En meget skalerbar tilgang til at udføre økologiske undersøgelser af selfing caenorhabditis nematoder

Summary

Denne protokol kan bruges til at udføre store økologiske undersøgelser af selfing Caenorhabditis nematoder. Den primære fordel ved denne metode er den effektive organisering og analyse af økologiske og molekylære data forbundet med nematoderne indsamlet fra naturen.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en af de største modelorganismer inden for biologi, men først for nylig har forskere fokuseret på dens naturlige økologi. Den relative sparsomme information om C. elegans i sin naturlige sammenhæng kommer fra de udfordringer, der er forbundet med identifikationen af den lille nematode i naturen. På trods af disse udfordringer har et stigende fokus på C. elegans økologi forårsaget et væld af nye oplysninger om dets liv uden for laboratoriet. Den intensiverede søgen efter C. elegans i naturen har bidraget til opdagelsen af mange nye Caenorhabditis arter og afsløret, at kongeneriske nematoder ofte lever sammen i naturen, hvor de lever af mikrobielle blomster forbundet med rådnende plantemateriale. Identifikationen af nye arter har også afsløret, at det androdioecious parringssystem hos mænd og selvbefrugtende hermafroditter har udviklet sig tre gange uafhængigt inden for Caenorhabditis. De to andre selvkørende arter, C. briggsae og C. tropicalis, deler de eksperimentelle fordele ved C. elegans og har muliggjort komparative undersøgelser af det mekanistiske grundlag for vigtige træk, herunder selvbefrugtning. På trods af disse fremskridt er der stadig meget at lære om økologien og den naturlige mangfoldighed af disse vigtige arter. For eksempel mangler vi stadig funktionel information for mange af deres gener, som måske kun opnås gennem en forståelse af deres naturlige økologi. For at lette økologisk forskning i selvkørende Caenorhabditis nematoder udviklede vi en meget skalerbar metode til at indsamle nematoder fra naturen. Vores metode gør brug af mobile dataindsamlingsplatforme, skybaserede databaser og R-softwaremiljøet til at forbedre forskernes evne til at indsamle nematoder fra naturen, registrere tilknyttede økologiske data og identificere vilde nematoder ved hjælp af molekylære stregkoder.

Introduction

De sidste to årtier har medført en øget interesse for økologien af Caenorhabditis nematoder. Fra disse undersøgelser ved vi, at de fritlevende Caenorhabditis-arter kan isoleres fra flygtige mikrohabitater i både tempererede og tropiske regioner, hvor de lever af mikrobielle blomster forbundet med nedbrydende plantemateriale, nogle gange i sympatry1,2,3,4,5,6,7,8 . Vi har også lært, at konvergent udvikling af selvbefrugtning har fundet sted i slægten tre gange, og selving er den dominerende reproduktionsmåde for C. briggsae, C. elegans og C. tropicalis9,10. Blandt disse selvbrugere er C. elegans et af de mest studerede dyr på Jorden og er blevet brugt af forskere til at gøre kritiske fremskridt inden for biologi. Det er vigtigt, at de andre selvkørende Caenorhabditis-arter deler mange af C. elegans eksperimentelle fordele og hurtigt fremmer komparative undersøgelser i slægten. Den kryptiske karakter af disse nematoder i naturen gør det imidlertid vanskeligt at studere deres økologi og naturlige mangfoldighed, hvilket er afgørende for at forstå deres geners biologiske funktioner og de måder, hvorpå evolutionen har formet genetisk mangfoldighed blandt ^arterne10,11.

Den største udfordring ved at studere økologien af selvkørende Caenorhabditis nematoder i naturen er deres lille størrelse; voksne nematoder er ofte 1 mm lange eller mindre. Denne udfordring kræver, at forskere prøver substrater fra naturen og forsøger at adskille nematoder af interesse fra substraterne i laboratoriet uden evnen til at observere dyr i naturen. Fordi selv uddannede eksperter har svært ved at skelne selvkørende Caenorhabditis nematoder fra andre fritlevende nematoder under mikroskopet, fjernes nematoder typisk fra substratet, isoleres og efterlades til at sprede sig, før de identificeres ved sekvensidentitet ved hjælp af etablerede molekylære stregkoder3,12,13,14 . Den tid og de kræfter, der kræves for at behandle hver nematode på denne måde, udgør en organisatorisk udfordring, da forskere skal være i stand til at spore identiteten af hver nematode isoleret i laboratoriet tilbage til det nøjagtige substrat og tilhørende økologiske data, der er udtaget prøver af i marken. Her beskriver vi en trinvis proces til effektivt at indsamle og identificere selvkørende Caenorhabditis nematoder fra marken og trofast forbinde disse isolater med deres tilhørende rumlige og økologiske data i høj skala.

Denne indsamlingsmetode øger omfanget og nøjagtigheden af økologiske undersøgelser ved hjælp af mobile dataindsamlingsplatforme, skybaserede databaser og R-softwaremiljøet. Fulcrum er en tilpasselig dataindsamlingsplatform, der fungerer med de fleste mobile enheder og giver brugerne mulighed for at opbygge brugerdefinerede applikationer til at indsamle og organisere placeringsbaserede data (https://www.fulcrumapp.com). Denne protokol indeholder detaljerede instruktioner om, hvordan man bruger tilpassede dataindsamlingsapplikationer til at organisere rumligt eksplicitte økologiske data fra marken og nøjagtigt forbinde disse data med identiteten af nematoder isoleret i laboratoriet. Protokollen forklarer også, hvordan man effektivt identificerer selvkørende Caenorhabditis nematoder ved hjælp af etablerede molekylære stregkoder. Dataene fra disse metoder kan behandles enkelt og reproducerbart med den ledsagende R-softwarepakke easyFulcrum15 for at udforske økologien og den genetiske mangfoldighed af naturlige Caenorhabditis-populationer.

Protocol

1. Forberedelse af indsamling

1. Identificer et sted at undersøge Caenorhabditis nematoder.
   BEMÆRK: I de fleste tempererede regioner kan C. elegans og C. briggsae let isoleres fra menneskerelaterede levesteder som landbrugsmarker eller land- og byhaver1. I subtropiske og tropiske regioner kan C. briggsae, C. elegans og C. tropicalis alle findes i de menneskerelaterede levesteder, der er anført ovenfor, nogle gange i nærheden af hinanden. C. elegans synes dog at foretrække køligere og tørrere levesteder end de andre arter i tropiske ^{levesteder7,8}. Hver af arterne kan også isoleres fra vilde levesteder, der ikke er forbundet med mennesker, men disse levesteder udtages sjældnere.
2. Opret et Fulcrum-projekt for at organisere indsamlings- og isolationsdata med de mobile dataindsamlingsapplikationer.
   1. Opret en konto hos Fulcrum online ved hjælp af en gratis ^{uddannelsesaftale16}. Føj applikationen Nematode Field Sampling til en Fulcrum-konto ved at klikke på knappen ADD APP17.
   2. Føj applikationen Nematode Isolation til en konto ved at klikke på knappen TILFØJ APP18.
      BEMÆRK: Det anbefales, at hver tur til et sted organiseres som sit indsamlingsprojekt ved hjælp af navngivningskonventionen 'YearMonthLocation', f.eks. 2020FebruaryAustralia.
3. Føj brugere til Fulcrum-kontoen for at give dem adgang til indsamlingsprojektet. Sørg for, at hver bruger downloader Fulcrum-mobilapplikationen for at deltage i projektet.
4. Udskriv et sæt QR-kodeetiketter for at spore samlingerne (C-etiketter) og nematodeisolationerne (S-etiketter) med mobilapplikationen. Fastgør C-etiketterne til plastikposer med lynlås, rul de mærkede poser i grupper på 25, og pakk dem ind med et gummibånd til pakning. Opbevar sættet med S-etiketter til brug i laboratoriet.
   BEMÆRK: I hele denne protokol er samlingerne (substrater fra marken) indeholdt i poser eller på plader og er mærket med C-etiketter. De isolerede nematoder er mærket med S-etiketter. C-etiketterne bruges til at identificere unikke samlinger, og S-etiketterne bruges til at identificere unikke nematodeisolater. Disse to typer etiketter bruges til at skabe forbindelsen mellem en bestemt samling (C-label) og nematoderne isoleret fra denne samling (S-labels) i Fulcrum-databasen. Udskriv dobbelt så mange S-labels som C-labels til et indsamlingsprojekt, fordi der i gennemsnit isoleres to nematoder pr. samling. Flere S-labels kan udskrives senere, hvis det er nødvendigt. 2.500 unikke C-etiketter (supplerende fil 1) og 5.000 unikke S-etiketter (supplerende fil 2) findes i tillægget.
5. Forbered 10 cm NGMA plader til samlinger og 3,5 cm NGMA plader til isolering af nematoder. Lav en plade på 10 cm og mindst to plader på 3,5 cm pr. ^kollektion21. Disse plader er podet med Escherichia coli stamme OP50 efter etablerede protokoller. Opbevar pladerne inden brug ved 4 °C i højst 1 måned.

2. Indsamling i marken

BEMÆRK: Caenorhabditis nematoder isoleres oftest fra rådnende vegetabilsk materiale, herunder frugt, nødder, frø, bælg, blomster, stilke, vegetabilsk kuld og kompost1,5,6,8. De bedste substrater er rådne og næsten uigenkendelige som frugter eller blomster; undgå underlag, der er for tørre eller våde (figur 1). Underlag indsamles mest effektivt fra marken ved at arbejde parvis. Personen med det berøringsfri infrarøde termometer vælger et substrat til indsamling og indsamler prøven, mens deres partner bruger Nematode Field Sampling-applikationen i Fulcrum til at registrere indsamlingsdataene. Parret af samlere gentager denne proces, indtil det ønskede antal prøver er indsamlet. Listen over materialer, der kræves til feltarbejde, findes i (Supplerende tabel 1).

1. Åbn Fulcrum-mobilappen, vælg Nematode Field Sampling i rullemenuen. Tryk på + for at starte en ny post i projektet (figur 2A). Tag et billede af substratet.
2. Klik på feltet øverst i midten for at vælge det korrekte indsamlingsprojekt, der er lavet i trin 1.2 (figur 2B). Tryk på feltet C-label nederst i samlingsposten, og vælg Scan, når prompten vises. Scan stregkoden på indsamlingsposen ved hjælp af kameraet på mobilenheden, og tryk derefter på OK øverst til højre på skærmen.
3. Tryk på feltet Substrat , og vælg en substrattype i rullemenuen. Tilføj noter om substratet ved at trykke på feltet Substrater og manuelt indtaste noter.
4. Vælg et landskab i rullemenuen. Vælg det landskab, der bedst repræsenterer prøveudtagningsstedet.
5. Vælg en himmelvisning. Når du vælger himmelvisning, skal du beskrive himmelsynligheden på prøveudtagningsstedet (f.eks. En fuld himmeludsigt uden blokeret udsigt fra træer eller andre strukturer = fuld).
6. Mål substratets overfladetemperatur ved hjælp af berøringsfrit termometer, og registrer værdien i substrattemperaturfeltet.
   BEMÆRK: Hold det berøringsfri termometer højst 14 tommer fra underlaget, mens du registrerer temperaturen.
7. Mål omgivelsestemperaturen og fugtigheden med den håndholdte enhed, og registrer disse data i de rigtige felter.
   BEMÆRK: Kontroller, at omgivelsestemperatur- og fugtighedsanordningen ikke er i venteposition. Måleenheden ændres, når knappen frigives. Opbevar enheden i en udvendig lomme for at undgå uregelmæssige aflæsninger.
8. Gem posten i Fulcrum ved at trykke på Gem øverst til venstre på skærmen.
9. Saml omkring en spiseskefuld af substratet uden pinde eller andre hårde stykker ved at vende opsamlingsposen for at bruge den som en "handske" til at samle substratet op og derefter forsegle posen. Læg et papirhåndklæde i posen, hvis prøven er særlig fugtig.
   BEMÆRK: I varme klimaer skal du placere poserne i bløde kølere med køligere pakker for at holde samlingerne kølige.
10. Når alle prøverne er indsamlet for dagen, skal du rengøre indsamlingsudstyret, tage batterier ud af sonder, genoplade batterier, frysepakker igen. Synkroniser Fulcrum-indsamlingsdataene ved at trykke på knappen Synkroniser øverst til venstre i programmet Nematode Field Sampling .
    BEMÆRK: Uploads kan tage flere minutter uden en stærk mobilforbindelse, så det kan være bedst at vente på WiFi-adgang. Dataene forbliver på mobile enheder og synkroniseres med skyen.
11. Send prøverne til en hjemmeinstitution ved at placere dem i en forsendelseskasse natten over. Minimer den tid, prøverne udsættes for temperaturer under 11 °C eller over 25 °C, ved at sende pakker på dage, hvor godset transporteres.
    BEMÆRK: De fleste forsendelsesfaciliteter sender ikke gods natten over i weekenden på fjerntliggende steder.

3. Udregulering af feltsamlinger i laboratoriet

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du organiserer overførslen af prøver fra mærkede indsamlingsposer til mærkede plader. Prøverne kan ankomme fra en forsendelse natten over eller direkte fra marken.

1. Modtag forsendelsen af samlinger og inspicér for ødelagte poser eller andre tegn på skade. Hvis poser er brudt, skal du kassere materialet og rengøre de ubrudte opsamlingsposer med 70% ethanol; undgå C-etiketten på posen med ethanolen, da det vil misfarve etiketten og gøre den vanskelig at læse.
2. For hver lynlåspose skal du notere C-etiketten på posen og fastgøre en matchende C-etiket på låget på en 10 cm plade plettet med OP50-bakterier.
   BEMÆRK: De mærkede 10 cm plader kaldes 'C-plader' for resten af protokollen. Den nemmeste måde at organisere prøverne på er at placere opsamlingsposerne på en laboratoriebænk med den matchende C-plade ovenpå (figur 3).
3. For hver samling overføres ca. en spiseskefuld prøve fra opsamlingsposen til C-pladen ved hjælp af en ren plastske. Tilsæt prøven omkring bakterieplænen i halvmåne eller ringform, dæk ikke bakterieplænen helt (figur 4).
   BEMÆRK: Hold spisesedlen ren ved at placere den i et bægerglas med 95% ethanol, når den ikke er i brug. Brug et papirhåndklæde til at tørre spiseskefulden, inden du overfører yderligere prøver.
4. Registrer det tidspunkt, hvor samlingerne blev overført fra opsamlingsposer til C-plader, og opbevar C-pladerne ved stuetemperatur (RT) i mindst 24 timer, før man forsøger at isolere nematoder i afsnit 4.

4. Isolering af nematoder fra samlinger

1. Åbn Fulcrum-applikationen på den mobile enhed, og vælg Nematode Isolation i programmenuen (figur 5A). Lav en ny isolationspost ved at trykke på ikonet + nederst til højre (figur 5B).
2. På det nye skærmbillede med isolationsposten skal du bekræfte det korrekte indsamlingsprojekt ved at markere det projektnavn, der vises i feltet øverst i midten. Hvis det forkerte projekt vises, skal du trykke på projektnavnet for at skifte til det rigtige projekt (figur 5C).
3. Tryk på knappen Vælg under feltet C-etiket for at finde den C-etiket, der er knyttet til den prøve, hvorfra nematoder isoleres (figur 5D). Tryk på ikonet Søg , og tryk derefter på ikonet Scan for at scanne C-label QR-koden på C-pladen med enhedens kamera. Når QR-koden er scannet, vises en C-label-post i feltet C-label .
4. Tryk på kameraikonet i feltet Fotos for at åbne enhedens kamera, og brug det til at tage et foto af prøven på C-pladen med QR-koden synlig (figur 5E). Tryk på Udført for at vende tilbage til isolationsskærmen.
   BEMÆRK: Disse isolationsoptagelsesbilleder kan bruges til at udforske specifikke egenskaber ved substratet på et senere tidspunkt.
5. Brug et dissekerende mikroskop til at lede efter nematoder på C-pladen. Tryk på feltet Orme på prøve for at registrere tilstedeværelsen af nematoder på prøven (figur 5F). Tryk på Ja , hvis nematoder er til stede på C-pladen, og tryk på Nej, hvis der ikke er nogen nematoder til stede.
6. Tryk på Spor, hvis der kun er nematodespor til stede. Hvis der ikke er nematoder til stede, parafilm C-pladen og bortskaffe den i en biofarebeholder.
   BEMÆRK: Vend C-pladen over papiraffaldsbeholderen, og tryk forsigtigt på bagsiden af pladen for at løsne alle de udtagne substrater. Dette trin gør det lettere at finde og isolere nematoder, der kan være under substratet på C-pladen.
7. Hvis nematoder er til stede, skal du isolere op til fem nematoder fra C-pladen. For at isolere en nematode skal du overføre en nematode fra C-pladen til en S-plade ved hjælp af en platintrådplukker. Isoler sunde, gravide voksne, hvis det er muligt. Isoler dog andre faser, hvis voksne ikke findes.
   BEMÆRK: Efter isolering vil op til fem S-plader hver have en enkelt nematode på sig. Opbevar disse S-plader med isolerede nematoder fra den samme C-plade organiseret sammen i en pæn stak væk fra andre S-plader, indtil de er indgået i Fulcrum.
8. Tryk på feltet S-mærkede plader for at indtaste den eller de S-plader, der bruges til denne isolering. Tryk på + nederst til højre. Tryk på S-label , og klik derefter på Scan for at åbne enhedens kamera. Brug enhedens kamera til at scanne S-label QR-koden på S-pladen.
   BEMÆRK: Sørg for, at S-label-koden stemmer overens med koden på pladen. Hvis det stemmer overens, skal du trykke på Udført. Hvis det ikke gør det, skal du trykke på Annuller og genscanne, indtil det matcher, og klik derefter på Udført. Nogle gange scannes QR-koder for nærliggende plader ved et uheld.
9. Når du har indtastet hver S-plade, skal du gemme posten med knappen Gem øverst til højre. Posten går tabt, hvis den ikke gemmes. Tryk på + nederst til højre for at tilføje flere S-mærkede plader, hvis det er nødvendigt, indtil alle nematoder isoleret fra C-pladen er indtastet. Når du har tilføjet alle de S-mærkede plader til isolationsposten, skal du trykke på knappen < øverst til venstre for at gå tilbage til isolationspostskærmen.
   BEMÆRK: Hvis du vil annullere en isolationspost, fordi fejl ikke kan løses, skal du klikke på Annuller øverst til venstre. Dette trin åbner en dialogboks, der spørger, om posten kan kasseres uden at gemme. Hvis det ønskes, skal du klikke på Ja, kassér.
10. Tryk på knappen Gem øverst til højre, når isolationsposten har tilføjet alle oplysninger korrekt. Derefter parafilm S-pladerne med isolerede nematoder og læg dem til side i et område, der er udpeget til at holde S-plader med nematoder.
11. Parafilm C-pladen og kassér den i biofarebeholderen. Tryk på ikonet Synkroniser for at uploade alle data til Fulcrum.
12. Sorter alle S-pladerne i alfanumerisk rækkefølge, og læg derefter S-pladerne i papkasser. Sørg for, at S-pladerne er med lågsiden nedad og parafilmet. Stabl op til fire S-plader i én position i kassen, og mærk papkassen med projektets navn, dato, klokkeslæt og et unikt kassenummer.
13. Opbevar de mærkede kasser på RT. Disse isolater vil blive kontrolleret for spredning ved 48 timer og igen ved 168 timer, hvis det er nødvendigt.

5. Eksport af S-plader fra Fulcrum

BEMÆRK: Dette afsnit beskriver, hvordan du eksporterer S-etiketter, der bruges i isolationsprocessen, fra Fulcrum-projektdatabasen. Disse S-etiketter vil blive brugt til at spore spredningsområder, mens de identificeres ved sekvensidentitet i afsnit 6-9.

1. Log ind på Fulcrum-webstedet, og vælg applikationen Nematode Isolation . Klik på Eksportør fra venstre side af skærmen. Klik for at vælge det ønskede projekt, og marker afkrydsningsfeltet Nematodeisolering . Klik på Næste for at downloade en .zip fil, der indeholder filen "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv".
2. Åbn filen 'nematode_isolation_s_labeled_plates.csv', og sorter den efter kolonnen 'S-label' i stigende rækkefølge (den mindste S-etiket vil være øverst). Vælg alle S-etiketterne, og kopier dem fra regnearket.
3. Naviger til den vilde isolat genotyping skabelon google sheet (wild_isolate_genotyping_template) ved hjælp af en ^webbrowser19.
   1. Lav en kopi af dette Google-ark ved at højreklikke på fanen Genoypingskabelon og derefter vælge indstillingen Kopier til nyt regneark . Vælg Åbn regneark for at se det nye Google-ark.
   2. Navngiv dette nye ark med omdrejningspunktets projektnavn efterfulgt af 'wild_isolate_genotyping', f.eks. '2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping'.
      BEMÆRK: Dette ark kaldes 'genolysningsarket' i resten af protokollen.
4. Indsæt de S-etiketter, der er kopieret fra kolonnen »nematode_isolation_s_labeled_plates.csv« »s_label«, i kolonnen med genotypeark med titlen »s_label«. Tjek kolonnen 's_label_repeat_error' for '1'er. En værdi på '1' i denne kolonne betyder, at S-etiketten duplikeres et eller andet sted på genotypearket. Hvis der opdages dobbeltarbejde, skal du undersøge og rette dem, før du går videre.
5. Udfyld kolonnen »isolation_box_number« for alle S-etiketter.

6. Kontroller for spredning på S-plader

1. Kontroller for dyr, der formerer sig på S-plader 48 timer efter isolering (brug dato og klokkeslæt for sidste isolering på kassen fra trin 4.11 til at guide timing).
   BEMÆRK: Prolifererende nematoder er kendetegnet ved afkom på S-pladen.
2. Hvis en S-plade breder sig, skal du indtaste »1« i kolonnen proliferation_48 på genotypearket og derefter flytte S-pladen til en rubrik mærket »48 timers spredning, rubrik 1«. Anbring maksimalt 88 S-plader i en spredningskasse, og begynd derefter at fylde en ny kasse mærket '48 timers spredning, boks 2'. Sørg for, at S-etiketterne er organiseret i alfanumerisk rækkefølge i 48 timers spredningsbokse.
   BEMÆRK: Bortskaf ikke de ikke-spredende S-plader; disse plader vil blive kontrolleret igen ved 168 timer efter isolation. Hvis det ønskes, konsolideres disse S-plader i numerisk rækkefølge i kasser mærket '48 timer ikke-spredning, boks X', men husk at registrere, hvornår 168 timers afkrydsningsfeltet skal ske på den nye boks.
3. Efter at have identificeret alle de spredende S-etiketter ved 48 timer, gå videre til afsnit 7 for S-plader med spredning ved 48 timer.
4. Kontroller de S-plader, der ikke spredte sig ved 48 timer efter isolation igen ved 168 timer efter isolation.
   1. Hvis en S-plade nu breder sig, skal du indtaste '1' i kolonnen proliferation_168 på genotypearket og derefter flytte S-pladen til en kasse mærket '168 h proliferation, box 1'.
   2. Anbring maksimalt 88 S-plader i en spredningsboks, og begynd derefter at fylde en ny kasse mærket '168 timers spredning, boks 2'. Sørg for at organisere S-etiketter i alfanumerisk rækkefølge i 168 timers spredningsbokse.
5. Kassér S-pladerne, der ikke har spredning efter 168 timer. Gå videre til afsnit 7 for S-plader med spredning ved 168 timer.

7. Lysis af isofikvindelige linjer

BEMÆRK: Dette trin bruger datafilterværktøjet i Google Sheets til at hjælpe med at udskrive lysisregneark til S-pladerne i spredningsboksene. Formålet med lysis-regnearkene er at give personalet de korrekte positioner til S-etiketter i lysisbåndsrør ved bænken.

1. Åbn genotypearket for det ønskede projekt, og vælg alle celler ved at skrive Cmd + A. Klik på Data > Opret et filter for at tilføje en filterknap til hver kolonneoverskrift. Brug knapperne Filter til kun at få vist de S-plader, der skal genotypes. Hvis f.eks. alle S-plader med spredning ved 48 timer skal lyseres: Klik på knappen Filter i kolonnen 'proliferation_48', og vælg '1'.
2. Når det genotypende Google-ark er blevet filtreret, skal du gennemgå listen over S-etiketter, der vises, for at sikre, at de er de S-etiketter, der skal udskrives på regnearket.
   1. I kolonnen 'strip_tube_number' i det genotypende Google-ark skal du indtaste et unikt nummer hver 11. række.
   2. Indtast striprørnumrene for et projekt i successiv rækkefølge, der starter ved 1 og aldrig duplikeres. Indtast 2 til 12 for hvert strimmelrørnummer i 'strip_tube_position'.
      BEMÆRK: Brug 12-rørs strimmelrør til lysis. Den første position (strip_tube_position 1) vil være kontrol, men kontrollerne føjes ikke til lysisregnearkene (kun de strip_tube_positions tilføjes, 2-12). På tidspunktet for lysis vil den positive kontrolstamme 'N2' blive tilføjet til position 1 i hvert lige nummereret strimmelrør som en positiv kontrol. Der tilføjes ingen orme til position 1 i hvert ulige nummereret strimmelrør som en negativ kontrol.
3. Filtrer det genotypende google-ark yderligere for kun at inkludere S-etiketterne i en spredningsboks, der skal lyseres, og vælg derefter kolonnerne 's_label' til 'lysis_notes'. Udskriv et lysisregneark for hver spredningsboks, der skal lyseres.
4. Klik på rullemenuen i feltet Udskriv, og vælg Valgte celler. Klik på Næste øverst til højre, og brug derefter dialogen til at udskrive lysisregnearket til spredningsboksen.
5. Gentag trin 7.3-7.5 for at udskrive et lysikregneark for hver spredningsboks.
   BEMÆRK: Hver spredningsboks rummer op til 88 S-plader, hvilket svarer til otte 12-brønds strimmelrør.
6. Forbered 12-brønds strimmelrør til alle de prøver, der vil blive lyseret. Mærk et strimmelrør med et unikt 'strip_tube_number', der er tildelt i lysisregnearket. Denne etiket skal skrives på hættestrimlen og strimmelrøret for at undgå forvirring, hvis de er adskilt. EVEN-striprørene har en positiv kontrol (N2-orme) i position 1. ODD-striprørene har en negativ kontrol (ingen orme) i position 1.
7. Der fyldes nok lysisbuffer (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM _MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Tween 20, 0,02% gelatine med proteinase K tilsat til en endelig koncentration på 0,4 mg/ml) til alle prøverne og tilsættes 5% ekstra for pipettefejl. Skaler efter behov.
   BEMÆRK: Lysisbufferen fremstilles bedst ved at kombinere alle ingredienser undtagen proteinase K og fryse i 10-50 ml alikvoter ved -20 °C. Optø aliquots og opbevar dem ved 4 °C inden brug; Umiddelbart før brug tilsættes proteinase K og blandes grundigt. Opbevar lysisbufferen på is, mens du arbejder.
8. Arranger S-pladerne til et bestemt strimmelrør i rækkefølge ved hjælp af det trykte lysisregneark som vejledning.
9. Fjern et strimmelrør, og tilsæt 8 μL lysisbuffer til hver hætte med en gentagen pipettor. Tilføj lysisbufferen til en strimmel hætter ad gangen, fordi lysisbufferen vil fordampe, hvis den efterlades ved RT og afdækkes. Pluk 3-5 dyr fra kildepladerne (S-plade eller N2-lagerplade til positiv kontrol) i de relevante hættepositioner, der er angivet på lysisregnearket. Optag noter til enhver S-plade med færre end 5 orme plukket til lysis i den lysis_notes del af lysisregnearket.
10. Når du har lagt nematoder i hver position af strimmelrøret, skal du placere hættestrimlen tilbage på strimmelrøret. Match den markerede hætte (position 1) med det markerede rør (position 1). Når det er lukket, centrifugeres strimmelrøret kort, indtil nematoderne er i bunden af røret.
11. Anbring strimlen i -80 °C fryseren, indtil den er helt frosset (mindst 10 min.). Gentag trin 7.9 til 7.11, indtil alle strimler har nematoder tilsat til lysis. Organiser rørstrimlerne i numerisk rækkefølge.
12. Fjern sæt af striprør, og kør lysisprogrammet i en termocyklist: 1 time ved 60 °C, 15 min ved 95 °C, hold ved 12 °C. Når lysisprogrammet er færdigt, skal du spinde prøverne ned ved 300 x g i 15 s ved RT og opbevare lysaterne ved -80 ° C i op til 1 uge.
13. Organiser rørstrimlerne i numerisk rækkefølge ved hjælp af 96-brønds pladeholdere og inkluder en etiket med et spredningsboksnummer, strimmelrørnummerområde, dato og forskerens initialer. Opdater genolysningsarkkolonnerne 'lysis_date' og 'lysis_notes' med oplysninger fra lysisregnearket.

8. PCR af SSU- og ITS2-sekvenser

BEMÆRK: Dette afsnit indeholder instruktioner om, hvordan du udfører to separate PCR'er for hver lyseret S-plade. Det første primersæt forstærker et 500-bp fragment af 18S rDNA lille underenhedsgen (SSU); oECA1271 = fremadgående primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = omvendt primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA ¹². Denne PCR bruges til at kontrollere kvaliteten af skabelon-DNA'et. PCR forstærker SSU-regionen for næsten alle nematodearter. Hvis SSU PCR ikke forstærker, tyder dette resultat på, at lysiskvaliteten er dårlig, og lysen skal gentages for denne S-plade. Det andet primersæt forstærker et 2.000 bp fragment af det interne transskriberede afstandsområde mellem 5.8S og 28S rDNA-generne (ITS2); oECA1687 = fremadrettet primer CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = omvendt primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. ITS2 PCR-produktet er Sanger-sekventeret, og sekvensen bruges til at identificere nematoder i Caenorhabditis-slægten til artsniveauet efter sekvenslighed.

1. Brug filtreringsværktøjet i genotypearket til kun at få vist de S-etiketter, der skal bruges til PCR.
   1. Opdater pcr_plate_number, og pcr_well kolonner i genodypingarket. For at forhindre nedbrydning af lysismateriale køres SSU og ITS2 PCR'er på samme tid.
   2. Brug de samme pcr_plate_number til ITS2- og SSU PCR'erne, selvom disse er separate reaktioner i separate plader. De vil blive skelnet med »SSU«- eller »ITS2«-mærker.
2. Tildel en pcr_plate_number til otte eller færre strimmelrør (et strimmelrør pr. Række af PCR-pladen med 96 brønde, arrangeret i stigende rækkefølge, f.eks. laveste strimmelrørnummer ovenpå). Tildel derefter en pcr_plate_well til hver S-etiket i strimmelrørene.
   BEMÆRK: Strimmelrørene er arrangeret i stigende rækkefølge med det laveste strimmelrørnummer tildelt række A og det højeste tal i række H. Position 1 af alle strimmelrør er tildelt kolonne 1. Derfor vil striprør nummer 1, position 1 blive tildelt PCR-plade nummer 1, godt A01.
3. Mærk 96-brønds PCR-plade (r) for at rumme de prøver, der skal bruges til PCR. Mærk hver PCR-plade med følgende oplysninger: projektnavn, PCR-type, PCR-pladenummer og dato for PCR (f.eks. 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Mærk også pladen med strimmelrørnumrene, der vil blive indlæst i hver række.
4. Fjern lysismaterialet fra fryseren -80 °C, og optø strimmelrørene, der indeholder lysismaterialet, på is. Mens lysismaterialet optøes, skal du forberede ITS2- og SSU-masterblandinger i separate rør på is. SSU- og ITS2 PCR-opskrifterne findes i supplerende tabel 2.
   BEMÆRK: Forbered 100 reaktioner af PCR-masterblanding for hver 96-brønds plade for at muliggøre pipetteringsfejl. Brug en 15 ml eller 50 ml konisk til at holde masterblandingen, hvis der skal anvendes store mængder.
5. Vortex masteren blandes forsigtigt, indtil Taq fordeles i hele blandingen. Når de er blandet, blandes 38 μL af masteren til de relevante brønde på PCR-pladerne på is. Brug sterile v-bundtrug til engangsbrug og en 12-brønds flerkanalspipette til at overføre masterblandingen til PCR-pladerne.
6. Spin ned de optøede lysisstrimmelrør for at fjerne lysismateriale fra hætterne. Fjern forsigtigt lågene på alle strimmelrørene, der skal lægges i den første PCR-plade. Brug en flerkanalspipette med lavt volumen (enten 12-brønd eller 8-brønd) til at tilføje 2 μL lysat til den relevante brønd i PCR-pladen. Rør forsigtigt lysatet op og ned en gang, før du fjerner 2 μL.
   BEMÆRK: Kontroller tipene for at sikre, at de indeholder lysis før overførslen. Husk at ændre tip mellem rækker eller kolonner.
7. Dæk PCR-pladen med PCR-klæbende folie og brug en rulle til at skabe en tæt tætning. Når folien er påført, drejes PCR-pladerne kortvarigt ned i en centrifuge. Opbevar pladen på is, indtil den er klar til at køre i termocyklisten.
8. Kør PCR'erne med det relevante termocyklistprogram. Se supplerende tabel 2 for at få flere oplysninger om SSU- og ITS2 PCR-programmerne.
9. Gentag trin 8.4- 8.8, indtil alle PCR'er er kørt.
10. Mens PCR-reaktionerne kører, hæld en 100 ml 1,5% agarosegel. Hver gel vil indeholde prøver eller en enkelt PCR-plade.
    1. Der tilsættes 1,5 g agarose til en kolbe på 500 ml, derefter tilsættes 100 ml 1x TAE-buffer (supplerende tabel 3), og der hvirvles rundt for at blande. Mikrobølgeovn til opløsning og afkøling af gelen.
    2. Når opløsningen er afkølet, tilsættes 5 μL 10 mg/ml ethidiumbromidopløsning og blandes for at kombinere. Hæld opløsningen i en støbebakke med fire kamme med 25 brønde, så gelen kan rumme 96 prøver plus en stige for hver række i gelen.
       BEMÆRK: Ethidiumbromid er et potent mutagen. Ved håndtering af ethidiumbromid skal du bruge en laboratoriefrakke, kemikalieresistente handsker og kemiske sikkerhedsbriller.
11. Lige før PCR er færdig, tilsættes 6x lastfarvestof til et engangstrug og bruges en flerkanalspipette til at tilføje 2 μL 6x lastfarvestof til hver brønd i en ny 96-brønds PCR-plade. Denne plade vil blive brugt til at indlæse prøverne i gelen. Lav nok af disse plader til at rumme alle prøverne.
12. Når PCR'erne er færdige, skal du fjerne PCR-pladerne og kortvarigt centrifugere dem ved 300 x g i 15 s ved RT. Opbevar PCR-pladerne på is, indtil PCR-produkterne kan løbe tør på en gel.
    1. For at køre produkterne ud på en gel skal du bruge en 12-brønds flerkanalspipette til at tilsætte 5 μL af hver prøve til den passende brønd på en 96-brønds plade indeholdende 2 μL 6x lastfarvestof.
    2. Læg derefter 6 μL af denne blanding i hver brønd af en nyligt støbt gel. Læg 6 μL på 1 KB plus stige i den første brønd i hver række af gelen.
       BEMÆRK: For at fylde gelens brønde kan det være nødvendigt at blande række A og række B fra PCR-pladen i gelens første række. For at undgå forvirring skal du registrere gel_number og gel_position i genotekstningsarket for hver PCR-prøve.
13. Anbring et nyt folielåg på den resterende PCR i pladen/pladerne, og opbevar dem ved 4 °C. Disse reaktionsprodukter vil blive anvendt til sekventering i trin 9.
14. Kør PCR-produkterne ud på gelen ved 120 V i 20 min. Billede den gel og optegnelse, som S-etiketter giver ITS2- og/eller SSU PCR-produkter, i kolonnerne »pcr_product_its2« og »prc_product_ssu« på genotikarket. Marker tilstedeværelsen af et band med et '1'; markér et '0' for intet band.

9. Identifikation af nematoder med Sanger-sekventering og sekvens BLAST

BEMÆRK: Dette afsnit indeholder instruktioner til sekventering af ITS2-ampliconerne fra S-etiketterne, tilpasning af disse sekvenser til National Center for Biotechnology Information (NCBI) database ved hjælp af BLAST-algoritmen og analyse af BLAST-resultaterne for at identificere nematoderne på S-pladerne.

1. For hver prøve, der er ITS2-positiv, skal du bruge det resterende ITS2 PCR-produkt til Sanger-sekventering ved hjælp af den fremadrettede primer oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Sørg for, at sekventeringsoutputfilerne let kan knyttes til en S-etiket ved at registrere kolonnerne 'sequencing_plate' og 'sequencing_well' for hver S-etiket i genotekroneringen.
2. Hent .seq-outputfilerne for hver S-etiket fra sekventeringsplatformen. Arranger .seq-filerne for et projekt i en enkelt mappe med .seq-filer for hver batch af sekventering, der er placeret i undermapper.
3. Åbn kommandolinjegrænsefladeværktøjet, og naviger til den øverste mappe, der indeholder .seq-filerne, ved at indtaste kommandoen: cd . Hvis den ikke allerede findes, skal du oprette en flettet FASTA for alle .seq-filerne ved at indtaste følgende kommando: for dir i */; gør cd $dir; for fil i *.seq; ekko ">"$file; kat $file; udført >>.. /all_seqs.fa; cd..; færdig.
   BEMÆRK: Denne kode opretter en flettet FASTA-fil med navnet 'all_seqs.fa' fra alle .seq-filerne i projektmappen. Denne fil kan bruges i NCBI online nukleotid BLAST værktøj til hurtigt at justere ITS2 sekvensen af hver S-label til NCBI's sekvens database.
4. I en webbrowser skal du navigere til NBCI ^{BLAST-webstedet20} og klikke på knappen Vælg fil . Vælg den all_seqs.fa-fil, der netop blev oprettet, og klik derefter på knappen Noget lignende sekvenser (BLASTn). Klik på BLAST-knappen nederst på siden for at starte BLAST-søgningen.
5. Opdater genotekstningsarket med BLAST-resultaterne for hver S-etiket. Brug filterværktøjet til at gøre opdatering af genotype-Google-arket lettere. Klik på Data > Opret et filter for at tilføje en filterknap til hver kolonneoverskrift. Filtrer kolonnen sequencing_plate for at vælge de sekventeringsplader, der skal opdateres med BLAST-resultater.
6. Brug rullemenuen på NCBI BLAST-resultatsiden til at kontrollere resultaterne for hver S-plade ITS2-sekvens (figur 6).
7. Kontroller, om der ikke er nogen BLAST-hits. Et sekvens-id på rullelisten med præfikset * har ingen eksplosionshits. For disse S-etiketter skal du indtaste 'no hit ' i kolonnen manual_blast_notes på genotypearket.
8. Tjek for en mulig ny Caenorhabditis art. Klik på linket på det øverste hit for at visualisere justeringen (figur 6). Hvis det øverste hit er (1) en Caenorhabditis-art , (2) justeringen indeholder mere end fem uoverensstemmelser i midten af sekvensen, og (3) forespørgselsdækningen er større end 50%, antyder dette resultat, at isolatet kan være en ny Caenorhabditis-art (figur 7). For disse S-plader indtastes arten af den øverste BLAST i kolonnen 'species_id', indtaster en 1 i kolonnen 'possible_new_caeno_sp' og 'mulig ny Caeno sp.' i kolonnen 'manual_blast_notes' sammen med procentidentitet (f.eks. 'mulig ny Caeno sp. 89% identitet').
9. For S-pladesekvenser, der BLAST til en Caenorhabditis-art , skal du indtaste det fulde slægts- og artsnavn på det øverste BLAST-hit i kolonnen 'species_id'. For eksempel 'Caenorhabditis elegans'.
10. For S-pladesekvenser, der BLAST til en ikke-Caenorhabditis-art , skal du kun indtaste slægten af det øverste BLAST-hit efterfulgt af 'sp.' i kolonnen 'species_id'. Denne notation betyder, at isolatet er en ukendt art inden for den navngivne slægt. For eksempel 'Oscheius sp.'.
    BEMÆRK: ITS2-sekvensen kan ikke anvendes til pålideligt at identificere isolater på artsniveau uden for Caenorhabditis-slægten3,13.
11. Indtast 1 i kolonnen »make_strain_name« på genotypearket, hvis »species_id« = »Caenorhabditis elegans«, »Caenorhabditis briggsae« eller »Caenorhabditis tropicalis« ELLER »possible_new_caeno_sp« = 1.
12. Navngiv stammerne med unikke navne efter Caenorhabditis nomenklaturkonventioner, dvs. en unik laboratoriebetegnelse bestående af 2-3 store bogstaver efterfulgt af et tal for hver unik ^stamme23. Indtast stammenavnene i kolonnen "strain_name".
13. Efter at stammer er navngivet, kan de kryokonserveres ved hjælp af etablerede protokoller ²⁴.

10. Behandling af indsamlingsdata med easyFulcrum-pakken i R

BEMÆRK: Dette trin beskriver, hvordan du forbinder indsamlingsdataene (C-etiketter) og nematodeisoleringsdataene (S-etiketter) sammen ved hjælp af easyFulcrum R-pakken. Softwaren indeholder funktioner, der yderligere vil forbinde Fulcrum-dataene med genotypedataene fra genotypearket, så S-label-artsidentiteter og stammenavne er organiseret i en enkelt dataramme.

1. Opret en ny mappe, der er navngivet til kollektionsprojektet. Arranger mappestrukturen i mappen, så den matcher de krav, der er beskrevet i R-pakken ^{easyFulcrum15}.
2. Naviger til Fulcrum-webstedet, og log ind. Eksporter de rå projektdata fra Fulcrum-databasen ved hjælp af Fulcrum-webstedets dataeksportværktøj til venstre, og markér følgende afkrydsningsfelter: projekt, inkluder fotos, inkluder GPS-data, feltprøveudtagning og isolering.
   BEMÆRK: Fulcrum-dataene for projektet eksporteres som fem kommaseparerede værdifiler (.csv). De komplette projektdata samles i en enkelt dataramme ved hjælp af easyFulcrum-pakken i R.
3. Flyt de fem .csv filer, der eksporteres fra Fulcrum, til den projektmappe, der blev oprettet i trin 10.1 som beskrevet i easyFulcrum-vignetten21.
4. Åbn en Rstudio-session, og installer easyfulcrum-pakken i R ved at indtaste følgende kommandoer i R-konsollen 'install.packages("devtools")' og 'devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")'.
5. Åbn et nyt R-script, og følg anvisningerne i easyfulcrum-vignetten for at behandle ^{indsamlingsdataene21}.

Representative Results

Denne protokol er blevet brugt til at indsamle Caenorhabditis nematoder fra flere steder, herunder Hawaii og Californien. Isolationssuccesraten for Caenorhabditis nematoder varierer med indsamlingssted, klima, prøveudtagningserfaring og substrattyper, der udtages prøver af. Protokollen er blevet brugt til i vid udstrækning at prøve de hawaiiske øer, hvor ni indsamlingsprojekter er blevet gennemført over flere år og årstider. Isolationssuccesraten for selvkørende Caenorhabditis-arter er næsten identiske for C. briggsae (162 af 4.506 prøver, 3,6%) og C. elegans (163 af 4.506 prøver, 3,6%) og meget lavere for C. tropicalis (26 af 4.506 prøver, 0,58%)⁸. Hver af de selvkørende arter er beriget med rådnende frugt- og blomstersubstrater i forhold til de andre substratkategorier. Prøve rådnende frugt- og blomstersubstrater, hvis forskeren forsøger at maksimere succesraten snarere end at karakterisere substratpræferencer. Succesraten varierer dog med kvaliteten af det valgte substrat. For eksempel blandt frugt- og blomstersubstrater vil de substrater, der er for tørre, våde eller friske, sandsynligvis ikke give Caenorhabditis nematoder.

Skalerbarheden af denne indsamlingsprotokol fremgår af antallet af samlinger, som et enkelt par forskere kan indsamle fra naturen. For eksempel var et par forskere, der brugte denne indsamlingsprotokol, i oktober 2018 i stand til at indsamle i alt over 1.000 prøver på 7 dage fra flere steder på to hawaiiske øer. Dette felthold sendte prøverne natten over til laboratoriet, hvor et team på otte forskere isolerede over 2.000 nematoder fra prøverne, da de ankom. En vigtig fordel ved denne protokol er, at den minimerer omkostningerne forbundet med prøveudtagning på fjerntliggende steder ved at reducere det udstyr og personale, der kræves i marken. Ved hjælp af denne protokol kan et lille feltteam fokusere på prøveudtagning, mens isolationsteamet kan behandle prøverne på deres hjeminstitution ved hjælp af skrøbeligt og tungt udstyr som dissekering af mikroskoper og agarplader til isolering af nematoder. Desuden gør implementeringen af den mobile dataindsamlingsapplikation det muligt at knytte alle de feltdata, der er knyttet til prøverne, direkte til C-mærket, hvilket gør det muligt for isolationsteamet at arbejde uafhængigt af feltteamet, mens de behandler prøver.

Forskere, der bruger denne indsamlingsprotokol, skal overveje den indsats, der kræves for at isolere nematoder forud for et indsamlingsprojekt. Isolations- og identifikationstrinnene er hastighedsbegrænsende, og et lille indsamlingsteam kan hurtigt overvælde isolatorer med prøver. Desuden kan den laboratorieplads, der kræves for at behandle mange samlinger, forstyrre den igangværende forskning (figur 3). Derudover kræver nogle isolerede nematoder yderligere indsats for at genotype. For eksempel undlader ca. 2% af isolaterne at forstærke med SSU PCR-primeren indstillet efter det første lysisforsøg og skal lyseres igen for at sikre, at lysismaterialet er egnet til forstærkning med ITS2-primersættet (figur 8). Desuden undlader ca. 3% af isolaterne at producere kvalitetssekvenser efter en indledende runde af Sanger-sekventering. For disse isolater kræves der ofte en anden runde lysis, ITS2 PCR og Sanger-sekventering, hvilket kan øge afleveringstiden for isolationsteamet. Det er vigtigt, at sekvensidentitet alene ikke er tilstrækkeligt bevis til at retfærdiggøre en ny Caenorhabditis-art (figur 7). For korrekt at retfærdiggøre at hæve et isolat som en ny Caenorhabditis-art skal der gøres en ekstra indsats for at udføre parringsforsøg og etablere en ^typeprøve13. En formel morfologisk beskrivelse af den typede prøve foretrækkes også, men kræves ^ikke3. Tilsammen tyder disse overvejelser på, at forskere, der vedtager denne indsamlingsprotokol, vil drage fordel af forsøgstest af isolations- og identifikationstrinnene for at sikre, at ressourcerne fordeles korrekt, før et indsamlingsprojekt begynder. Det er vigtigt, at selv små indsamlingsprojekter kan drage fordel af denne protokol, fordi processen er meget reproducerbar, og dataene let kan revideres til kvalitetskontrolformål på tværs af laboratoriegrupper.

Figur 1: Substrateksempler. (A) En ideel rådnende frugt er vist i midten af billedet (1), frugten er næsten uigenkendelig. Mindre rådnet frugt vises i nærheden; undgå prøveudtagning af friskfaldne frugter (2). (B) En ideelt nedbrudt blomst er vist øverst (3). Undgå prøveudtagning af nyfaldne blomster (4). (C) Det mørke bladkuld under det øverste lag af tørre blade er ideelt, når der udtages prøver for selvkørende Caenorhabditis nematoder (5). Undgå prøveudtagning af tørt bladkuld (6). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Nematode Field Sampling mobilapplikationen. (A) Den indledende skærm efter åbning af Nematode Field Sampling-applikationen på en Apple-enhed i Fulcrum. Den røde pil nederst til højre peger på knappen +, der bruges til at oprette en ny samlingspost. (B) Et eksempel på en ny samlingspost, der vises på en Apple-enhed. Den røde pil peger på feltet "Projekt" øverst på skærmen med indsamlingsoptegnelser. Sørg for at vælge det rigtige projekt, når du prøver i marken. Projektfeltet vil som standard være det sidste projekt, der blev brugt ved oprettelse af efterfølgende indsamlingsposter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Indsamlingsposer og indsamlingsplader organiseret forud for uddeling af prøver. Denne figur viser prøverne i C-mærkede opsamlingsposer til venstre. Hver kollektionspose har en matchende C-mærket 10 cm plade ovenpå. Til højre ses 10 cm opsamlingsplader, der indeholder prøvemateriale, efter at det er overført fra opsamlingsposerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: En opsamlingsplade (C-plade) med korrekt overført prøve. En 10 cm C-plade med nedbrydende frugt placeret på kanten af bakterieplænen. C-etiketten er fastgjort til pladelåget. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Nematode-isolationsmobilapplikationen. (A) Skærmbilledet til valg af applikation i Fulcrum-mobilapplikationen. Den røde pil peger på applikationen Nematode Isolation . (B) Startskærmen efter åbning af nematodeisoleringsapplikationen på en Apple-enhed i Fulcrum. Den røde pil nederst til højre peger på knappen + , der bruges til at oprette en ny isolationspost. (C) Et eksempel på en ny isolationspost, der vises på en Apple-enhed. Den røde pil peger på feltet 'Projekt' øverst på skærmen med isolationsposten. Sørg for at vælge det rigtige projekt, når du isolerer. Projektfeltet vil som standard være det sidste projekt, der blev brugt ved oprettelse af efterfølgende isolationsposter. (D) Når brugerne har trykket på feltet Vælg under C-label, trykker brugerne på søgeknappen (rød pil) for at finde den C-etiket, hvorfra de isolerer nematoder. (E) Når C-mærkaten er valgt, fotograferer brugerne C-pladen ved hjælp af enhedens kamera. (F) Brugerne indtaster derefter, om der er nematoder på C-pladen eller ej. S-etiketter tilføjes til isolationsposten, hvis der er nematoder, der skal isoleres. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: NCBI BLAST-resultatside. (1) Rullemenuen, der bruges til at se BLAST-resultaterne for alle sekvenser. (2) Beskrivelsen af den aktuelle sekvens, der er valgt i rullemenuen. I dette tilfælde vises resultaterne for S-label S-05554. (3) Det største BLAST-hit for S-05554 vises. Den lilla tekst angiver, at der er klikket på linket til visualisering af denne justering. Sørg for at inspicere justeringerne med øjet for at identificere mulige nye Caenorhabditis arter, se trin 9.8 ovenfor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 7: EKSEMPLER på visualisering af NCBI BLAST-justering. (A) Et eksempel på et isolats ITS2-forespørgselssekvens justeret til en C. kamaaina-emnesekvens . (1) Den procentvise identitet af linjeføringen (89%), hvilket er lavt for et top BLAST-hit. (2) En uoverensstemmelse mellem forespørgslen og emnesekvensen (G til A). 3) Et mellemrum mellem fire basispar i emnesekvensen foretaget af justeringsalgoritmen huller i forespørgslen eller emnet indikerer dårlig justering. (4) En generaliseret region i midten af tilpasningen med mange uoverensstemmelser og huller. En region som denne antyder, at forespørgselssekvensen kan komme fra en ny Caenorhabditis-art . Vist er et faktisk justeringseksempel på en ny art, C. oiwi, der blev opdaget i 2017. (B) Et eksempel på en god tilpasning mellem et isolats ITS2-forespørgselssekvens og en emnesekvens. (5) Justeringens procentvise identitet (99 %), hvilket normalt betyder, at forespørgselssekvensen kommer fra et isolat af samme art som emnet. (6) En central region i tilpasningen til perfekt identitet. En region som denne antyder, at forespørgselsisolatet sandsynligvis er den samme art som emnet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 8: SSU- og ITS2 PCR-produkter. Den øverste gel viser PCR-produkter genereret med SSU-primersættet til 12 repræsentative prøver. En DNA-stige er inkluderet til venstre som reference. SSU PCR-produkterne til Caenorhabditis nematoder er ca. 500 bp lange. Prøver 2-12 forstærket med SSU-primersættet, men prøve en gjorde det ikke. Fraværet af en 500 bp SSU-amplicon til prøve 1 antyder, at lysismaterialet var af dårlig kvalitet, og prøven skal lyseres igen. Den nederste gel viser PCR-produkter, der genereres med ITS2-primersættet til de samme 12 prøver, der er vist i den øverste gel. Stigen og prøverne er i samme retning for begge geler. Seks af de 12 prøver forstærkede sig ikke med ITS2-grundsættet. Prøverne med SSU- og ITS2-bånd er Sanger sekventeret og identificeret ved sekvenslighed ved hjælp af NCBI BLAST-algoritmen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: C-etiketter. En PDF-fil, der indeholder 2500 unikke C-etiketter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: S-etiketter. En PDF-fil, der indeholder 5000 unikke S-etiketter. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel 1: Feltmaterialer. En pakkeliste over materialer, der anvendes i marken til prøveudtagning af nematoder. Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 2: PCR-opskrifter og termocyklistforhold. En tabel med PCR-opskrifter og termocyklistbetingelser for ITS2 og SSU PCR'erne . Klik her for at downloade denne tabel.

Supplerende tabel 3: Elektroforesebufferopskrifter. En opskrift på 0,5 M pH 8,0 Ethylendiamintetraeddikesyreopløsning (EDTA) og TRIS-acetat-EDTA (TAE) bufferopløsningen. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Denne protokol indeholder kritiske trin, der skal udføres med forsigtighed. For eksempel er det vigtigt, at felt- og isolationsholdene er omhyggelige med at udvælge det korrekte indsamlingsprojekt i ansøgningen, inden der indsamles prøver fra marken eller isoleres nematoder fra prøverne i laboratoriet. I tilfælde af at det forkerte indsamlingsprojekt vælges, korrigeres de fejlagtige dataposter bedst i Fulcrum-databasen ved hjælp af postredigeringsværktøjerne online. Denne proces kan være kedelig for mange fejlplacerede poster. Databasen bevarer dog eventuelle ændringer af poster, så en fuldstændig revision af indsamlings- og isolationsposter er mulig. De andre kritiske trin i denne protokol involverer håndtering af prøver fra marken og nematoder isoleret fra disse prøver. For at sikre, at Caenorhabditis nematoder overlever prøveudtagnings- og forsendelsestrinnene, bør prøvernes temperatur holdes mellem 4 °C og 25 °C. Temperaturer over 25 °C kan forårsage sterilitet i C. elegans14. Sørg for, at prøver overføres fra opsamlingsposer til indsamlingsplader inden for fem dage, når det er muligt for at minimere tabet for nematoder. Efter at nematoder er isoleret, er det afgørende, at de genotypes og kryokonserveres, før de omkommer. Det er svært at finde levende nematoder på S-plader, der er mere end to til tre uger gamle, fordi svampe- og bakterieforurening kan gøre S-pladerne ugæstfrie.

Denne protokol kan let ændres for at imødekomme forskellige typer data, som forskere måske ønsker at indsamle, mens de er i marken. For eksempel er det nemt at tilpasse applikationen 'Nematode field sampling' med nye dataindtastningsfelter ved hjælp af Fulcrums online GUI til applikationsredigering. Desuden kan dataanalysepakken, easyFulcrum, rumme disse redigeringer, når de nye ^data15 behandles. En anden ændring, som brugerne kan finde tiltalende, er at bruge en anden prøveudtagningsmetode i marken. I stedet for at udtage prøver af diskrete substrater, kan forskere ønske at prøve større områder, der indeholder flere substrattyper. Disse større prøver behandles bedst i laboratoriet ved hjælp af Baermann-tragten eller ^{bakkeekstraktionsmetoderne13}. Det er vigtigt, at brugen af C-etiketter og S-etiketter stadig gælder for disse teknikker og derfor er kompatible med mobile applikationer.

De primære begrænsninger i denne protokol vedrører håndteringstiden for nematoder før isolering i laboratoriet. For det første gør forsinkelsestiden mellem prøveindsamling og nematodeisolering det umuligt at registrere udviklingsstadierne af nematoder på en given prøve på indsamlingstidspunktet. For det andet er hyppigheden af hanner og udkrydsning i naturen centrale evolutionære spørgsmål for selving af Caenorhabditis ^nematoder10. Denne metode er ikke velegnet til at løse disse spørgsmål, fordi nematoder sandsynligvis har gennemgået flere generationer før isolering. Forsinket isolation betyder, at direkte bevis for mandlig frekvens i naturen er umulig. Desuden betyder forsinkelsen i flere generationer under genotiktrinnene, at genomiske beviser for udkrydsning (heterozygositet) vil blive eroderet, før en nematodestamme kan sekventeres. For at identificere heterozygositet i naturen anvendes afkom produceret af en nematode direkte isoleret fra naturen til sekventering2. En anden potentiel begrænsning af denne protokol er, at den er forudindtaget mod identifikation af selfing Caenorhabditis. Dette skyldes, at isolerede nematoder af selvkørende arter har større chance for at sprede sig end obligatoriske outcrossers, som kun vil sprede sig, hvis en befrugtet kvinde isoleres.

Denne indsamlingsmetode er baseret på eksisterende ^{indsamlingsprotokoller13,14}. Det største fremskridt inden for denne teknik er brugen af mobilteknologi og tilpasset software til at lette organiseringen af store mængder økologiske og molekylære data forbundet med store indsamlingsprojekter. De økologiske data, der genereres ved hjælp af denne indsamlingsprotokol, kan bruges til at løse udestående spørgsmål for naturlige populationer af Caenorhabditis-arter. For eksempel er data genereret med denne metode blevet brugt til at opdage nichepræferencer for arten på tværs af hawaiiøerne. Ved at sekventere genomerne af kryokonserverede nematoder kan forskerne desuden undersøge, hvordan mønstre af genetisk variation er korreleret med økologiske data. Forskning af denne art kan afdække signaturer af lokal tilpasning i Caenorhabditis populationer og give vigtig indsigt i relevansen af genetisk variation i naturlige ^{sammenhænge8}. For at få en funktionel forståelse af mange gener i Caenorhabditis nematoder er økologiske undersøgelser sandsynligvis ^påkrævet11. Selv for C. elegans mangler en stor del af generne funktionelle kommentarer, på trods af at det er det første flercellede dyr, der sekventeres og et af de mest grundigt studerede dyr på Jorden. Denne indsamlingsprotokol blev udviklet for at hjælpe med at løse denne videnkløft ved at lette indsamlingen af vilde Caenorhabditis nematoder og undersøgelsen af deres økologi og naturlige genetiske mangfoldighed.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive labels	Avery	61533	Printing the C-labels and S-labels
Agarose	Thomas Scientific	C748D75	agarose gel preparation
Backpack			A backpack for each team member to hold equipment, samples, food, and water for the day.
Cardboard boxes	Fisher Scientific	AS261	Storage of S-plates
Centrifuge	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Collection bags	Zip-lock	NA	Collection of substrates
Digital temperature/humidity meter	Preciva	HT-86	Measurement of ambient temperature and humidity
Disecting scope	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Disposible reservoirs	USA Scientific	1306-1010	Aliquoting PCR master mixes and loading dye
DNA ladder, 1 KB plus	Thermo Scientific	SM0243	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
dNTPs	Thomas Scientific	CB4430-2	PCR master mix component
easyFulcrum R package	NA	NA	An R package for processing collection data http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html
EDTA solution (0.5 M pH 8.0)	NA	NA	See supplemental table 3 for recipe
Ethanol (95%)	NA	NA	Plating out samples, spoon sterilization
Ethidium bromide solution (10 mg/mL)	VWR	97064-602	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
External battery charger for mobile device	NA	NA	External battery charger and charging cable for iPhone or Android
Flask (500 mL)	Fisher Scientific	FB501500	agarose gel preparation
Food	NA	NA	Pack accordingly
Gel electrophoresis apparatus	Thermo Scientific	B2	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel loading dye, 6x	NEB	B7022S	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
ITS2 primer set	NA	NA	oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC
ITS2 sequencing primer	NA	NA	oECA306 = forward primer CACTTTCAAGCAACCCGAC
Lysis buffer	NA	NA	Nematode lysis, see protocol for recipe
Microwave	NA	NA	agarose gel preparation
Mobile device	NA	NA	Charged phone in airplane mode. The Fulcrum app GPS positions are inaccurate compared to the GPS positions extracted from pictures. This setting ensures that you use less power and get more precise GPS measurements.
NGMA plates, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713	C-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
NGMA plates, 3.5 cm	Greiner Bio-One	5662-7102Q	S-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
Non-contact infrared thermometer	Etekcity	B00837ZGRY	Measurement of substrate temperature
Paper towels	NA	NA	Paper towels for absorbing excess moisture in a bagged sample.
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Plate sealing
PCR adhesive foil	VWR	60941-126	PCR adhesive foil
PCR buffer (10x)	Thomas Scientific	CB3702-7	PCR master mix component
PCR plates (96-well)	Thomas Scientific	1149K04	SSU and ITS2 PCRs
Pencil	NA	NA
Plastic spoons	NA	NA	Plating out samples
Platinum pick	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Pre-labeled ziplock collection bags	NA	NA	Bundles of zip-lock plastic bags pre-labelled with C-label barcodes. Each bundle should contain 25 barcoded bags wrapped with a rubber band.
Proteinase K	Sigma	3115879001	Nematode lysis, added to lysis buffer just prior to use
R software	NA	NA	R software: A language and environment for statistical computing https://www.R-project.org/
Soft cooler bag and ice pack	NA	NA	Collection coolers and cooler packs to keep samples cool when ambient temperature is above 25 °C.
Spare batteries	NA	NA	Extra batteries for sampling equipment
SSU primer set	NA	NA	oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA
Strip tube caps (12-well)	Thomas Scientific	1159V29	Nematode lysis
Strip tubes (12-well)	Thomas Scientific	1159V31	Nematode lysis
TAE buffer (1x)	NA	NA	Visualizing SSU and ITS2 PCR products. See supplemental table 3 for recipe
Taq polymerase	Thomas Scientific	C775Y45	PCR master mix component
Thermocycler	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Water	NA	NA	Pack accordingly