Ett mycket skalbart tillvägagångssätt för att utföra ekologiska undersökningar av självgående caenorhabditis nematoder

Summary

Detta protokoll kan användas för att utföra storskaliga ekologiska undersökningar av självgående Caenorhabditis nematoder. Den främsta fördelen med denna metod är effektiv organisation och analys av ekologiska och molekylära data associerade med nematoder som samlas in från naturen.

Abstract

Caenorhabditis elegans är en av de viktigaste modellorganismerna inom biologi, men först nyligen har forskare fokuserat på dess naturliga ekologi. Den relativa sparsiteten i informationen om C. elegans i dess naturliga sammanhang kommer från de utmaningar som är förknippade med identifieringen av den lilla nematoden i naturen. Trots dessa utmaningar har ett ökat fokus på C. eleganss ekologi orsakat en mängd ny information om dess liv utanför laboratoriet. Det intensifierade sökandet efter C. elegans i naturen har bidragit till upptäckten av många nya Caenorhabditis arter och visade att kongeniska nematoder ofta sambo i naturen, där de matar på mikrobiella blommor i samband med ruttande växtmaterial. Identifieringen av nya arter har också visat att det androdioecious parningssystemet hos män och självbefruktande hermafroditer har utvecklats tre gånger självständigt inom Caenorhabditis. De andra två självande arterna, C. briggsae och C. tropicalis, delar de experimentella fördelarna med C. elegans och har möjliggjort jämförande studier av den mekanistiska grunden för viktiga egenskaper, inklusive självbefruktning. Trots dessa framsteg återstår mycket att lära om ekologin och den naturliga mångfalden hos dessa viktiga arter. Till exempel saknar vi fortfarande funktionell information för många av deras gener, som bara kan uppnås genom en förståelse av deras naturliga ekologi. För att underlätta ekologisk forskning av självgående Caenorhabditis nematoder utvecklade vi en mycket skalbar metod för att samla nematoder från naturen. Vår metod använder mobila datainsamlingsplattformar, molnbaserade databaser och R-programvarumiljön för att förbättra forskarnas förmåga att samla in nematoder från naturen, registrera associerade ekologiska data och identifiera vilda nematoder med hjälp av molekylära streckkoder.

Introduction

De senaste två decennierna har medfört ett ökat intresse för caenorhabditis nematoders ekologi. Från dessa studier vet vi att de frilevande caenorhabditarterna kan isoleras från tillfälliga mikromiljöer i både tempererade och tropiska regioner, där de livnär sig på mikrobiella blommor i samband med sönderdelning av växtmaterial, ibland i sympatry1,2,3,4,5,6,7,8 . Vi har också lärt oss att konvergent evolution av självbefruktning har inträffat i släktet tre gånger, och självande är det dominerande reproduktionssättet för C. briggsae, C. elegans och C. tropicalis9,10. Bland dessa jagare är C. elegans ett av de mest studerade djuren på jorden och har använts av forskare för att göra kritiska framsteg inom biologin. Viktigt är att de andra självgående Caenorhabditis-arterna delar många av C. elegans experimentella fördelar och snabbt avancerar jämförande studier i släktet. Men nematodernas kryptiska natur i naturen gör det svårt att studera deras ekologi och naturliga mångfald, vilket är avgörande för att förstå de biologiska funktionerna i deras gener och hur evolutionen har format genetisk mångfald bland ^arten10,11.

Den största utmaningen att studera ekologin hos självgående Caenorhabditis nematoder i naturen är deras lilla storlek; vuxna nematoder är ofta 1 mm långa eller mindre. Denna utmaning kräver att forskare tar prover på substrat från naturen och försöker separera nematoder av intresse från substraten i laboratoriet utan möjlighet att observera djur i naturen. Eftersom även utbildade experter har svårt att diskriminera självande Caenorhabditis nematoder från andra frilevande nematoder under mikroskopet, avlägsnas nematoder vanligtvis från substratet, isoleras och lämnas för att föröka sig innan de identifieras genom sekvensidentitet med hjälp av etablerade molekylära streckkoder3,12,13,14 . Den tid och ansträngning som krävs för att bearbeta varje nematod på detta sätt utgör en organisatorisk utmaning, eftersom forskare måste kunna spåra identiteten hos varje nematod isolerad i laboratoriet tillbaka till det exakta substratet och tillhörande ekologiska data som provtas i fältet. Här beskriver vi en steg-för-steg-process för att effektivt samla in och identifiera självgående Caenorhabditis nematoder från fältet och troget länka dessa isolat med deras tillhörande rumsliga och ekologiska data i hög skala.

Den här insamlingsmetoden ökar omfattningen och noggrannheten i ekologiska undersökningar med hjälp av mobila datainsamlingsplattformar, molnbaserade databaser och R-programvarumiljön. Fulcrum är en anpassningsbar datainsamlingsplattform som fungerar med de flesta mobila enheter och gör det möjligt för användare att bygga anpassade applikationer för att samla in och organisera platsbaserade data (https://www.fulcrumapp.com). Det här protokollet innehåller detaljerade instruktioner om hur du använder anpassade datainsamlingsprogram för att organisera rumsligt explicita ekologiska data från fältet och korrekt länka dessa data till identiteten hos nematoder som isolerats i laboratoriet. Protokollet förklarar också hur man effektivt identifierar självgående Caenorhabditis nematoder med hjälp av etablerade molekylära streckkoder. Data från dessa metoder kan bearbetas enkelt och reproducerbart med det medföljande R-programvarupaketet easyFulcrum15 för att utforska ekologin och den genetiska mångfalden hos naturliga caenorhabditispopulationer.

Protocol

1. Insamlingsberedning

1. Identifiera en plats för att undersöka Caenorhabditis nematoder.
   OBS: I de flesta tempererade regioner kan C. elegans och C. briggsae enkelt isoleras från livsmiljöer som jordbruksområden eller landsbygds- och stadsträdgårdar1. I subtropiska och tropiska regioner kan C. briggsae, C. elegans och C. tropicalis alla hittas i de mänskliga associerade livsmiljöerna som anges ovan, ibland i närheten av varandra. C. elegans verkar dock föredra svalare, torrare livsmiljöer än de andra arterna i tropiska ^{livsmiljöer7,8}. Var och en av arterna kan också isoleras från vilda livsmiljöer som inte är associerade med människor, men dessa livsmiljöer provtas mindre ofta.
2. Skapa ett Fulcrum-projekt för att organisera insamlings- och isoleringsdata med de mobila datainsamlingsprogrammen.
   1. Skapa ett konto hos Fulcrum online med ett kostnadsfritt ^{utbildningsavtal16}. Lägg till Nematode Field Sampling-programmet på ett Fulcrum-konto genom att klicka på LÄGG TILL APP-knapp17.
   2. Lägg till Nematode Isolation-programmet i ett konto genom att klicka på LÄGG TILL APP-knapp18.
      OBS: Det rekommenderas att varje resa till en plats organiseras som sitt insamlingsprojekt med namngivningskonventionen "YearMonthLocation", t.ex. 2020FebruaryAustralia.
3. Lägg till användare i Fulcrum-kontot för att ge dem åtkomst till insamlingsprojektet. Se till att varje användare laddar ner Fulcrum-mobilapplikationen för att delta i projektet.
4. Skriv ut en uppsättning QR-kodetiketter för att spåra samlingarna (C-etiketter) och nematodisoleringarna (S-etiketter) med mobilprogrammet. Fäst C-etiketterna på plastpåsar med dragkedja, rulla de märkta påsarna i grupper om 25 och linda in dem med ett gummiband för packning. Förvara uppsättningen S-etiketter för användning i laboratoriet.
   OBS: Genom hela detta protokoll finns samlingarna (substrat från fältet) i påsar eller på plattor och är märkta med C-etiketter. De isolerade nematoderna är märkta med S-etiketter. C-etiketterna används för att identifiera unika samlingar och S-etiketterna används för att identifiera unika nematoderolat. Dessa två typer av etiketter används för att göra kopplingen mellan en viss samling (C-etikett) och nematoderna isolerad från den samlingen (S-etiketter) i Fulcrum-databasen. Skriv ut dubbelt så många S-etiketter som C-etiketter för ett samlingsprojekt eftersom i genomsnitt två nematoder isoleras per samling. Fler S-etiketter kan skrivas ut senare om det behövs. 2 500 unika C-etiketter (Kompletterande fil 1) och 5 000 unika S-etiketter (Kompletterande fil 2) tillhandahålls i tillägget.
5. Förbered 10 cm NGMA-plattor för samlingar och 3,5 cm NGMA-plattor för isolering av nematoder. Gör en 10 cm tallrik och minst två 3,5 cm plattor per ^uppsamling21. Dessa plattor sås med Escherichia coli stam OP50 enligt etablerade protokoll. Förvara plattorna före användning vid 4 °C i högst 1 månad.

2. Fältinsamling

OBS: Caenorhabditis nematoder är oftast isolerade från ruttande vegetabiliskt material, inklusive frukt, nötter, frön, baljor, blommor, stjälkar, vegetabilisk kull och kompost1,5,6,8. De bästa substraten är ruttna och nästan oigenkännliga som frukter eller blommor; undvika substrat som är för torra eller våta (figur 1). Substrat samlas mest effektivt från fältet genom att arbeta i par. Individen med den kontaktfria infraröda termometern väljer ett substrat för insamling och samlar in provet medan deras partner använder Nematode Field Sampling-applikationen i Fulcrum för att registrera insamlingsdata. Samlarparet kommer att upprepa denna process tills önskat antal prover samlas in. Listan över material som krävs för fältarbete finns i (Kompletterande tabell 1).

1. Öppna Fulcrum-mobilappen och välj Nematode Field Sampling på den nedrullningsbara menyn. Tryck + för att starta en ny post i projektet (figur 2A). Ta ett foto av substratet.
2. Klicka på rutan i det övre mitten för att välja rätt insamlingsprojekt som görs i steg 1.2 (bild 2B). Tryck på C-etikettfältet längst ned i samlingsposten och välj Skanna när prompten visas. Skanna streckkoden på insamlingspåsen med hjälp av den mobila enhetskameran och tryck sedan på Klar längst upp till höger på skärmen.
3. Tryck på fältet Substrat och välj en substrattyp i rullgardinsmenyn. Lägg till anteckningar om substratet genom att trycka på fältet Substrat notes och manuellt ange anteckningar.
4. Välj ett landskap på den nedrullningsbar menyn. Välj det landskap som bäst representerar samplingsplatsen.
5. Välj en himmelsvy. När du väljer skyvy, beskriv himlens synlighet på provtagningsplatsen (t.ex. en full himmelsvy utan blockerad utsikt från träd eller andra strukturer = full).
6. Mät yttemperaturen på substratet med hjälp av beröringsfri termometer och registrera värdet i substratets temperaturfält.
   OBS: Håll den kontaktfria termometern högst 14 tum från substratet medan du registrerar temperaturen.
7. Mät omgivningstemperaturen och luftfuktigheten med handenheten och registrera dessa data i rätt fält.
   OBS: Kontrollera att omgivningstemperaturen och luftfuktighetsanordningen inte är spärrad. Mätenheten ändras när knappen släpps. Förvara enheten i en utvändsficka för att undvika oregelbundna avläsningar.
8. Spara posten i Fulcrum genom att trycka på Spara längst upp till vänster på skärmen.
9. Samla ungefär en matsked av substratet utan pinnar eller andra hårda bitar genom att invertera uppsamlingspåsen för att använda den som en "handske" för att plocka upp substratet och försegla sedan påsen. Lägg en pappershandduk i påsen om provet är särskilt fuktigt.
   OBS: I varma klimat, placera påsarna i mjuka kylare med kylare förpackningar för att hålla kollektionerna svala.
10. När alla prover har samlats in för dagen, rengör uppsamlingsutrustningen, ta batterier ur sonder, ladda batterier, frysa fryspaket igen. Synkronisera Fulcrum-insamlingsdata genom att trycka på knappen Synkronisera längst upp till vänster i Nematode Field Sampling-programmet .
    Uppladdningarna kan ta flera minuter utan en stark mobilanslutning så det kan vara bäst att vänta på WiFi-åtkomst. Data kommer att finnas kvar på mobila enheter och synkroniseras med molnet.
11. Skicka proverna till en heminstitution genom att placera dem i en fraktlåda över natten. Minimera den tid då proverna utsätts för temperaturer under 11 °C eller mer än 25 °C genom fraktpaket på dagar då last transporteras.
    OBS: De flesta fraktanläggningar skickar inte last över natten på helgerna på avlägsna platser.

3. Plätera ut fältsamlingar i laboratoriet

OBS: Det här avsnittet beskriver hur du organiserar överföringen av prover från märkta uppsamlingspåsar till märkta plattor. Proverna kan anlända från en försändelse över natten eller direkt från fältet.

1. Ta emot transport av samlingar och inspektera för trasiga väskor eller andra bevis på skada. Om påsar är trasiga, kassera materialet och rengör de obrutna uppsamlingspåsarna med 70% etanol; undvik C-etiketten på påsen med etanolen eftersom den missfärgar etiketten och gör den svår att läsa.
2. För varje zip-lock väska, notera C-etiketten på påsen och fäst en matchande C-etikett på locket på en 10 cm tallrik prickad med OP50 bakterier.
   OBS: De märkta 10 cm plattorna kallas "C-plattor" för resten av protokollet. Det enklaste sättet att organisera proverna är att placera uppsamlingspåsarna på en labbbänk med den matchande C-plattan ovanpå (bild 3).
3. För varje samling, överför ungefär en matsked prov från uppsamlingspåsen till C-plattan med en ren plastsked. Tillsätt provet runt bakteriegräsmattan i halvmåne- eller ringform, täck inte helt bakteriegräsmattan (figur 4).
   OBS: Håll matskeden ren genom att placera den i en bägare med 95% etanol när den inte används. Använd en pappershandduk för att torka matskeden innan du överför ytterligare prover.
4. Registrera den tid då samlingarna överfördes från uppsamlingspåsar till C-plattor och håll C-plattorna i rumstemperatur (RT) i minst 24 timmar innan de försökte isolera nematoder i avsnitt 4.

4. Isolera nematoder från samlingar

1. Öppna Fulcrum-applikationen på den mobila enheten och välj Nematode Isolation i applikationsmenyn (bild 5A). Skapa en ny isoleringspost genom att trycka på + -ikonen längst ned till höger (bild 5B).
2. Bekräfta rätt samlingsprojekt på den nya isoleringspostskärmen genom att kontrollera projektnamnet som visas i rutan längst upp i mitten. Om fel projekt visas trycker du på projektnamnet för att växla till rätt projekt (bild 5C).
3. Tryck på knappen Välj under C-etikettfältet för att hitta C-etiketten som är associerad med det exempel från vilket nematoder isoleras (bild 5D). Tryck på sökikonen och tryck sedan på scanikonen för att skanna C-etiketten QR-koden på C-plattan med enhetskameran. När QR-koden har skannats visas en C-etikettpost i C-etikettfältet .
4. Tryck på kameraikonen i fältet Foton för att öppna enhetskameran och använda den för att ta ett foto av provet på C-plattan med QR-koden synlig (bild 5E). Tryck på Klar för att återgå till isoleringsskärmen.
   OBS: Dessa isoleringsinspelningsfoton kan användas för att utforska specifika attribut för substratet vid ett senare tillfälle.
5. Använd ett dissekerande mikroskop för att leta efter nematoder på C-plattan. Tryck på fältet Worms on Sample för att registrera förekomsten av nematoder på provet (figur 5F). Tryck på Ja om nematoder finns på C-plattan och knacka på Nej om inga nematoder finns.
6. Tryck på Spår om det bara finns nematoder. Om inga nematoder förekommer, parafilma C-plattan och kassera den i en biohazard bin.
   OBS: Vänd C-plattan över den biohazard avfallsbehållaren och knacka försiktigt på baksidan av plattan för att lossa alla provtagna substrat. Detta steg gör det lättare att hitta och isolera nematoder som kan vara under substratet på C-plattan.
7. Om nematoder förekommer, isolera upp till fem nematoder från C-plattan. För att isolera en nematod, överför en nematod från C-plattan till en S-platta med hjälp av en platinatrådsplockning. Isolera friska, gravida vuxna om möjligt. Isolera dock andra stadier om vuxna inte hittas.
   OBS: Efter isolering kommer upp till fem S-plattor att ha en enda nematod på sig. Håll dessa S-plattor med isolerade nematoder från samma C-platta organiserade tillsammans i en snygg stack bort från andra S-plattor tills de matas in i Fulcrum.
8. Tryck på fältet S-märkta plattor för att ange de S-plattor som används för isoleringen. Tryck på + längst ner till höger. Tryck på S-label och klicka sedan på Skanna för att öppna enhetskameran. Använd enhetskameran för att skanna S-label QR-koden på S-plattan.
   OBS: Se till att S-etikettkoden matchar koden på plattan. Om det matchar, tryck på Klar. Om det inte gör det trycker du på Avbryt och skannar igen tills det matchar och klickar sedan på Klar. Ibland skannas QR-koder för närliggande plattor av misstag.
9. När du har angett varje S-platta sparar du posten med knappen Spara längst upp till höger. Posten går förlorad om den inte sparas. Tryck på + längst ner till höger för att lägga till fler S-märkta plattor om det behövs tills alla nematoder som isolerats från C-plattan matas in. När du har lagt till alla S-märkta plattor för isoleringsposten trycker du på < -knappen längst upp till vänster för att gå tillbaka till isoleringsinspelningsskärmen.
   OM du vill avbryta en isoleringspost på grund av att fel inte kan lösas klickar du på Avbryt längst upp till vänster. Det här steget öppnar en dialogruta där du frågar om posten kan ignoreras utan att spara. Om så önskas klickar du på Ja, Ignorera.
10. Tryck på knappen Spara längst upp till höger när isoleringsposten har lagt till all information korrekt. Parafilma sedan S-plattorna med isolerade nematoder och lägg dem åt sidan i ett område som är avsett att hålla S-plattor med nematoder.
11. Parafilma C-plattan och kasta den i biohazard bin. Tryck på synkroniseringsikonen för att ladda upp all data till Fulcrum.
12. Sortera alla S-plattor i alfanumerisk ordning och placera sedan S-plattorna i kartonger. Se till att S-plattorna är locksidan nedåt och parafilmade. Stapla upp till fyra S-plattor på ett läge i lådan och märk kartongen med projektets namn, datum, tid och ett unikt lådnummer.
13. Förvara de märkta lådorna på RT. Dessa isolat kommer att kontrolleras för spridning vid 48 h och igen vid 168 h om det behövs.

5. Exportera S-plattor från Fulcrum

I det här avsnittet beskrivs hur du exporterar S-etiketter som används i isoleringsprocessen från Fulcrum-projektdatabasen. Dessa S-etiketter kommer att användas för att spåra förökande isofemalelinjer medan de identifieras av sekvensidentitet i avsnitten 6-9.

1. Logga in på Fulcrums webbplats och välj Nematode Isolation-programmet . Klicka på Exporter från vänster sida av skärmen. Markera önskat projekt genom att klicka här om du vill markera önskat projekt och markera rutan Nematodeisolering . Klicka på Nästa om du vill hämta en .zip fil som innehåller filen "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv".
2. Öppna filen "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" och sortera den efter kolumnen "S-etikett" i stigande ordning (den minsta S-etiketten kommer att finnas överst). Markera alla S-etiketter och kopiera dem från kalkylbladet.
3. Navigera till den vilda isolat genotypningsmallen google sheet (wild_isolate_genotyping_template) med hjälp av en ^{webbläsare19}.
   1. Gör en kopia av det här Google-arket genom att högerklicka på fliken Genotypningsmall och sedan välja alternativet Kopiera till nytt kalkylblad . Välj Öppna kalkylblad om du vill visa det nya Google-arket.
   2. Namnge det här nya arket med fulcrumprojektets namn följt av "wild_isolate_genotyping", t.ex. "2020FebruaryAustralia_wild_isolate_genotyping".
      OBS: Detta blad kallas "genotypningsbladet" i resten av protokollet.
4. Klistra in S-etiketterna som kopierats från kolumnen "nematode_isolation_s_labeled_plates.csv" s_label i kolumnen med genotypningsark med titeln "s_label". Kontrollera kolumnen "s_label_repeat_error" för "1". Värdet "1" i den här kolumnen innebär att S-etiketten dupliceras någonstans på genotypningsbladet. Om dubbleringar upptäcks undersöker och korrigerar du dem innan du går vidare.
5. Fyll i kolumnen "isolation_box_number" för alla S-etiketter.

6. Kontrollera om det finns spridning på S-plattor

1. Kontrollera om det finns prolifererande djur på S-plattor 48 h efter isolering (använd datum och tid för den senaste isoleringen på lådan från steg 4.11 för att styra tidpunkten).
   OBS: Prolifererande nematoder kännetecknas av avkommor på S-plattan.
2. Om en S-platta breder ut sig anger du "1" i proliferation_48 kolonnen på genotypningsbladet och flyttar sedan S-plattan till en ruta med etiketten "48 h proliferation, box 1". Placera högst 88 S-plattor i en spridningslåda och börja sedan fylla en ny låda märkt "48 h proliferation, box 2". Se till att S-etiketterna är ordnade i alfanumerisk ordning i 48 h-spridningsrutorna.
   OBS: Kassera inte de icke-prolifererande S-plattorna; dessa plattor kommer att kontrolleras igen vid 168 h efter isolering. Om så önskas konsoliderar du dessa S-plattor i numerisk ordning i rutor märkta "48 h non-proliferating, box X", men kom ihåg att registrera när 168 h-kontrollen måste ske på den nya rutan.
3. Efter att ha identifierat alla prolifererande S-etiketter vid 48 h, gå vidare till avsnitt 7 för S-plattor med spridning vid 48 h.
4. Kontrollera S-plattorna som inte spred sig vid 48 h efter isolering igen vid 168 h efter isolering.
   1. Om en S-platta nu breder ut sig anger du "1" i kolumnen proliferation_168 på genotypningsplåten och flyttar sedan S-plattan till en ruta med etiketten "168 h proliferation, ruta 1".
   2. Placera högst 88 S-plattor i en spridningslåda och börja sedan fylla en ny låda märkt "168 h proliferation, box 2". Var noga med att organisera S-etiketter i alfanumerisk ordning i 168 h spridningsrutorna.
5. Kassera S-plattorna som inte har någon spridning efter 168 h. Gå vidare till sektion 7 för S-plattor med spridning vid 168 h.

7. Lys av isofemalelinjer

Obs: Det här steget kommer att använda datafilterverktyget i Google-ark för att skriva ut lyskalkylblad för S-plattorna i spridningsrutorna. Syftet med lyskalkylbladen är att ge personalen rätt positioner för S-etiketter i lysbandsrör vid bänken.

1. Öppna genotypningsbladet för önskat projekt och markera alla celler genom att skriva Cmd+A. Klicka på Data > Skapa ett filter för att lägga till en filterknapp i varje kolumnrubrik. Använd filterknapparna för att endast visa de S-plattor som ska vara genotypade. Om till exempel alla S-plattor med spridning vid 48 h ska lysas: Klicka på filterknappen i kolumnen "proliferation_48" och välj "1".
2. När google-arket har filtrerats granskar du listan över S-etiketter som visas för att säkerställa att de är de S-etiketter som ska skrivas ut i kalkylbladet.
   1. I kolumnen "strip_tube_number" i google-arket anger du ett unikt nummer var 11:e rad.
   2. Ange striprörsnumren för ett projekt i på varandra följande ordning från 1 och aldrig duplicerat. Ange 2 till 12 i "strip_tube_position".
      OBS: Använd 12-rörs bandrör för lys. Den första positionen (strip_tube_position 1) kommer att vara kontroll, men kontrollerna läggs inte till i lyskalkylbladen (endast strip_tube_positions läggs till, 2-12). Vid tidpunkten för lysen kommer den positiva kontrollstammen "N2" att läggas till position 1 av varje jämnt numrerat bandrör som en positiv kontroll. Inga maskar läggs till i position 1 av varje udda numrerat remsarör som en negativ kontroll.
3. Filtrera genotypningsbladet ytterligare för att bara inkludera S-etiketterna i en spridningsruta som ska lysas och välj sedan kolumnerna "s_label" genom "lysis_notes". Skriv ut ett lyskalkylblad för varje spridningsruta som ska lysas.
4. Klicka på den nedrullningsbara menyn i fältet Skriv ut och välj Markerade celler. Klicka på Nästa längst upp till höger och använd sedan dialogen för att skriva ut lyskalkylbladet för spridningsrutan.
5. Upprepa steg 7.3-7.5 om du vill skriva ut ett lysförslag för varje spridningsruta.
   OBS: Varje spridningslåda rymmer upp till 88 S-plattor, vilket motsvarar åtta 12-brunnsbandrör.
6. Förbered 12-brunnsbandrör för alla prover som ska lysas. Märk ett bandrör med en unik "strip_tube_number" som tilldelats i lyskalkylbladet. Denna etikett måste skrivas på locket och bandröret för att undvika förvirring om de är separerade. Even strip-rören har en positiv kontroll (N2 maskar) i position 1. ODD-bandrören har en negativ kontroll (inga maskar) i position 1.
7. Gör upp tillräckligt med lysbuffert (100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8,2, 5 mM _MgCl2, 0,9% IGEPAL, 0,9% Interpol 20, 0,02% gelatin med proteinas K tillsatt till en slutlig koncentration av 0,4 mg/ml) för alla prover och tillsätt 5% extra för pipetter fel. Skala vid behov.
   OBS: Lysbufferten framställs bäst genom att kombinera alla ingredienser utom proteinas K och frysa i 10-50 ml alikvoter vid -20 °C. Tina alikvoter och håll vid 4 °C före användning. tillsätt proteinas K omedelbart före användning och blanda noggrant. Håll lysbufferten på is medan du arbetar.
8. Ordna S-plattorna för ett visst bandrör så att du använder det utskrivna lyskalkylbladet som vägledning.
9. Lossa ett bandrör och tillsätt 8 μL lysbuffert till varje lock med en upprepad pipetor. Tillsätt lysbufferten i en remsa med kapsyler i taget eftersom lysbufferten avdunstar om den lämnas vid RT och avtäcks. Plocka 3-5 djur från källplattorna (S-plattan eller N2-buljongplattan för positiva kontroller) i lämpliga kapsylpositioner som anges i lyskalkylbladet. Registrera anteckningar för alla S-plattor med färre än 5 maskar som plockats till lysen i avsnittet lysis_notes i lyskalkylbladet.
10. Efter att ha laddat nematoder i varje position av bandröret, placera locket tillbaka på bandröret. Matcha det markerade locket (läge 1) med det markerade röret (läge 1). När det är täckt, centrifugera remsaröret kort tills nematoderna är längst ner i röret.
11. Placera remsan i frysen -80 °C tills den är helt frusen (minst 10 min). Upprepa steg 7.9 till 7.11 tills alla remsor har nematoder tillsatta för lys. Organisera rörremsorna i numerisk ordning.
12. Ta bort uppsättningarna av bandrör och kör lysprogrammet i en termocykel: 1 h vid 60 °C, 15 min vid 95 °C, håll vid 12 °C. När lysprogrammet är klart, snurra ner proverna vid 300 x g i 15 s på RT och förvara lysatesna vid -80 °C i upp till 1 vecka.
13. Organisera rörremsorna i numerisk ordning med hjälp av 96-brunnsplåthållare och inkludera en etikett med ett spridningsboxnummer, bandrörsnummerintervall, datum och forskarens initialer. Uppdatera genotypningsarkkolumnerna "lysis_date" och "lysis_notes" med information från kalkylbladet lys.

8. PCR av SSU- och ITS2-sekvenser

OBS: Det här avsnittet kommer att ge instruktioner om hur du utför två separata PCR för varje lysad S-platta. Den första primeruppsättningen förstärker ett 500-bp fragment av 18S rDNA liten subunit gen (SSU); oECA1271 = framåt primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = omvänd primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA ¹². Denna PCR används för att kontrollera kvaliteten på mall-DNA. PCR förstärker SSU-regionen för nästan alla nematoderter. Om SSU PCR misslyckas med att förstärka, tyder detta resultat på att lyskvaliteten är dålig och lysen måste upprepas för denna S-platta. Den andra primeruppsättningen förstärker ett 2 000 bp fragment av den interna transkriberade distansregionen mellan 5,8S- och 28S-rDNA-generna (ITS2); oECA1687 = framåt primer CTGCGTTACTTACCACGAATTGCARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAMGATCTGC3. ITS2 PCR-produkten är Sanger sekvenserad och sekvensen används för att identifiera nematoder i caenorhabditis-släktet till arten nivå efter sekvenslikhet.

1. Använd filtreringsverktyget i genotypningsbladet om du bara vill visa de S-etiketter som ska användas för PCR.
   1. Uppdatera kolumnerna pcr_plate_number och pcr_well i genotypningsbladet. För att förhindra nedbrytning av lysmaterial körs SSU- och ITS2-PCR samtidigt.
   2. Använd samma pcr_plate_number för ITS2- och SSU PCR även om det rör sig om separata reaktioner i separata plattor. De kommer att särskiljas med SSU- eller ITS2-etiketter.
2. Tilldela en pcr_plate_number till åtta eller färre bandrör (ett bandrör per rad på 96-brunns PCR-plattan, ordnade i stigande ordning, t.ex. lägsta bandrörsnummer ovanpå). Tilldela sedan en pcr_plate_well till varje S-etikett i bandrören.
   OBS: Bandrören är ordnade i stigande ordning, med det lägsta bandrörsnumret tilldelat till rad A och det högsta numret i rad H. Position 1 av alla bandrör tilldelas kolumn 1. Därför kommer bandrör nummer 1, position 1 att tilldelas PCR-platta nummer 1, ja A01.
3. Etikett 96-brunn PCR-plattor för att rymma de prover som ska användas för PCR. Märk varje PCR-platta med följande information: projektnamn, PCR-typ, PCR-nummer och datum för PCR (t.ex. 2020FebruaryAustralia_SSU_1_20200304). Märk också plattan med bandrörsnumren som laddas i varje rad.
4. Ta bort lysmaterialet från frysen -80 °C och tina bandrören som innehåller lysmaterialet på is. Medan lysmaterialet tinar, förbered ITS2 och SSU masterblandningar i separata rör på is. SSU- och ITS2 PCR-recepten finns i tilläggstabell 2.
   OBS: Förbered 100 reaktioner av PCR-huvudblandningen för varje 96-brunnsplatta för att möjliggöra pipetteringsfel. Använd en 15 ml eller 50 ml konisk för att hålla huvudblandningen om stora volymer ska användas.
5. Virvel masterblandningen försiktigt tills Taq fördelas genom hela blandningen. När den har blandats, alikvot 38 μL av huvudblandningen till lämpliga brunnar på PCR-plattorna på is. Använd sterila v-bottentråg för engångsbruk och en 12-välormare flerkanalig pipett för att överföra huvudblandningen till PCR-plattorna.
6. Snurra ner de tinade lysbandsrören för att avlägsna lysmaterial från locken. Ta försiktigt bort locken på alla bandrör som kommer att laddas i den första PCR-plattan. Använd en flerkanalig rörett med låg volym (antingen 12 väl eller 8-brunn) för att tillsätta 2 μL lysat till lämplig brunn i PCR-plattan. Rör försiktigt lysat upp och ner en gång innan du tar bort 2 μL.
   OBS: Kontrollera tipsen för att säkerställa att de innehåller lysen före överföringen. Kom ihåg att ändra tips mellan rader eller kolumner.
7. Täck PCR-plattan med PCR-självhäftande folie och använd en rulle för att skapa en tät tätning. När folien har applicerats, snurra kort ner PCR-plattorna i en centrifug. Håll plattan på is tills den är klar att köras i termocykeln.
8. Kör PCR med lämpligt termocykelprogram. Se kompletterande tabell 2 för mer information om SSU- och ITS2 PCR-programmen.
9. Upprepa steg 8.4-8.8 tills alla PCR är körda.
10. Medan PCR-reaktionerna är igång, häll en 100 ml 1,5% agarose gel. Varje gel kommer att innehålla prover eller en enda PCR-platta.
    1. Tillsätt 1,5 g agaros till en 500 ml-kolv, tillsätt sedan 100 ml 1x TAE-buffert (kompletterande bord 3) och virvla runt för att blanda. Mikrovågsugn för att lösa upp och kyla gelén.
    2. När lösningen har svalnat, tillsätt 5 μL 10 mg/ml etidiumbromidlösning och blanda för att kombinera. Häll lösningen i en gjutbricka med fyra 25-brunnskammar så att gelén rymmer 96 prover plus en stege för varje rad i gelén.
       OBS: Etidiumbromid är en potent mutagen. Vid hantering av etidiumbromid, använd en labbrock, kemikaliebeständiga handskar och kemiska skyddsglasögon.
11. Strax innan PCR är klar, tillsätt 6x laddningsfärg till ett engångstråg och använd en flerkanalig pipett för att lägga till 2 μL 6x lastfärg till varje brunn på en ny 96-väl PCR-platta. Denna platta kommer att användas för att ladda proverna i gelén. Gör tillräckligt med dessa plattor för att rymma alla prover.
12. När PCR är klar, ta bort PCR-plattorna och centrifugera dem kort på 300 x g i 15 s på RT. Förvara PCR-plattorna på is tills PCR-produkterna kan köras ut på en gel.
    1. För att köra produkterna ut på en gel, använd en 12-väl multikanalig pipett för att tillsätta 5 μL av varje prov till lämplig brunn på en 96-välplatta som innehåller 2 μL 6x lastfärg.
    2. Ladda sedan 6 μL av denna blandning i varje brunn i en nyligen gjuten gel. Lasta 6 μL av 1 KB plus stege i den första brunnen i varje rad i gelén.
       OBS: För att fylla geléns brunnar kan det vara nödvändigt att varvat rad A och rad B från PCR-plattan i den första raden av gelén. För att undvika förvirring registrerar du gel_number och gel_position i genotypningsbladet för varje PCR-prov.
13. Placera ett nytt folielock på den eller de återstående PCR:erna i plattan och förvara dem vid 4 °C. Dessa reaktionsprodukter kommer att användas för sekvensering i steg 9.
14. Kör PCR-produkterna på gelén på 120 V i 20 min. Föreställ dig den gel och post som S-etiketter ger ITS2- och/eller SSU PCR-produkter i kolumnerna "pcr_product_its2" och "prc_product_ssu" på genotypningsbladet. Markera närvaron av ett band med en "1"; markera en "0" för inget band.

9. Identifiera nematoder med Sanger sekvensering och sekvens BLAST

OBS: Det här avsnittet innehåller instruktioner för sekvensering av ITS2-amplicons från S-etiketterna, justera dessa sekvenser till National Center for Biotechnology Information (NCBI) databas med hjälp av BLAST-algoritmen och tolka BLAST-resultaten för att identifiera nematoderna på S-plattorna.

1. För varje prov som är ITS2-positivt, använd den återstående ITS2 PCR-produkten för Sanger-sekvensering med den främre primern oECA306 (CACTTTCAAGCAACCCGAC). Se till att sekvenseringsutdatafilerna enkelt länkas till en S-etikett genom att registrera kolumnerna "sequencing_plate" och "sequencing_well" för varje S-etikett i genotypningsbladet.
2. Hämta .seq-utdatafilerna för varje S-etikett från sekvenseringsplattformen. Ordna .seq-filerna för ett projekt i en enda katalog med .seq-filer för varje batch av sekvensering som finns i underkataloger.
3. Öppna kommandoradsverktyget och navigera till den översta katalogen som innehåller SEQ-filerna genom att ange kommandot: cd . Om det inte redan finns, skapa en sammanslagen FASTA för alla .seq filer genom att ange följande kommando: för dir i */; gör cd $dir; för fil i *.seq; eko ">"$file; katt $file; gjort >>.. /all_seqs.fa; cd ..; gjort.
   OBS: Den här koden skapar en sammanslagen FASTA-fil med namnet "all_seqs.fa" från alla .seq-filer i projektkatalogen. Denna fil kan användas i NCBI online nukleotid BLAST verktyg för att snabbt justera ITS2 sekvensen av varje S-etikett till NCBI: s sekvensdatabas.
4. I en webbläsare navigerar du till NBCI ^{BLAST-webbplatsen20} och klickar på knappen Välj fil . Välj filen all_seqs.fa som just skapades och klicka sedan på knappen Något liknande sekvenser (BLASTn). Klicka på BLAST-knappen längst ner på sidan för att börja BLAST-sökningen.
5. Uppdatera genotypningsbladet med BLAST-resultaten för varje S-etikett. Använd filterverktyget för att göra det enklare att uppdatera google-arket för genotypning. Klicka på Data > Skapa ett filter om du vill lägga till en filterknapp i varje kolumnrubrik. Filtrera kolumnen sequencing_plate för att välja de sekvenseringsplattor som ska uppdateras med BLAST-resultat.
6. Använd rullgardinsmenyn på NCBI BLAST-resultatsidan för att kontrollera resultaten för varje S-platta ITS2-sekvens (bild 6).
7. Kontrollera inga BLAST-träffar. Ett sekvens-ID i listrutan som föregås av * har inga tryckträffar. För dessa S-etiketter anger du "no hit " i kolumnen manual_blast_notes på genotypningsbladet.
8. Kontrollera om det finns en möjlig ny caenorhabditis art. Klicka på länken på den övre träffen för att visualisera justeringen (bild 6). Om den översta träffen är (1) en caenorhabditist , (2) justeringen innehåller mer än fem missmatchningar i mitten av sekvensen, och (3) frågetäckningen är större än 50%, tyder detta resultat på att isolatet kan vara en ny kaenorhabitart (figur 7). För dessa S-plattor anger arten av den översta BLAST-träffen i kolumnen "species_id", anger en 1 i kolumnen "possible_new_caeno_sp" och "möjlig ny Caeno sp."- kolumn i kolumnen "manual_blast_notes" tillsammans med procentidentitet (t.ex. "möjlig ny Caeno sp. 89% identitet").
9. För S-pläterar ordnar det BLAST till en Caenorhabditis art, ange det fulla släktet och artnamnet av det bästa BLAST-sloggen i "species_id" kolonnen. Till exempel "Caenorhabditis elegans".
10. För S-pläterar ordnar det BLAST till en non-Caenorhabditis art, skriver in endast släktet av den bästa BLAST-hiten följt av "sp.", i "species_id" kolonnen. Denna notation innebär att isolatet är en okänd art inom det namngivna släktet. Till exempel "Oscheius sp.".
    OBS: ITS2-sekvensen kan inte användas för att på ett tillförlitligt sätt identifiera isolat till artnivån utanför Caenorhabditis-släktet3,13.
11. Ange 1 i "make_strain_name kolumnen" i genotypningsbladet om "species_id" = "Caenorhabditis elegans", "Caenorhabditis briggsae" eller "Caenorhabditis tropicalis", OR "possible_new_caeno_sp" = 1.
12. Namnge stammarna med unika namn enligt Caenorhabditis nomenklaturkonventioner, dvs. en unik laboratoriebeteckning bestående av 2-3 versaler följt av ett nummer för varje unik ^stam23. Ange stamnamnen i kolumnen "strain_name".
13. När stammar har namngetts kan de kryopreserveras med hjälp av etablerade protokoll ²⁴.

10. Behandla insamlingsdata med easyFulcrum-paketet i R

I det här steget beskrivs hur du länkar insamlingsdata (C-etiketter) och nematodisoleringsdata (S-etiketter) tillsammans med easyFulcrum R-paketet. Programvaran innehåller funktioner som ytterligare kommer att sammanfoga Fulcrum-data med genotypningsdata från genotypningsbladet så att S-etikett art identiteter och stamnamn är organiserade i en enda dataram.

1. Skapa en ny katalog med namnet för samlingsprojektet. Ordna mappstrukturen i katalogen så att den matchar kraven som beskrivs i R-paketet ^{easyFulcrum15}.
2. Navigera till Fulcrums webbplats och logga in. Exportera rådata från Fulcrum-databasen med hjälp av Fulcrum-webbplatsens dataexportverktyg till vänster och markera följande kryssrutor: projektera, inkludera foton, inkludera GPS-data, fältprovtagning och isolering.
   Fulcrum-data för projektet kommer att exporteras som fem kommaavgränsade värdefiler (.csv). De fullständiga projektdata kommer att sammanfogas till en enda dataram med easyFulcrum-paketet i R.
3. Flytta de fem .csv filer som exporteras från Fulcrum till projektkatalogen som skapades i steg 10.1 enligt instruktionerna i easyFulcrum-vinjetten21.
4. Öppna en Rstudio-session och installera easyfulcrum-paketet i R genom att ange följande kommandon i R-konsolen "install.packages("devtools")" och "devtools::install_github("AndersenLab/easyfulcrum")".
5. Öppna ett nytt R-skript och följ anvisningarna i easyfulcrum vinjett för att bearbeta ^{insamlingsdata21}.

Representative Results

Detta protokoll har använts för att samla in Caenorhabditis nematoder från flera platser, inklusive Hawaii och Kalifornien. Isoleringsframgångsgraden för Caenorhabditis nematoder varierar med insamlingsplats, klimat, provtagningsupplevelse och substrattyper som provtas. Protokollet har använts för att i stor utsträckning prova Hawaiiöarna, där nio insamlingsprojekt har genomförts under flera år och säsonger. Isoleringsframgångsfrekvensen för självgående Caenorhabditis arter är nästan identiska för C. briggsae (162 av 4,506 prover, 3,6%) och C. elegans (163 av 4,506 prover, 3,6%), och mycket lägre för C. tropicalis (26 av 4 506 prover, 0,58%)⁸. Var och en av de självgående arterna berikas på ruttande frukt- och blomsubstrat i förhållande till de andra substratkategorierna. Prova ruttande frukt- och blomsubstrat om forskaren försöker maximera framgångsgraden snarare än att karakterisera substratpreferenser. Framgångsgraden varierar dock med kvaliteten på det valda substratet. Till exempel bland frukt- och blomsubstrat kommer de substrat som är för torra, våta eller färska sannolikt inte att ge Caenorhabditis nematoder.

Skalbarheten i detta samlingsprotokoll framgår av antalet samlingar som ett enda par forskare kan samla in från naturen. Till exempel, i oktober 2018, kunde ett par forskare som använder detta insamlingsprotokoll samla in totalt över 1 000 prover på 7 dagar från flera platser på två Hawaiian Islands. Detta fältteam skickade proverna över natten till laboratoriet, där ett team på åtta forskare isolerade över 2 000 nematoder från proverna när de anlände. En viktig fördel med detta protokoll är att det minimerar kostnaden för provtagning på avlägsna platser genom att minska den utrustning och personal som krävs på fältet. Med hjälp av detta protokoll kan ett litet fältteam fokusera på provtagning medan isoleringsteamet kan bearbeta proverna på sin heminstitution med hjälp av ömtålig och tung utrustning som dissekering av mikroskop och agarplattor för att isolera nematoder. Dessutom gör implementeringen av den mobila datainsamlingsapplikationen att alla fältdata som är associerade med exemplen kan länkas direkt till C-etiketten, vilket gör det möjligt för isoleringsteamet att arbeta oberoende av fältteamet när de bearbetar prover.

Forskare som använder detta insamlingsprotokoll måste överväga den ansträngning som krävs för att isolera nematoder före ett insamlingsprojekt. Isolerings-och identifierings stegen är hastighets begränsande, och ett litet insamlings team kan snabbt överbelasta isolatorer med exempel. Dessutom kan det laboratorieutrymme som krävs för att bearbeta många samlingar störa pågående forskning (figur 3). Dessutom kräver vissa isolerade nematoder ytterligare ansträngning för att genotyp. Till exempel misslyckas cirka 2 % av isolaten med SSU PCR-primern efter det första lysförsöket och måste återlysseras för att säkerställa att lysmaterialet är lämpligt för förstärkning med ITS2-primeruppsättningen (bild 8). Dessutom misslyckas cirka 3% av isolaten med att producera kvalitetssekvenser efter en första omgång Sanger-sekvensering. För dessa isolat krävs ofta en annan omgång lys, ITS2 PCR och Sanger-sekvensering, vilket kan öka leveranstiden för isoleringsteamet. Det är viktigt att enbart sekvensidentitet inte är tillräckliga bevis för att motivera en ny caenorhabditart (figur 7). För att på ett korrekt sätt motivera att ett isolat höjs som en ny caenorhabditisart måste ytterligare ansträngningar göras för att utföra parningsexperiment och upprätta ett maskinskrivet ^prov13. En formell morfologisk beskrivning av det skrivna exemplaret föredras också men krävs ^inte3. Tillsammans tyder dessa överväganden på att forskare som antar detta insamlingsprotokoll kommer att dra nytta av testtester av isolerings- och identifieringsstegen för att säkerställa att resurserna fördelas korrekt innan ett insamlingsprojekt börjar. Viktigt är att även små insamlingsprojekt kan dra nytta av detta protokoll eftersom processen är mycket reproducerbar och data enkelt kan granskas för kvalitetskontrolländamål mellan laboratoriegrupper.

Bild 1: Substratexempel. (A) En idealisk ruttande frukt visas i mitten av bilden (1), frukten är nästan oigenkännlig. Mindre rutten frukt visas i närheten; undvika provtagning av nyfallna frukter (2). B) En idealiskt sönderdelad blomma visas högst upp (3). Undvik provtagning av nyfallna blommor (4). C) Den mörka bladskräpet under det översta lagret av torra blad är idealisk vid provtagning för självgående Caenorhabditis nematoder (5). Undvik provtagning av torrbladsskräp (6). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 2: Den mobila applikationen Nematode Field Sampling. (A) Den första skärmen efter att ha öppnat Nematode Field Sampling-applikationen på en Apple-enhet i Fulcrum. Den röda pilen längst ned till höger pekar på knappen + som används för att skapa en ny samlingspost. (B) Ett exempel på en ny samlingspost som visas på en Apple-enhet. Den röda pilen pekar på fältet "Projekt" högst upp på samlingspostskärmen. Se till att välja rätt projekt vid provtagning i fältet. Projektfältet kommer som standard det sista projektet som användes när efterföljande samlingsposter skapats. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 3: Uppsamlingspåsar och uppsamlingsplattor organiserade innan proverna pläterar ut. Den här figuren visar proverna i C-märkta uppsamlingspåsar till vänster. Varje uppsamlingspåse har en matchande C-märkt 10 cm tallrik ovanpå den. Till höger finns 10 cm uppsamlingsplattor som innehåller provmaterial efter att det överförts från uppsamlingspåsarna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 4: En uppsamlingsplatta (C-platta) med ett korrekt överfört prov. En 10 cm C-tallrik med sönderdelande frukt placerad på kanten av bakteriegräsmattan. C-etiketten är fastsatt på plåtlocket. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 5: Nematode isolering mobilapplikation. (A) Applikationsvalsskärmen i Fulcrums mobilapplikation. Den röda pilen pekar på Nematode-isoleringsprogrammet . (B) Den första skärmen efter att ha öppnat Nematode Isolation-applikationen på en Apple-enhet i Fulcrum. Den röda pilen längst ned till höger pekar på knappen + som används för att skapa en ny isoleringspost. (C) Ett exempel på en ny isoleringspost som visas på en Apple-enhet. Den röda pilen pekar på fältet "Projekt" högst upp på isoleringsinspelningsskärmen. Var noga med att välja rätt projekt när du isolerar. Projektfältet kommer som standard det sista projektet som användes när efterföljande isoleringsposter skapats. (D) När du har tryckt på fältet Välj under C-etikett trycker användarna på sökknappen (röd pil) för att hitta C-etiketten som de isolerar nematoder från. (E) När C-etiketten har valts kommer användarna att fotografera C-plattan med hjälp av enhetskameran. (F) Användare anger sedan om det finns nematoder på C-plattan eller inte. S-etiketter läggs till i isoleringsposten om det finns nematoder som ska isoleras. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 6: NCBI BLAST resultatsida. (1) Den nedrullningsbar meny som används för att visa BLAST-resultaten för alla sekvenser. (2) Beskrivningen av den aktuella sekvensen som valts från listrutan. I detta fall visas resultaten för S-etiketten S-05554. (3) Den bästa BLAST-träffen för S-05554 visas. Den lila texten anger att länken för att visualisera justeringen har klickats på. Var noga med att inspektera inriktningarna med öga för att identifiera eventuella nya caenorhabditis arter, se steg 9.8 ovan. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Bild 7: EXEMPEL på NCBI BLAST-justeringsvisualisering. (A) Ett exempel på ett isolats ITS2-frågesekvens justerad mot en C. kamaaina-ämnessekvens . (1) Justeringens procentuella identitet (89%), vilket är lågt för en topp BLAST-träff. (2) En obalans mellan fråge- och ämnessekvensen (G till A). (3) Ett mellanrum med fyra baspar i ämnessekvensen som gjorts av justeringsalgoritmen. luckor i frågan eller ämnet indikerar dålig justering. (4) En generaliserad region i mitten av justeringen med många missmatchningar och luckor. En region som den här antyder att frågesekvensen kan komma från en ny Caenorhabditis art. Visas är ett faktiskt anpassningsexempel på en ny art, C. oiwi, som upptäcktes 2017. (B) Ett exempel på en bra justering mellan ett isolats ITS2-frågesekvens och en ämnessekvens. (5) Justeringens procentuella identitet (99 %), vilket vanligtvis innebär att frågesekvensen kommer från ett isolat av samma art som ämnet. (6) En central region i anpassningen till den perfekta identiteten. En region som den här antyder att frågeisolat troligen är samma art som ämnet. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figur 8: SSU- och ITS2 PCR-produkter. Den övre gelen visar PCR-produkter som genereras med SSU-primern för 12 representativa prover. En DNA-stege ingår till vänster som referens. SSU PCR-produkterna för Caenorhabditis nematoder är cirka 500 bp långa. Proverna 2-12 förstärktes med SSU-primern, men prov ett gjorde det inte. Avsaknaden av en 500 bp SSU amplicon för prov ett tyder på att lysmaterialet var av dålig kvalitet och provet måste återlysseras. Den nedre gelen visar PCR-produkter som genereras med ITS2-primern för samma 12 prover som visas i toppgelen. Stegen och proverna är i samma riktning för båda gelerna. Sex av de 12 proverna förstärktes inte med ITS2-primern. Proverna med SSU- och ITS2-band är Sanger sekvenserade och identifierade genom sekvenslikhet med hjälp av NCBI BLAST-algoritmen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande fil 1: C-etiketter. En PDF-fil som innehåller 2500 unika C-etiketter. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: S-etiketter. En PDF-fil som innehåller 5000 unika S-etiketter. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Fältmaterial. En förpackningsförteckning över material som används på fältet för att prova nematoder. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 2: PCR-recept och termocyklistförhållanden. En tabell med PCR-recept och termocykelförhållanden för ITS2 och SSU PCR. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 3: Elektroforesbuffertrecept. Ett recept på 0,5 M pH 8,0 Etylendiamintetraateetic acid solution (EDTA) och buffertlösningen TRIS-acetate-EDTA (TAE). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

Det här protokollet innehåller kritiska steg som måste utföras med försiktighet. Det är till exempel viktigt att fält- och isoleringsteamen är noga med att välja rätt insamlingsprojekt i programmet innan de samlar in prover från fältet eller isolerar nematoder från proverna i laboratoriet. Om fel insamlingsprojekt väljs korrigeras de felaktiga dataposterna bäst i Fulcrum-databasen med hjälp av postredigeringsverktygen online. Den här processen kan vara tråkig för många felplacerade poster. Databasen behåller dock alla ändringar i poster så att en fullständig granskning av insamlings- och isoleringsposter är möjlig. De andra kritiska stegen i detta protokoll omfattar hantering av prover från fältet och nematoder som isolerats från dessa prover. För att säkerställa att nematoder med caenorhabditis överlever provtagnings- och transportstegen bör provernas temperatur hållas mellan 4 °C och 25 °C. Temperaturer över 25 °C kan orsaka sterilitet i C. ^elegans14. Se till att proverna överförs från uppsamlingspåsar till uppsamlingsplattor inom fem dagar när det är möjligt för att minimera förlusten av nematoder. Efter att nematoder isolerats är det viktigt att de är genotypade och kryopreserverade innan de förgås. Det är svårt att hitta levande nematoder på S-plattor som är mer än två till tre veckor gamla eftersom svamp- och bakterieförorening kan göra S-plattorna ogästvänliga.

Detta protokoll kan enkelt ändras för att rymma olika typer av data som forskare kanske vill samla in när de är ute på fältet. Det är till exempel enkelt att anpassa programmet "Nematode field sampling" med nya datainmatningsfält med Fulcrums online-GUI för programredigering. Dessutom kan dataanalyspaketet, easyFulcrum, rymma dessa redigeringar när de bearbetar de nya ^{uppgifterna15}. En annan ändring som användare kan tycka är tilltalande är att använda en annan provtagningsmetod i fältet. I stället för att ta prover på diskreta substrat kan forskare vilja ta prover på större områden som innehåller flera substrattyper. Dessa större prover bearbetas bäst i laboratoriet med hjälp av Baermann-tratten eller brickans ^{utsugningsmetoder13}. Det är viktigt att användningen av C-etiketter och S-etiketter fortfarande gäller för dessa tekniker och är därför kompatibla med mobila applikationer.

De primära begränsningarna i detta protokoll avser hanteringstiden för nematoder före isolering i laboratoriet. För det första gör fördröjningen mellan provinsamling och nematodisolering det omöjligt att registrera utvecklingsstadierna för nematoder på ett visst prov vid insamlingstillfället. För det andra är frekvensen av män och outcrossing i naturen viktiga evolutionära frågor för självande Caenorhabditis ^nematodes10. Denna metod är inte väl lämpad för att ta itu med dessa frågor eftersom nematoder sannolikt har gått igenom flera generationer före isolering. Fördröjd isolering innebär att direkta bevis på manlig frekvens i naturen är omöjliga. Dessutom innebär den multigenerationella fördröjningen under genotypningsstegen att genomiska bevis på outcrossing (heterozygosity) kommer att eroderas innan en nematodstam kan sekvenseras. För att identifiera heterozygositet i naturen används avkomman som produceras av en nematod direkt isolerad från naturen för ^{sekvensering2}. En annan potentiell begränsning av detta protokoll är att det är partiskt mot identifiering av självgående Caenorhabditis. Detta beror på att isolerade nematoder av självande arter har större chans att sprida sig än att tvinga utcrossers, som bara kommer att sprida sig om en befruktad kvinna isoleras.

Den här insamlingsmetoden baseras på befintliga ^{insamlingsprotokoll13,14}. Den stora utvecklingen av denna teknik är användningen av mobil teknik och anpassad programvara för att underlätta organisationen av stora mängder ekologiska och molekylära data i samband med storskaliga insamlingsprojekt. De ekologiska data som genereras med hjälp av detta insamlingsprotokoll kan användas för att ta itu med utestående frågor för naturliga populationer av caenorhabditis arter. Till exempel har data som genererats med denna metod använts för att upptäcka nischpreferenser för arten över Hawaiian Islands. Genom att sekvensera arvsreserverade nematoders arvsreserverade nematoder kan forskare dessutom undersöka hur mönster av genetisk variation är korrelerade med ekologiska data. Forskning av detta slag kan avslöja signaturer av lokal anpassning i Caenorhabditis populationer och ge viktiga insikter om relevansen av genetisk variation i naturliga ^sammanhang8. För att få en funktionell förståelse för många gener i Caenorhabditis nematoder krävs sannolikt ekologiska ^studier11. Även för C. elegans saknar en stor del av generna funktionella anteckningar, trots att det är det första multicellulära djuret som sekvenseras och ett av de mest noggrant studerade djuren på jorden. Detta insamlingsprotokoll utvecklades för att hjälpa till att ta itu med denna kunskapslucka genom att underlätta insamlingen av vilda Caenorhabditis nematoder och studien av deras ekologi och naturliga genetiska mångfald.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive labels	Avery	61533	Printing the C-labels and S-labels
Agarose	Thomas Scientific	C748D75	agarose gel preparation
Backpack			A backpack for each team member to hold equipment, samples, food, and water for the day.
Cardboard boxes	Fisher Scientific	AS261	Storage of S-plates
Centrifuge	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Collection bags	Zip-lock	NA	Collection of substrates
Digital temperature/humidity meter	Preciva	HT-86	Measurement of ambient temperature and humidity
Disecting scope	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Disposible reservoirs	USA Scientific	1306-1010	Aliquoting PCR master mixes and loading dye
DNA ladder, 1 KB plus	Thermo Scientific	SM0243	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
dNTPs	Thomas Scientific	CB4430-2	PCR master mix component
easyFulcrum R package	NA	NA	An R package for processing collection data http://andersenlab.org/easyfulcrum/articles/easyFulcrum.html
EDTA solution (0.5 M pH 8.0)	NA	NA	See supplemental table 3 for recipe
Ethanol (95%)	NA	NA	Plating out samples, spoon sterilization
Ethidium bromide solution (10 mg/mL)	VWR	97064-602	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
External battery charger for mobile device	NA	NA	External battery charger and charging cable for iPhone or Android
Flask (500 mL)	Fisher Scientific	FB501500	agarose gel preparation
Food	NA	NA	Pack accordingly
Gel electrophoresis apparatus	Thermo Scientific	B2	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
Gel loading dye, 6x	NEB	B7022S	Visualizing SSU and ITS2 PCR products
ITS2 primer set	NA	NA	oECA1687 = forward primer CTGCGTTACTTACCACGAATTG CARAC, oECA202 = reverse primer GCGGTATTTGCTACTACCAYYAM GATCTGC
ITS2 sequencing primer	NA	NA	oECA306 = forward primer CACTTTCAAGCAACCCGAC
Lysis buffer	NA	NA	Nematode lysis, see protocol for recipe
Microwave	NA	NA	agarose gel preparation
Mobile device	NA	NA	Charged phone in airplane mode. The Fulcrum app GPS positions are inaccurate compared to the GPS positions extracted from pictures. This setting ensures that you use less power and get more precise GPS measurements.
NGMA plates, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713	C-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
NGMA plates, 3.5 cm	Greiner Bio-One	5662-7102Q	S-plates, see Andersen et al. 2014 for NGMA plate protocol.
Non-contact infrared thermometer	Etekcity	B00837ZGRY	Measurement of substrate temperature
Paper towels	NA	NA	Paper towels for absorbing excess moisture in a bagged sample.
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	Plate sealing
PCR adhesive foil	VWR	60941-126	PCR adhesive foil
PCR buffer (10x)	Thomas Scientific	CB3702-7	PCR master mix component
PCR plates (96-well)	Thomas Scientific	1149K04	SSU and ITS2 PCRs
Pencil	NA	NA
Plastic spoons	NA	NA	Plating out samples
Platinum pick	NA	NA	Nematode isolation, lysis
Pre-labeled ziplock collection bags	NA	NA	Bundles of zip-lock plastic bags pre-labelled with C-label barcodes. Each bundle should contain 25 barcoded bags wrapped with a rubber band.
Proteinase K	Sigma	3115879001	Nematode lysis, added to lysis buffer just prior to use
R software	NA	NA	R software: A language and environment for statistical computing https://www.R-project.org/
Soft cooler bag and ice pack	NA	NA	Collection coolers and cooler packs to keep samples cool when ambient temperature is above 25 °C.
Spare batteries	NA	NA	Extra batteries for sampling equipment
SSU primer set	NA	NA	oECA1271 = forward primer TACAATGGAAGGCAGCAGGC, oECA1272 = reverse primer CCTCTGACTTTCGTTCTTGATTAA
Strip tube caps (12-well)	Thomas Scientific	1159V29	Nematode lysis
Strip tubes (12-well)	Thomas Scientific	1159V31	Nematode lysis
TAE buffer (1x)	NA	NA	Visualizing SSU and ITS2 PCR products. See supplemental table 3 for recipe
Taq polymerase	Thomas Scientific	C775Y45	PCR master mix component
Thermocycler	NA	NA	Neamtode lysis, SSU and ITS2 PCR
Water	NA	NA	Pack accordingly