Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Выполнение in vivo и ex vivo электроимпедансной миографии у грызунов

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63513
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Department of Neurology, Harvard Medical School - Beth Israel Deaconess Medical Center, 2Accelerating NeuroVentures, 3Charley's Fund

Summary

В этой статье подробно описано, как выполнить in vivo (с использованием поверхностных и игольчатых электродных массивов) и ex vivo (с использованием диэлектрической ячейки) электроимпедансную миографию на икроножной мышце грызунов. Он продемонстрирует технику как на мышах, так и на крысах и подробно расскажет о доступных модификациях (например, тучных животных, щенках).

Abstract

Электроимпедансная миография (EIM) является удобным методом, который может быть использован в доклинических и клинических исследованиях для оценки здоровья и заболеваний мышечной ткани. EIM получают путем приложения низкоинтенсивного, направленно сфокусированного электрического тока к интересующей мышце в диапазоне частот (т.е. от 1 кГц до 10 МГц) и регистрации результирующих напряжений. Из них получают несколько стандартных компонентов импеданса, включая реактивное сопротивление, сопротивление и фазу. При выполнении измерений ex vivo на иссеченной мышце также могут быть рассчитаны присущие ткани пассивные электрические свойства, а именно проводимость и относительная диэлектрическая проницаемость. EIM широко используется у животных и людей для диагностики и отслеживания мышечных изменений при различных заболеваниях, в связи с простой атрофией неиспользования или в качестве меры терапевтического вмешательства. Клинически EIM предлагает потенциал для отслеживания прогрессирования заболевания с течением времени и оценки воздействия терапевтических вмешательств, тем самым предлагая возможность сократить продолжительность клинических испытаний и уменьшить требования к размеру выборки. Поскольку он может быть выполнен неинвазивно или минимально инвазивно на живых животных моделях, а также на людях, EIM предлагает потенциал для использования в качестве нового трансляционного инструмента, позволяющего как доклинические, так и клинические разработки. В этой статье приведены пошаговые инструкции о том, как выполнять измерения EIM in vivo и ex vivo у мышей и крыс, включая подходы к адаптации методов к конкретным условиям, например, для использования у детенышей или животных с ожирением.

Introduction

Электроимпедансная миография (EIM) обеспечивает мощный метод оценки состояния мышц, потенциально позволяющий диагностировать нервно-мышечные расстройства, отслеживать прогрессирование заболевания и оценивать реакцию на терапию 1,2,3. Он может быть применен аналогично моделям болезней животных и людей, что позволяет относительно беспрепятственно переходить от доклинических к клиническим исследованиям. Измерения EIM легко получены с использованием четырех линейно расположенных электродов, причем два внешних применяют безболезненный, слабый электрический ток в диапазоне частот (обычно от 1 кГц до примерно 2 МГц), а два внутренних регистрируют результирующие напряжения1. Из этих напряжений можно получить импедансные характеристики ткани, включая сопротивление (R), меру того, насколько трудно току проходить через ткань, и реактивность (X) или «зарядоспособность» ткани, меру, связанную со способностью ткани хранить заряд (емкость). Из реактивности и сопротивления фазовый угол (θ) вычисляется с помощью следующего уравнения: Equation 1, обеспечивающего единую суммативную меру импеданса. Такие измерения могут быть получены с помощью любого многочастотного биоимпедансного устройства. Поскольку миофибры по существу являются длинными цилиндрами, мышечная ткань также очень анизотропна, причем ток протекает легче вдоль волокон, чем через них 4,5. Таким образом, EIM часто выполняется в двух направлениях: с массивом, размещенным вдоль волокон таким образом, что ток проходит параллельно им, и поперек мышцы таким, что ток течет перпендикулярно им. Кроме того, при измерениях ex vivo, где известный объем ткани измеряется в измерительной ячейке импеданса, могут быть получены присущие мышце электрические свойства (т.е. проводимость и относительная диэлектрическая проницаемость)6.

Термин «нервно-мышечные расстройства» определяет широкий спектр первичных и вторичных заболеваний, которые приводят к структурным изменениям мышц и дисфункции. Это включает в себя боковой амиотрофический склероз и различные формы мышечной дистрофии, а также более простые изменения, связанные со старением (например, саркопения), атрофию неиспользования (например, из-за длительного постельного режима или микрогравитации) или даже травму7. В то время как причины многочисленны и могут исходить от двигательного нейрона, нервов, нервно-мышечных соединений или самой мышцы, EIM может быть использован для обнаружения ранних изменений в мышцах из-за многих из этих процессов и для отслеживания прогрессирования или ответа на терапию. Например, у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна (МДД) было показано, что EIM обнаруживает прогрессирование заболевания и реакцию на кортикостероиды8. Недавняя работа также показала, что EIM чувствителен к различным состояниям неиспользования, включая фракционную гравитацию9, как это было бы на Луне или Марсе, и эффекты старения10,11. Наконец, применяя алгоритмы прогнозирования и машинного обучения к набору данных, полученным при каждом измерении (многочастотные и зависящие от направления данные), становится возможным вывести гистологические аспекты ткани, включая размер миофибры12,13, воспалительные изменения и отек14, а также содержание соединительной ткани и жира15,16.

Несколько других неинвазивных или минимально инвазивных методов также используются для оценки здоровья мышц у людей и животных, включая игольчатую электромиографию17 и технологии визуализации, такие как магнитно-резонансная томография, компьютерная томография и ультразвук 18,19. Тем не менее, EIM демонстрирует явные преимущества по сравнению с этими технологиями. Например, электромиография регистрирует только активные электрические свойства мембран миофибры, а не пассивные свойства, и, таким образом, не может обеспечить истинную оценку мышечного состава или структуры. В определенном отношении методы визуализации более тесно связаны с EIM, так как они также предоставляют информацию о структуре и составе ткани. Но в некотором смысле они предоставляют слишком много данных, требуя детальной сегментации изображений и экспертного анализа, а не просто предоставления количественного результата. Кроме того, учитывая их сложность, методы визуализации также в значительной степени зависят от специфики как используемого аппаратного, так и программного обеспечения, что в идеале требует использования идентичных систем для сравнения наборов данных. Напротив, тот факт, что EIM намного проще, означает, что он меньше подвержен влиянию этих технических проблем и не требует какой-либо формы обработки изображений или экспертного анализа.

Следующий протокол демонстрирует, как выполнять in vivo EIM у крыс и мышей, используя как неинвазивные (поверхностный массив), так и минимально инвазивные (подкожный игольчатый массив), а также ex vivo EIM на свежеиссеченных мышцах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского центра Бет Исраэль Диаконисс под номерами протокола (031-2019; 025-2019). Носите надлежащее оборудование СИЗ для работы с животными и придерживайтесь руководящих принципов IACUC для всех работ с животными.

1. In vivo поверхность EIM

  1. Поместите животное в бокс для анестезии, чтобы вызвать анестезию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для крыс использовали 1,5%-3,5% изофлурана и 2 O2 л·мин-1 , а для мышей - 2% изофлурана и 1 O2 л·мин-1 .
  2. После полного обезболивания, о чем свидетельствует отсутствие реакции после защемления ноги животного, поместите мышь на скамейку в положение лежа и используйте носовой конус для поддержания анестезии с использованием 1,5% изофлурана и потока кислорода 1 л·мин-1.
  3. Поместите ногу животного для анализа под углом 45° тазобедренным суставом (колено вытянуто) и закрепите стопу медицинской лентой.
  4. Используйте машинку для стрижки волос, чтобы обрезать мех, накладывающийся на икроножную мышцу.
  5. Нанесите толстый слой крема для депиляции на кожу животного и дайте ему постоять в течение 1 мин. Затем используйте насыщенную физиологическим раствором марлю, чтобы удалить средство для депиляции. Повторяйте этот процесс до трех раз, пока не будет удален весь мех, накладывающийся на икроножную мышцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите марлевую прокладку, смоченную в физиологическом растворе, на кожу, когда измерения не получены, чтобы предотвратить обезвоживание кожи.
  6. Подключите поверхностный массив (рисунок 1) к устройству EIM и дайте электродам покоиться на куске марли, смоченной в солевом растворе.
  7. Поместите поверхностный массив непосредственно на кожу над икроножной мышцей, ориентированной продольно к мышечным волокнам.
  8. После проверки подходящего контакта, на который указывают все полосы, появляющиеся зеленым цветом на программном обеспечении, показывающие стабильность значений сопротивления, реактивности и фазы 50 кГц, получите измерения EIM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кривые должны проверяться в режиме реального времени для обеспечения надлежащего сбора данных.
  9. Поверните массив поверхности на 90° и переместите его на кожу над икроножной мышцей, чтобы получить поперечные измерения (проверьте наличие зеленых полос, указывающих на стабильность).
  10. Повторите шаги 1.7, 1.8 и 1.9, чтобы получить в общей сложности четыре измерения на мышцу: два продольных и два поперечных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте средство для депиляции более одного раза (т.е. до трех применений в одном и том же случае) каждые две недели, чтобы предотвратить чрезмерное раздражение кожи и травмы. Важно выполнить измерения в течение примерно 5-10 минут после удаления крема для депиляции, поскольку развитие локализованного отека кожи, вызванного депиляционным агентом, может повлиять на собранные данные импеданса. Восстановление животных происходит сразу после прекращения изофлурановой анестезии, и процедура не требует обезболивающего лечения.

2. In vivo игольчатый массив EIM

  1. Обезболить животное и подготовить ногу, используя ту же процедуру, которая описана в шагах 1.1-1.4. Тем не менее, нет необходимости использовать депиляционное средство при выполнении in vivo EIM с использованием игольчатого массива.
  2. Подключите игольчатый массив (рисунок 2A-F) к устройству EIM и дайте ему отдохнуть в весовой лодке, содержащей солевой раствор. Проверьте возможности подключения и стабильность сигнала (обозначены зелеными полосами).
  3. Продезинфицируйте кожу и иглы спиртом. Поместите игольчатый массив в продольное положение по сравнению с миофибрами и плотно вдавите его в кожу, пока все иглы не проникнут в кожу и нижележащую мышцу до пластиковой защиты на массиве. Получение данных.
  4. Аккуратно извлеките массив и снова вставьте его через кожу и в мышцу под углом 90° относительно первого измерения, в поперечном направлении. Получение данных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании игольчатых массивов измерения следует проводить только один раз в каждом направлении, чтобы уменьшить воздействие игольчатых электродов на кожу и мышечную ткань. При возникновении кровотечения осторожно вытрите кровь перед выполнением второго измерения. Восстановление животных происходит сразу после прекращения изофлурановой анестезии, и процедура не требует обезболивающего лечения.

3. Ex vivo EIM

  1. Подготовьте диэлектрическую ячейку ex vivo (рисунок 2G,H), добавьте солевой раствор в камеру и подключите ячейку к устройству EIM для получения эталонных значений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Значения фазы и реактивного сопротивления физиологического раствора должны оставаться постоянными при нуле или около нуля, а значения сопротивления физиологического раствора должны оставаться постоянными на уровне приблизительно 100 ± 25 Ω в диапазоне частот от 1 кГц до 1 МГц.
  2. Усыплите животное в соответствии с соответствующими руководящими принципами IACUC.
  3. С помощью ножниц отрежьте кожу возле ахиллова сухожилия. Используя пинцет, потяните кожу движением вверх, чтобы раскрыть подлежащие мышцы и фасции. Аккуратно рассекните бицепс бедра, накладывая икроножную мышцу и разрезая седалищный нерв.
  4. Отрежьте ахиллово сухожилие, чтобы освободить дистальный конец икроножных и камбаловидных мышц, и осторожно потяните сухожилие вверх, используя ножницы для удаления любых прикреплений. Как только все насадки будут удалены, с помощью ножниц отрежьте ростральный конец камбаловидной мышцы и удалите его.
  5. Используйте ножницы, чтобы рассечь головки икроножной мышцы вокруг коленной чашечки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления икроножной мышцы важно помнить первоначальную ориентацию миофибров.
  6. Поместите икроножную мышцу на лист зубного воска и разделите ее с помощью лезвия бритвы и линейки, чтобы получить срез 10 мм х 10 мм от центра икроножной мышцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер диэлектрической ячейки может быть настроен. Для крыс использовалась ячейка размером 10 мм x 10 мм, а для мышей — ячейка размером 5 мм x 5 мм.
  7. Используя пинцет, осторожно поместите икроножную мышцу в диэлектрические клетки, убедившись, что волокна ориентированы продольно (т. Е. Каудальные и ростральные конечности должны касаться электродов). Убедитесь, что мышца полностью соприкасается с металлическими электродами.
  8. Прикрепите верхнюю часть диэлектрической ячейки и вставьте две монополярные иглы (26 G) в два отверстия. Подключите провода от устройства EIM к ячейке ex vivo в следующем порядке: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, где I представляет электроды тока, а V представляет электроды напряжения). Приобретите продольное измерение.
  9. Откройте диэлектрическую ячейку и переориентируйте мышцу в поперечном направлении, повернув ее на 90°. Прикрепите верхнюю часть диэлектрической ячейки. Получите поперечное измерение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EIM может быть получен во многих условиях, включая поверхностные массивы in vivo (рисунок 1), игольчатые массивы in vivo (рисунок 2A-F) и диэлектрические элементы ex vivo (рисунок 2G, H).

EIM обеспечивает почти мгновенный снимок состояния мышц на основе измеренных значений импеданса. Измерения производятся быстро и приводят к простому файлу выходных данных, который не требует какого-либо специального программного обеспечения (рисунок 3A). Действительно, любое многочастотное импедансное устройство, предоставляющее данные для отдельных частот, сможет производить стандартный выход .csv, который можно открыть независимо. Система, описанная в этом протоколе, также предоставляет название и условия эксперимента со значениями фазы, реактивности и сопротивления для каждого испытания на каждой измеренной частоте в выходном файле. Для обеспечения воспроизводимости обычно получают и усредняют два испытания продольного (испытания 1 и 3) и поперечного (испытания 2 и 4) значения, которые используются для всех последующих анализов.

При отображении в зависимости от частоты значения EIM приводят к созданию стандартных кривых, которые могут быть проанализированы для обнаружения ложных или загрязненных артефактами данных. Такие неровности обычно связаны с контактными проблемами при измерениях поверхности, что приводит к экстремальным значениям, наблюдаемым на низких частотах (обычно большие положительные или отрицательные значения). Репрезентативные кривые отображаются для фазовых (рисунок 3B), реактивного сопротивления (рисунок 3C) и сопротивления (рисунок 3D) для продольных (синие круги) и поперечных (серые квадраты) измерений. Также показан график, показывающий реактивное сопротивление как функцию сопротивления (график Коула-Коула) как в продольном, так и в поперечном направлениях (рисунок 3E). Этот шаг имеет решающее значение, поскольку он является частью проверки данных, что позволяет легко обнаруживать ложные или загрязненные артефактами данные. Если обнаружен чрезмерный артефакт (обычно из-за плохого контакта между поверхностным массивом и кожей), то можно выполнить несколько процедур для улучшения контакта. К ним относятся нанесение дополнительного крема для депиляции, увлажнение кожи в течение примерно 1 мин солевой промокшей марлевой прокладкой или мягкое надавливание на электродный массив. Как правило, простой процесс повторения измерения несколько раз также поможет решить эту проблему.

Измерения EIM отражают реакцию мышечной ткани на электрический ток в широком диапазоне частот, каждая из которых нацелена на различные структуры. Например, низкие частоты (т.е. 5 кГц) не проникают через мембрану миофибры, обеспечивая тем самым анализ внеклеточных признаков, которые могут быть использованы для обнаружения воспаления и инфильтрации нейтрофилов14. Напротив, высокие частоты (>1 МГц) могут проникать в клеточные мембраны и, следовательно, опрашивать как внутриклеточные, так и внеклеточные пространства и использовались для дифференцировки мышечных волокон типа1.

Figure 1
Рисунок 1: Массив поверхностей, напечатанный на 3D-принтере. Фотографии поверхностного массива, который был напечатан на 3D-принтере для получения измерений поверхностного импеданса (как продольных, так и поперечных) у мышей in vivo. (A) Фотография, показывающая поверхностный массив, подключенный к устройству сбора. B) крупный план поверхностной решетки, показывающий колесо, используемое для поворота массива на 90° для получения как продольных, так и поперечных измерений. (C) Крупный план поверхностных электродов. Поверхностные электроды имеют следующие характеристики: ширина электродов = 0,5 мм, длина наружных электродов = 4 мм, длина внутренних электродов = 3 мм и расстояние между электродами = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Другие массивы, которые могут быть использованы для размещения конкретных экспериментальных проектов. Фотографии: (А) игольчатого массива, используемого для крыс и покрытого (с использованием неметаллического лака для ногтей) для уменьшения вклада подкожного жира (пространство 2 мм, глубина 4 мм, покрытие 2 мм); (B) игольчатый массив с расстоянием 2 мм и глубиной 4 мм; (C) игольчатый массив с расстоянием 2 мм и глубиной 3 мм; (D) игольчатый массив с расстоянием 2 мм и глубиной 2 мм; (E) игольчатый массив для мелких животных и детенышей с расстоянием 1 мм и глубиной 2 мм; (F) игольчатый массив с расстоянием 1 мм и глубиной 1 мм; (G) диэлектрическая ячейка ex vivo , предназначенная для мышц взрослой мыши (5 мм x 5 мм); и (H) диэлектрическая ячейка ex vivo , предназначенная для мышц крыс (10 мм x 10 мм). Модификации (результаты не представлены здесь) для получения измерений на животных с ожирением (т.е. мыши ob/ob или db/db) могут быть выполнены путем увеличения длины иглы, добавления непроводящего покрытия и увеличения/уменьшения расстояния между иглами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Вывод данных и репрезентативные кривые, полученные у мышей с поверхностью in vivo EIM в продольном (синем) и поперечном (серый) направлениях. (A) Выходной файл в .csv формате, полученный после получения двух продольных (измерения 1 и 3, окрашены в синий цвет) и двух поперечных (измерения 2 и 4, окрашенные в серый) измерений EIM in vivo . Значения указаны для каждой частоты (колонка А). Анализы проводятся впоследствии с использованием среднего значения продольных и поперечных измерений соответственно. Информация, найденная в ячейках A1:B4, заполняется автоматически программным обеспечением в соответствии с метками, выбранными при получении EIM. Репрезентативные кривые как для продольных (синие круги), так и для поперечных (серые квадраты) значений фазы (B), реактивности (C) и сопротивления (D) в зависимости от частоты. В соответствии со стандартной практикой в поле импеданса, ось X указывается с помощью логарифмической шкалы. Е) репрезентативные кривые реактивного сопротивления как для продольных, так и для поперечных измерений. LP: продольная фаза; ТП: поперечная фаза; LX: продольное реактивное сопротивление; TX: поперечное сопротивление; LR: продольное сопротивление; и TR: поперечное сопротивление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В данной статье приведены основные методы проведения EIM у грызунов, как in vivo , так и ex vivo. Для получения надежных измерений крайне важно выполнить ряд шагов. Во-первых, нужно правильно определить интересующую мышцу, так как каждая мышца будет иметь разные реакции на заболевания, лечение и патологию. Следует помнить, что данные, полученные на одной мышце (например, икроножной мышце), не будут предоставлять ту же информацию, что и на другой мышце (например, передней большеберцовой кости). Во-вторых, нужно тщательно выбрать лучший электродный массив для выполнения измерений импеданса. Хотя каждый тип массива имеет как преимущества, так и недостатки, важно выбрать массив, который будет соответствовать экспериментальному дизайну, принимая во внимание прогрессирование заболевания и влияние на анатомию (например, тяжелая атрофия). Наконец, EIM позволяет исследователям собирать невероятное количество данных за несколько секунд, но контроль качества должен быть выполнен должным образом, чтобы обеспечить отсутствие артефактов.

Система EIM легко настраивается на нескольких уровнях. Хотя используемая здесь система была разработана для сбора клинических и доклинических данных, для этой цели можно использовать любую многочастотную систему измерения импеданса, если она предоставляет индивидуальные частотные данные. Как правило, импедансные системы обеспечивают стандартную .csv файла в качестве выходных данных. Аналогичным образом, могут быть сделаны дополнительные изменения в отношении массивов, так как все, что действительно требуется, это четыре электрода, размещенных в линии. Например, в этом протоколе для выполнения требований использовались различные изготовленные на заказ электроды, но массивы могут быть адаптированы к индивидуальным потребностям с использованием простых (например, эпоксидный клей, подкожные иглы) или сложных (например, 3D-принтеры) инструментов. Альтернативно, четыре электрода могут быть объединены в одну иглу, как описано ранее20. В нашей лаборатории массивы были разработаны для детенышей путем уменьшения расстояния между электродами, чтобы гарантировать, что небольшие мышцы могут быть измерены как в продольном, так и в поперечном направлениях. При работе с тучными животными, которые имеют значительно больший слой подкожно-жировой клетчатки, рекомендуется использование частично покрытых игольчатых электродов. Это позволяет увеличить вклад мышечной ткани в измерение импеданса при одновременном снижении вклада жировой ткани21.

В то время как методы игл и поверхностные методы могут использоваться как у крыс, так и у мышей, как описано и продемонстрировано, обычно рекомендуется использовать измерения иглы у крыс, поскольку они быстрее, поскольку они не требуют усилий для подготовки кожи. Кроме того, их больший размер означает, что игольчатые электроды лишь минимально травмируют мышцу. У мышей, учитывая их небольшой размер, поверхностные измерения рекомендуются, чтобы избежать повреждения мышц и учитывая, что подготовка кожи относительно проста и быстра.

Каждый метод EIM имеет свой собственный набор ограничений. Ключевым ограничением является то, что электродные массивы не легко доступны у поставщиков, а вместо этого требуют индивидуальной генерации в лаборатории. Чтобы помочь новым исследователям, этот протокол включает в себя измерения для нескольких массивов (как ручной работы, так и 3D-печати), и авторы предоставят пользовательские массивы или сделают соответствующие файлы CAD доступными по запросу. Как упоминалось ранее, качество данных имеет решающее значение, и дополнительные проблемы могут повлиять на качество данных для каждого из типов измерений (например, поверхность, игла и ex vivo). Для хороших поверхностных данных необходимо полностью удалить волосы, а также, вероятно, роговой слой кожи, чтобы получить наилучшие результаты с минимальным контактным артефактом. Тем не менее, использование средства для депиляции также означает, что кожа будет медленно становиться отечной с течением времени, поэтому необходимо быстро завершить измерения импеданса после удаления волос. Ожидание 10 минут или дольше может дать значительно отличающиеся значения по сравнению с выполнением измерений в течение минуты или двух после удаления волос. Измерения игольчатого массива у крыс или мышей обычно вызывают, по крайней мере, небольшое количество кровотечения, которое может повлиять на показания, если оно превратится в более крупную гематому вокруг вставленных игл. Наконец, измерения ex vivo требуют особой осторожности, чтобы гарантировать, что мышечные волокна в диэлектрической ячейке точно выровнены по отношению к металлическим пластинам. Наконец, у маленьких или больных мышей может быть невозможно получить поперечные измерения, учитывая небольшой размер мышц. Но, как отмечалось выше, остается возможным разработать пользовательские 4-электродные решетки, которые могут быть достаточно маленькими, чтобы проводить продольные измерения даже в самых маленьких мышцах.

Анализ данных может быть довольно простым - например, путем измерения одного выхода (например, фазы) на одной частоте (например, 50 кГц) в одном направлении (например, продольном) - или довольно сложным, путем включения всех параметров импеданса во всем частотном спектре как в продольном, так и в поперечном направлениях. Когда используются значения одночастотного импеданса, они обычно находятся в диапазоне 30-100 кГц, поскольку мышца имеет тенденцию быть наиболее реактивной (т.е. наиболее «заряжаемой») в этом диапазоне частот. Однако также использовались конденсированные или свернутые параметры, которые пытаются уловить форму частотного спектра. Эти значения включали наклоны линейных соответствий сопротивления, реактивного сопротивления и фазовых данных22 и 2-частотных соотношений23. Альтернативно, параметры Коула-Коула могут быть рассчитаны на основе припадков данных импеданса, включая R0 (определение сопротивления на нулевойчастоте), R inf (определение сопротивления на бесконечной частоте) и fc (центральная частота)24,25,26,27. Наконец, машинное обучение можно использовать для анализа всех данных сразу и улучшения прогностических моделей, как для регрессии 12,13,15,16, так и для классификации.

Несмотря на эти ограничения, EIM является мощным и относительно простым инструментом для оценки нескольких аспектов здоровья мышц. В то время как основное внимание в этой рукописи уделяется одной мышце (икроножной мышце), ничто не препятствует использованию EIM на других поверхностных мышцах (например, квадрицепсах или бицепсах плечевых) с использованием поверхностных электродов или более глубоких мышц с использованием массива игольчатых электродов. Действительно, у людей эта техника использовалась в самых разных мышцах, включая мышцы верхних и нижних конечностей 8,28, а также осевые мышцы (например, параспинальные мышцы и мышцы живота)29,30.

Было показано, что EIM обеспечивает надежные показатели в отношении прогрессирования заболевания, ремиссии атрофии и лечения с течением времени. Одночастотные данные могут быть вполне достаточными для оценки состояния заболевания с течением времени31; тем не менее ценность многочастотных данных заключается в том, что они все еще могут помочь оценить качество измерения, как описано выше. Одночастотные данные в изоляции могут быть существенно загрязнены контактными артефактами, и это не было бы очевидно без обзора всего спектра импеданса. В клинических исследованиях поверхностный EIM может часто использоваться для получения безболезненных измерений, что делает его простым инструментом для нанесения32. Это обилие данных может иметь решающее значение для более деликатного отслеживания прогрессирования заболевания. Более того, добавление EIM к клиническим протоколам может значительно сократить количество участников, необходимых во время клинического исследования 28,31.

EIM находит все большее применение в оценке различных нервно-мышечных состояний у людей. Соответственно, способность эффективно выполнять технику на грызунах помогает расширить потенциальную практическую ценность технологии, а также улучшить наше понимание взаимосвязи между различными выходами EIM и базовой гистологией. Методика, как правило, проста в использовании и вместе с полезными количественными данными, которые она предоставляет, заслуживает включения в стандартный арсенал инструментов для оценки нервных и мышечных расстройств в моделях болезни грызунов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

С. Б. Рутков имеет участие и выступает в качестве консультанта и научного консультанта Myolex, Inc., компании, которая разрабатывает импедансные устройства для клинического и исследовательского использования, а также систему mView, используемую здесь. Он также является членом Совета директоров компании. Компания также имеет возможность лицензировать запатентованную импедансную технологию, изобретателем которой назван С. Б. Рутков. Другие авторы не имеют никаких других соответствующих связей или финансового участия с какой-либо организацией или учреждением, имеющим финансовый интерес или финансовый конфликт с предметом или материалами, обсуждаемыми в рукописи, кроме раскрытых.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фондом Чарли и NIH R01NS055099.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Printer Formlabs Inc. Form 2 Desktop 3D printer
3D Printer Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD Creality Ender 3 V2 3D printer
3M Micropore surgical tape Fisher 19-027761 and 19-061655 models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape Fisher 18-999-380 and 18-999-381 models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing Digi-Key (Sullins connector solution) S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators Fisher 22-363-172
Dental Wax Fisher NC9377103
Depilatory agent NAIR NA hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps Fine Science Tools No. 11270-20 Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper Fisher 14-648-17 Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life Devcon series 14265, model 2217 Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell Custom NA Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps Fine Science Tools No. 11051-10 Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper Amazon NA Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device Myolex EIM1103 mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays Custom NA Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array Custom NA The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane Patterson Veterinary Supplies 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze Fisher 22-028-559 2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes Fisher S67090A Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades Fisher 12-640 Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors Fine Science Tools No. 91460-11 Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline Ambu 745 12-50/24 Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp Fine Science Tools No. 14002-13 Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes Natus 902-DMG50-S 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution Fisher S5815 1000 mL sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
  2. Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
  3. Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
  4. Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
  5. Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
  6. Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
  7. Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
  8. Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
  9. Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
  10. Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
  11. Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
  12. Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
  13. Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
  14. Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
  15. Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
  16. Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
  17. Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
  18. Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
  19. Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
  20. Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
  21. Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
  22. Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
  23. Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
  24. Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
  25. Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
  26. Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
  27. Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
  28. Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
  29. Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
  30. Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
  31. Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
  32. Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).

Tags

Биология Выпуск 184 Сопротивление мышцы мыши крысы миография анизотропия биомаркер
Выполнение <em>in vivo</em> и <em>ex vivo</em> электроимпедансной миографии у грызунов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mortreux, M., Nagy, J. A., Zhong,… More

Mortreux, M., Nagy, J. A., Zhong, H., Sung, D. M., Concepcion, H. A., Leitner, M., Dalle Pazze, L., Rutkove, S. B. Performing In Vivo and Ex Vivo Electrical Impedance Myography in Rodents. J. Vis. Exp. (184), e63513, doi:10.3791/63513 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter