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मानकीकरण और बायोमेडिकल अनुसंधान में उपयोग के लिए 3 डी कैनाइन हेपेटिक और आंतों के Organoid संस्कृतियों के रखरखाव

Published: January 31, 2022 doi: 10.3791/63515
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 2, 2, 4, 4, 1,3, 2,3
1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

Summary

3 डी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए कैनाइन आंतों और यकृत ऊतकों से वयस्क स्टेम कोशिकाओं की कटाई के लिए प्रयोगात्मक तरीकों का वर्णन किया गया है। इसके अलावा, लगातार विकास सुनिश्चित करने और फसल, बायोबैंक, और कैनाइन आंतों और यकृत ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को पुनर्जीवित करने के लिए मानक संचालन प्रक्रियाएं प्रदान करने के लिए प्रयोगशाला तकनीकों पर चर्चा की जाती है।

Abstract

कुत्तों में मनुष्यों के अनुरूप जटिल मल्टीफैक्टोरियल बीमारियां विकसित होती हैं, जिनमें भड़काऊ रोग, चयापचय रोग और कैंसर शामिल हैं। इसलिए, वे मानव चिकित्सा के लिए ट्रांसलेशनल क्षमता के साथ प्रासंगिक बड़े पशु मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ऑर्गेनोइड्स 3-आयामी (3 डी), स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न स्व-इकट्ठे संरचनाएं हैं जो उनके मूल अंग के माइक्रोएनाटॉमी और शरीर विज्ञान की नकल करती हैं। इन ट्रांसलेशनल इन विट्रो मॉडल का उपयोग दवा पारगम्यता और खोज अनुप्रयोगों, विष विज्ञान मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है, और मल्टीफैक्टोरियल पुरानी बीमारियों के पैथोफिजियोलॉजी की यांत्रिक समझ प्रदान करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, कैनाइन ऑर्गेनोइड्स साथी कुत्तों के जीवन को बढ़ा सकते हैं, पशु चिकित्सा अनुसंधान के विभिन्न क्षेत्रों में इनपुट प्रदान कर सकते हैं और पशु चिकित्सा में व्यक्तिगत उपचार अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। दाताओं का एक छोटा समूह ऑर्गेनोइड नमूनों का एक बायोबैंक बना सकता है, जिससे निरंतर ऊतक कटाई की आवश्यकता कम हो जाती है, क्योंकि ऑर्गेनोइड सेल लाइनों को अनिश्चित काल तक उप-सुसंस्कृत किया जा सकता है। इसमें, तीन प्रोटोकॉल जो वयस्क स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न आंतों और यकृत कैनाइन ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति पर ध्यान केंद्रित करते हैं, प्रस्तुत किए जाते हैं। कैनाइन ऑर्गेनोइड आइसोलेशन प्रोटोकॉल ऊतक को संसाधित करने और एक सहायक मैट्रिक्स (घुलनशील बाह्य कोशिकीय झिल्ली मैट्रिक्स) में सेल आइसोलेट के एम्बेडिंग के तरीकों को रेखांकित करता है। कैनाइन ऑर्गेनोइड रखरखाव प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड विकास और रखरखाव का वर्णन करता है, जिसमें विस्तार के लिए उचित समय के साथ सफाई और पासिंग शामिल है। ऑर्गेनोइड हार्वेस्टिंग और बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल आगे के विश्लेषण के लिए ऑर्गेनोइड्स को निकालने, फ्रीज करने और संरक्षित करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Introduction

कृन्तक बायोमेडिकल और ट्रांसलेशनल रिसर्च 1 के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले पशु मॉडल हैं। वे बीमारियों के बुनियादी आणविक रोगजनन की जांच के लिए असाधारण रूप से उपयोगी हैं, हालांकि पुरानी मल्टीफैक्टोरियल बीमारियों के लिए उनकी नैदानिक प्रासंगिकता पर हाल ही में सवाल उठाया गया है2। कैनाइन मॉडल कृन्तकों 3,4 की तुलना में कई फायदे प्रदर्शित करता है। कुत्तों और मनुष्यों को मेटाबोलोमिक्स और आंतों के माइक्रोबायोम में समानताएं साझा होती हैं जो उनके पालतू जानवरों की विभिन्न अवधियों में मानव आहार की खपत के कारण विकसित होती हैं5,6,7। कैनाइन और मानव जठरांत्र संबंधी शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान के बीच समानताएं उदाहरणों में से एक हैं8।

इसके अतिरिक्त, कुत्ते अक्सर अपने मालिकों के साथ समान वातावरण और जीवन शैली साझा करते हैं। कृन्तकों की तुलना में कुत्तों का लंबा जीवनकाल कई पुरानी स्थितियों के प्राकृतिक विकास के लिए अनुमति देता है10। सूजन आंत्र रोग या चयापचय सिंड्रोम multifactorial पुरानी बीमारियों के उदाहरण हैं जो मनुष्यों और कुत्तों के बीच महत्वपूर्ण समानताएं साझा करते हैं11,12। कैनाइन प्रीक्लिनिकल परीक्षण जो स्वाभाविक रूप से होने वाली बीमारियों के साथ कुत्तों को शामिल करते हैं, कृंतक मॉडल 13 से प्राप्त लोगों की तुलना में अधिक विश्वसनीय डेटा उत्पन्न कर सकते हैं। हालांकि, जीवित पशु अनुसंधान के उपयोग को कम करने और 3Rs (Reduce, Refine, Replace) 14 के सिद्धांतों का पालन करने के लिए, 3 D इन विट्रो कैनाइन ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके विवो परीक्षण में विकल्प उभरे हैं15।

ऑर्गेनोइड्स स्व-इकट्ठे 3 डी स्टेम सेल-व्युत्पन्न संरचनाएं हैं जो अपने मूल अंगों के शरीर विज्ञान और माइक्रोएनाटॉमी को दोहराती हैं16,17। इस तकनीक को पहली बार 200917 में सातो एट अल द्वारा वर्णित किया गया था और उपकला सेल लाइनों में विट्रो अध्ययनों में अधिक अनुवाद योग्य के लिए अनुमति दी गई थी, जो पहले 2 डी कैंसर सेल संस्कृतियों 18,19,20 का उपयोग करके संभव था। Organoids कई बायोमेडिकल विषयों में विट्रो मॉडल में उपयोगी हैं जैसे कि प्रीक्लिनिकल टॉक्सिकोलॉजिकल 21,22,23, अवशोषण, या चयापचय अध्ययन24,25,26,27,28, साथ ही साथ व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण 29,30,31 में . कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड्स की सफल संस्कृति को 201912 में पहली बार वर्णित किया गया है, जबकि कुत्ते से व्युत्पन्न यकृत ऑर्गेनोइड्स को पहली बार 201532 में नंटासैंटी एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था। कैनाइन ऑर्गेनोइड्स का उपयोग कैनाइन क्रोनिक एंटरोपैथी, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्ट्रोमल ट्यूमर, कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा 12 और विल्सन रोग 33,34 की जांच करने वाले अध्ययनों में सफलतापूर्वक किया गया है।

जबकि वयस्क स्टेम कोशिकाओं को necropsies के माध्यम से काटा जा सकता है, ऑर्गेनोइड तकनीक को हमेशा जानवरों के बलिदान की आवश्यकता नहीं होती है। एंडोस्कोपिक और लेप्रोस्कोपिक बायोप्सी, या यहां तक कि अंगों के ठीक-सुई एस्पिरेट्स 35, उपकला ऑर्गेनोइड अलगाव 12 के लिए वयस्क स्टेम कोशिकाओं का एक व्यवहार्य स्रोत हैं। पशु चिकित्सा अभ्यास में इस तरह की गैर-आक्रामक तकनीकों का व्यापक उपयोग रिवर्स ट्रांसलेशनल अनुसंधान (पशु चिकित्सा नैदानिक अभ्यास से मानव नैदानिक अभ्यास और इसके विपरीत जानकारी का अनुवाद) के लिए विकल्पों की सुविधा प्रदान करता है। ऑर्गेनोइड प्रौद्योगिकी की आगे की प्रगति को ऑर्गेनोइड संस्कृति और रखरखाव विधियों के मानकीकरण द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल आंशिक रूप से 201536 से सक्सेना एट अल के पहले प्रकाशित काम पर आधारित है, और विधियों को कैनाइन आंतों और यकृत ऑर्गेनोइड संस्कृति की बारीकियों को फिट करने के लिए अनुकूलित किया गया था। कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल के समग्र वर्कफ़्लो को चित्र 1 में दर्शाया गया है।

कैनाइन ऑर्गेनोइड आइसोलेशन प्रोटोकॉल एंडोस्कोपिक, लेप्रोस्कोपिक और सर्जिकल बायोप्सी, साथ ही नेक्रोप्सी से नमूने प्राप्त करने के तरीकों का परिचय देता है। यह ऊतक के नमूनों और प्रयोगशाला में परिवहन के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों के प्रारंभिक पूर्व-उपचार की रूपरेखा तैयार करता है। ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए आवश्यक सामग्री और अभिकर्मकों को 'अलगाव की तैयारी' अनुभाग में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। ऊतक के नमूनों से वयस्क स्टेम सेल अलगाव की प्रक्रिया को आगे विस्तार से वर्णित किया गया है। अंत में, एक घुलनशील बाह्य कोशिकीय झिल्ली मैट्रिक्स का उपयोग करके गुंबद जैसी संरचनाओं में ऑर्गेनोइड्स चढ़ाना की प्रक्रिया पर चर्चा की जाती है।

दूसरा प्रोटोकॉल, कैनाइन ऑर्गेनोइड रखरखाव प्रोटोकॉल, ऑर्गेनोइड्स के दस्तावेजीकरण और खेती के तरीकों का वर्णन करता है। मीडिया परिवर्तन और उनकी आवृत्ति पर इस अनुभाग में चर्चा की गई है। इसके अलावा, प्रयोगशाला प्रक्रियाओं जैसे कि कोशिका संस्कृतियों को पास करना और साफ करना, जो 3 डी कैनाइन ऑर्गेनोइड्स के सफल रखरखाव को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं, का वर्णन किया गया है। उपयुक्त पासिंग प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम है, और इस चरण के संभावित समायोजन और समस्या निवारण पर पांडुलिपि में आगे चर्चा की गई है।

अंतिम प्रोटोकॉल कैनाइन ऑर्गेनोइड हार्वेस्टिंग और बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल है जिसमें पैराफिन-एम्बेडिंग और आरएनए संरक्षण के लिए पूर्ण विकसित ऑर्गेनोइड्स तैयार करने के तरीके शामिल हैं। तरल नाइट्रोजन भंडारण में बायोबैंकिंग ऑर्गेनोइड नमूनों के तरीकों का भी यहां वर्णन किया गया है। अंत में, जमे हुए नमूनों को पिघलाने और उनके विकास का समर्थन करने के तरीकों पर चर्चा की जाती है।

अंत में, इस लेख का उद्देश्य अंतर-प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के मानकीकरण के माध्यम से सुसंगत कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति प्रक्रियाएं प्रदान करना है। ऐसा करने में, पांडुलिपि का उद्देश्य कैनाइन ऑर्गेनोइड मॉडल से प्राप्त डेटा की पुनरुत्पादकता को सुविधाजनक बनाना है ताकि ट्रांसलेशनल बायोमेडिकल रिसर्च में उनकी प्रासंगिकता को बढ़ाया जा सके।

Figure 1
चित्रा 1: कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो. कैनाइन ऑर्गेनोइड आइसोलेशन प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड अलगाव के लिए आवश्यक सामग्रियों की तैयारी का वर्णन करता है, एक ऊतक के नमूने की कटाई (नेक्रोप्सी, एंडोस्कोपिक, लेप्रोस्कोपिक और सर्जिकल बायोप्सी के माध्यम से), और सेलुलर आबादी के सेल पृथक्करण और चढ़ाना पर मार्गदर्शन। कैनाइन ऑर्गेनोइड रखरखाव प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड संस्कृति की सफाई और पासिंग पर चर्चा करता है। ऑर्गेनोइड हार्वेस्टिंग और बायोबैंकिंग प्रोटोकॉल पैराफिन-एम्बेडिंग और आगे ऑर्गेनोइड लक्षण वर्णन के लिए ऑर्गेनोइड नमूनों की तैयारी पर चर्चा करता है। बायोबैंक ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के तरीकों और तरल नाइट्रोजन में भंडारण से उन्हें पुनर्जीवित करने के तरीकों पर भी चर्चा की जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Protocol

अनुसंधान को अनुमोदित किया गया था और आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी (आईएसीयूसी -19-337) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुपालन में किया गया था; IACUC-18-065; IACUC-19-017)।

नोट:: निम्न अनुभाग (चरण 1-3) कैनाइन Organoid अलगाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

1. अलगाव के लिए तैयारी

  1. परिवहन ट्यूब: ऑर्गेनोइड अलगाव से पहले (आमतौर पर 24 घंटे पहले), डुलबेको के संशोधित ईगल मध्यम / पोषक तत्व मिश्रण एफ -12 (उन्नत डीएमईएम / एफ 12) के 10 मिलीलीटर के साथ एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब भरें जो पेन स्ट्रेप के 0.2 मिलीलीटर से समृद्ध है।
  2. लेप्रोस्कोपिक, चीरा, या उच्छेदन बायोप्सी के लिए, तीन अतिरिक्त 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। इन ट्यूबों को पूर्ण चेलेटिंग समाधान के 10 मिलीलीटर के साथ भरें (1x CCS; तालिका 1 देखें)।
    नोट: चरण 1.2 के लिए, फॉस्फेट बफ़र्ड सेलाइन (PBS) में 2 mM N-Acetylcysteine (NAC) का उपयोग स्टेम सेल हार्वेस्टिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पारंपरिक समाधान के रूप में भी किया जा सकता है। पीबीएस में 1x सीसीएस या एनएसी का उपयोग करते समय कोई अंतर नहीं देखा गया था। समाधान में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए दोनों समाधान जोड़े जाते हैं।
  3. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को रखें और प्रोटोकॉल के शेष के लिए बर्फ पर ट्यूबों का परिवहन करें।
  4. 1x CCS के 5 mL के साथ पांच 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, 1x CCS के 3 mL के साथ एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, एक खाली 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब (supernatant ट्यूब), और 1x CCS के 5 mL और भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के 2 mL के साथ एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
    नोट: उपरोक्त अलगाव के दिन से पहले तैयार किया जा सकता है यदि कई नमूनों को संसाधित किया जाएगा। उदाहरण के लिए, चित्र 2 में अलगाव ट्यूब लेआउट देखें।
  5. अलगाव के दिन, जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक पेट्री डिश, स्केलपेल, बर्फ की बाल्टी, और ठंडे उन्नत डीएमईएम / एफ 12 तैयार करें। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) में 24-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेटों की आवश्यक संख्या को पूर्व-गर्म करने के लिए रखें।
  6. पिघलने के लिए बर्फ पर घुलनशील बाह्य कोशिकीय झिल्ली मैट्रिक्स (ईसीएम; सामग्री की तालिका देखें) रखें।
    नोट: बर्फ में डूबने से तेजी से पिघलने से बचाता है और ठोसीकरण से बचने में मदद करता है। सोल्यूबिलाइज्ड ईसीएम को चढ़ाना में सहायता करने के लिए पिपेट युक्तियों का एक बॉक्स फ्रीजर में रखा जा सकता है।
  7. Prechill 4 डिग्री सेल्सियस करने के लिए एक सेंट्रीफ्यूज.
  8. विकास कारकों "CMGF +" या "organoid मीडिया" (संरचना के लिए तालिका 1 देखें) फ्रीजर / रेफ्रिजरेटर से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान के लिए के साथ पूरा मीडिया ले जाएँ। जब संभव हो तो सीधे प्रकाश जोखिम से बचें।

Figure 2
चित्रा 2: अलगाव ट्यूब लेआउट. ऊतक कटाई के लिए अनुशंसित सेटअप में 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में उन्नत डीएमईएम / एफ 12 के 10 एमएल और पेन स्ट्रेप के 0.2 एमएल शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सर्जिकल बायोप्सी या नेक्रोप्सी के लिए 1x CCS के 10 mL से भरे तीन 50 mL ट्यूबों की आवश्यकता होती है। अलगाव चरणों के लिए अनुशंसित ट्यूब लेआउट में सीसीएस धोने के चरणों के दौरान उपयोग किए जाने वाले 1x सीसीएस के 5 एमएल वाले पांच ट्यूब शामिल हैं। पहली ट्यूब का उपयोग एक नमूना ट्यूब के रूप में किया जाता है जिसमें कीमा बनाया हुआ ऊतक होता है, और शेष ट्यूब पहली ट्यूब में जोड़े जाने के लिए 1x CCS के जलाशयों के रूप में कार्य करते हैं। छठी ट्यूब में 6-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित होने पर नमूना ट्यूब से शेष ऊतक को फ्लश करने के लिए 1x CCS के 3 मिलीलीटर होते हैं। इन छह ट्यूबों का उपयोग ईडीटीए इनक्यूबेशन कदम से पहले किया जाएगा। 1x CCS के 5 mL और FBS के 2 mL के साथ एक ट्यूब EDTA इनक्यूबेशन के बाद एक नमूना ट्यूब के रूप में कार्य करता है, और इस ट्यूब से supernatant स्टेम कोशिकाओं के साथ अलगाव के बाकी हिस्सों के लिए एक खाली ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है। अलगाव शुरू करने से पहले ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. ऊतक कटाई

  1. आंतों के एंडोस्कोपिक, और लेप्रोस्कोपिक बायोप्सी (व्यास 2.8 मिमी) को बड़े बायोप्सी संदंश का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। आंतों की साइट के प्रति कम से कम आठ एंडोस्कोपिक नमूनों की कटाई करें।
  2. सीधे परिवहन ट्यूबों में नमूने ले लीजिए और उन्हें बर्फ पर जगह.
  3. सर्जिकल बायोप्सी और necropsies के लिए, 0.5 सेमी x 0.5 सेमी के आकार के साथ ऊतक टुकड़ों की कटाई और उन्हें पहले 1x CCS ट्यूब में जगह।
    नोट: आंतों की बायोप्सी के लिए, किसी भी शेष आंतों की सामग्री को हटा दें और विली को हटाने के लिए एक स्केलपेल के साथ म्यूकोसल परत को स्क्रैप करें। यदि नमूने भरपूर मात्रा में हैं, तो अतिरिक्त बायोप्सी को क्रायोवियल्स में एकत्र किया जा सकता है जिसमें आरएनए स्टोरेज अभिकर्मक (1 एमएल) या पैराफिन-एम्बेडेड होते हैं जो ऑर्गेनोइड्स और उनके मूल के ऊतकों के बीच भविष्य की तुलना के लिए होते हैं। टीईएम विश्लेषण के लिए बायोप्सी लेने के मामले में, विली को स्क्रैप न करें और परिरक्षक (3% पैराफॉर्मेल्डिहाइड और फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) में 3% ग्लूटाराल्डिहाइड) में नमूना स्टोर न करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. ~ 30 s के लिए 1x CCS ट्यूब को जोरदार रूप से हिलाएं, और फिर संदंश का उपयोग करके नमूने को एक नए 1x CCS ट्यूब में स्थानांतरित करें। इस प्रक्रिया को दो बार दोहराएं।
  5. पिछले 1x CCS ट्यूब से परिवहन ट्यूब (उन्नत DMEM / F12 + पेन Strep) के लिए नमूना हस्तांतरण और प्रयोगशाला के लिए नमूना वापस लाने के लिए।
    नोट: इस तरह से पूर्व-इलाज किए गए नमूनों को बर्फ पर रात भर भी भेजा जा सकता है (सूखी बर्फ पर जहाज न करें)।

3. ऑर्गेनोइड अलगाव

नोट: एक biosafety कैबिनेट में एसेप्टिक तकनीकों का उपयोग कर अलगाव प्रदर्शन। कैनाइन ऑर्गेनोइड अलगाव वर्कफ़्लो के लिए चित्र 3 देखें.

  1. ~ 30 s के लिए परिवहन ट्यूब में ऊतक के नमूने को हिलाएं और अत्यधिक supernatant को हटा दें जब तक कि तरल पदार्थ की सतह के पास धीमी गति से पिपेटिंग करके ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर नहीं छोड़ा जाता है। सुनिश्चित करें कि किसी भी ऊतक को त्यागने के लिए नहीं।
  2. स्थानांतरण ऊतक और शेष supernatant एक बाँझ पेट्री पकवान के लिए. डिस्पोजेबल स्केलपेल (या स्टरलाइज्ड संदंश और कैंची) का उपयोग करके, ऊतक को छोटे टुकड़ों (1 मिमी 2 का आकार) में काट और कीमा बनाते हैं, जो लगभग 5 मिनट के लिए मैश स्थिरता जैसा दिखता है।
  3. पहले सीसीएस ट्यूब के लिए पेट्री डिश से तरल के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक pipet. पेट्री डिश में उन्नत DMEM / F12 के 2 एमएल जोड़ें, शेष ऊतक फ्लश करें, और पहले सीसीएस ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  4. भंवर 5 s के लिए 1x CCS ट्यूब लगभग पांच बार. बायोप्सी को 15 एमएल ट्यूब (लगभग 1 मिनट) के तल पर बसने की अनुमति दें और सुपरनेटेंट को तब तक हटा दें जब तक कि ट्यूब में 5 एमएल न बचे हों। नमूना ट्यूब के लिए नई ट्यूब से 1x CCS स्थानांतरण.
  5. अगले दो ट्यूबों के लिए पिछले चरण को दोहराएँ। अंतिम दो washes पर, supernatant नीचे 3 मिलीलीटर ट्यूब में शेष करने के लिए निकालें।
  6. बायोप्सी और 1x CCS नमूना ट्यूब से एक 6 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं के लिए स्थानांतरण. फिर, नमूना ट्यूब में 1x CCS के 3 मिलीलीटर जोड़ें, किसी भी शेष ऊतक को इकट्ठा करने के लिए धीरे से घुमाएं, और प्लेट के एक ही कुएं में स्थानांतरित करें।
  7. 0.5 M EDTA के 150 μL जोड़ें (एक कुएं में 6.15 mL की कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए)। 6-अच्छी तरह से प्लेट को 20 डिग्री पर रखें, 24-rpm nutating मिक्सर / रॉकर 4 डिग्री सेल्सियस पर। 10 मिनट के लिए जिगर के नमूनों और चलती रॉकर पर 1 घंटे के लिए आंतों के नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  8. 6-अच्छी तरह से प्लेट को जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस ले जाएं। कीमा बनाया हुआ ऊतक और तरल को 1x CCS / FBS ट्यूब में स्थानांतरित करें और ऊतकों को बसने की अनुमति दें। Supernatant परिवहन (इस भाग में अब मुक्त स्टेम कोशिकाएं शामिल हैं) और खाली ट्यूब के लिए ऊतक के ऊपरी हिस्से के लगभग 0.2 मिलीलीटर।
  9. नमूना युक्त ट्यूब नीचे स्पिन (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x g). स्टेम कोशिकाओं को अब कीमा बनाया हुआ ऊतक के साथ छर्राया जाता है। निकालें और गोली को परेशान नहीं करने के लिए supernatant ध्यान से त्याग.
  10. उन्नत DMEM / F12 में गोली को फिर से निलंबित करें और ट्यूब को फिर से स्पिन करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x g )। supernatant aspirate और गोली परेशान नहीं है.
  11. विघटित कोशिकाओं और ऊतकों को सीडिंग के लिए आवश्यक घुलनशील ईसीएम की मात्रा की गणना करें। उचित सीडिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से घुलनशील ईसीएम के 30 μL का उपयोग करें।
    नोट: एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के 4 से 6 कुओं में एक नमूना पोस्ट अलगाव एम्बेड करें (यानी, नमूने में कीमा बनाया हुआ ऊतक की मात्रा के आधार पर)।
  12. नमूना ट्यूब के लिए घुलनशील ईसीएम की गणना की मात्रा जोड़ें और बुलबुले के गठन से बचने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। कुओं के बीच में निलंबन को बीज दें ताकि घुलनशील ईसीएम एक गुंबद जैसी संरचना बना सके।
    नोट: एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से पिपेट युक्तियों का उपयोग करना घुलनशील ईसीएम चढ़ाना में सहायता करता है। यदि ऊतक चंक्स P200 पिपेट टिप से बड़े हैं, तो प्लेटिंग में सहायता करने के लिए व्यापक ठंडे युक्तियों का उपयोग करें या ठंडे P1000 युक्तियों को काटें। जब भी संभव हो बर्फ पर घुलनशील ईसीएम के साथ नमूना रखें।
  13. प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) में ले जाएं और घुलनशील ईसीएम को ~ 30 मिनट के लिए ठोस करने की अनुमति दें।
  14. सीएमजीएफ + में रॉक अवरोधक और GSK3 π मिलाएं ( तालिका 1 में सांद्रता)। हर अच्छी तरह से इस समाधान (CMGF + R / G) के 500 μL जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण)।

Figure 3
चित्रा 3: कैनाइन ऑर्गेनोइड अलगाव वर्कफ़्लो। काटे गए ऊतक के नमूने को पेट्री डिश में स्थानांतरित किया जाता है और ठीक से कीमा बनाया जाता है। नमूना तब एक 1x CCS ट्यूब के लिए स्थानांतरित कर दिया है, और धोने के चरणों का प्रदर्शन कर रहे हैं. 6-वेल प्लेट में ईडीटीए इनक्यूबेशन के लिए, नमूना तब 1x सीसीएस और एफबीएस युक्त एक ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। ऊतक के बसने के बाद, ऊतक की एक छोटी राशि के साथ supernatant एक खाली ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है। नमूना परिणामस्वरूप काता जाता है, supernatant हटा दिया जाता है, और गोली उन्नत DMEM / F12 में resuspended है। ट्यूब को फिर से काता जाता है, और supernatant aspirated और त्याग दिया जाता है। घुलनशील ईसीएम को ट्यूब में जोड़ा जाता है, मिश्रित किया जाता है, और नमूना 24-अच्छी तरह से प्लेट में मढ़वाया जाता है। प्लेट को 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) किया जाता है, और फिर मीडिया को जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

नोट:: निम्न अनुभाग (चरण 4 और 5) कैनाइन Organoid रखरखाव प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। तालिका 2 के अनुसार मीडिया बदलें और एपोप्टोसिस, संदूषण, भीड़-भाड़, और घुलनशील ईसीएम की टुकड़ी के संकेतों के लिए दैनिक ऑर्गेनोइड्स की जांच करें। संस्कृतियों पर स्थितियों और प्रयोगात्मक प्रभावों की सटीक निगरानी करने के लिए दैनिक नोट्स को चित्रा 4 के अनुसार लिया जाना चाहिए। सटीक और पुनरुत्पादक ऑर्गेनोइड संस्कृति से संबंधित नोटटेकिंग के लिए अनुमति देने वाले टेम्पलेट के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें। यकृत organoids के लिए, CMGF + रॉक अवरोधक और GSK3 के साथ बढ़ाया का उपयोग करें।

Figure 4
चित्रा 4: ऑर्गेनोइड आकार और घनत्व गाइड( ए) ऑर्गेनोइड विकास की सटीक ट्रैकिंग के लिए ऑर्गेनोइड आकार चार्ट। आकार मार्गदर्शिका में अतिरिक्त-छोटे (XS), छोटे (S), मध्यम (M), बड़े (L), और अतिरिक्त-बड़े (XL) श्रेणियाँ शामिल हैं. (बी) घनत्व मार्गदर्शिका में बहुत कम घनत्व (वीएलडी), कम घनत्व (एलडी), मध्यम घनत्व (एमडी), उच्च घनत्व (एचडी), और बहुत उच्च घनत्व श्रेणियां (वीएचडी) शामिल हैं। (सी) ऑर्गेनोइड नमूने के जीवाणु और कवक संदूषण की प्रतिनिधि छवियां। (डी) ऑर्गेनोइड भीड़ और एपोप्टोसिस की प्रतिनिधि छवियां। उद्देश्य आवर्धन प्रत्येक पैनल में इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

मीडिया परिवर्तन अनुशंसा
सोमवार मंगलवार बुधवार गुरूवार शुक्रवार शानिवार रविवार
500 μL N/A 500 μL N/A 750 μL N/A N/A

तालिका 2: मीडिया परिवर्तन अनुशंसा. साप्ताहिक मीडिया परिवर्तन की अनुशंसित समयरेखा. मीडिया (आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए सीएमजीएफ + के 500 μL, या यकृत ऑर्गेनोइड्स के लिए सीएमजीएफ + आर / जी के 500 μL) को हर दूसरे दिन बदलने की सिफारिश की जाती है। सप्ताहांत पर अतिरिक्त घंटों के लिए खाते में, मीडिया के 750 μL को शुक्रवार दोपहर को जोड़ा जाता है, जिसमें सोमवार की सुबह मीडिया को ताज़ा किया जाता है।

4. Organoid सफाई

नोट: ऑर्गेनोइड सफाई या पासिंग को ऑर्गेनोइड संस्कृति के स्वास्थ्य को बनाए रखने के लिए नियमित रूप से किया जाना चाहिए। सफाई की प्रक्रिया का प्रदर्शन करें जब भी संस्कृति में एपोप्टोसिस, मलबे की उपस्थिति, ऑर्गेनोइड्स की भीड़, या घुलनशील ईसीएम की टुकड़ी देखी जाती है। चित्र 4D देखें।

  1. घुलनशील ईसीएम के विनाश से बचने के लिए प्लेट झुकाव करते समय कुओं से मीडिया को हटा दें।
    नोट: यदि घुलनशील ईसीएम टुकड़ी काफी है, तो नमूना युक्त घुलनशील ईसीएम के टुकड़ों को खोने से बचने के लिए मीडिया को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने की सलाह दी जाती है।
  2. एक P1000 टिप का उपयोग करके बार-बार pipetting द्वारा मैट्रिक्स गुंबदों को भंग करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए prechilled उन्नत DMEM / F12 के 0.5 mL जोड़ें (अत्यधिक बुलबुले बनाने से बचें)। ऑर्गेनोइड युक्त भंग मैट्रिक्स को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें और यदि वॉल्यूम 6 एमएल से कम है, तो धीरे-धीरे ट्यूब को उन्नत डीएमईएम / एफ 12 के साथ भरें ताकि 6 एमएल की कुल मात्रा तक पहुंच सकें।
  3. ट्यूब स्पिन (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x जी ) और सभी supernatant को हटाने के लिए सुनिश्चित करते हुए कि गोली परेशान नहीं करने के लिए.
  4. घुलनशील ईसीएम की आवश्यक मात्रा जोड़ें (उचित सीडिंग घनत्व प्राप्त करने के लिए 30 μL प्रति अच्छी तरह से) और धीरे-धीरे पिपेट मिश्रण द्वारा गोली को फिर से निलंबित करें। एक गुंबद बनाने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट के बीच में निलंबन प्लेट।
  5. प्लेट को एक इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) में ~ 30 मिनट के लिए रखें, और फिर मीडिया की उचित मात्रा जोड़ें (तालिका 2)।

5. Organoid passaging

नोट: Passaging आमतौर पर ऑर्गेनोइड सेल लाइन का विस्तार करने के लिए प्रारंभिक संस्कृति के 5-7 दिनों के बाद किया जाता है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को आमतौर पर 1: 3 अनुपात में विस्तारित किया जा सकता है। पारित होने के लिए तैयार स्वस्थ संस्कृतियों की छवियों को चित्र 4 में देखा जा सकता है। ऑर्गेनोइड्स को आकार में कम से कम मध्यम होना चाहिए।

  1. चरण 4.1 से 4.3 तक निष्पादित करें।
  2. ट्यूब में 0.5 मिलीलीटर छोड़ने supernatant निकालें। सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान न करें।
  3. ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), एक पिपेट के साथ एस्पिरेटिंग करके ठीक से मिश्रण करें और 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें (8 मिनट के लिए आंतों के ऑर्गेनोइड्स या 10 मिनट के लिए यकृत ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करें)। इनक्यूबेशन के आधे समय बिंदु पर ट्यूब को कई बार फ्लिक करके समाधान को मिश्रण करना जारी रखें।
  4. नमूना युक्त ट्यूब को एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में वापस ले जाएं और धीरे-धीरे ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज को निष्क्रिय करने और कोशिकाओं के पृथक्करण को रोकने के लिए प्रीचिल्ड एडवांस्ड डीएमईएम / एफ 12 के 6 एमएल जोड़ें।
  5. ट्यूब स्पिन (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x g ) और supernatant निकालें। सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान न करें।
  6. चरण 4.4 निष्पादित करें। और 4.5
    नोट:: निम्न अनुभाग (चरण 6-9) Organoid हार्वेस्टिंग और Biobanking प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को ऊतक से मुक्त होना चाहिए जिसे पिछले मार्गों के दौरान हटा दिया गया है। संस्कृतियों को भी स्वस्थ होना चाहिए, कम से कम आकार में बड़ा होना चाहिए, और घनत्व में मध्यम से उच्च होना चाहिए। डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए तैयार स्वस्थ संस्कृतियों की छवियों को चित्र 4 में देखा जा सकता है। उप-इष्टतम ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के संरक्षण और कटाई के साथ डाउनस्ट्रीम में आगे बढ़ना लक्षण वर्णन परिणामों और बायोबैंक की व्यवहार्यता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। चित्रा 5 में अनुशंसित 24-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट की समीक्षा करें।

Figure 5
चित्रा 5: अनुशंसित 24-अच्छी तरह से प्लेट लेआउट. ऑर्गेनोइड संस्कृति के विस्तार के बाद बुनियादी लक्षण वर्णन के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट का अनुशंसित लेआउट। छह कुओं (मध्यम से उच्च घनत्व के मध्यम से बड़े ऑर्गेनोइड्स) के पैराफिन-एम्बेडिंग आमतौर पर एक हिस्टोलॉजी ब्लॉक में ऑर्गेनोइड्स की उच्च एकाग्रता के लिए अनुमति देगा। ऑर्गेनोइड्स के चार कुओं को डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए आरएनए भंडारण अभिकर्मक के साथ एक क्रायोवियल में पूल किया जा सकता है। चौदह कुओं का उपयोग ऑर्गेनोइड नमूनों को बायोबैंकिंग करने के लिए किया जाता है और सात क्रायोप्रिजर्व्ड शीशियों के लिए सामग्री प्रदान करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

6. ऑर्गेनोइड्स का निर्धारण

  1. अच्छी तरह से मीडिया को निकालें और सुनिश्चित करें कि घुलनशील ईसीएम गुंबद को परेशान न करें।
  2. फॉर्मेलिन-एसिटिक एसिड-अल्कोहल समाधान के 500 μL जोड़ें जो एक फिक्सेटिव (FAA; तालिका 1 में संरचना) के रूप में कार्य करता है।
  3. कमरे के तापमान पर ऑर्गेनोइड्स स्टोर करें। 24 घंटे के बाद, एस्पिरेट एफएए और 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से भरें। तेजी से वाष्पीकरण से बचने के लिए एक प्रयोगशाला लचीली फिल्म टेप ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ प्लेटों को लपेटें। ऑर्गेनोइड्स अब पैराफिन-एम्बेडिंग के लिए तैयार हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति का पैराफिन-एम्बेडिंग पारंपरिक धातु आधार मोल्ड्स में किया जाता है।

7. आरएनए संरक्षण

  1. कुओं से मीडिया निकालें और सुनिश्चित करें कि घुलनशील ईसीएम गुंबद को परेशान न करें।
  2. 0.5 मिलीलीटर प्रीचिल्ड उन्नत DMEM / F12 प्रति अच्छी तरह से बार-बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा घुलनशील ईसीएम गुंबदों को भंग करने के लिए (अत्यधिक बुलबुले बनाने से बचें) का उपयोग करें। ऑर्गेनोइड्स को 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को बर्फ पर रखें और यदि वॉल्यूम 6 एमएल से कम है, तो धीरे-धीरे कुल मात्रा के 6 मिलीलीटर तक पहुंचने के लिए उन्नत डीएमईएम / एफ 12 के साथ ट्यूब को भरें।
  3. ट्यूब स्पिन (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 x g ) और सभी supernatant निकालें। सुनिश्चित करें कि गोली को परेशान न करें।
  4. नमूना ट्यूब के लिए पीबीएस के 100 μL जोड़ें और कोमल pipetting द्वारा गोली resuspend. नमूना ट्यूब की सामग्री को क्रायोवियल में स्थानांतरित करें।
  5. नमूना ट्यूब में आरएनए भंडारण अभिकर्मक के 900 μL जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और किसी भी शेष organoids इकट्ठा करने के लिए मिश्रण। इन अवशिष्ट ऑर्गेनोइड्स को क्रायोवियल में स्थानांतरित करें और उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (आमतौर पर एक क्रायोवल में पूल किए गए चार कुएं डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त होंगे, जिसमें क्यूपीसीआर और आरएनए अनुक्रमण शामिल हैं)।
    नोट: एक क्रायोवियल आमतौर पर आरएनए के कुल 4,000 एनजी का उत्पादन करता है (स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण के माध्यम से मापा जाता है)।

8. Organoid biobanking

नोट: बायोबैंकिंग आमतौर पर पारित होने के 3-4 दिनों के बाद होता है। एपोप्टोसिस के संकेत इस विधि को करने के लिए संस्कृति में मौजूद नहीं होने चाहिए। ठंड के लिए उपयुक्त आकार और घनत्व को संदर्भित करने के लिए चित्र4 देखें। बायोबैंक मध्यम से बहुत उच्च घनत्व पर अतिरिक्त-बड़े ऑर्गेनोइड्स के लिए मध्यम। एक आपातकालीन फ्रीज चरण का पालन किया जा सकता है यदि एक ऑर्गेनोइड सेल लाइन विशेष रूप से दुर्लभ है या आगे की व्यवहार्यता की गारंटी नहीं है। सामान्य ऑर्गेनोइड बायोबैंकिंग (चरण 8.1 से 8.4) के लिए समान चरणों का पालन करें। आपातकालीन ठंड छोटी और कम घनी संस्कृतियों के साथ किया जाता है। 8.1 से 8.4 चरणों के बाद एक क्रायोवियल में बढ़ते ऑर्गेनोइड्स के कई कुओं के रूप में पूल करें। ध्यान रखें कि संस्कृति का विस्तार करने के प्रयास में पर्याप्त संख्या में ऑर्गेनोइड्स को जीवित रखा जाना चाहिए (आपातकालीन ठंड केवल संदूषण या अन्य अप्रत्याशित घटनाओं के माध्यम से संस्कृति के संभावित नुकसान से बचाने के लिए एक बैकअप प्रक्रिया है)।

  1. 7.1 से 7.3 तक चरणों का पालन करें।
  2. नमूना ट्यूब के लिए क्रायोवियल प्रति ( तालिका 1 में संरचना) फ्रीजिंग मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा गोली resuspend.
  3. समाधान के 1 मिलीलीटर को एक क्रायोवियल (दो कुओं / क्रायोवियल का अनुपात) में स्थानांतरित करें और क्रायोवियल को बर्फ पर रखें।
  4. क्रायोवियल्स को बर्फ से एक ठंड कंटेनर में स्थानांतरित करें (नियमित रूप से आइसोप्रोपेनॉल के साथ जलाशय को फिर से भरें) और तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। 24 घंटे के बाद लंबी अवधि के भंडारण के लिए नमूनों को तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में ले जाएं।
    नोट: एक शराब मुक्त सेल फ्रीजिंग कंटेनर भी एक पारंपरिक एक के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है। सुनिश्चित करें कि नमूने -80 डिग्री सेल्सियस से दीर्घकालिक तरल नाइट्रोजन भंडारण के लिए परिवहन के दौरान पिघलते नहीं हैं। बार-बार पिघलने से सेल संस्कृति की व्यवहार्यता कम हो जाती है।

9. तरल नाइट्रोजन भंडारण से पुनरुद्धार

नोट: जब एक ऑर्गेनोइड लाइन को पिघलाने का चयन करते हैं, तो पुनर्जीवित ऑर्गेनोइड्स के सबसेट को फिर से तैयार किया जाना चाहिए और बायोबैंक में कम से कम एक (अधिमानतः अधिक) क्रायोवियल्स के साथ जितनी जल्दी हो सके प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए।

  1. धीरे-धीरे पिघलने के लिए बर्फ पर घुलनशील ईसीएम रखें, इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) में 24-अच्छी तरह से प्लेट डालें, और 15 एमएल ट्यूब और उन्नत डीएमईएम / एफ 12 जैसे आवश्यक अभिकर्मकों को तैयार करें।
  2. तरल नाइट्रोजन भंडारण से एक ऑर्गेनोइड नमूना युक्त एक क्रायोवियल को पुनर्प्राप्त करें और तुरंत इसे 2 मिनट के लिए गर्मी स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें।
  3. एक biosafety कैबिनेट में एक 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए cryovial की सामग्री हस्तांतरण. धीरे-धीरे 6 एमएल की कुल मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रीचिल्ड एडवांस्ड डीएमईएम / एफ 12 जोड़ें।
  4. ट्यूब स्पिन (700 x g 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए). supernatant निकालें और गोली परेशान करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें।
  5. गोली के लिए घुलनशील ईसीएम के 180 μL (30 μL प्रति अच्छी तरह से) जोड़ें और पूर्व गर्म 24-अच्छी तरह से प्लेट में इस निलंबन प्लेट। एक क्रायोवील को 24-अच्छी तरह से प्लेट के छह कुओं पर चढ़ाया जा सकता है।
  6. इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वातावरण) में ~ 30 मिनट के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें और सीएमजीएफ + आर / जी जोड़ें (आंतों के ऑर्गेनोइड्स के लिए, 24 से 48 घंटे में सीएमजीएफ + पर स्विच करें)।
    नोट: जब एक नमूना मढ़वाया जाता है और 24-अच्छी तरह से प्लेट में बढ़ रहा है, तो इसे व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए पासिंग से पहले कम से कम 2 दिनों के लिए पुनर्प्राप्त करने की अनुमति दी जानी चाहिए।

Representative Results

कैनाइन ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल आमतौर पर ~ 50,000 से ~ 150,000 आंतों या यकृत कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रति अच्छी तरह से उत्पन्न करता है। प्रतिनिधि ऑर्गेनोइड्स को चित्र 6 में देखा जा सकता है।

Figure 6
चित्रा 6: कैनाइन ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए ऑर्गेनोइड्स की छवियों को दर्शाया गया है। (A, B) ग्रहणी से व्युत्पन्न आंत्र ऑर्गेनोइड्स (10x और 5x उद्देश्य आवर्धन पर लिया जाता है)। पुराने budded organoids और युवा गोलाकार की उपस्थिति पर ध्यान दें। (C,D) जेजुनम के निचले हिस्से से कैनाइन एंटरोइड्स (10x और 20x उद्देश्य आवर्धन पर लिया गया)। (E,F) इलियल एंटरोइड्स (20x और 5x उद्देश्य आवर्धन पर लिया गया), और (G, H) colonoids (10x उद्देश्य आवर्धन पर लिया गया)। (I) 20x उद्देश्य आवर्धन पर ली गई यकृत ऑर्गेनोइड्स की एक प्रतिनिधि छवि। अधिकांश ऑर्गेनोइड्स अपने नवोदित रूप में होते हैं। चित्र में छोटे यकृत गोलाकार भी देखे जा सकते हैं। (जे) प्रतिनिधि छवि एक दुर्लभ हेपेटिक ऑर्गेनोइड दिखाती है जो एक वाहिनी जैसी संरचना बनाती है (10x उद्देश्य आवर्धन पर ली जाती है)। स्केल बार (500 μm) प्रत्येक छवि के शीर्ष-बाएं कोने में मौजूद है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके व्युत्पन्न Enteroids और colonoids पहले 201912 में चंद्रा एट अल द्वारा विशेषता थी। कैनाइन आंत्र ऑर्गेनोइड्स आंतों के उपकला की एक नियमित सेलुलर आबादी से बने होते हैं। सीटू संकरण में आरएनए का उपयोग करते हुए, स्टेम सेल बायोमाकर्स की अभिव्यक्ति (ल्यूसीन-रिच रिपीट जिसमें जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर 5 - एलजीआर 5 और एसआरवाई-बॉक्स ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 9 - एसओएक्स 9), पैनेथ सेल बायोमार्कर (एफ्रिन टाइप-बी रिसेप्टर 2 - ईपीएचबी 2), अवशोषक उपकला सेल मार्कर (क्षारीय फॉस्फेट - एएलपी) और एंटरोएंडोक्राइन मार्कर (न्यूरोजेनिन -3 - न्यूरो जी 3)12 की पुष्टि की गई थी। एल्शियन ब्लू स्टेनिंग को गोब्लेट कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पैराफिन-एम्बेडेड स्लाइड पर किया गया था। इसके अतिरिक्त, ऑप्टिकल चयापचय इमेजिंग (ओएमआई) या सिस्टिक फाइब्रोसिस ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) सूजन परख जैसे कार्यात्मक assays organoids की चयापचय गतिविधि की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया गया था। सूजन आंत्र रोग, जठरांत्र संबंधी स्ट्रोमल ट्यूमर (जीआईएसटी), या कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा के निदान वाले कुत्तों से कैनाइन ऑर्गेनोइड्स को भी इस प्रोटोकॉल 12 का उपयोग करके अलग किया गया था।

स्टेम सेल अलगाव के बाद, यकृत कैनाइन ऑर्गेनोइड्स अपने जीवन चक्र को गोलाकार के विस्तार के रूप में शुरू करते हैं, और ~ 7 दिनों के बाद, वे नवोदित और अलग-अलग ऑर्गेनोइड्स में बदल जाते हैं। इस प्रोटोकॉल के अनुसार अलग-थलग और सुसंस्कृत कैनाइन हेपेटिक गोलाकार को उनके विकास को मापने और पारित होने के लिए आदर्श समय निर्धारित करने के लिए मापा गया था। स्वस्थ वयस्क कुत्तों (एन = 7) के लेप्रोस्कोपिक यकृत बायोप्सी से व्युत्पन्न गोलाकार को उनकी संस्कृति के पहले 7 दिनों के दौरान मापा गया था। प्रतिनिधि छवियों को लिया गया था, और गोलाकार (एन = 845) के अनुदैर्ध्य (ए) और विकर्ण (बी) त्रिज्या को पूरी संस्कृति में मापा गया था। गोलाकार के आयतन (V), सतह क्षेत्र (P), 2D दीर्घवृत्त क्षेत्र (A), और परिधि (C) की गणना की गई थी। प्रयोग की गणना और परिणामों को चित्र 7 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। 2 डी दीर्घवृत्त क्षेत्र और परिधि का उपयोग प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके ऑर्गेनोइड संस्कृति के स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए किया गया था। ये मूल्य संस्कृति रखरखाव निर्णयों के लिए एक गाइड के रूप में काम कर सकते हैं।

संक्षेप में, गोलाकार तेजी से मात्रा, सतह क्षेत्र, 2 डी दीर्घवृत्त क्षेत्र और परिधि में विस्तारित हुआ। सात बीगल से माप डेटा निम्नलिखित गणनाओं के लिए औसत किया गया था। दिन 2 से 3 तक वॉल्यूम में 479% (±6%) की वृद्धि हुई। उसी समय बिंदु पर, गोलाकार सतह क्षेत्र और 2 डी दीर्घवृत्त क्षेत्र में क्रमशः 211% (±208%) और 209% (±198%) की वृद्धि हुई। 2डी दीर्घवृत्त परिधि दिन 2 से 3 तक 73% (±57%) तक बढ़ गई। दिन 2-7 से यकृत ऑर्गेनोइड्स की समग्र मात्रा में वृद्धि 365 गुना से अधिक थी, सतह क्षेत्र और 2 डी दीर्घवृत्त क्षेत्र में 49 गुना वृद्धि हुई, और 2 डी दीर्घवृत्त परिधि में छह गुना वृद्धि हुई।

इसके बाद, दो वयस्क कुत्ते के नमूनों से व्युत्पन्न गोलाकार को आगे बढ़ने के बाद पारित किया गया था और सीटू संकरण (आरएनए आईएसएच) में आरएनए के लिए हर दिन (दिन 2-7) एकत्र किया गया था। कैनाइन जांच को डिज़ाइन किया गया था (जांच सूची पूरक तालिका 2 के रूप में प्रदान की गई है), और एमआरएनए अभिव्यक्ति का मूल्यांकन स्टेम सेल मार्करों (एलजीआर 5) के लिए किया गया था, चोलएंजियोसाइट्स के लिए विशिष्ट मार्कर (साइटोकेराटिन 7 - केआरटी -7, और एक्वापोरिन 1 - एक्यूपी 1), साथ ही हेपेटोसाइट मार्कर (फोर्कहेड बॉक्स प्रोटीन ए 1 - फॉक्सए 1; और साइटोक्रोम पी 450 3ए 12 - CYP3A12)। मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन अर्ध-मात्रात्मक तरीके से किया गया था ( चित्र8 में प्रतिनिधि चित्र)। गोलाकारों ने कोलोन्जियोसाइट्स मार्कर केआरटी -7 को प्राथमिकता से व्यक्त किया जो सिग्नल क्षेत्र / कोशिकाओं के कुल क्षेत्र में 1% से 26% तक होता है। AQP1 ऑर्गेनोइड नमूनों में व्यक्त नहीं किया गया था, यकीनन क्योंकि कैनाइन यकृत के नमूनों में इसकी उपस्थिति विरल है। स्टेम सेल मार्कर अभिव्यक्ति (LGR5) 0.17% से 0.78% के बीच थी, जबकि हेपेटोसाइट मार्करों को FOXA1 के लिए 0.05% -0.34% और CYP3A12 के लिए 0.03% -0.28% पर कम हद तक व्यक्त किया गया था।

Figure 7
चित्र 7: यकृत गोलाकार मापन। (A) हेपेटिक गोलाकार वृद्धि 2-7 दिन से संस्कृतियों के हर दिन देखी गई थी। गोलाकार पहली बार 2 दिन पर बने, और अंतिम गोलाकार ने 7 वें दिन नवोदित प्रक्रिया शुरू की। एक बाद के प्रयोग ने आरएनए आईएसएच करने के लिए पैराफिन-एम्बेडिंग के लिए हर दिन गोलाकार फसल के लिए पारित होने के बाद दो कैनाइन ऑर्गेनोइड लाइनों का उपयोग किया (दिन 2 छवि को 40x पर लिया गया था, 10x पर दिन 6 छवि, और बाकी छवियों को 20x आवर्धन पर लिया गया था)। (बी) एक यकृत गोलाकार क्लस्टर को अलगाव के 4 दिनों के बाद घुलनशील ईसीएम में एम्बेडेड ऊतक खंड से जुड़ा हुआ दिखाया गया है। गोलाकार के अनुदैर्ध्य और विकर्ण त्रिज्या को मापा गया था (छवि 10x पर ली गई थी)। पैनल (सी) आयतन (वी), सतह क्षेत्र (पी), 2 डी दीर्घवृत्त क्षेत्र (ए), और परिधि (सी) प्राप्त करने के लिए गणना के लिए उपयोग किए जाने वाले सूत्र को दर्शाता है। इन गणनाओं के लिए, यह माना जाता था कि कैनाइन हेपेटिक गोलाकार आदर्श गोलाकार हैं। यकृत गोलाकार की मात्रा, सतह क्षेत्र, 2 डी दीर्घवृत्त क्षेत्र, और विकास के अलग-अलग दिनों के लिए 2 डी दीर्घवृत्त परिधि के माप के परिणामों को पैनल (डी) में दर्शाया गया है। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. (ई) KRT-7, LGR5, FOXA1, और CYP3A12 की mRNA अभिव्यक्ति को दिन 2 से दिन 7 के पारित होने के बाद कैनाइन हेपेटिक गोलाकार के नमूनों में मापा गया था। AQP1 इन नमूनों में व्यक्त नहीं किया गया था। एक स्केल बार (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) प्रत्येक छवि के शीर्ष बाईं ओर मौजूद है। उद्देश्य आवर्धन नोट किया. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस मानकीकृत तकनीक के बाद पासिंग प्रक्रिया के दौरान ऑर्गेनोइड्स शायद ही कभी टूटेंगे। यदि पृथक्करण नहीं होता है, तो इष्टतम सेल क्लस्टर विघटन को प्राप्त करने के लिए पारित होने के समय को समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के लंबे समय तक संपर्क में रहने से ऑर्गेनोइड्स के विकास पर नकारात्मक प्रभाव पड़ सकता है। यकृत ऑर्गेनोइड्स का उपयोग बाद के प्रयोग में इष्टतम पृथक्करण समय की जांच करने और एक उचित पासिंग विधि स्थापित करने के लिए किया गया था। संक्षेप में, दो स्वस्थ कुत्तों (6 अच्छी तरह से प्रतिकृति प्रत्येक) से यकृत ऑर्गेनोइड्स को 12 मिनट और 24 मिनट के लिए ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के साथ पारित किया गया था। नमूनों को हर 6 मिनट में उत्तेजित किया गया था। पृथक्करण टाइमपॉइंट के अंत में, 6 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा उन्नत डीएमईएम / एफ 12 को समाधान में जोड़ा गया था, और नमूनों को काता गया था (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 एक्स जी )। supernatant (पतला ट्रिप्सिन की तरह प्रोटीज के साथ उन्नत DMEM / F12) को हटा दिया गया था, और छर्रों को ऊपर वर्णित के रूप में घुलनशील ईसीएम में एम्बेडेड किया गया था (चरण 4.4-4.5)। घुलनशील ईसीएम और सीएमजीएफ + आर / जी में संस्कृति के 12 घंटे के बाद, दोनों नमूनों में अंतर देखा गया था। ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के साथ 12 मिनट की इनक्यूबेशन ने ऑर्गेनोइड विकास को बाधित नहीं किया। हालांकि, ऑर्गेनोइड्स की वृद्धि नकारात्मक रूप से प्रभावित हुई थी ( चित्रा 9 देखें) 24 मिनट के इनक्यूबेशन का उपयोग करके।

Figure 9
चित्रा 9: कैनाइन हेपेटिक ऑर्गेनोइड मार्ग प्रयोग। दो कुत्तों (D_1 और D_2) से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियां 12 मिनट या 24 मिनट के लिए ट्रिप्सिन जैसी प्रोटीज इनक्यूबेशन विधि का उपयोग करके पारित की गई हैं। नियंत्रण नमूनों को 10 मिनट के लिए ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के साथ पारित किया गया था। एक स्केल बार (μm) प्रत्येक छवि के शीर्ष बाईं ओर मौजूद है और 500 μm (5x उद्देश्य आवर्धन) का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके बाद, एक प्रतिकूल वातावरण (संरचनात्मक समर्थन और पोषण के अभाव) में इस प्रोटोकॉल से व्युत्पन्न कैनाइन हेपेटिक ऑर्गेनोइड्स की उत्तरजीविता में जांच की गई थी। जांच ने हेपेटिक ऑर्गेनोइड के सफल विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक ऑर्गेनोइड मीडिया और बेसमेंट मैट्रिक्स की मात्रा निर्धारित करने और ऑर्गेनोइड संस्कृति पर ऐसी स्थितियों के प्रभाव को स्थापित करने पर ध्यान केंद्रित किया। उत्तरजीविता को सीमित संख्या में ऑर्गेनोइड्स के साथ 96-अच्छी तरह से प्लेट में मापा गया था। दो कुत्तों से ऑर्गेनोइड्स को ऊपर वर्णित के रूप में पारित किया गया था और घुलनशील ईसीएम (10 μL या 15 μL) के विभिन्न संस्करणों में एम्बेडेड (12 प्रतिकृतियां) एम्बेडेड किया गया था। कोशिकाओं को 400 कोशिकाओं / 10 μL अच्छी तरह से और 600 कोशिकाओं / 15 μL की एकाग्रता में अच्छी तरह से 40,000 कोशिकाओं / एमएल के अनुरूप प्लेट किया गया था। दो मीडिया प्रकार (CMGF+, या CMGF+ R/G) को विभिन्न खंडों (25 μL, 30 μL, या 35 μL) में जोड़ा गया था। मीडिया को कभी नहीं बदला गया था, और कोई रखरखाव प्रक्रिया नहीं की गई थी। ऑर्गेनोइड्स की उत्तरजीविता की हर दिन निगरानी की गई थी। ऑर्गेनोइड मृत्यु को ऑर्गेनोइड संरचनाओं के 50% से अधिक के विघटन के रूप में परिभाषित किया गया था। इन स्थितियों में ऑर्गेनोइड्स की जीवित रहने की दर 12.9 (±2.3) दिनों से लेकर 18 (±1.5) दिनों तक थी, और परिणामों को तालिका 3 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। दो नमूने जो सबसे लंबे समय तक जीवित रहे, वे 15 μL घुलनशील ईसीएम और CMGF + मीडिया के 30 μL में एम्बेडेड कुत्तों से व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स थे। दोनों नमूनों को घुलनशील ईसीएम (30 μL) और ताजा मीडिया (500 μL) में एक मानक 24-अच्छी तरह से प्लेट में एम्बेडेड किया गया था, जो 18 दिनों के अभाव के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऑर्गेनोइड विस्तार अभी भी संभव था (चित्रा 10)।

मीडिया प्रकार मतलब (दिन बच गए) माध्यिका CV% मतलब (दिन बच गए) माध्यिका CV% मतलब (दिन बच गए) माध्यिका CV% मतलब (दिन बच गए) माध्यिका CV%
मीडिया (μL) 30 25 35 30
ECM (μL) 10 10 10 15
D_1 CMGF+ R/G 12.50 13 11.57 12.83 13 4.50 11.83 11.5 12.91 12.08 13 12.46
CMGF+ 17.08 17 16.26 18.50 19 4.89 18.42 19 14.54 17.82 19 8.99
D_2 CMGF+ R/G 13.67 14 13.36 13.00 13 12.70 14.00 14.5 17.23 13.08 13 8.90
CMGF+ 15.50 15 18.56 17.50 18 10.48 17.50 19 20.89 17.00 17 14.41
कुल CMGF+ R/G 13.08 13 13.13 12.92 13 9.39 12.92 13 17.52 12.58 13 11.22
CMGF+ 16.29 16.5 17.69 18.00 18.5 8.35 17.96 19 17.65 17.43 17 11.70
मृत्यु = ऑर्गेनोइड द्रव्यमान का 50% से अधिक अव्यवहार्य है

तालिका 3: उत्तरजीविता प्रयोग परिणाम। प्रयोग संरचनात्मक समर्थन या दो organoid संस्कृतियों के पोषण के अभाव पर आधारित था। परिणामों में अलग-अलग कुत्तों में घुलनशील ईसीएम और मीडिया की व्यक्तिगत सांद्रता का माध्य, माध्यिका और मानक विचलन (सीवी%) शामिल है।

Figure 10
चित्रा 10: Organoids पोषण और संरचनात्मक अभाव. ऑर्गेनोइड्स को विस्तार के बाद के अभाव (ए) की क्षमता की पुष्टि करने के लिए 24-अच्छी तरह से प्लेटों में फिर से चढ़ाया गया था। रीप्लेटिंग के बाद दिन 4 और दिन 7 से प्रतिनिधि छवियां ऑर्गेनोइड्स के विस्तार को दिखाती हैं, जो व्यवहार्य ऑर्गेनोइड्स को नेत्रहीन रूप से पहचानने की क्षमता की पुष्टि करती हैं (छवियों को 5x उद्देश्य आवर्धन पर लिया जाता है)। जीवित, या मृत माने जाने वाले ऑर्गेनोइड्स की प्रतिनिधि छवियों को (बी) में देखा जाता है। छवियों को 5x उद्देश्य आवर्धन पर लिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: सीटू संकरण प्रतिनिधि छवियों में यकृत गोलाकार आरएनए। LGR5, KRT7, FOXA1, और CYP3A12 मार्करों की प्रतिनिधि छवियों को दिन 2-7 पोस्ट मार्ग से नमूनों के 60x उद्देश्य आवर्धन पर लिया गया था। सकारात्मक एमआरएनए अणु लाल दाग. AQP1 नमूनों में व्यक्त नहीं किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अपूर्ण चेलेटिंग समाधान (आईसीएस) संरचना अंतिम एकाग्रता
500 mL H2O ना
2.49 ग्राम Na2HPO4-2H2O 4.98 mg/mL
2.7 ग्राम KH2PO4 5.4 mg/mL
14 ग्राम NaCl 28 mg/mL
0.3 ग्राम KCl 0.6 mg/mL
37.5 ग्राम सुक्रोज 75 mg/mL
25 ग्राम D-Sorbitol 50 mg/mL
पूर्ण chelating समाधान (CCS) संरचना V/V % या अंतिम सांद्रता
अपूर्ण चेलेशन समाधान 20%
बाँझ H2O 80%
DTT 520 μM
पेन स्ट्रेप पेन: 196 U/ Strep 196 ug/mL
ऑर्गेनोइड मीडिया संरचना अंतिम एकाग्रता
उन्नत DMEM/ ना
FBS 8%
ग्लूटामैक्स 2 mM
HEPES 10 mM
Primocin 100 μg/mL
B27 पूरक 1x
N2 पूरक 1x
N-Acetyl-L-cysteine 1 mM
मुरीन EGF 50 ng/mL
मुरीन नोगिन 100 ng/mL
मानव आर-स्पॉन्डिन -1 500 ng/mL
Murine Wnt-3a 100 ng/mL
[Leu15]-गैस्ट्रिन मैं मानव 10 nM
निकोटिनामाइड 10 mM
A-83-01 500 nM
SB202190 (P38 अवरोधक) 10 μM
TMS (Trimethoprim sulfamethoxazole) 10 μg/mL
अतिरिक्त घटक अंतिम एकाग्रता
रॉक अवरोधक (Y-27632) 10 μM
Stemolecule CHIR99021 (GSK3π) 2.5 μM
फ्रीजिंग मीडिया संरचना V/V प्रतिशत
Organoid मीडिया और रॉक अवरोधक 50%
FBS 40%
डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (DMSO) 10%
FAA संरचना V/V प्रतिशत
इथेनॉल (100%) 50%
एसिटिक एसिड, ग्लेशियल 5%
फॉर्मेल्डिहाइड (37%) 10%
आसुत जल 35%

तालिका 1: समाधान और मीडिया की संरचना। अपूर्ण और पूर्ण chelating समाधान, CMGF + (organoid मीडिया), ठंड मीडिया, और FAA के घटकों और सांद्रता की एक सूची।

अनुपूरक तालिका 1: Organoid देखभाल टेम्पलेट. यह टेम्पलेट प्रत्येक दिन के लिए सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य ऑर्गेनोइड नोटटेकिंग की अनुमति देता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2: सीटू संकरण जांच में आरएनए। सीटू संकरण तकनीक में आरएनए करने के लिए प्रौद्योगिकी के निर्माता द्वारा विशेष रूप से कैनाइन एमआरएनए लक्ष्यों के लिए डिज़ाइन की गई जांच की सूची। अलग-अलग मार्करों के महत्व, एक जांच का नाम, इसकी संदर्भ संख्या और लक्ष्य क्षेत्र के बारे में जानकारी सूचीबद्ध है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

वर्तमान में कैनाइन हेपेटिक और आंतों के ऑर्गेनोइड्स के अलगाव और रखरखाव के लिए उपलब्ध मानकीकृत प्रोटोकॉल की कमी है। ऑर्गेनोइड संस्कृतियों के लिए मानक संचालन प्रक्रियाओं की स्थापना इस मॉडल के लिए विभिन्न प्रयोगशाला सेटिंग्स में लागू होने के लिए वारंट की गई है। विशेष रूप से, इन कैनाइन ऑर्गेनोइड मॉडल की संस्कृति के लिए मानकीकृत ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रदान करना संस्कृति के दौरान ऑर्गेनोइड्स के सामान्य विकास की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण है और विस्तार और रखरखाव के लिए इष्टतम टाइमपॉइंट प्राप्त करने के लिए पासिंग है। प्रोटोकॉल का उपयोग करके सुसंस्कृत कैनाइन आंत्र ऑर्गेनोइड्स को पहले चंद्रा एट अल.12 की विशेषता है।

प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक ऑर्गेनोइड्स का पासिंग है। यकृत गोलाकार के पहले पारित होने के लिए इष्टतम समय यकृत गोलाकार माप के आधार पर अलगाव के बाद दिन 7 पर निर्धारित किया गया था। गोलाकार की अधिकतम मात्रा दिन 7 तक प्राप्त की गई थी, और एक ही समय में, गोलाकार ने कली करना शुरू कर दिया और यकृत ऑर्गेनोइड्स का गठन किया। अलगाव के बाद दिन 2-7 से समग्र ऑर्गेनोइड मात्रा में वृद्धि 365 गुना से अधिक थी, यह सुझाव देते हुए कि इष्टतम मार्ग समय कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड संस्कृति की तुलना में अधिक है। संस्कृति में 7 दिनों के बाद, यकृत गोलाकार में सेलुलर एपोप्टोसिस के कोई सकल संकेत नहीं देखे गए थे, यहां तक कि सफाई या पासिंग के बिना भी (चित्रा 7)। आंतों और यकृत organoids passaging चुनौतीपूर्ण हो सकता है के रूप में प्रक्रिया कोशिकाओं के नुकसान और परिवर्तित व्यवहार्यता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. परिणामों से संकेत मिलता है कि ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज (12 मिनट तक) के साथ यकृत ऑर्गेनोइड्स की लंबे समय तक इनक्यूबेशन उपसंस्कृति को नकारात्मक रूप से प्रभावित नहीं करती है। 24 मिनट से अधिक समय तक ट्रिप्सिन-जैसे प्रोटीज में ऑर्गेनोइड्स को इनक्यूबेट करना ऑर्गेनोइड्स के बाद के उपसंस्कृति के लिए हानिकारक हो सकता है।

ऑर्गेनोइड मार्ग के साथ सेल समूहों में सबऑप्टिमल टूटने के मामले में, ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन के बजाय यांत्रिक पृथक्करण अधिक फायदेमंद हो सकता है। यदि ऑर्गेनोइड्स के उचित पृथक्करण के साथ समस्याओं का सामना करना पड़ता है, तो मार्ग उपज को बढ़ाने के लिए नमूनों के संक्षिप्त भंवर का प्रयास किया जा सकता है। दूसरी ओर, भंवर में एक संस्कृति को बर्बाद करने और कोशिकाओं को नुकसान पहुंचाने की क्षमता होती है, इसलिए इसका उपयोग केवल तभी किया जाना चाहिए जब अन्य प्रक्रियाएं बार-बार विफल हो जाती हैं। एकल कोशिकाओं में यकृत ऑर्गेनोइड्स को तोड़ने से ऑर्गेनोइड्स की वृद्धि दर कम हो जाती है, जबकि उन्हें कोशिकाओं के समूहों में तोड़ने से उनकी व्यवहार्यता में काफी सुधार हो सकता है। दस मिनट ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल के लिए इनक्यूबेशन समय के रूप में चुना गया था। ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज प्रयोग में 24 मिनट के इनक्यूबेशन की तुलना में 12 मिनट इनक्यूबेशन टाइमपॉइंट को साइटोटोक्सिक नहीं माना गया था।

उत्तरजीविता प्रयोग ने पुष्टि की कि कैनाइन हेपेटिक ऑर्गेनोइड्स प्रतिकूल परिस्थितियों (संरचनात्मक और पोषण संबंधी कमी) में 19.5 दिनों तक जीवित रह सकते हैं। ऑर्गेनोइड्स जो इन स्थितियों से सबसे लंबे समय तक बच गए थे, उन्हें सीएमजीएफ + मीडिया के साथ सुसंस्कृत किया गया था। यह अवलोकन मीडिया में यकृत ऑर्गेनोइड्स की धीमी वृद्धि के कारण हो सकता है जो रॉक इनहिबिटर और जीएसके 3 के साथ पूरक नहीं है। सीएमजीएफ + आर / जी के साथ ऑर्गेनोइड संस्कृतियों में तेजी से वृद्धि हुई है और उनके संसाधनों को तेजी से समाप्त कर दिया गया है। यह प्रयोग एक उच्च-थ्रूपुट सिस्टम रूपांतरण को प्राप्त करने के लिए कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति को छोटा करने की संभावनाओं को खोलता है। इस तरह की तकनीक काफी कम लागत पर दवा की खोज या विष विज्ञान अध्ययन को सुविधाजनक बनाने की क्षमता दिखाती है।

कैनाइन ऑर्गेनोइड संस्कृति रखरखाव के दौरान सामना की जाने वाली कुछ सामान्य समस्याएं अनुचित नमूना ठोसीकरण हैं जब चढ़ाना, संस्कृति संदूषण, और ऑर्गेनोइड्स के उचित घनत्व और आकार की स्थापना। यदि घुलनशील ईसीएम चढ़ाना के दौरान समय से पहले ठोस हो जाता है, तो तुरंत इसे 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। यदि घुलनशील ईसीएम गुंबद जैसी संरचनाओं का निर्माण नहीं करता है, तो यह संभावना है कि नमूने से पर्याप्त मीडिया नहीं हटाया गया था। यदि यह मामला है, तो गुंबदों के बनने तक नमूने को अधिक घुलनशील ईसीएम के साथ पतला करें।

जब एक पूरी प्लेट में कवक या जीवाणु संदूषण पाया जाता है ( चित्रा 4 देखें), तो सबसे अच्छा समाधान प्लेट को त्यागना है। एंटिफंगल या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ उपचार का प्रयास किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के प्रयास की सफलता बेहद कम है। यदि एक भी कुआं एक प्लेट में दूषित है, तो व्यवहार्य और अप्रभावित कुओं को एक नई प्लेट में साफ किया जा सकता है (चरण 4.1 से 4.5 का पालन करें) और बारीकी से निगरानी की जा सकती है। यदि नमूना पहले से ही आपातकालीन जमे हुए है, तो पूरे नमूने को त्यागने की सलाह दी जाती है, क्योंकि नमूने को पिघलाने से इनक्यूबेटर को अतिरिक्त संदूषण जोखिम में उजागर किया जाता है।

स्वस्थ ऑर्गेनोइड संस्कृति कम से कम मध्यम आकार और मध्यम घनत्व श्रेणी या उससे बड़ी होनी चाहिए। इष्टतम घनत्व ऑर्गेनोइड संस्कृति विकास के लिए महत्वपूर्ण है। कम घनत्व मध्यम घनत्व के लिए organoids सफाई द्वारा सही किया जाना चाहिए. यदि अत्यधिक घनत्व की स्थिति होती है (भीड़ भाड़), तो ऑर्गेनोइड्स को अधिक कुओं में विस्तारित किया जाना चाहिए। सेलुलर एपोप्टोसिस के सकल संकेत अक्सर ऑर्गेनोइड संस्कृति के भीड़-भाड़ और कम घनत्व दोनों के साथ होते हैं। यदि इन मुद्दों को समय पर ठीक नहीं किया जाता है, तो पूरे ऑर्गेनोइड संस्कृति कुछ ही दिनों में एपोप्टोटिक हो जाएगी। यदि ऑर्गेनोइड्स अतिरिक्त बड़े आकार या बहुत अधिक घनत्व प्राप्त करते हैं, तो संस्कृति का उपयोग प्रयोग, ठंड, या निर्धारण के लिए किया जाना चाहिए।

ऑर्गेनोइड मीडिया में वर्तमान में 17 घटक शामिल हैं, और ऑर्गेनोइड रखरखाव और विस्तार के लिए आवश्यक विकास कारकों के अलावा इसलिए महंगा हो सकता है। इस समस्या को 2 डी सेल संस्कृतियों को बढ़ाकर हल किया जा सकता है जो वातानुकूलित सीएमजीएफ + का उत्पादन करने के लिए विकास कारकों को संश्लेषित करते हैं। सेल संस्कृति L-WRN WNT-3a, R-Spondin-3, और Noggin विकास कारक37 का उत्पादन करता है। सेल कॉलोनी 90% DMEM / F12 और 10% FBS संस्कृति मीडिया का उपयोग करती है। जब संस्कृति 90 प्रतिशत confluency प्राप्त करती है, तो मीडिया को 1 सप्ताह के लिए हर दिन काटा जाता है। काटा गया मीडिया तब 2x सीएमजीएफ + (इन विकास कारकों के बिना) के साथ मिश्रित होता है। जबकि 2 डी संस्कृतियां लागत के एक अंश पर आवश्यक विकास कारकों का उत्पादन कर सकती हैं, मीडिया का उत्पादन करने के लिए अतिरिक्त समय और तैयारी की उम्मीद की जानी चाहिए। वातानुकूलित मीडिया बैचों के बीच विकास कारकों की सांद्रता भी 37,38 हो सकती है।

कैनाइन वयस्क स्टेम-सेल-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड संस्कृतियां एक अद्वितीय बायोमेडिकल मॉडल हैं जो वन हेल्थ इनिशिएटिव 39 के लक्ष्यों को प्राप्त करने में मदद कर सकती हैं। ऑर्गेनोइड तकनीक का उपयोग कई बुनियादी और बायोमेडिकल अनुसंधान क्षेत्रों में किया जा सकता है, जो विकासात्मक जीव विज्ञान, पैथोफिजियोलॉजी, दवा की खोज और परीक्षण, संक्रामक रोगों और पुनर्योजी चिकित्सा के अध्ययन के लिए विष विज्ञान से फैला हुआ है। ट्रांसलेशनल और रिवर्स ट्रांसलेशनल रिसर्च दोनों ऐसे क्षेत्र हैं जहां कैनाइन ऑर्गेनोइड्स लागू होते हैं15। कुत्तों का उपयोग सदियों से ट्रांसलेशनल प्रयोगात्मक सेटिंग्स में किया गया है, और उनके साथी पशु स्थिति ने पशु चिकित्सा में सबसे अधिक खोजी गई प्रजातियों में से एक के रूप में अपनी स्थिति को भी सुविधाजनक बनाया है।

अंत में, यह पांडुलिपि विभिन्न जैव चिकित्सा क्षेत्रों में इस मॉडल के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए कैनाइन हेपेटिक और आंतों के ऑर्गेनोइड्स के अलगाव, रखरखाव, कटाई और बायोबैंकिंग के लिए मानकीकृत ऑपरेटिंग प्रोटोकॉल प्रदान करती है। यह मॉडल ज्ञान के अंतर और अंतःविषय साझाकरण को बढ़ावा देने के लिए एक स्वास्थ्य पहल के एक उपकरण के रूप में रिवर्स ट्रांसलेशनल अनुसंधान को बढ़ावा देने के लिए विशिष्ट रूप से उपयुक्त है।

Disclosures

K. Allenspach LifEngine Animal Health और 3D Health Solutions के सह-संस्थापक हैं। वह सेवा पशु स्वास्थ्य, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics, और मंगल ग्रह के लिए एक सलाहकार के रूप में कार्य करता है। J. P. Mochel LifEngine Animal Health और 3D Health Solutions के सह-संस्थापक हैं। डॉ मोचेल सेवा पशु स्वास्थ्य और लोकाचार पशु स्वास्थ्य के लिए एक सलाहकार के रूप में कार्य करता है। अन्य लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखक आयोवा स्टेट यूनिवर्सिटी के कर्मचारियों की पशु चिकित्सा नैदानिक प्रयोगशाला के प्रति आभार व्यक्त करना चाहते हैं, अर्थात्, हेली एम लैम्बर्ट, एमिली रहे, रोजालिन एम. ब्रानमैन, विक्टोरिया जे. ग्रीन, और जेनिफर एम. ग्रोएल्ट्ज़-थ्रश, प्रदान किए गए नमूनों के समय पर प्रसंस्करण के लिए। लेखकफैकल्टी स्टार्टअप, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award, और NSF SBIR उप-पुरस्कार से ISU # 1912948 को समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chelating solution
D-Sorbitol Fisher Chemical BP439-500
DTT Promega V3151
KCl Fisher Chemical P217-500
KH2PO4 Sigma P5655-100G
Na2HPO4-2H2O Sigma S5136-100G
NaCl Fisher Chemical S271-500
Pen Strep Gibco 15140-122
Sucrose Fisher Chemical S5-500
Organoid media
[Leu15]-Gastrin I human Sigma G9145-.5MG
A-83-01 PeproTech 9094360
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
B27 supplement Gibco 17504-044
FBS Corning 35-010-CV
Glutamax Gibco 35050-061
HEPES VWR Life Science J848-500ML
Human R-Spondin-1 PeproTech 120-38-500UG
Murine EGF PeproTech 315-09-1MG
Murine Noggin PeproTech 250-38-250UG
Murine Wnt-3a PeproTech 315-20-10UG
N2 supplement Gibco 17502-048
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G
Nicotinamide Sigma N0636-100G
Primocin InvivoGen ant-pm-1
ROCK inhibitor (Y-27632) EMD Millipore Corp. SCM 075
SB202190 (P38 inhibitor) Sigma S7067-25MG
Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) Reprocell 04-0004-base
Trimethoprim Sigma T7883-5G
Sulfamethoxazole Sigma-Aldrich S7507-10G
Reagents
Acetic Acid, Glacial Fisher Chemical A38-500
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Chemicals D128-500
EDTA, pH 8.0, 0.5 M Invitrogen 15575-038
Formaldehyde (37%) Fisher Chemical F79P-4
Glutaraldehyde solution Sigma G5882
Matrigel Matrix For Organoid Culture Corning 356255 Extracellular Membrane Matrix
Paraformaldehyde, 97% Alfa Aesar A11313
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) Corning 21-040-CM
PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) Corning 21-040-CM
RNAlater Soln. Invitrogen AM7021 RNA Storage Reagent
TrypLE Express Gibco 12604-021 Trypsin-like Protease
Other
6 Well Cell Culture Plate Corning 3516
ACD Hybez II Hybridization System ACD a biotechne brand 321710
Centrifuge Tube, 15 mL Corning 430766
CoolCell LX Corning BCS-405MC
Cryogenic Vials Corning 430488
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) Fisherbrand 05-539-13
GyroMini Nutating mixer (Rocker) Labnet S0500-230V-EU
Heat Bath Lab-Line Instruments 3000
Mr. Frosty Freezing Container ThermoFisher Scientific 5100-0001
NanoDrop 2000 ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP SpectrophotometerAnalysis
Panasonic incubator Panasonic MCO-170ML-PA
Parafilm M Wrapping Film Bemis Company Inc PM996/EMD Laboratory Flexible Film Tape
Protected Disposable Scalpels Bard-Parker 239844
RNAscope 2.5 HD Assay – RED ACD a biotechne brand 322350
RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents ACD a biotechne brand 322330
RNAscope Target Retrieval Reagents ACD a biotechne brand 322000
RNAscope Wash Buffer Reagents ACD a biotechne brand 310091
Tissue Culture Dish Dot Scientific 6676621
Tissue Culture Plate 24 wells Fisherbrand FB012929

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References

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Gabriel, V., Zdyrski, C., Sahoo, D. K., Dao, K., Bourgois-Mochel, A., Kopper, J., Zeng, X. L., Estes, M. K., Mochel, J. P., Allenspach, K. Standardization and Maintenance of 3D Canine Hepatic and Intestinal Organoid Cultures for Use in Biomedical Research. J. Vis. Exp. (179), e63515, doi:10.3791/63515 (2022).

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