Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/63498
Automatic Translation
1, 1
1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Summary

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Abstract

MicroRNA's (miRNA's) zijn korte RNA-moleculen die wijdverspreid zijn in eukaryoten. De meeste miRNA's worden getranscribeerd van introns en hun rijping omvat verschillende RNA-bindende eiwitten in de kern. Volwassen miRNA's bemiddelen vaak gen-uitschakeling, en dit is een belangrijk hulpmiddel geworden voor het begrijpen van post-transcriptionele gebeurtenissen. Daarnaast kan het worden onderzocht als een veelbelovende methodologie voor gentherapieën. Er is momenteel echter een gebrek aan directe methoden voor het beoordelen van miRNA-expressie in zoogdiercelculturen. Hier beschrijven we een efficiënte en eenvoudige methode die helpt bij het bepalen van miRNA-biogenese en rijping door bevestiging van de interactie met doelsequenties. Dit systeem maakt ook de scheiding mogelijk van exogene miRNA-rijping van zijn endogene activiteit met behulp van een doxycycline-induceerbare promotor die in staat is om primaire miRNA (pri-miRNA) transcriptie met hoge efficiëntie en lage kosten te beheersen. Deze tool maakt ook modulatie met RNA-bindende eiwitten in een apart plasmide mogelijk. Naast het gebruik ervan met een verscheidenheid aan verschillende miRNA's en hun respectieve doelen, kan het worden aangepast aan verschillende cellijnen, op voorwaarde dat deze vatbaar zijn voor transfectie.

Introduction

Precursor mRNA splicing is een belangrijk proces voor genexpressieregulatie in eukaryoten1. De verwijdering van introns en de vereniging van exonen in volwassen RNA wordt gekatalyseerd door het spliceosoom, een ribonucleoproteïnecomplex van 2 megadalton dat bestaat uit 5 snRNA's (U1, U2, U4, U5 en U6) samen met meer dan 100 eiwitten 2,3. De splicingreactie vindt co-transcriptioneel plaats en het spliceosoom wordt geassembleerd bij elk nieuw intron geleid door de herkenning van geconserveerde spliceplaatsen op exon-introngrenzen en binnen het intron4. Verschillende introns kunnen verschillende splicingsnelheden hebben, ondanks de opmerkelijke conservering van het spliceosoomcomplex en zijn componenten. Naast de verschillen in het behoud van de splice-site, kunnen regulerende sequenties verdeeld over introns en exonen RNA-bindende eiwitten (RBP) sturen en splicing 5,6 stimuleren of onderdrukken. HuR is een alomtegenwoordig tot expressie gebrachte RBP en is een belangrijke factor om mRNA-stabiliteit te beheersen7. Eerdere resultaten van onze groep toonden aan dat HuR kan binden aan introns die miRNA's bevatten, wat aangeeft dat dit eiwit een belangrijke factor kan zijn om miRNA-verwerking en rijping te vergemakkelijken, wat ook leidt tot het genereren van alternatieve splicingisovormen 6,8,9.

Veel microRNA's (miRNA's) zijn gecodeerd vanuit intronische sequenties. Terwijl sommige deel uitmaken van de intron, staan andere bekend als "mirtrons" en worden gevormd door de gehele intron 10,11. miRNA's zijn korte niet-coderende RNA's, variërend van 18 tot 24 nucleotiden in lengte12. Hun volwassen sequentie vertoont gedeeltelijke of volledige complementariteit met doelsequenties in mRNA's, waardoor de translatie- en/of mRNA-vervalsnelheden worden beïnvloed. De combinaties van miRNA's en doelen drijven de cel naar verschillende uitkomsten. Verschillende miRNA's kunnen cellen naar pro- of antitumorale fenotypendrijven 13. Oncogene miRNA's richten zich meestal op mRNA's die een onderdrukkend kenmerk veroorzaken, wat leidt tot verhoogde cellulaire proliferatie, migratie en invasie14. Aan de andere kant kunnen tumorsuppressieve miRNA's zich richten op oncogene mRNA's of mRNA's die verband houden met verhoogde celproliferatie.

De verwerking en rijping van miRNA's zijn ook afhankelijk van hun oorsprong. De meeste intronische miRNA's worden verwerkt met deelname van de microprocessor, gevormd door de ribonuclease Drosha en eiwitcofactoren12. Mirtrons worden verwerkt met de activiteit van het spliceosoom onafhankelijk van Drosha15. Gezien de hoge frequentie van miRNA's in introns, veronderstelden we dat RNA-bindende eiwitten die betrokken zijn bij splicing ook de verwerking en rijping van deze miRNA's zouden kunnen vergemakkelijken. Met name de RBP hnRNP A2/B1 is al in verband gebracht met de microprocessor en miRNA-biogenese16.

We hebben eerder gemeld dat verschillende RNA-bindende eiwitten, zoals hnRNPs en HuR, geassocieerd zijn met intronische miRNA's door massaspectrometrie17. HuR's (ELAVL1) associatie met miRNA's uit de miR-17-92 intronische cluster werd bevestigd met behulp van immunoprecipitatie en in silico-analyse 9. miR-17-92 is een intronisch miRNA-cluster bestaande uit zes miRNA's met verhoogde expressie in verschillende kankers18,19. Dit cluster staat ook bekend als "oncomiR-1" en bestaat uit miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20, miR-19b en miR-92a. miR-19a en miR-19b behoren tot de meest oncogene miRNA's van dit cluster19. De verhoogde expressie van HuR stimuleert miR-19a en miR-19b synthese9. Omdat intronische gebieden die dit cluster flankeren geassocieerd zijn met HuR, hebben we een methode ontwikkeld om te onderzoeken of dit eiwit miR-19a en miR-19b expressie en rijping kan reguleren. Een belangrijke voorspelling van onze hypothese was dat HuR, als regulerend eiwit, miRNA-biogenese zou kunnen vergemakkelijken, wat zou leiden tot fenotypische veranderingen. Een mogelijkheid was dat miRNA's werden verwerkt door de stimulatie van HuR, maar niet volwassen en functioneel zouden zijn en daarom zouden de effecten van het eiwit het fenotype niet direct beïnvloeden. Daarom hebben we een splicing reporter assay ontwikkeld om te onderzoeken of een RBP zoals HuR de biogenese en rijping van een intronisch miRNA kan beïnvloeden. Door miRNA-verwerking en -rijping te bevestigen, toont onze test de interactie met de doelsequentie en de generatie van een volwassen en functioneel miRNA. In onze test koppelen we de expressie van een intronisch miRNA-cluster aan een luciferaseplasmide om te controleren op miRNA-doelbinding in gekweekte cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Een overzicht van het hier beschreven protocol is weergegeven in figuur 1.

1. Plasmide constructie

  1. pCAGGS-Cre: Dit plasmide werd geleverd door Dr. E. Makeyev21.
  2. pRD-miR-17-92:
    1. Amplify pre-miR-17-92 door PCR met behulp van 0,5 μM van elke specifieke primer (Tabel van Materialen), 150 ng cDNA, 1 mM dNTPs, 1x Taq PCR-buffer en 5 U high-fidelity Taq DNA-polymerase. Voer een pcr-reactie zonder sjablooncontrole uit (gebruik water in plaats van cDNA) om te controleren op DNA-besmetting.
    2. Ligate het PCR-product in pRD-RIPE (vriendelijk verstrekt door Dr. E. Makeyev, Nanyang Technological University, Singapore)21 in het intron tussen de EcoRI- en EcoRV-beperkingsplaatsen met behulp van DNA-ligase, waardoor pRD-miR-17-92 ontstaat. Bevestig de integriteit van de reeks door Sanger-sequencing.
  3. PmiRGLO-RAP-IB
    1. Ontwerp voorwaartse en omgekeerde primers geflankeerd door XhoI / XbaI-beperkingssites en met één NotI-beperkingssite erin. Meng equimolaire hoeveelheden voor- en achterwaartse primers en incubeer het mengsel bij 90 °C gedurende 5 minuten en breng het vervolgens gedurende 15 minuten over op 37 °C. Gebruik als besturingselementen primers met gecodeerde doelreeksen (materiaaltabel).
    2. Splits de gegloeide fragmenten met behulp van XhoI / XbaI-restrictie-enzymen en lireer ze stroomafwaarts van de luc2-sequentie in pmiR-GLO, waarbij pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR (Luc-RAP-1B) en pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR (Luc-scrambled) reporterconstructies worden gegenereerd. Bevestig ligatie met NotI-decolleté.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de overhangen die ontstaan na het gloeien van de primer complementair zijn aan de vector na splitsingsreactie.
  4. pFLAG-Hur
    1. Om een HuR overexpressie plasmide te genereren, versterkt u de HuR-sequentie met specifieke primers. Meng 300 ng cDNA, 0,5 μM van elke specifieke primer, 1 mM dNTPs mix, 1x PCR buffer en 5 U high-fidelity Taq DNA polymerase.
    2. Ligate het PCR-product in pGEM-T en bevestig de integriteit van de DNA-sequentie door Sanger-sequencing. Verwijder het HuR-fragment uit pGEM-T en subclone het in pFLAG-CMV-3 zoogdierexpressievector om de pFLAG-HuR-vector te genereren.

2. Celkweek

OPMERKING: De HeLa-Cre cellijn was een geschenk van Dr. E. Makeyev21, en de papillaire schildklierkankercel (BCPAP) werd vriendelijk verstrekt door Dr. Massimo Santoro (Universiteit "Federico II", Napels, Italië). HeLa-cel, papillaire schildklierkankercel (BCPAP) en HEK-293T werden gebruikt om HuR te overexpresseren.

  1. Onderhoud de cellen in DMEM/hoge glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1 mM natriumpyruvaat, 200 mM L-glutamine en 1x penicilline-streptomycine (100 U/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine) in 100 mm petrischalen, tenzij anders aangegeven. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met gecontroleerde atmosfeer (5% CO2).
  2. Incubeer hechte cellen met trypsine/EDTA (0,5% oplossingsmengsel) bij 37 °C gedurende 3-5 min. Laat ze loskomen van de plaat (incubatietijd kan variëren afhankelijk van het celtype).
  3. Voer transfecties uit met een op lipiden gebaseerd transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Zorg ervoor dat de celculturen voor ongeveer 70% samenvloeien. Gebruik vergelijkbare hoeveelheden DNA voor alle transfectiecombinaties, zoals hieronder beschreven, door de juiste DNA's toe te voegen. Voer transfectie-experimenten uit in replicaties.
    1. Meng 200 ng DNA en 1,25 μL transfectiereagens in 100 μL van het kweekmedium. Voeg het transfectiemengsel toe aan de cellen. Incubeer de cellen met de transfectiemengsels gedurende 4 uur bij 37 °C. Vervang vervolgens het medium door een medium met 10% FBS en incubeer nog eens 24 uur voordat u de antibiotica voor selectie toevoegt.

3. HuR-overexpressie

  1. Transfect pFLAG-HuR en lege pFLAG in HeLa. Selecteer cellen door de concentratie van geneticïne (G418) (1 μg/ml) te verhogen van 100 μg/ml naar 1000 μg/ml, waardoor stabiele cellijnen worden gegenereerd.
  2. Bevestig overexpressie met kwantitatieve PCR met behulp van specifieke primers voor HuR-mRNA, zoals beschreven in stap 7.

4. Totale RNA-isolatie

  1. Gebruik vers verzamelde cellen. Trypsinize 70% confluent celculturen (voor deze test werden HeLa-Cre-cellen gebruikt), zoals beschreven in stap 2.2.
  2. Verzamel de celpellet door centrifugeren gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C en was deze met 1x PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing); herhaal de centrifugatie.
  3. Resuspendeer de celpellet in 1 ml 1x PBS en breng deze over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C.
  5. Weeg de droge celpellet en pas de volumes en de grootte van de buizen dienovereenkomstig aan. 1 mg cellen levert ongeveer 1 μg totaal RNA op.
  6. Voeg in een kap 500-1.000 μL fenol / chloroform toe aan de celpellet (idealiter 750 μL per 0,25 g cellen) en homogeniseer het door op en neer te pipetteren en te mengen met de vortex.
  7. Incubeer het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (20 °C tot 25 °C) om de volledige dissociatie van nucleoproteïnecomplexen mogelijk te maken.
  8. Centrifugeer het monster bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  9. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg 200 μL chloroform toe per 1 ml fenol:chloroform. Sluit de monsterbuizen stevig af.
  10. Meng krachtig gedurende 15 s (met de hand of kort vortexend met een lagere snelheid) en incubeer bij kamertemperatuur (20 °C tot 25 °C) gedurende 2 min tot 3 min.
  11. Centrifugeer de monsters bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  12. Controleer op de aanwezigheid van een onderste rode fenol-chloroformfase, een tussenfase en een kleurloze bovenste waterige fase. RNA blijft in de bovenste waterige fase. Verzamel in een kap de waterige fase, vermijd contact met de tussenliggende fase en breng over naar een verse buis.
  13. RNA neerslaan door de waterige fase te mengen met 400 μL isopropanol van moleculaire kwaliteit (1:1 verhouding tot fenol/chloroform gebruikt) en 2 μL glycogeen in elke buis (het zal helpen om de aanwezigheid van de pellet te visualiseren).
  14. Meng krachtig met de hand of homogeniseer met de punt gedurende ~ 10 s. Incubeer gedurende 15 min of een nacht bij −20 °C.
  15. Centrifugeer het monster bij 12.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
  16. Was de RNA-pellet door 3 volumes 100% ethanol toe te voegen (ongeveer 1 ml, verdund met DEPC-water) en meng het monster door vortexing totdat de pellet vrijkomt en van de bodem drijft.
  17. Centrifugeer bij 7.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  18. Was de RNA-pellet 1x door 1 ml 75% ethanol toe te voegen en meng het monster door vortexing totdat de pellet vrijkomt en van de bodem drijft. Herhaal de centrifugatie zoals beschreven in stap 4.17.
  19. Voer een extra 5 s centrifugatiespin uit om resterende vloeistof van de zijkant van de buis te verzamelen en verwijder eventuele resterende vloeistof met een pipet zonder de pellet te verstoren.
  20. Droog de RNA-pellet kort aan de lucht door de dop van de buis gedurende 3-5 minuten bij kamertemperatuur te openen en los de RNA-pellet op in 20-50 μL RNase-vrij DEPC-behandeld water. Incubeer het RNA gedurende 10 minuten bij 55-60 °C om de resuspensie van de pellet te vergemakkelijken.

5. Bepaling van de totale RNA-concentratie en -kwaliteit

  1. Bepaal de RNA-concentratie door de absorptie bij 260 nm en 280 nm te meten met behulp van een spectrofotometer. Verkrijg volledige spectrale gegevens voordat u de monsters in downstream-toepassingen gebruikt.
  2. Controleer de RNA-kwaliteit door 800-1000 ng op een 1,5% agarose-gel op te lossen met behulp van 0,5X TBE-buffer (45 mM Tris-base, 45 mM boorzuur, 1 mM EDTA). Totaal RNA scheidt zich in twee banden die verwijzen naar 28S en 18S rRNA's.
    1. Maak alle reagentia en was alle apparatuur die wordt gebruikt voor het laten lopen van de gel met DEPC-behandeld water. DEPC-behandeld water wordt in de kap bereid door 1 ml diethylpyrocarbonaat toe te voegen aan 1000 ml ultrazuiver water. Incubeer gedurende ~2 uur bij kamertemperatuur of bij 37 °C en autoclaaf. Bewaren bij kamertemperatuur gedurende maximaal 10 maanden.
      OPMERKING: Elektroforese van totale RNA's van zoogdieren leidt tot de scheiding van 28S- en 18S rRNA's in een verhouding van ongeveer 2:1. De banden moeten intact zijn en zichtbaar als twee scherpe banden. Gedegradeerd RNA zal resulteren in wazige banden.

6. Reverse transcriptie

  1. Stel de reverse transcriptiereactie in met 1 μg totaal RNA.
  2. Voer reverse transcriptie (RT) uit met behulp van reverse transcriptase-enzym (zie Materiaaltabel) en 50 ng/μL willekeurige decamerprimers.
    1. Meng RNA, willekeurige primers en 1 mM dNTP-mix (10 mM) in 10 μL. Incubeer bij 65 °C gedurende 5 min en op ijs gedurende 1 min. Voeg de volgende reagentia toe: 1x RT-buffer, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 40 U RNase-remmer en 200 U reverse transcriptase.
    2. Incubeer gedurende 10 minuten bij 25 °C en gedurende 1 uur bij 50 °C (temperaturen kunnen veranderen als verschillende enzymen worden gebruikt). Beëindig de reactie door gedurende 5 minuten bij 85 °C te broeden. cDA's kunnen bij −20 °C worden bewaard.

7. Kwantitatieve PCR

  1. Om de reactie in een eindvolume van 15 μL samen te stellen, mengt u 3 μL cDNA (100 ng/μL), 3,2 pmol van elke primer, 6 μL mastermix met de dNTP's en enzymen en 2,8 μL ultrapuur water.
    OPMERKING: Gebruik primers voor endogene constitutieve genen als controles (huishoudgenen) om de expressieniveaus van HuR-mRNA en miRNA's te normaliseren. β-Actine en snRNA U6 (RNU6B) zijn beschikbare opties voor de normalisatie van respectievelijk mRNA's en miRNA's, maar andere genen kunnen ook geschikt zijn, afhankelijk van het geval.
  2. Kwantificeer de expressieniveaus met behulp van de delta-delta Ct (2-ΔΔCt) methode20.

8. De test van de verslaggever

  1. Cellen die voor de test worden gebruikt
    1. Transfecteer de plasmiden in HeLa-Cre cellen als volgt. Transfect met pTK-Renilla (40 ng), vervolgens pRD-miR-17-92, waarbij HeLa-Cre-miR-17-92 wordt gegenereerd en wordt geselecteerd met 1 μg /ml puromycine.
    2. Transfect HeLa-Cre-miR-17-92-pTK-Renilla met pmiRGLO-RAP-IB-3ʹ-UTR of pmiRGLO-scrambled-3ʹ-UTR, afzonderlijk. Selecteer met penicilline (100 U / ml) en streptomycine (100 μg / ml). Deze transfecties genereren Luc-RAP-1-B en Luc-scrambled.
    3. Transfecteer de cellen met pFLAG-HuR of lege pFLAG (stap 3).
    4. Ga verder met celkweek, zoals beschreven in stap 2.2., met HeLa-Cre miR-17-92-luc, HeLa-Cre miR-17-92-scrambled, HeLa-Cre miR-17-92-HuR en HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc tot ongeveer 80% van de samenvloeiing. Induceer met 1 μL doxycycline (1 μg/ml) gedurende 30 min bij 37 °C. Bewaar ook alle cellen zonder doxycycline als controles, voor dezelfde periode.
      OPMERKING: De uiteindelijke concentratie doxycycline hangt af van de cellijn van keuze. Een teveel aan doxycycline kan giftig zijn voor zoogdiercellen.
  2. Luminescerende test
    1. Om verschillende luminescentie-intensiteiten te kwantificeren en te vergelijken, gebruikt u de Dual-luciferase reporter assay kit. Ontdooi luciferasetestoplossingen en laat ze bij kamertemperatuur voordat u met de test begint.
    2. Bereid de mix Stop and Glo (blauwe dopbuizen) door 200 μL van het substraat te mengen in 10 ml Luciferase Assay Buffer II. Bereid de mix LAR II (groene dopbuizen) door 10 ml Luciferase Assay Buffer II te mengen in de amberkleurige injectieflacon Luciferase Assay Substrate II en schud goed.
    3. Breng de oplossingen over naar centrifugebuizen van 15 ml die eerder zijn geïdentificeerd en beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen de oplossingen eerder worden bereid in aliquots van 1-2 ml en worden ingevroren bij −80 °C beschermd tegen licht in aluminiumfolie.
    4. Voer de luminescentiemetingen uit met behulp van een apparatuur zoals Synergy; meet luciferase als relatieve lichteenheden (RLU).
    5. Exporteer de resultaten naar een spreadsheet voor verdere statistische analyse.
    6. Voer normalisatie van vuurvlieg-luciferase-activiteit uit door de controle Renilla (luciferase / Renilla) en plot dat als relatieve lichteenheden (RLU) in een grafiek. Herhaal dit voor groepen met en zonder doxycycline-inductie.
    7. Bereken de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM). Voer de t-test of tweerichtings-ANOVA van een student uit, gevolgd door de post-test van Tukey om groepsvergelijking mogelijk te maken. Deze analyses zijn beschikbaar in een pakket zoals GraphPad Prism. Verschillen bij p-waarden < 0,05 worden als significant beschouwd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Onze eerste hypothese was dat HuR intronische miRNA-biogenese zou kunnen vergemakkelijken door zich te binden aan zijn pre-miRNA-sequentie. De verbinding van HuR-expressie en miR-17-92 clusterbiogenese zou dus kunnen wijzen op een nieuw mechanisme dat de rijping van deze miRNA's regelt. Overexpressie van HuR bij transfectie van pFLAG-HuR werd bevestigd in drie verschillende cellijnen: HeLa, BCPAP en HEK-293T (Figuur 2). Als controles werden niet-getransfecteerde cellen en cellen getransfecteerd met lege pFLAG-vectoren gebruikt. Belangrijk is dat we hebben waargenomen dat HuR-overexpressie in deze cellen de expressie van miR-19a stimuleert (aanvullende tabel 1-resultaten gerapporteerd in Gatti da Silva et al.9).

Om te bevestigen dat de geïnduceerde miRNA's echt functioneel waren, werd een in vitro reportersysteem ontworpen, zoals hier beschreven. Het kunstmatige intron in pRD-RIPE scheidt twee coderende regio's van eGFP. Deze cassette staat onder controle van een tetracycline responsive element (TRE). De expressie van eGFP wordt dus gecontroleerd door de aanwezigheid van het antibioticum doxycycline (DOX) in het celmedium (figuur 3).

Een in silico-zoekopdracht met behulp van miRbase en TargetScan onthulde mogelijke mRNA-doelen voor miR-19a en miR-19b (componenten van het miR-17-92-cluster). Als potentieel doelwit voor beide miRNA's werd gekozen voor de sequentie 5' TTTGCACA 3', gevonden op de RAP-IB 3' UTR-regio( Aanvullende tabel 2). RAP-IB is een GTPase lid van de Ras-geassocieerde eiwitfamilie (RAS). De geïnduceerde miRNA's waren correct verwerkt en functioneel in onze test omdat het hybridiseerde naar de doelsequentie gekloond naast luciferase (zie figuur 3, pmiR-GLO-doelwit). Daarom blokkeerde het luciferasevertaling, wat tot uiting kwam in verminderde luciferase-activiteit (figuur 3). Als controle voor deze test hebben we de doelsequentie gecodeerd en vervangen door 5'GGGTAAA 3' in Luc-scrambled plasmide (doel- en scrambled-sequenties worden onderstreept in de oligos-sequenties in de tabel met materialen).

In normale omstandigheden en zonder inductie van het pRD-miR-17-92 plasmide vonden endogene miR-19a en/ of miR-19b het doelwit op pmiR-GLO, wat leidde tot verminderde luciferase-activiteit (gegevens niet getoond). Na DOX-suppletie werd een lichte en niet statistisch significante vermindering van luciferase-activiteit waargenomen in cellen met een gecodeerde doelsequentie. Dit kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van doelsequenties voor andere miRNA's in deze reeks. Een sterke vermindering van de luciferaseactiviteit werd waargenomen met RAP-IB 3'UTR bij verhoogde miR-19a- en miR-19 b-expressievan pRD-miR-17-92 in vergelijking met HeLa-Cre-cellen (zie figuur 4, vergelijk oranje en zwarte balken). De transfectie van pFLAG-HuR in deze cellen op zichzelf veranderde de luciferaseactiviteit niet (zie figuur 4, vergelijk grijze en zwarte balken). Overexpressie van HuR in combinatie met doxycycline-suppletie, stimulerende expressie van de miR-17-92-cluster, verminderde echter de luciferase-activiteit verder (zie figuur 4, vergelijk grijze en rode balken). Dit duidt op een positieve regulatie van HuR ten opzichte van miR-19a en miR-19b, gekoppeld aan correcte verwerking en rijping van deze miRNA's, die in staat waren om met succes hun doelen te vinden (HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc) (zie figuur 4).

Het gebruik van dit reportersysteem bevestigde dat HuR expressie en juiste rijping van miR-19a en miR-19 b in HeLa-celleninduceert.

Figure 1
Figuur 1: Een conceptueel overzicht van het hier beschreven protocol. Plasmiden die het miRNA, de doelsequentie, het regulerende eiwit en pTK-Renilla bevatten, werden getransfecteerd in gekweekte cellen. Na antibioticaselectie werden deze cellen gebruikt voor het induceren van miRNA-expressie (met doxycycline), met daaropvolgende kwantificering van luciferase-activiteit en voor RNA-analyse om HuR-overexpressie te bevestigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Bevestiging van FLAG-HuR overexpressie in (A) HeLa, (B) BCPAP en (C) HEK293T cellen door qPCR. Transfectie met lege pFLAG werd gebruikt als controle (witte balken). β-actine werd gebruikt om Ct-waarden te normaliseren. De y-as vertegenwoordigt de vouwverandering van expressie die na normalisatie wordt berekend. De foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten die zijn berekend op basis van drie onafhankelijke metingen. **P <0,005, ****P < 0,0005 (figuur aangepast van Gatti da Silva et al.9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Intronisch miRNA-reportersysteem. (A) Schematische weergave van het pRD-RIPE-plasmide dat pRD-miR-17-92 genereerde. pre-miR-17-92 werd in de intron ingebracht en stond onder controle van een dox-induceerbare promotor; rechts het pmiR-GLO plasmide met RAP-IB 3'UTR-doelsequentie (pmiRGLO-RAP-IB); de controle had de gecodeerde doelvolgorde (pmiRGLO-scrambled). (B) Detail van de volgorde van pmiRGLO-RAP-IB, met de nadruk op de doelsequentie die complementair is aan miR-19a en miR-19b. Luciferase-activiteit wordt verminderd door de interactie van miRNA en het doelwit (figuur aangepast van Gatti da Silva et al.9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: HeLa-Cre-cellen werden getransfecteerd met reporterplasmiden pTK-Renilla, pmiRGLO-RAP-IB, pmiRGLO-scrambled, pRD-miR-17-92 en pFLAG-HuR. Luciferase-activiteit op niet-getransfecteerde HeLa-Cre-cellen (zwart), HeLa-Cre miR-17-92-scrambled (wit), HeLa-Cre-HuR (grijs), HeLa-Cre miR-17-92-luc (oranje) en HeLa-Cre miR-17-92-HuR-luc (rood). Luciferase-activiteit werd gekwantificeerd zoals beschreven in het protocol als de relatieve activiteit van vuurvlieg luciferase ten opzichte van Renilla luciferase (waargenomen met pTK-Renilla) en genormaliseerd na doxycycline toevoeging. Het wordt weergegeven als "relatieve lichteenheden" (RLU) op de y-as. **P < 0,005; P < 0,0005 (figuur aangepast van Gatti da Silva et al.9). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Ruwe Ct-waarden waargenomen voor qPCR om miR-19-expressie te analyseren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende tabel 2: RAP-IB 3'UTR-sequentie en miR-19-doelsequentie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pre-mRNA-splicing is een belangrijk proces voor genexpressieregulatie en de controle ervan kan sterke effecten op celfenotypische modificaties veroorzaken22,23. Meer dan 70% van de miRNA's wordt getranscribeerd van introns bij mensen, en we veronderstelden dat hun verwerking en rijping zou kunnen worden vergemakkelijkt door regulerende eiwittente splitsen 24,25. We ontwikkelden een methode om intronische miRNA-verwerking en -functie in gekweekte cellen te analyseren. Onze test maakt gebruik van vier verschillende plasmiden en stelt ons in staat om de rijping van endogene en exogene of geïnduceerde miRNA's te testen. De hier beschreven methode kan binnen 2-3 dagen worden uitgevoerd en vereist geen dure reagentia.

Aangezien HuR een RNA-bindend eiwit is dat belangrijk is voor mRNA-stabiliteit en immuun-neergeslagen is met miR-18 en miR-19a miRNA's17, testte deze test of het intronische miRNA-biogenese en -rijping kon stimuleren. HuR wordt niet gevonden in de kern van spliceosomen, maar interageert met eiwitten die betrokken zijn bij mRNA-stabilisatie26. Consequent is overexpressie van HuR in verband gebracht met de ontwikkeling van eierstok- en blaaskanker27,28. In papillaire schildklierkankercellen zagen we dat HuR de celproliferatie, migratie en invasie verhoogt9. HuR beïnvloedt ook de mRNA-stabiliteit van celcyclusregulatoren zoals PTEN, cycline A2 en cycline D2, waardoor celproliferatie en migratie toenemen en leiden tot tumorogene kenmerken29,30. Een aanzienlijk deel van deze mRNA's heeft echter ook doelsequenties voor miR-19a en miR-19b. HuR kan zich met name binden aan het intronische gebied waar deze miRNA's worden getranscribeerd, wat leidt tot het idee dat het de splicing en rijping van deze miRNA's kan beheersen en bijgevolg tumorigene kenmerken kan verbeteren.

Om dat te testen is deze test ontwikkeld met vier verschillende plasmiden. De eerste bevat de miRNA-cluster miR-17-92 die in een intron is ingebracht en de expressie ervan wordt gecontroleerd bij toevoeging van doxycycline. Het tweede plasmide is de commerciële pmiR-GLO met de doelsequentie naast de 3' van het luc2-gen. Binding van het miRNA aan deze doelsequentie beïnvloedt luc2-expressie, die kan worden gemeten op een luminescentietest. Het derde plasmide is pFLAG-HuR, dat de overexpressie van dit regulerende eiwit induceert. Ten slotte wordt pTK-Renilla ook gebruikt om de Renilla luciferase fluorescentie op te nemen. Onze resultaten gaven aan dat HuR de expressie van miR-17-92 stimuleert en de associatie van zijn componenten met de doelsequenties verhoogt, wat resulteert in volwassen en functionele miRNA-moleculen. We beschrijven de associatie van HuR met miRNA in een ander artikel9. De doelsequenties die in deze studie werden gebruikt, waren specifiek voor miR-19a en miR-19b miRNA's. Deze methode kan echter ook worden aangepast aan het gebruik van kortere of langere doelsequenties, waaronder meerdere doellocaties. In dit geval moet bij de analyse rekening worden gehouden met niet-specifieke binding van endogene miRNA's aan de doelsequentie of sequenties in de buurt. De gebruikte sequenties kunnen andere mogelijke doellocaties hebben, die de luciferase-activiteit kunnen beïnvloeden. De hier beschreven methode kan ook worden gebruikt om verschillende doelen van een miRNA of een groep miRNA's die samen zijn getranscribeerd te valideren, waardoor functionele studies van miRNA's en hun specifieke fenotypische veranderingen mogelijk worden. Er moet ook worden opgemerkt dat het de resultaten mogelijk maakt om te worden vergeleken tussen verschillende cellijnen en genetische achtergronden.

De meest kritische stappen voor het bredere gebruik van dit protocol in zoogdiercellen zijn de efficiëntie van de transfectie- en inductiestappen. Omdat verschillende plasmiden in de cellen worden getransfecteerd, zijn adequate controles ook van cruciaal belang. Deze parameters veranderen met de grootte van de plasmiden en worden beïnvloed door de uitgebreide tijd in celkweek. Daarom is een belangrijk punt dat moet worden overwogen voordat met de test wordt begonnen, het gemak van transfectie van de gekozen cellen. Bovendien kan het uitgebreide gebruik van verschillende antibiotica om te selecteren op de verschillende plasmiden (gentamicine, puromycine en doxycycline) en de expressie te activeren schadelijk zijn voor cellen en de efficiëntie van de volgende experimenten verminderen. Het is belangrijk dat deze test eerst wordt geoptimaliseerd met cellen met bekende transfectie-efficiëntie.

De verslaggever toonde met succes aan dat verhoogde HuR-expressie miRNA-biogenese kon induceren en bevestigde de functionele rijping ervan. Belangrijk is dat overexpressie van HuR geen invloed had op de hoeveelheid geproduceerd intron, omdat we geen verminderde luciferase-activiteit in deze toestand waarnamen (figuur 4). Verdere experimenten kunnen worden uitgevoerd om RRP's en miRNA's te karakteriseren met behulp van dit reportersysteem. Het zou bijvoorbeeld belangrijk zijn om enkele mutaties in miRNA-sequenties of in hun flankerende regio's te creëren en de impact van regulerende eiwitten in miRNA-biogenese te analyseren. Dit zou de specifieke karakterisering van de biogenese van individuele miRNA's mogelijk maken en zou ook de kennis over geconserveerde sequenties voor miRNA-verwerking en rijping kunnen verbeteren.

Wij beschouwen dit als een belangrijke methodologische bijdrage aan de studie van miRNA-biogenese en -rijping en de rol van splicing regulerende eiwitten in deze processen. Het kan ook worden toegepast op studies over de regulatie en controle van mRNA's en miRNA's in verschillende soorten cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

De auteurs zijn E. Makeyev (Nanyang Technological University, Singapore) dankbaar voor de HeLa-Cre cellen en pRD-RIPE en pCAGGS-Cre plasmiden. We bedanken Edna Kimura, Carolina Purcell Goes, Gisela Ramos, Lucia Rossetti Lopes en Anselmo Moriscot voor hun steun.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Recombinant DNA
pCAGGS-Cre (Cre- encoding plasmid) A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pFLAG-HuR Generated during this work
pmiRGLO-RAP-IB Generated during this work
pmiRGLO-scrambled Generated during this work
pRD-miR-17-92 Generated during this work
pRD-RIPE-donor A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
pTK-Renilla Promega E2241
Antibodies
anti-B-actin Sigma Aldrich A5316
anti-HuR Cell Signaling mAb 12582
IRDye 680CW Goat anti-mouse IgG Li-Cor Biosciences 926-68070
IRDye 800CW Goat anti-rabbit IgG Li-Cor Biosciences 929-70020
Experimental Models: Cell Lines
HeLa-Cre A kind gift from E. Makeyev from Khandelia et al., 2011
HeLa-Cre miR17-92 Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-HuR-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-luc Generated during this work
HeLa-Cre miR17-92-scrambled Generated during this work
Chemicals and Peptides
DMEM/high-glucose Thermo Fisher Scientific 12800-017
Doxycycline BioBasic MB719150
Dual-Glo Luciferase Assay System Promega E2940
EcoRI Thermo Fisher Scientific ER0271
EcoRV Thermo Fisher Scientific ER0301
Geneticin Thermo Fisher Scientific E859-EG
L-glutamine Life Technologies
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
pFLAG-CMV™-3 Expression Vector Sigma Aldrich E6783
pGEM-T Promega A3600
Platinum Taq DNA polymerase Thermo Fisher Scientific 10966-030
pmiR-GLO Promega E1330
Puromycin Sigma Aldrich P8833
RNAse OUT Thermo Fisher Scientific 752899
SuperScript IV kit Thermo Fisher Scientific 18091050
Trizol-LS reagent Thermo Fisher 10296-028
trypsin/EDTA 10X Life Technologies 15400-054
XbaI Thermo Fisher Scientific 10131035
XhoI Promega R616A
Oligonucleotides
forward RAP-1B pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAAG
CTACTATATCAGTTTGCACAT
reverse RAP-1B pmiRGLO Exxtend CTAGATGTGCAAACTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward scrambled pmiRGLO Exxtend TCGAGTAGCGGCCGCTAGTAA
GCTACTATATCAGGGGTAAAAT
reverse scrambled pmiRGLO Exxtend CTAGATTTTACCCCTGATATAGT
AGCTTACTAGCGGCCGCTAC
forward HuR pFLAG Exxtend GCCGCGAATTCAATGTCTAAT
GGTTATGAAGAC
reverse HuR pFLAG Exxtend GCGCTGATATCGTTATTTGTG
GGACTTGTTGG
forward pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ATCCTCGAGAATTCCCATTAG
GGATTATGCTGAG
reverse pre-miR-1792 pRD-RIPE Exxtend ACTAAGCTTGATATCATCTTG
TACATTTAACAGTG
forward snRNA U6 (RNU6B) Exxtend CTCGCTTCGGCAGCACATATAC
reverse snRNA U6 (RNU6B) Exxtend GGAACGCTTCACGAATTTGCGTG
forward B-Actin qPCR Exxtend ACCTTCTACAATGAGCTGCG
reverse B-Actin qPCR Exxtend CCTGGATAGCAACGTACATGG
forward HuR qPCR Exxtend ATCCTCTGGCAGATGTTTGG
reverse HuR qPCR Exxtend CATCGCGGCTTCTTCATAGT
forward pre-miR-1792 qPCR Exxtend GTGCTCGAGACGAATTCGTCA
GAATAATGTCAAAGTG
reverse pre-miR-1792 qPCR Exxtend TCCAAGCTTAAGATATCCCAAAC
TCAACAGGCCG
Software and Algorithms
Prism 8 for Mac OS X Graphpad https://www.graphpad.com
ImageJ National Institutes of Health http://imagej.nih.gov/ij

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  2. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  3. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  6. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  7. Mukherjee, N., et al. Integrative regulatory mapping indicates that the RNA-binding protein HuR couples pre-mRNA processing and mRNA stability. Molecular Cell. 43 (3), 327-339 (2011).
  8. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  9. Gatti da Silva, G. H., Dos Santos, M. G. P., Nagasse, H. Y., Coltri, P. P. Human antigen R (HuR) facilitates miR-19 synthesis and affects cellular kinetics in papillary thyroid cancer. Cellular Physiology and Biochemistry. 56, 105-119 (2022).
  10. Westholm, J. O., Lai, E. C. Mirtrons: MicroRNA biogenesis via splicing. Biochimie. 93 (11), 1897-1904 (2011).
  11. Michlewski, G., Cáceres, J. F. Post-transcriptional control of miRNA biogenesis. RNA. 25 (1), 1-16 (2019).
  12. Bartel, D. P. MicroRNAs: Target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  13. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - MicroRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  14. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  15. Curtis, H. J., Sibley, C. R., Wood, M. J. Mirtrons, an emerging class of atypical miRNA. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 3 (5), 617-632 (2012).
  16. Alarcon, C. R., et al. HNRNPA2B1 is a mediator of m(6)A-dependent nuclear RNA processing events. Cell. 162 (6), 1299-1308 (2015).
  17. Paiva, M. M., Kimura, E. T., Coltri, P. P. miR18a and miR19a recruit specific proteins for splicing in thyroid cancer cells. Cancer Genomics and Proteomics. 14 (5), 373-381 (2017).
  18. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  19. Olive, V., et al. miR-19 is a key oncogenic component of mir-17-92. Genes & Development. 23 (24), 2839-2849 (2009).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Khandelia, P., Yap, K., Makeyev, E. V. Streamlined platform for short hairpin RNA interference and transgenesis in cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12799-12804 (2011).
  22. Huelga, S. C., et al. Integrative genome-wide analysis reveals cooperative regulation of alternative splicing by hnRNP proteins. Cell Reports. 1 (2), 167-178 (2012).
  23. Karni, R., et al. The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (3), 185-193 (2007).
  24. Franca, G. S., Vibranovski, M. D., Galante, P. A. Host gene constraints and genomic context impact the expression and evolution of human microRNAs. Nature Communications. 7, 11438 (2016).
  25. Havens, M. A., Reich, A. A., Hastings, M. L. Drosha promotes splicing of a pre-microRNA-like alternative exon. PLoS Genetics. 10 (5), 1004312 (2014).
  26. Grammatikakis, I., Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Posttranslational control of HuR function. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 8 (1), (2017).
  27. Chang, S. H., et al. ELAVL1 regulates alternative splicing of eIF4E transporter to promote postnatal angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18309-18314 (2014).
  28. Huang, Y. H., et al. Delivery of therapeutics targeting the mRNA-binding protein HuR using 3DNA nanocarriers suppresses ovarian tumor growth. Cancer Research. 76 (6), 1549-1559 (2016).
  29. Wang, W., Caldwell, M. C., Lin, S., Furneaux, H., Gorospe, M. HuR regulates cyclin A and cyclin B1 mRNA stability during cell proliferation. The EMBO Journal. 19 (10), 2340-2350 (2000).
  30. Guo, X., Connick, M. C., Vanderhoof, J., Ishak, M. A., Hartley, R. S. MicroRNA-16 modulates HuR regulation of cyclin E1 in breast cancer cells. International Journal of Molecular Sciences. 16 (4), 7112-7132 (2015).

Tags

Kankeronderzoek Nummer 184
Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. … More

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A Reporter Assay to Analyze Intronic microRNA Maturation in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (184), e63498, doi:10.3791/63498 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter