।
Introduction
चिकन भ्रूण व्यापक रूप से विकासात्मक, प्रतिरक्षाविज्ञानी, रोग, और अन्य जैविक अनुप्रयोगों 1,2,3 में सदियों से उपयोग किया जाता है। उनके पास विष विज्ञान और सेल जीव विज्ञान 4 के अध्ययन में अन्य पशु मॉडल पर कई अंतर्निहित फायदेहैं। चिकन भ्रूण आसानी से सुलभ हैं और विट्रो में हेरफेर किया जा सकता है और सीधे किसी भी विकास के चरण में मनाया जा सकता है, जो एक आसान भ्रूण अनुसंधान मॉडल प्रणाली प्रदान करता है।
सामान्य तौर पर, इलेक्ट्रोट्रांसफेक्शन और सबजर्मिनल-कैविटी इंजेक्शन जैसे वर्तमान चिकन भ्रूण वितरण विधियों में विशेषज्ञ उपकरण ों की आवश्यकता और एक डिज़ाइन किए गए कार्यक्रम की आवश्यकता और जर्दी और एल्बुमेन 5,6,7 की उपस्थिति के कारण अक्षमता जैसी सीमाएं हैं। यहां हम चिकन भ्रूण में बहिर्जात सामग्री देने के लिए एक सरल और कुशल हैंडलिंग विधि दिखाते हैं। यह विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में उपयोग किया जाने वाला एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है। इंजेक्टेड सामग्री रक्त परिसंचरण के माध्यम से पूरे भ्रूण में फैल जाती है। चिकन भ्रूण के शुरुआती विकास के दौरान, पीजीसी रक्त के माध्यम से माइग्रेट कर सकते हैं, जननांग रिज को उपनिवेशित कर सकते हैं, और फिर युग्मकों में विकसित हो सकते हैं, जो बहिर्जात सामग्री प्रदान करने के लिए एक मूल्यवान संभव मार्ग प्रदान करतेहैं। अब, इस विधि का व्यापक रूप से जीन फ़ंक्शन, भ्रूण और विकासात्मक जीव विज्ञान, और चिमेरिक और ट्रांसजेनिक चिकन उत्पादन 9,10,11 के अध्ययन में उपयोग किया गया है।
चिकन भ्रूण में ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन में एक अच्छी तरह से स्थापित और आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधि 12,13,14 है। इस पेपर में, हम इंजेक्शन सामग्री, साइटों, खुराक और प्रतिनिधि परिणामों सहित इस प्रोटोकॉल का एक व्यापक विवरण दिखाते हैं।
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Protocol
जानवरों की देखभाल और उपयोग से जुड़ी सभी प्रक्रियाएं अमेरिकी राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशानिर्देशों (एनआईएच पब नंबर 85-23, संशोधित 1996) के अनुरूप थीं और चिकन भ्रूण प्रोटोकॉल को यांगझोउ विश्वविद्यालय, चीन की प्रयोगशाला पशु प्रबंधन और प्रयोगात्मक पशु नैतिकता समिति (नंबर 201803124) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. निषेचित अंडा संग्रह और तैयारी
नोट: स्तनधारियों के विपरीत, चिकन में एक अंडाशय में लाखों रोम होते हैं, लेकिन इनमें से केवल कुछ रोम ओव्यूलेट करने के लिए पर्याप्त परिपक्व होते हैं। प्रत्येक कूप में एक ओसाइट या रोगाणु कोशिका होती है। जैसे ही कूप परिपक्व होता है और अपनी जर्दी को छोड़ता है, इसे फैलोपियन ट्यूब की कीप में शामिल कर लिया जाता है। जैसे ही कूप ओविडक्ट के जुगुलर पेट में प्रवेश करता है, वीर्य मुर्गी के शरीर में अंडे को बांधता है, और मुर्गी के शरीर में कैल्शियम एक खोल बनाता है जो निषेचित अंडे को कवर करता है, जिससे शरीर में एक नरम-खोल वाला अंडा बनता है। कैल्शियम का खोल धीरे-धीरे गाढ़ा हो जाता है जब तक कि अंडे का उत्पादन नहीं हो जाता है।
- एक स्थानीय विक्रेता या संस्था से निषेचित अंडे एकत्र करें, जिसे 1 सप्ताह के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
नोट: उच्च भंडारण तापमान भ्रूण को विकसित करने में मदद करेगा, जबकि कम तापमान भ्रूण व्यवहार्यता को कम कर देगा। यदि भंडारण समय बहुत लंबा है तो भ्रूण विकसित करने में विफल रहेगा। - इनक्यूबेटर में अंडे को स्थानांतरित करने से पहले 75% इथेनॉल के साथ अंडे के छिलके को धीरे-धीरे और धीरे-धीरे स्क्रब करें।
- अंडे बग़ल में रखें, बड़े करीने से 37.8 डिग्री सेल्सियस और 60% आर्द्रता पर एक इनक्यूबेटर में एक रैक पर। इनक्यूबेशन (एचएच चरण 17) के 60 घंटे के बाद, भ्रूण दृश्यमान रक्त वाहिकाओं को विकसित करेगा और दिल15 को हराना शुरू कर देगा।
नोट: इनक्यूबेशन के 2 दिनों के बाद, छोटे आदिम डॉट्स, दिल के शुरुआती चरण, दिखाई देते हैं। इस प्रक्रिया को चेरीबीडिंग कहा जाता है। ~ 2.5 दिनों में, दिल और अन्य शरीर के खंड दृश्यमान जहाजों के साथ बनते हैं।
2. इंजेक्शन से पहले तैयारी
- कांच की केशिकाएं तैयार करें जिनका उपयोग सुइयों के रूप में किया जाएगा। इंजेक्शन से पहले, 1 मिमी के बाहरी व्यास और पुलर का उपयोग करके 0.6 मिमी के आंतरिक व्यास के साथ 90 मिमी ग्लास केशिकाओं को खींचें। संदंश का उपयोग करके टिप्स तोड़ें (ग्लास केशिका का कोण आमतौर पर 45 डिग्री होता है) और 2 घंटे के लिए यूवी प्रकाश के तहत केशिकाओं को निष्फल करें।
- इस तरह के plasmids, पैक lentiviruses, और PGCs के रूप में बहिर्जात सामग्री तैयार करें।
- धीरे से प्लास्मिड पीईजीएफपी-एन 1 (प्लास्मिड, 1μg / μL को व्यक्त करने वाला एक बढ़ाया जीएफपी) को 1: 3 अनुपात (एम / वी) पर लिपोसोम के साथ मिलाएं। 10 ng/μL की अंतिम DNA सांद्रता प्राप्त करने के लिए पानी जोड़ें। इंजेक्शन से पहले डीएनए मिश्रण को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बैठने दें।
- इंजेक्शन से पहले बर्फ पर वायरस पिघलना। इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले लेंटिवायरस का टिटर 5 x 106 Tu / mL से अधिक होना चाहिए।
- माता-पिता या संशोधित गोनाड पीजीसी (E4.5, HH चरण 24) को 2,000-5,000 कोशिकाओं / μL तक पतला करें।
नोट: यहाँ हम trypan नीले रंग का उपयोग कर इंजेक्शन प्रक्रिया दिखाया है.
3. Windowing
- भ्रूण को उजागर करने से पहले, कपास की गेंद का उपयोग करके 75% अल्कोहल के साथ अंडे के छिलके की सतह को धीरे-धीरे और धीरे से पोंछकर उन्हें निष्फल करें, अंडे के कुंद किनारे को अच्छी तरह से निष्फल करना सुनिश्चित करें।
- नसबंदी के बाद, भ्रूण को बेनकाब करने के लिए अंडे की सतह पर एक छोटी खिड़की (0.5 सेमी x 0.5 सेमी) बनाने के लिए संदंश के साथ धीरे से कुंद छोर को टैप करें। भ्रूण झिल्ली को हटा दें और फिर विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे धारक पर अंडे को रखें।
4. इंजेक्शन
- माइक्रोस्कोप के नीचे रक्त वाहिकाओं की तलाश करें और भ्रूण का पता लगाने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप के फोकस को समायोजित करें, और फिर इंजेक्शन के लिए तैयार रक्त वाहिका को ढूंढें।
- बहिर्जात समाधान (प्लास्मिड, लेंटिवायरस, या पीजीसी) के साथ कांच की सुई को धीरे-धीरे एक पिपेट का उपयोग करके भरें, सुई में हवा के बुलबुले से बचें।
- रक्त वाहिका पर बहिर्जात समाधान के साथ सुई का लक्ष्य रखें, जिसमें रक्त वाहिका के समानांतर सुई इंजेक्ट की जा रही है।
- धीरे से पोत में भरी हुई सुई डालें और माइक्रोस्कोप के नीचे समाधान को बाहर निकालने के लिए पंप को चालू करें (आमतौर पर इंजेक्ट की गई मात्रा ~ 1-5 μL होती है)। वायु पंप दबाव जहाजों के विनाश को रोकने के लिए पर्याप्त कम होना चाहिए, क्योंकि अत्यधिक उच्च वायुचाप उच्च गति के प्रवाह के लिए अग्रणी रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाएगा।
- एक बार बहिर्जात समाधान को पोत में इंजेक्ट करने के बाद, सुनिश्चित करें कि पोत का रंग समाधान रंग में बदल जाता है और 2-5 सेकंड में लाल हो जाता है, यह दर्शाता है कि बहिर्जात समाधान सफलतापूर्वक पोत को वितरित किया जाता है। इस बिंदु पर समाधान धमनी में प्रवेश करता है, और दिल की धड़कन के साथ धमनी के माध्यम से भ्रूण में वापस प्रसारित होता है, और फिर नस में।
नोट: संवहनी इंजेक्शन (चित्रा 1 बी) के लिए दो इंजेक्शन साइटें हैं: एक सिर है, जहां बहिर्जात समाधान भ्रूण के सिर में नस से और रक्त प्रवाह के माध्यम से हृदय में इंजेक्ट किया जाता है, फिर दिल की धड़कन के साथ पूरे भ्रूण में प्रसारित होता है (चित्रा 1 बी, तीर 1)। एक और भ्रूण रक्त के पृष्ठीय महाधमनी के माध्यम से है; बहिर्जात समाधान इंजेक्ट किया जाता है और पूरे भ्रूण में फैलता है (चित्रा 1 बी)। तीर 2) भ्रूण हृदय की धड़कन के साथ।
- एक बार बहिर्जात समाधान को पोत में इंजेक्ट करने के बाद, सुनिश्चित करें कि पोत का रंग समाधान रंग में बदल जाता है और 2-5 सेकंड में लाल हो जाता है, यह दर्शाता है कि बहिर्जात समाधान सफलतापूर्वक पोत को वितरित किया जाता है। इस बिंदु पर समाधान धमनी में प्रवेश करता है, और दिल की धड़कन के साथ धमनी के माध्यम से भ्रूण में वापस प्रसारित होता है, और फिर नस में।
- इंजेक्शन के बाद, स्टीरियो माइक्रोस्कोप से अंडे को हटा दें और अंडे के अंदर पेनिसिलिन समाधान के 200 μL को छोड़ दें। मेडिकल टेप का एक 3 सेमी लंबा टुकड़ा काटें और खिड़की को सील करें। किसी भी हवा के बुलबुले को निचोड़ने के लिए कैंची के साथ टेप को धीरे से स्क्रैप करें और फिर खोलने को सील करने के लिए एक और टुकड़ा काट लें।
- लेबल और इंजेक्ट किए गए अंडे को इनक्यूबेटर में वापस रखें और आवश्यक विकास चरण या हैचिंग तक इनक्यूबेट करें।
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Representative Results
हम यहां चिकन भ्रूण के ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन में दिखाते हैं। इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की एक योजनाबद्ध प्रक्रिया को चित्र 1 में दिखाया गया है; हमारे अध्ययन में, हमने इंजेक्शन का परीक्षण और सत्यापन करने के लिए विभिन्न बहिर्जात समाधानों का उपयोग किया।
इंजेक्ट की गई सामग्रियों को बेहतर ढंग से देखने के लिए, ट्रिपैन ब्लू (0.4%) को भ्रूण में एक ट्रेसर के रूप में इंजेक्ट किया गया था। अनुरेखक (नीला) या तो पृष्ठीय महाधमनी या सिर इंजेक्शन (चित्रा 2) द्वारा रक्त परिसंचरण के माध्यम से पूरे भ्रूण को फैलाने के लिए मनाया गया था। दो अलग-अलग साइटों पर इंजेक्ट की गई सामग्री पूरे भ्रूण में फैलने में सक्षम थी, जो रक्त परिसंचरण के माध्यम से प्रसार को दर्शाती है। नीले रंग का विज़ुअलाइज़ेशन इंजेक्शन की सफलता की पुष्टि करता है।
पीईजीएफपी-एन 1 वेक्टर को 1 μg/μL की सांद्रता प्राप्त करने के लिए PEI के साथ लपेटा गया था, जबकि लेंटिवायरल वेक्टर pLVX-EGFP को PEI के साथ लपेटा गया था और 5 x 106 Tu/μL की वायरस एकाग्रता प्राप्त करने के लिए अनुमापन के बाद पतला किया गया था। 2.5 दिन के भ्रूण (HH चरण 14-15) को लपेटे गए pEGFP-N1 या pLVX-EGFP के साथ इंजेक्ट किया गया था। 4.5 दिनों (एचएच चरण 24) पर, भ्रूण को स्टीरियोस्कोपिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा गया था। इंजेक्शन के बाद वेक्टर अभिव्यक्ति को इंगित करने वाले भ्रूण में हरे रंग की प्रतिदीप्ति देखी गई थी। परिणामों से पता चलता है कि लिपोसोम (पीईआई) और पैक किए गए लेंटिवायरस द्वारा encapsulated plasmids चिकन भ्रूण में 2 दिन के बाद इंजेक्शन (चित्रा 3) में व्यक्त किए गए थे। प्लास्मिड और लेंटिवायरल वेक्टर इंजेक्शन परिणामों ने भ्रूण में बहिर्जात जीन अभिव्यक्ति को साबित कर दिया, जिसका अर्थ जीन हस्तांतरण में संभावित आवेदन था।
पीजीसी को भ्रूण (E4.5, HH चरण 24) के जननांग रिज से अलग किया गया था और पिछले प्रकाशन16 के रूप में शुद्धिकरण के लिए सुसंस्कृत किया गया था। इंजेक्ट किए गए पीजीसी को लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) के साथ लेबल किया गया था। E6.0 दिनों (HH चरण 28) में, प्राप्तकर्ता भ्रूण के गोनाड को अलग किया गया था और मनाया गया था। परिणामों से पता चला है कि दाता PGCs (लाल अंक) प्रभावी ढंग से दर्ज करने और प्राप्तकर्ता के gonads (चित्रा 4) उपनिवेश करने में सक्षम थे।
चित्रा 1: इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की योजनाबद्ध। (ए) इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की समयरेखा; (बी) काले तीर, सिर (1) और पृष्ठीय महाधमनी (2) द्वारा इंगित दो इंजेक्शन साइटें; (c) इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: विभिन्न इंजेक्शन साइटों में ट्रेसिंग डाई का प्रसार। शीर्ष: पृष्ठीय महाधमनी; नीचे: सिर. स्केल बार = 50 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: भ्रूण में GFP की अभिव्यक्ति 2 दिन के बाद lentiviral वेक्टर और encapsulated प्लास्मिड इंजेक्शन. स्केल बार = 100 मिमी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्राप्तकर्ता चिकन भ्रूण में इंजेक्ट किए गए लाल प्रतिदीप्ति-लेबल वाले PGCs का विज़ुअलाइज़ेशन( E6.0, HH चरण 28) गोनाड। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
चिकन भ्रूण के ओवो इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन की विधि को बहिर्जात सामग्री (वेक्टर, वायरल, या पीजीसी) के लिए अनुकूलित किया जाता है जिसे भ्रूण में स्थानांतरित किया जाता है। इस विधि के आधार पर, हमने स्थिर जीन ओवरएक्सप्रेशन या हस्तक्षेप (स्पिनजेड, जून, यूबीई 2 आई, आदि) के साथ चिकन भ्रूण मॉडल का निर्माण किया 17,18,19. ये अच्छी तरह से स्थापित मॉडल इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता साबित करते हैं। इसके अतिरिक्त, हमने न केवल प्राप्तकर्ता के भ्रूण गोनाड में अलग-अलग पीजीसी स्थानांतरित कर दिए, बल्कि प्रेरित पीजीसी के साथ प्रत्यारोपित भ्रूण गोनाड के साथ व्यवहार्य संतानों का भी सफलतापूर्वक उत्पादन किया, जो भविष्य में इस विधि के भव्य आवेदन का तात्पर्य है20।
विधि का महत्वपूर्ण कदम इंजेक्शन है। बहिर्जात सामग्री को सीधे रक्त वाहिकाओं में इंजेक्ट किया जाना चाहिए, न कि बहुत गहरा या बहुत उथला। इस प्रकार, इसे चिकन भ्रूण और उच्च इंजेक्शन कौशल के साथ काम करने के अनुभव की आवश्यकता होती है जिसे आसानी से अभ्यास के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। एयर-सेल इंजेक्शन की तुलना में, उच्च इंजेक्शन प्रभावकारिता और सटीकता इस विधि का उपयोग करके अधिक आसानी से प्राप्त की जाती है। उच्च लागत और जटिल चरणों की सीमाओं के अलावा, जब एक बड़ी खिड़की बनाई जाती है तो इलेक्ट्रोट्रांसफेक्शन लागू नहीं किया जाता है, क्योंकि इससे कम जीवित रहने की दर हो सकती है।
चिकन भ्रूण में जीन हेरफेर के लिए एक विधि के रूप में, विधि में कुछ सीमाएं भी हैं। लगभग आधे अंडे 40% -60% की जीवित रहने की दर के साथ इंजेक्शन के बाद इनक्यूबेशन के दौरान मर गए थे। इस बीच, वितरण दक्षता पर विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है, विशेष रूप से पीजीसी इंजेक्शन के लिए (हमारे मामले में, प्लास्मिड और लेंटीवायरस इंजेक्शन की दक्षता ~ 50% -60% है, और पीजीसी इंजेक्शन की दक्षता ~ 30% -40% है)। भविष्य में, प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया जा सकता है और जीवित रहने की दर को काफी बढ़ाया जा सकता है, इस विधि के आवेदन क्षेत्र में और सुधार हो सकता है।
अंत में, यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि इन ओवो चिकन भ्रूण इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन भ्रूण में स्थानांतरित होने के लिए बहिर्जात सामग्री (वैक्टर या पीजीसी) के लिए विशिष्ट है। इसके अलावा, इस विधि को आसानी से सीखा जा सकता है और कई क्षेत्रों में लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
हितों के टकराव की घोषणा नहीं की गई थी।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31972547) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जिंग वांग द्वारा कॉपी की गई बैठक और वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी, यूएसए में मलिक डोनलिक द्वारा वॉइसओवर की सराहना करते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescence macro-microscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Glass Capillaries | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | liposome |
| pEGFP-N1 vector | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP lentivirus vector | Addgene | 128652 | |
| Pneumatic Microinjector | Narishige | IM-11-2 | |
| Puller | Narishige | PC-100 | |
| Trypan Blue Stain | Gibco | 15250061 |
References
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