Summary
Eksperimentelle metoder for å høste voksne stamceller fra hundens tarm- og levervev for å etablere 3D organoidkulturer beskrives. Videre diskuteres laboratorieteknikkene for å sikre konsistent vekst og gi standard driftsprosedyrer for høsting, biobank og gjenopplive hundens tarm- og leverorganoidkulturer.
Abstract
Hunder utvikler komplekse multifaktorielle sykdommer analogt med mennesker, inkludert inflammatoriske sykdommer, metabolske sykdommer og kreft. Derfor representerer de relevante store dyremodeller med translasjonspotensialet til human medisin. Organoider er 3-dimensjonale (3D), selvmonterte strukturer avledet fra stamceller som etterligner mikroanatomi og fysiologi av deres opprinnelsesorgan. Disse translasjonelle in vitro-modellene kan brukes til stoffpermeabilitet og oppdagelsesapplikasjoner, toksikologivurdering og for å gi en mekanistisk forståelse av patofysiologien til multifaktorielle kroniske sykdommer. Videre kan hundeorganoider forbedre livene til følgesvenner, gi innspill på ulike områder av veterinærforskning og legge til rette for personlige behandlingsapplikasjoner i veterinærmedisin. En liten gruppe givere kan lage en biobank av organoidprøver, noe som reduserer behovet for kontinuerlig vevshøsting, da organoide cellelinjer kan underkultureres på ubestemt tid. Heri presenteres tre protokoller som fokuserer på kulturen av tarm- og levermusinorganoider avledet fra voksne stamceller. Canine Organoid Isolation Protocol skisserer metoder for å behandle vev og innebygging av celleisolering i en støttende matrise (solubilisert ekstracellulær membranmatrise). Canine Organoid Maintenance Protocol beskriver organoid vekst og vedlikehold, inkludert rengjøring og passivring sammen med passende tidspunkt for utvidelse. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol beskriver måter å trekke ut, fryse og bevare organoider for videre analyse.
Introduction
Gnagere er den mest brukte dyremodellen for biomedisinsk og translasjonell forskning1. De er usedvanlig nyttige for å undersøke grunnleggende molekylær patogenese av sykdommene, selv om deres kliniske relevans for kroniske multifaktorielle sykdommer nylig har blitt stilt spørsmål ved2. Hundemodellen har flere fordeler i forhold til gnagere3,4. Hunder og mennesker deler likheter i metabolomikk og tarmmikrobiom som utviklet seg på grunn av forbruk av menneskelig diett gjennom ulike perioder av domesticering5,6,7. Likheter mellom hund og human gastrointestinal anatomi og fysiologi er et annet av eksemplene8.
I tillegg deler hunder ofte lignende miljøer og livsstil med sine eiere9. Jo lengre levetid for hunder i forhold til gnagere tillater den naturlige utviklingen av mange kroniske tilstander10. Inflammatorisk tarmsykdom eller metabolsk syndrom er eksempler på multifaktorielle kroniske sykdommer som deler viktige likheter mellom mennesker og hunder11,12. Prekliniske studier av hunder som involverer hunder med naturlig forekommende sykdommer, kan generere mer pålitelige data enn de som er oppnådd fra gnagermodeller13. For å minimere bruken av levende dyreforskning og overholde prinsippene til 3Rs (Reduce, Refine, Replace)14, har det imidlertid dukket opp alternativer til in vivo-testing ved hjelp av 3D in vitro hundeorganoider15.
Organoider er selvmonterte 3D stamcelleavledede strukturer som rekapitulerer fysiologien og mikroanatomien til deres opprinnelige organer16,17. Denne teknologien ble først beskrevet av Sato et al. i 200917 og tillot mer overførbare in vitro-studier i epitelceller enn det som tidligere var mulig ved hjelp av 2D kreftcellekulturer18,19,20. Organoider er nyttige in vitro-modeller i mange biomedisinske disipliner som i preklinisk toksikologiske21,22,23, absorpsjons- eller metabolismestudier24,25,26,27,28, samt i personlige medisinske tilnærminger29,30,31 . Den vellykkede kulturen av hund intestinale organoider har blitt beskrevet for første gang i 201912, mens leverorganoider avledet fra en hund først ble rapportert av Nantasanti et al. i 201532. Canine organoider har siden blitt vellykket brukt i studier som undersøker hundens kroniske enteropatier, gastrointestinale stromale svulster, kolorektal adenokarsinom12 og Wilsons sykdom33,34.
Mens voksne stamceller kan høstes via nekropsier, krever organoidteknologien ikke alltid ofre for dyrene. Endoskopiske og laparoskopiske biopsier, eller til og med fin nål aspirater av organer35, er en levedyktig kilde til voksne stamceller for epitelial organoid isolasjon12. Utbredt bruk av slike ikke-invasive teknikker i veterinærpraksis legger til rette for alternativer for omvendt translasjonell forskning (oversettelse av informasjon fra veterinær klinisk praksis til menneskelig klinisk praksis og omvendt)15. Videreutvikling av organoid teknologi kan sikres ved standardisering av organoid kultur og vedlikeholdsmetoder. Den organoide protokollen som presenteres her er delvis basert på tidligere publisert arbeid av Saxena et al. fra 201536, og metoder ble tilpasset detaljer om hundens tarm- og leverorganoidkultur. Den generelle arbeidsflyten til hundens organoidprotokoller er avbildet i figur 1.
Canine Organoid Isolation Protocol introduserer metoder for å skaffe prøver fra endoskopisk, laparoskopisk og kirurgisk biopsi, samt nekropsier. Den skisserer den første forbehandlingen av vevsprøver og metoder som brukes til transport til laboratoriet. Materialer og reagenser som trengs for organoid isolasjon er oppsummert i avsnittet "Forberedelse for isolasjon". Prosessen med voksen stamcelleisolasjon fra vevsprøver er nærmere beskrevet. Til slutt diskuteres prosessen med å plating organoider i kuppellignende strukturer ved hjelp av en solubilisert ekstracellulær membranmatrise.
Den andre protokollen, Canine Organoid Maintenance Protocol, beskriver metoder for å dokumentere og dyrke organoider. Medieendringer og deres frekvens diskuteres i denne delen. Videre beskrives laboratorieprosedyrene som passivring og rengjøring av cellekulturene, som er avgjørende for å sikre vellykket vedlikehold av 3D-hundorganoider. Passende passivring er et kritisk skritt i protokollen, og mulige justeringer og feilsøking av dette trinnet diskuteres videre i manuskriptet.
Den siste protokollen er Canine Organoid Harvesting and Biobanking Protocol som inneholder metoder for å forberede fullvoksne organoider for parafin-innebygging og RNA-bevaring. Metoder for organoidprøver av biobanking i lagring av flytende nitrogen er også beskrevet her. Til slutt diskuteres måtene å tine frosne prøver og støtte veksten.
Til slutt tar denne artikkelen sikte på å gi konsistente organoide kulturprosedyrer for hunder gjennom standardisering av interlaboratoriumsprotokoller. Ved å gjøre dette har manuskriptet som mål å lette reproduserbarheten av data avledet fra hundeorganoidmodeller for å øke deres relevans i translasjonell biomedisinsk forskning.
Figur 1: Arbeidsflyt av organoidprotokoller for hunder. Canine Organoid Isolation Protocol beskriver utarbeidelsen av materialene som trengs for organoid isolasjon, høsting av en vevsprøve (ved hjelp av nekropsier, endoskopisk, laparoskopisk og kirurgisk biopsi), og veiledning om celledissosiasjon og plating av den cellulære befolkningen. Canine Organoid Maintenance Protocol diskuterer rengjøring og passivring av organoidkulturen. Organoid Harvesting and Biobanking Protocol diskuterer utarbeidelse av organoidprøver for parafin-innebygging og ytterligere organoid karakterisering. Metoder for å biobank organoid kulturer og gjenopplive dem fra lagring i flytende nitrogen er også diskutert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Forskningen ble godkjent og utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee ved Iowa State University (IACUC-19-337; IACUC-18-065; IACUC-19-017).
MERK: Følgende avsnitt (trinn 1-3) beskriver Canine Organoid Isolation Protocol.
1. Forberedelse for isolasjon
- Transportrør: Før organoidisolasjon (vanligvis 24 timer tidligere), fyll et 50 ml konisk rør med 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (Advanced DMEM/F12) beriket med 0,2 ml Pen Strep.
- For laparoskopiske, snitt eller eksisjonelle biopsier, lag tre ekstra 50 ml koniske rør. Fyll disse rørene med 10 ml komplett chelateringsløsning (1x CCS, se tabell 1).
MERK: For trinn 1.2 kan 2 mM N-Acetylcysteine (NAC) i fosfatbufret saltvann (PBS) også brukes som en tradisjonell løsning som brukes til stamcellehøsting. Det ble ikke observert noen forskjeller ved bruk av 1x CCS eller NAC i PBS. Begge løsningene legges til for å frigjøre celler i løsningen. - Hold rørene ved 4 °C over natten og transporter rørene på is resten av protokollen.
- Forbered fem 15 ml sentrifugerør med 5 ml 1x CCS, ett 15 ml sentrifugerør med 3 ml 1x CCS, ett tomt 15 ml sentrifugerør (supernatantrør) og ett 15 ml sentrifugerør med 5 ml 1x CCS og 2 ml fostersvinserum (FBS).
MERK: Ovennevnte kan utarbeides før isolasjonsdagen hvis flere prøver vil bli behandlet. For illustrasjon, se isolasjonsrøroppsettet i figur 2. - På isolasjonsdagen, lag en Petri-tallerken, skalpell, isbøtte og kald Avansert DMEM / F12 i biosikkerhetsskapet. Plasser det nødvendige antallet 24-brønns cellekulturplater i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2-atmosfære ) for å forvarme.
- Plasser den oppslående ekstracellulære membranmatrisen (ECM; se Materialbord) på isen for å begynne å tine.
MERK: Nedsenking i is beskytter mot rask opptining og bidrar til å unngå størkning. En eske pipettespisser kan plasseres i fryseren for å hjelpe til med å plate den løselige ECM. - Prechill en sentrifuge til 4 °C.
- Flytt Komplette medier med vekstfaktorer "CMGF+" eller "organoid media" (se tabell 1 for sammensetning) fra fryseren/kjøleskapet til et vannbad på 37 °C. Unngå direkte lyseksponering når det er mulig.
Figur 2: Oppsett av isolasjonsrør. Anbefalt oppsett for vevshøsting inkluderer 10 ml avansert DMEM / F12 og 0,2 ml Penn Strep i et 50 ml sentrifugerør. I tillegg kreves tre 50 ml rør fylt med 10 ml 1x CCS for kirurgiske biopsier eller nekropsier. Anbefalt røroppsett for isolasjonstrinn inkluderer fem rør som inneholder 5 ml 1x CCS som skal brukes under CCS-vasketrinn. Det første røret brukes som et prøverør som inneholder hakket vev, og de resterende rørene tjener som reservoarer på 1x CCS som skal legges til det første røret. Det sjette røret inneholder 3 ml 1x CCS for spyling av gjenværende vev fra prøverøret ved overføring til en 6-brønns plate. Disse seks rørene vil bli brukt før EDTA-inkubasjonstrinnet. Et rør med 5 ml 1x CCS og 2 ml FBS fungerer som et prøverør etter EDTA-inkubasjon, og supernatant fra dette røret overføres med stamceller til et tomt rør for resten av isolasjonen. Hold rørene ved 4 °C før du begynner å isolere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Vev høsting
- Intestinal endoskopisk, og laparoskopiske biopsier (diameter 2,8 mm) kan anskaffes ved hjelp av store biopsi tang. Høst minst åtte endoskopiske prøver per tarmsted.
- Samle prøver direkte inn i transportrør og legg dem på is.
- For kirurgiske biopsier og nekropsier, høst vevstykker med en størrelse på 0,5 cm x 0,5 cm og plasser dem i det første 1x CCS-røret.
MERK: For intestinale biopsier, fjern eventuelt gjenværende tarminnhold og skrap slimhinnen med en skalpell for å fjerne villi. Hvis prøver er rikelig, kan ytterligere biopsier samles inn i kryovarier som inneholder RNA-lagringsreagens (1 ml) eller parafin-innebygd for fremtidig sammenligning mellom organoider og deres opprinnelsesvev. Når det gjelder å ta biopsier for TEM-analyse, må du ikke skrape villi og lagre prøven i konserveringsmiddel (3% paraformaldehyd og 3% glutaraldehyd i fosfatbufret saltvann (PBS)) og lagre ved 4 °C. - Rist 1x CCS-røret kraftig i ~ 30 s, og overfør deretter prøven til et nytt 1x CCS-rør ved hjelp av tang. Gjenta denne prosessen to ganger.
- Overfør prøven fra det siste 1x CCS-røret til transportrøret (Advanced DMEM/F12 + Pen Strep) og ta prøven tilbake til laboratoriet.
MERK: Prøver som er forhåndsbehandlet på denne måten, kan også sendes over natten på is (må ikke sendes på tørris).
3. Organoid isolasjon
MERK: Utfør isolasjon ved hjelp av aseptiske teknikker i et biosikkerhetsskap. Se figur 3 for arbeidsflyt for organoid isolasjon av hunder.
- Rist vevsprøven i transportrøret i ~ 30 s og fjern overdreven supernatant til det er 0,5 ml igjen i røret ved langsom pipettering nær væskeoverflaten. Pass på at du ikke kaster bort noe vev.
- Overfør vev og gjenværende supernatant til en steril Petri-tallerken. Bruk en engangs skalpell (eller steriliserte tang og saks), kutt og hakk vevet i mindre stykker (størrelse på 1 mm2) som ligner en moskonsistens i ca. 5 minutter.
- Rør hakket vev med væske fra Petri-parabolen til det første CCS-røret. Tilsett 2 ml avansert DMEM/F12 i Petri-parabolen, skyll det gjenværende vevet og overfør til det første CCS-røret.
- Virvel 1x CCS-røret i 5 s omtrent fem ganger. La biopsier slå seg ned på bunnen av 15 ml-røret (ca. 1 min) og fjern supernatanten til det er 5 ml igjen i røret. Overfør 1x CCS fra det nye røret til prøverøret.
- Gjenta det forrige trinnet for de neste to rørene. På de to siste vaskene fjerner du supernatanten ned til 3 ml som er igjen i røret.
- Overfør biopsiene og 1x CCS fra prøverøret til en brønn på en 6-brønns plate. Deretter legger du til 3 ml 1x CCS i prøverøret, virvler forsiktig for å samle eventuelt gjenværende vev og overføres til samme brønn på platen.
- Tilsett 150 μL 0,5 M EDTA (for å oppnå et totalt volum på 6,15 ml i en brønn). Plasser 6-brønnsplaten på en 20°, 24 rpm mutterblander/rocker ved 4 °C. Inkuber leverprøvene i 10 min og tarmprøvene i 1 time på den bevegelige rockeren.
- Transporter 6-brønnsplaten tilbake til biosikkerhetsskapet. Overfør hakket vev og væske til et 1x CCS / FBS-rør og la vevet slå seg ned. Transporter supernatanten (denne delen inkluderer nå frie stamceller) og ca. 0,2 ml av den øvre delen av vevet til det tomme røret.
- Snurr ned røret som inneholder prøven (700 x g i 5 min ved 4 °C). Stamceller er nå pelletert sammen med hakket vev. Fjern og kast supernatanten forsiktig for ikke å forstyrre pelletsen.
- Resuspend pellets i Advanced DMEM/F12 og spinn røret igjen (700 x g i 5 min ved 4 °C). Aspirer supernatanten og ikke forstyrr pelletsen.
- Beregn volumet av solubilisert ECM som trengs for såing av de dissosierte cellene og vevet. Bruk 30 μL solubilisert ECM per brønn på en 24-brønns plate for å oppnå riktig såddtetthet.
MERK: Bygg inn en prøvestolpeisolasjon i 4 til 6 brønner på en 24-brønnsplate (dvs. basert på mengden hakket vev i prøven). - Tilsett det beregnede volumet av solubilisert ECM i prøverøret og rør sakte opp og ned for å unngå dannelse av bobler. Frø suspensjonen midt i brønnene slik at den solubiliserte ECM kan danne en kuppellignende struktur.
MERK: Bruk pipettespisser fra en -20 °C fryser som hjelper til med å plate solubilisert ECM. Hvis vevsbiter er større enn P200 pipettespissen, bruk brede kaldspisser eller kutt kalde P1000-spisser for å hjelpe til med plating. Oppbevar prøven med den løselige ECM på is når det er mulig. - Transporter platen til en inkubator (37 °C, 5 % CO2-atmosfære ) og la den løselige ECM størkne i ~30 min.
- Bland ROCK-hemmer og GSK3β i CMGF+ (konsentrasjoner i tabell 1). Tilsett 500 μL av denne løsningen (CMGF + R / G) til hver brønn. Plasser platen i inkubatoren (37 °C; 5 % CO2-atmosfære ).
Figur 3: Arbeidsflyt for organoid isolasjon av hunder. Den høstede vevsprøven overføres til en Petri-tallerken og hakkes riktig. Prøven overføres deretter til et 1x CCS-rør, og vasketrinn utføres. For EDTA-inkubasjonen i en 6-brønns plate overføres prøven deretter til et rør som inneholder 1x CCS og FBS. Etter at vevet legger seg, overføres supernatanten med en liten mengde vev til et tomt rør. Prøven er følgelig spunnet, supernatanten fjernes, og pelletsen resuspenderes i Advanced DMEM /F12. Røret er spunnet igjen, og supernatanten aspireres og kastes. Solubilisert ECM legges til røret, blandes, og prøven er belagt i en 24-brønns plate. Platen inkuberes derfor (37 °C, 5 % CO2-atmosfære ) i 30 minutter, og media tilsettes deretter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
MERK: Følgende avsnitt (trinn 4 og 5) beskriver vedlikeholdsprotokollen for hundeorganoid. Bytt medier i henhold til tabell 2 og kontroller organoidene daglig for tegn på apoptose, forurensning, overbefolkning og løsrivelse av solubilisert ECM. Daglige notater må tas i henhold til figur 4 for å nøyaktig overvåke forhold og eksperimentelle effekter på kulturene. Se Supplerende tabell 1 for en mal som gir mulighet for nøyaktig og reproduserbar organoid kulturrelatert notering. For leverorganoider, bruk CMGF+ forsterket med ROCK-hemmer og GSK3β.
Figur 4: Organoid størrelses- og tetthetsguide. (A) Organoid størrelseskart for nøyaktig sporing av organoid vekst. Størrelsesveiledningen inneholder ekstra små (XS), små (S), middels (M), store (L) og ekstra store (XL) kategorier. (B) Tetthetsveiledningen består av svært lav tetthet (VLD), lav tetthet (LD), middels tetthet (MD), høy tetthet (HD) og svært høy tetthet (VHD). (C) Representative bilder av bakteriell og soppforurensning av organoidprøven. (D) Representative bilder av organoid overbefolkning og apoptose. Den objektive forstørrelsen er angitt i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Anbefaling om medieendring | ||||||
| Mandag | Tirsdag | Onsdag | Torsdag | Fredag | Lørdag | Søndag |
| 500 μL | N/A | 500 μL | N/A | 750 μL | N/A | N/A |
Tabell 2: Anbefaling om medieendring. En anbefalt tidslinje for ukentlig medieendring. Medier (500 μL CMGF+ for intestinale organoider, eller 500 μL CMGF + R / G for leverorganoider) anbefales å endres annenhver dag. For å ta høyde for de ekstra timene i helgen, legges 750 μL medier til fredag ettermiddag, og media oppdateres mandag morgen.
4. Organoid rengjøring
MERK: Organoid rengjøring eller passivring må utføres regelmessig for å opprettholde helsen til organoidkulturen. Utfør rengjøringsprosedyren når apoptose i kulturen, tilstedeværelse av rusk, overbefolkning av organoidene eller løsrivelse av solubilisert ECM blir lagt merke til. Se figur 4D.
- Fjern mediet fra brønnene mens du vipper platen for å unngå ødeleggelse av den solubiliserte ECM.
MERK: Hvis løselighetsmiddelet ECM-løsningen er betydelig, anbefales det å overføre mediet til 15 ml-røret for å unngå å miste fragmenter av solubilisert ECM som inneholder prøven. - Tilsett 0,5 ml prechilled Advanced DMEM/F12 i hver brønn for å oppløse matrisekuplene ved gjentatt pipettering ved hjelp av en P1000-spiss (unngå å lage for store bobler). Overfør den organoidholdige oppløste matrisen til et 15 ml sentrifugerør. Hold røret på is, og hvis volumet er lavere enn 6 ml, fyll røret sakte med Avansert DMEM / F12 for å nå et totalt volum på 6 ml.
- Snurr røret (700 x g i 5 min ved 4 °C) og fjern all supernatanten mens du ikke forstyrrer pelletsen.
- Tilsett det nødvendige volumet av solubilisert ECM (30 μL per brønn for å oppnå riktig såingstetthet) og resuspender pellets langsomt ved pipetteblanding. Plate suspensjonen i midten av 24-brønnsplaten for å danne en kuppel.
- Plasser platen i en inkubator (37 °C, 5 % CO2-atmosfære ) i ~30 min, og tilsett deretter riktig medievolum (tabell 2).
5. Organoid passaging
MERK: Passaging utføres vanligvis 5-7 dager etter innledende kultur for å utvide den organoide cellelinjen. Organoidkulturer kan vanligvis utvides i et 1:3-forhold. Bilder av sunne kulturer som er klare for passasje, kan ses i figur 4. Organoider må være minst middels i størrelse.
- Utfør trinn 4.1 til 4.3.
- Fjern supernatanten som etterlater 0,5 ml i røret. Pass på at du ikke forstyrrer pelletsen.
- Tilsett 0,5 ml trypsinlignende protease (se Materialtabell), bland riktig ved å aspirere med pipette og inkubere i 37 °C vannbad (inkubere tarmorganoider i 8 minutter eller leverorganoider i 10 min). Fortsett å blande løsningen ved å flikke røret flere ganger ved pausepunktet for inkubasjonen.
- Flytt røret som inneholder prøven tilbake til et biosikkerhetsskap, og tilsett sakte 6 ml forhåndsstøttet avansert DMEM/F12 for å inaktivere trypsinlignende protease og stoppe dissosiasjonen av cellene.
- Snurr røret (700 x g i 5 min ved 4 °C) og fjern supernatanten. Pass på at du ikke forstyrrer pelletsen.
- Utfør trinn 4.4. og 4.5.
MERK: Følgende avsnitt (trinn 6-9) beskriver Organoid Harvesting and Biobanking Protocol. Organoide kulturer må være fri for vev som har blitt fjernet under tidligere passasjer. Kulturer bør også være sunne, minst store i størrelse og middels til høy i tetthet. Bilder av sunne kulturer som er klare for nedstrømsapplikasjoner, kan ses i figur 4. Å bevege seg nedstrøms med bevaring og høsting av sub-optimale organoidkulturer kan påvirke karakteriseringsresultatene negativt og biobankens levedyktighet. Se gjennom anbefalt 24-brønns plateoppsett i figur 5.
Figur 5: Anbefalt 24-brønns plateoppsett. Den anbefalte utformingen av 24-brønnsplaten for grunnleggende karakterisering etter utvidelse av organoidkulturen. Paraffin-innebygging av seks brønner (middels til store organoider av middels til høy tetthet) vil vanligvis tillate en høy konsentrasjon av organoider i en histologiblokk. Fire brønner med organoider kan samles til ett kryo toårig med RNA-lagringsreagens for nedstrømsapplikasjoner. Fjorten brønner brukes til biobanking av organoidprøvene og gir materiale til opptil syv kryopreserverte hetteglass. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Fiksering av organoider
- Fjern medier fra brønnen og sørg for ikke å forstyrre den løse ECM-kuppelen.
- Tilsett 500 μL formalin-eddiksyre-alkoholoppløsning som fungerer som et fikseringsmiddel (FAA; sammensetning i tabell 1).
- Oppbevar organoider ved romtemperatur. Etter 24 timer aspirerer du FAA og fyller brønnen med 70% etanol. Pakk plater med et laboratoriet fleksibelt filmbånd (se Materialfortegnelse) for å unngå rask fordampning. Organoidene er nå klare for parafin-innebygging. Parafin-innebyggingen av organoidkulturen utføres i tradisjonelle metallbaseformer.
7. RNA bevaring
- Fjern medier fra brønnene og sørg for ikke å forstyrre den løse ECM-kuppelen.
- Bruk 0,5 ml prechilled Advanced DMEM/F12 per brønn for å oppløse løse oppløsede ECM-kupler ved å pipettere opp og ned gjentatte ganger (unngå å skape for store bobler). Overfør organoidene til et 15 ml sentrifugerør. Hold røret på is, og hvis volumet er lavere enn 6 ml, fyll røret sakte med Avansert DMEM / F12 for å nå 6 ml totalt volum.
- Snurr røret (700 x g i 5 min ved 4 °C) og fjern alt supernatant. Pass på at du ikke forstyrrer pelletsen.
- Tilsett 100 μL PBS i prøverøret og resuspend pellet ved skånsom pipettering. Overfør innholdet i prøverøret til en kryovial.
- Tilsett 900 μL RNA-lagringsreagens (se Materialtabell) i prøverøret og bland for å samle eventuelle gjenværende organoider. Overfør disse gjenværende organoidene til kryo toårig og oppbevar dem ved -80 °C (vanligvis vil fire brønner samlet til en kryo toårig være tilstrekkelig for nedstrømsapplikasjoner, inkludert qPCR- og RNA-sekvensering).
MERK: En kryofil produserer vanligvis totalt 4000 ng RNA (målt via spektrofotometeranalyse).
8. Organoid biobanking
MERK: Biobanking skjer vanligvis 3-4 dager etter passering. Tegnene på apoptose bør ikke være til stede i kulturen for å utføre denne metoden. Se figur 4 for referansestørrelse og tetthet som er egnet for frysing. Biobank medium til ekstra store organoider ved middels til svært høye tettheter. Et nødfrysetrinn kan følges hvis en organoid cellelinje er spesielt sjelden eller ytterligere levedyktighet ikke er garantert. Følg de samme trinnene for normal organoid biobanking (trinn 8.1 til 8.4). Nødfrysing gjøres med mindre og mindre tette kulturer. Basseng så mange brønner med voksende organoider i en kryo toårig etter trinn 8,1 til 8,4. Husk at et tilstrekkelig antall organoider må holdes i live i et forsøk på å utvide kulturen (nødfrysing er ganske enkelt en backup-prosedyre for å beskytte mot mulig tap av kultur via forurensning eller andre uventede forekomster).
- Følg trinn 7.1 til 7.3.
- Tilsett 1 ml frysemedier per kryo toårig (sammensetning i tabell 1) i prøverøret og resuspender pellet forsiktig ved å pipettere opp og ned.
- Overfør 1 ml av løsningen til en kryovial (forholdet mellom to brønner / kryove) og hold kryovariene på is.
- Overfør kryovialene fra is til en frysebeholder (fyll regelmessig reservoaret med isopropanol) og overfør umiddelbart til -80 °C. Flytt prøvene til flytende nitrogen (-196 °C) for langtidslagring etter 24 timer.
MERK: En alkoholfri cellefrysingsbeholder kan også brukes i stedet for en tradisjonell beholder. Pass på at prøvene ikke tiner under transport fra -80 °C til langvarig lagring av flytende nitrogen. Gjentatt opptining reduserer levedyktigheten til cellekulturen.
9. Gjenoppliving fra lagring av flytende nitrogen
MERK: Når du velger å tine en organoid linje, må en undergruppe av de gjenopplivede organoidene fryses og erstattes i biobanken så raskt som mulig med minst en (helst flere) kryolater.
- Plasser solubilisert ECM på isen for å sakte tine, legg en 24-brønnsplate i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2-atmosfære ), og forbered de nødvendige reagensene som et 15 ml rør og avansert DMEM/F12.
- Gjenopprett en kryonal som inneholder en organoidprøve fra lagring av flytende nitrogen og overfør den umiddelbart til et varmebad (37 °C) i 2 minutter.
- Overfør innholdet i kryonomenet til et 15 ml sentrifugerør i et biosikkerhetsskap. Legg sakte til forhåndsklokket Avansert DMEM / F12 for å nå et totalt volum på 6 ml.
- Snurr røret (700 x g i 5 min ved 4 °C). Fjern supernatanten og sørg for ikke å forstyrre pelletsen.
- Tilsett 180 μL (30 μL per brønn) av solubilisert ECM til pelletsen og plate denne suspensjonen i den forvarmede 24-brønnsplaten. En kryovial kan belagt til seks brønner av en 24-brønns plate.
- Plasser 24-brønnsplaten i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2-atmosfære ) i ~30 min og tilsett CMGF+ R/G (for tarmorganoider, bytt til CMGF+ i 24 til 48 timer).
MERK: Når en prøve er belagt og vokser i 24-brønnsplaten, må den få lov til å komme seg i minst 2 dager før den passerer for å øke levedyktigheten.
Representative Results
Hundens organoidprotokoll genererer vanligvis ~ 50.000 til ~ 150.000 tarm- eller leverceller per brønn av en 24-brønns plate. Representative organoider kan ses i figur 6.
Figur 6: Representative bilder av hundeorganoider. Bilder av organoider isolert ved hjelp av denne protokollen er avbildet. (A,B) Intestinale organoider avledet fra tolvfingertarmen (tatt ved 10x og 5x objektiv forstørrelse). Legg merke til tilstedeværelsen av eldre budded organoider og yngre sfæroider. (C,D) Hund enteroider fra den nedre delen av jejunum (tatt ved 10x og 20x objektiv forstørrelse). (E,F) Ileal enteroider (tatt ved 20x og 5x objektiv forstørrelse), og (G, H) kolonoider (tatt ved 10x objektiv forstørrelse). (I) Et representativt bilde av leverorganoider tatt ved 20x objektiv forstørrelse. De fleste organoidene er i sin spirende form. Yngre leversfæroider kan også ses på bildet. (J) Representativt bilde som viser en sjeldenhepatisk organoid som danner en kanallignende struktur (tatt ved 10x objektiv forstørrelse). Skalalinjen (500 μm) er til stede øverst til venstre i hvert bilde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Enteroider og kolonoider avledet ved hjelp av denne protokollen ble tidligere preget av Chandra et al. i 201912. Canine intestinale organoider består av en vanlig cellulær populasjon av tarmepitelet. Ved hjelp av RNA in situ hybridisering, uttrykk for stamcellebiomarkører (Leucine-Rich Repeat Containing G Protein-Coupled Receptor 5 - LGR5 og SRY-Box Transcription Factor 9 - SOX9), Paneth Cell Biomarker (Ephrin type-B reseptor 2 - EPHB2), absorptive epitelformede cellemarkører (alkalisk fosfatase - ALP) og enterokendokrine markør (Neurogenin-3 - Neuro G3)12 ble bekreftet. Alcian Blue farging ble utført på parafin-innebygde lysbilder for å bekrefte tilstedeværelsen av Begerceller. I tillegg ble funksjonelle analyser som optisk metabolsk avbildning (OMI) eller cystisk fibrosetransmembrane konduktansregulator (CFTR) hevelsesanalyse utført for å bekrefte organoidenes metabolske aktivitet. Canine organoider fra hunder diagnostisert med inflammatorisk tarmsykdom, gastrointestinale stromale svulster (GIST) eller kolorektalt adenokarsinom ble også isolert ved hjelp av denne protokollen12.
Etter stamcelleisolasjon starter leverhundorganoider sin livssyklus som ekspanderende sfæroider, og etter ~ 7 dager blir de til spirende og differensierende organoider. Leversfæroider isolert og dyrket i henhold til denne protokollen ble målt for å kvantifisere veksten og bestemme den ideelle tiden for passasje. Sfæroider avledet fra laparoskopisk leverbiopsier av friske voksne hunder (n = 7) ble målt i løpet av de første 7 dagene av kulturen. Representative bilder ble tatt, og den langsgående (a) og diagonale (b) radiusen til sfæroidene (n = 845) ble målt gjennom hele kulturen. Volumet (V), overflatearealet (P), 2D-ellipseområdet (A) og omkretsen (C) av sfæroidene ble beregnet. Beregningene og resultatene av eksperimentet er oppsummert i figur 7. 2D ellipseområde og omkrets ble brukt til å vurdere organoidkulturens helse ved hjelp av lett mikroskopi. Disse verdiene kan fungere som en veiledning for kulturvedlikeholdsbeslutninger.
Kort sagt utvidet sfæroider raskt i volum, overflateareal, 2D-ellipseområde og omkrets. Måledataene fra de syv beagles ble gjennomsnittet for følgende beregninger. Volumet økte med 479% (±6%) fra dag 2 til 3. Samtidig økte sfæroidoverflateareal og 2D-ellipseareal med henholdsvis 211 % (±208 %) og 209 % (±198 %). 2D-ellipseomkretsen økte fra dag 2 til 3 med 73 % (±57 %). Økningen i det totale volumet av leverorganoider fra dag 2-7 var mer enn 365 ganger, overflateareal og 2D ellipseområde økte 49 ganger, og 2D ellipseomkrets økte seks ganger.
Deretter ble sfæroider avledet fra to voksne hundeprøver videre dyrket etter passasje og samlet hver dag (dag 2-7) for RNA in situ hybridisering (RNA ISH). Hundesonder ble designet (sondeliste er gitt som supplerende tabell 2), og mRNA-uttrykk ble evaluert for stamcellemarkører (LGR5), markører som er spesifikke for cholangiocytter (cytokeratin 7 - KRT-7, og aquaporin 1 - AQP1), samt hepatocyttmarkører (gaffeltr halshuggeboksprotein A1 - FOXA1; og cytokrom P450 3A12 - CYP3A12). Uttrykket av markørene ble vurdert på en semi-kvantitativ måte (representative bilder i figur 8). Sfæroider uttrykte fortrinnsvis cholangiocyttmarkøren KRT-7 fra 1% til 26% i signalområde / totalt celleområde. AQP1 ble ikke uttrykt i organoidprøvene, uten tvil fordi tilstedeværelsen i hundepatiske prøver er sparsom. Stamcellemarkøruttrykket (LGR5) varierte mellom 0,17 % og 0,78 %, mens hepatocyttmarkører i lavere grad ble uttrykt til 0,05 %-0,34 % for FOXA1 og 0,03 %-0,28 % for CYP3A12.
Figur 7: Leversfæroidmålinger. (A) Leversfæroidvekst ble observert hver dag i kulturer fra dag 2-7. Sfæroider ble først dannet på dag 2, og de siste sfæroidene startet den spirende prosessen på dag 7. Et påfølgende eksperiment brukte to organoidlinjer for hunder etter passasje for å høste sfæroider hver dag for parafin-innebygging for å utføre RNA ISH (dag 2 bilde ble tatt på 40x, dag 6 bilde på 10x, og resten av bildene ble tatt ved 20x forstørrelse). (B) En leversfæroid klynge er vist festet til en vevsbit innebygd i solubilisert ECM 4 dager etter isolasjon. Langsgående og diagonale radier av sfæroidene ble målt (bilde tatt ved 10x). Panel (C) viser formelen som brukes til beregninger for å utlede volum (V), overflateareal (P), 2D ellipseområde (A) og omkrets (C). For disse beregningene ble det antatt at leversfæroider av hunder er ideelle sfæroider. Resultater av målinger av leversfæroiders volum, overflateareal, 2D-ellipseområde og 2D ellipseomkrets for individuelle vekstdager er avbildet i panelet (D). Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). (E) mRNA-uttrykk for KRT-7, LGR5, FOXA1 og CYP3A12 ble målt i prøver av leversfæroider av hunder etter at dag 2 til dag 7 ble vedtatt. AQP1 ble ikke uttrykt i disse eksemplene. En skalastang (5x: 500 μm; 10x: 200 μm; 20x: 100 μm; 40x: 50 μm) er til stede øverst til venstre i hvert bilde. Objektiv forstørrelse notert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Organoider ville sjelden ikke bryte opp under passiviseringsprosessen etter denne standardiserte teknikken. Hvis dissosiasjon ikke oppstår, kan passasjetidene justeres for å oppnå optimal celleklynge oppløsning. Imidlertid kan langvarig eksponering for trypsinlignende protease påvirke veksten av organoidene negativt. Leverorganoider ble brukt i et påfølgende eksperiment for å undersøke optimal dissosiasjonstid og etablere en riktig passivitetsmetode. Kort sagt ble leverorganoider fra to friske hunder (6 godt replikerer hver) passert med trypsinlignende protease i 12 min og 24 min. Prøver ble opphisset hvert 6. På slutten av dissosiasjonstidspunktet ble 6 ml iskald Avansert DMEM/F12 lagt til løsningen, og prøver ble spunnet (700 x g i 5 minutter ved 4 °C). Supernatanten (Advanced DMEM/F12 med fortynnet trypsinlignende protease) ble fjernet, og pelletsene ble innebygd i solubilisert ECM som beskrevet ovenfor (trinn 4.4-4.5). Etter 12 timers kultur i solubilisert ECM og CMGF+ R/G ble det observert forskjeller i begge prøvene. En 12 min inkubasjon med trypsinlignende protease hemmte ikke organoid vekst. Veksten av organoider ble imidlertid negativt påvirket (se figur 9) ved hjelp av en 24 min inkubasjon.
Figur 9: Forsøk på leverorganoidpassasje hos hunder. Representative bilder av organoider avledet fra to hunder (D_1 og D_2) passert ved hjelp av trypsinlignende protease inkubasjonsmetode i 12 min eller 24 min. Kontrollprøver ble passeret med trypsinlignende protease i 10 minutter. En skalalinje (μm) er til stede øverst til venstre i hvert bilde og representerer 500 μm (5x objektiv forstørrelse). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter ble undersøkelsen av overlevelsesevnen til hundehvisortapoloider avledet fra denne protokollen i et ugunstig miljø (deprivasjon av strukturell støtte og ernæring) utført. Undersøkelsen fokuserte på å bestemme volumet av organoide medier og kjellermatrise som trengs for leverorganoidens vellykkede vekst og overlevelse, og også etablere slike forholds innflytelse på organoidkulturen. Overlevelse ble målt i en 96-brønnsplate med et begrenset antall organoider. Organoider fra to hunder ble passert som beskrevet ovenfor og innebygd (12 replikerer) i forskjellige mengder solubilisert ECM (10 μL eller 15 μL). Cellene ble belagt i en konsentrasjon på 400 celler / 10 μL brønn og 600 celler / 15 μL brønn tilsvarende 40.000 celler / ml. To medietyper (CMGF+, eller CMGF+ R/G) ble lagt til i forskjellige volumer (25 μL, 30 μL eller 35 μL). Mediet ble aldri endret, og ingen vedlikeholdsprosedyrer ble utført. Overlevelsen av organoidene ble overvåket hver dag. Organoid død ble definert som oppløsning av mer enn 50% av organoide strukturer. Overlevelsesraten for organoider under disse forholdene varierte fra 12,9 (±2,3) dager til 18 (±1,5) dager, og resultatene er oppsummert i tabell 3. De to prøvene som overlevde lengst var organoider avledet fra hunder innebygd i 15 μL solubilisert ECM og 30 μL CMGF + media. Begge prøvene ble innebygd i solubilisert ECM (30 μL) og ferske medier (500 μL) i en standard 24-brønnsplate etter 18 dagers deprivasjon for å sikre at organoid ekspansjon fortsatt var mulig (figur 10).
| Medietype | Middel (dager overlevd) | Median | CV% | Middel (dager overlevd) | Median | CV% | Middel (dager overlevd) | Median | CV% | Middel (dager overlevd) | Median | CV% | |
| Medier (μL) | 30 | 25 | 35 | 30 | |||||||||
| ECM (μL) | 10 | 10 | 10 | 15 | |||||||||
| D_1 | CMGF+ R/G | 12.50 | 13 | 11.57 | 12.83 | 13 | 4.50 | 11.83 | 11.5 | 12.91 | 12.08 | 13 | 12.46 |
| CMGF+ | 17.08 | 17 | 16.26 | 18.50 | 19 | 4.89 | 18.42 | 19 | 14.54 | 17.82 | 19 | 8.99 | |
| D_2 | CMGF+ R/G | 13.67 | 14 | 13.36 | 13.00 | 13 | 12.70 | 14.00 | 14.5 | 17.23 | 13.08 | 13 | 8.90 |
| CMGF+ | 15.50 | 15 | 18.56 | 17.50 | 18 | 10.48 | 17.50 | 19 | 20.89 | 17.00 | 17 | 14.41 | |
| TOTAL | CMGF+ R/G | 13.08 | 13 | 13.13 | 12.92 | 13 | 9.39 | 12.92 | 13 | 17.52 | 12.58 | 13 | 11.22 |
| CMGF+ | 16.29 | 16.5 | 17.69 | 18.00 | 18.5 | 8.35 | 17.96 | 19 | 17.65 | 17.43 | 17 | 11.70 | |
| død = mer enn 50 % av organoidmassen er uunngåelige | |||||||||||||
Tabell 3: Resultater av survivabilitetseksperimenter. Eksperimentet var basert på deprivasjon av strukturell støtte eller ernæring av to organoidkulturer. Resultatene inkluderer gjennomsnitt, median og standardavvik (CV%) av individuelle konsentrasjoner av solubilisert ECM og media hos individuelle hunder.
Figur 10: Organoider ernæringsmessig og strukturell deprivasjon. Organoider ble reskilt i 24-brønnsplater for å bekrefte muligheten for ekspansjon etter deprivasjon (A). Representative bilder fra dag 4 og dag 7 etter replating viser utvidelsen av organoidene, som bekrefter evnen til å identifisere levedyktige organoider visuelt (bilder er tatt ved 5x objektiv forstørrelse). Representative bilder av organoider som anses levende, eller døde, ses i (B). Bilder er tatt med 5x objektiv forstørrelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Leversfæroider RNA in situ hybridisering representative bilder. Representative bilder av LGR5-, KRT7-, FOXA1- og CYP3A12-markører ble tatt ved 60x objektiv forstørrelse av prøver fra dag 2-7 etter passering. Positive mRNA-molekyler flekker rødt. AQP1 ble ikke uttrykt i eksemplene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Ufullstendig chelating løsning (ICS) sammensetning | Endelig konsentrasjon |
| 500 ml H2O | NA |
| 2,49 g Na2HPO4-2H2O | 4,98 mg/ml |
| 2,7 g KH2PO4 | 5,4 mg/ml |
| 14 g NaCl | 28 mg/ml |
| 0,3 g KCl | 0,6 mg/ml |
| 37,5 g Sukrose | 75 mg/ml |
| 25 g D-Sorbitol | 50 mg/ml |
| Fullstendig chelating løsning (CCS) sammensetning | V/V % eller endelig konsentrasjon |
| Ufullstendig chelateringsløsning | 20% |
| Steril H2O | 80% |
| DTT | 520 μM |
| Penn strep | Penn: 196 U/ml; Strep 196 ug/ml |
| Organoid mediesammensetning | Endelig konsentrasjon |
| Avansert DMEM/F12 | NA |
| FBS | 8% |
| Glutamax | 2 mM |
| HEPES | 10 mM |
| Primocin | 100 μg/ml |
| B27 tillegg | 1x |
| N2 tillegg | 1x |
| N-Acetyl-L-cystein | 1 mM |
| Murine EGF | 50 ng/ml |
| Murine Noggin | 100 ng/ml |
| Menneskelig R-Spondin-1 | 500 ng/ml |
| Murine Wnt-3a | 100 ng/ml |
| [Leu15]-Gastrin I menneske | 10 nM |
| Nikotinamid | 10 mM |
| A-83-01 | 500 nM |
| SB202190 (P38-hemmer) | 10 μM |
| TMS (trimetoprim sulfametoksazol) | 10 μg/ml |
| Flere komponenter | Endelig konsentrasjon |
| ROCK-hemmer (Y-27632) | 10 μM |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | 2,5 μM |
| Frysing av mediesammensetning | V/V prosent |
| Organoide medier og ROCK-hemmere | 50% |
| FBS | 40% |
| Dimetylsulfoksid (DMSO) | 10% |
| FAA-sammensetning | V/V prosent |
| Etanol (100%) | 50% |
| Eddiksyre, Isbre | 5% |
| Formaldehyd (37%) | 10% |
| Destillert vann | 35% |
Tabell 1: Sammensetning av løsninger og medier. En liste over komponenter og konsentrasjoner av ufullstendige og komplette chelateringsløsninger, CMGF+ (organoidmedier), frysemedier og FAA.
Supplerende tabell 1: Organoid pleie mal. Denne malen gir mulighet for nøyaktig og reproduserbar organoid notering for hver dag. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2: RNA in situ hybridiseringssonder. Liste over sonder spesielt designet for hundemRNA-mål av en produsent av teknologien for å utføre RNA in situ hybridiseringsteknikk . Informasjon om betydningen av individuelle markører, navnet på en sonde, referansenummeret og målområdet er oppført. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Det er for tiden mangel på standardiserte protokoller tilgjengelig for isolering og vedlikehold av hunde lever- og tarmorganoider. Etablering av standard driftsprosedyrer for organoidkulturer er garantert at denne modellen skal gjelde i forskjellige laboratoriemiljøer. Spesielt å gi standardiserte driftsprotokoller for kulturen til disse hundeorganoidmodellene er nøkkelen til å karakterisere organoiders normale vekst under kultur og passivisere for å utlede optimale tidspunkter for ekspansjon og vedlikehold. Canine intestinale organoider dyrket ved hjelp av protokollen har tidligere vært preget av Chandra et al.12.
Et av de mest kritiske trinnene i protokollen er passivring av organoider. Den optimale tiden for den første passasjen av leversfæroider ble fastslått å være på dag 7 etter isolasjon basert på leversfæroidmålingene. Det maksimale volumet av sfæroider ble oppnådd ved dag 7, og samtidig begynte sfæroider å knoppe og danne leverorganoider. Økningen i det totale organoidvolumet fra dag 2-7 etter isolasjon var mer enn 365 ganger, noe som tyder på at den optimale gangtiden er lengre enn hundens tarmorganoidkultur. Etter 7 dager i kulturen ble det ikke observert grove tegn på cellulær apoptose i leversfæroidet, selv uten rengjøring eller passiving (figur 7). Passaging tarm- og leverorganoider kan være utfordrende, da prosedyren kan føre til tap av celler og endret levedyktighet. Resultatene indikerer at langvarig inkubasjon av leverorganoider med trypsinlignende protease (opptil 12 min) ikke påvirker subkulturen negativt. Inkubering av organoider i trypsinlignende protease i mer enn 24 min kan være skadelig for den etterfølgende subkulturen av organoidene.
Ved suboptimal brudd i celleklyngene med den organoide passasjen, kan mekanisk dissosiasjon i stedet for langvarig inkubasjon med trypsinlignende protease være mer fordelaktig. Hvis det oppstår problemer med riktig dissosiasjon av organoidene, kan kort vortexing av prøvene forsøkes å forbedre passasjeutbyttet. På den annen side har vortexing potensial til å ødelegge en kultur og skade celler, så det bør bare brukes når andre prosedyrer har mislyktes gjentatte ganger. Å bryte leverorganoider i enkeltceller senker vekstraten til organoidene, mens det å bryte dem inn i klynger av celler i stor grad kan forbedre deres levedyktighet. Ti minutter ble valgt som inkubasjonstid for organoidprotokollen. Et 12 min inkubasjonstidspunkt ble ansett som ikke cytotoksisk sammenlignet med en 24 min inkubasjon i det trypsinlignende proteaseeksperimentet.
Overlevelseseksperimentet bekreftet at leverorganoider hos hunder kunne overleve i opptil 19,5 dager under ugunstige forhold (strukturell og ernæringsmessig uttømming). Organoider som overlevde disse forholdene lengst ble dyrket med CMGF + media. Denne observasjonen kan ha vært forårsaket av den langsommere veksten av leverorganoider i medier som ikke er supplert med rockhemmer og GSK3β. Organoidkulturer med CMGF+ R/G vokste raskere og kan ha tømt ressursene raskere. Dette eksperimentet åpner muligheter for miniatyrisering av hundens organoidkultur for å oppnå en systemkonvertering med høy gjennomstrømning. En slik teknologi viser potensialet for å legge til rette for narkotikafunn eller toksikologistudier til en betydelig redusert kostnad.
Noen vanlige problemer som oppstår under vedlikehold av hundeorganoid kultur er feil prøvestørkning når du plating, kulturforurensning, og etablere riktig tetthet og størrelse på organoidene. Hvis solubilisert ECM størkner for tidlig under plating, legg den straks på is i 10 minutter. Hvis solubilized ECM ikke danner kuppellignende strukturer, er det sannsynlig at ikke nok medier ble fjernet fra prøven. Hvis dette er tilfelle, fortynn prøven med en mer solubilisert ECM til kupler dannes.
Når sopp- eller bakteriekontaminering finnes i en hel plate (se figur 4), er den beste løsningen å kaste platen. Behandling med antifungale eller antibiotikamedisiner kan forsøkes, men suksessen til et slikt forsøk er ekstremt lav. Hvis en enkelt brønn er forurenset i en plate, kan levedyktige og upåvirkede brønner rengjøres (følg trinn 4.1 til 4.5) til en ny plate og overvåkes nøye. Hvis prøven allerede er nødfrossen, anbefales det å kaste hele prøven, da opptining av prøven utsetter inkubatoren for ytterligere forurensningsrisiko.
Sunn organoid kultur bør være minst i kategorien middels størrelse og middels tetthet eller større. Optimal tetthet er avgjørende for organoid kulturvekst. Lavere tetthet må korrigeres ved å rengjøre organoidene til middels tetthet. Hvis situasjonen med ekstrem tetthet oppstår (overbefolkning), bør organoidene utvides til flere brønner. Grove tegn på cellulær apoptose følger ofte både overbefolkning og lav tetthet av organoidkulturen. Hvis disse problemene ikke korrigeres i tide, vil hele organoidkulturen bli apoptotisk om noen dager. Hvis organoider oppnår ekstra stor størrelse eller svært høy tetthet, bør kulturen brukes til et eksperiment, frysing eller fiksering.
De organoide mediene inneholder for tiden 17 komponenter, og tilsetningen av vekstfaktorer som trengs for organoid vedlikehold og ekspansjon kan derfor være dyrt. Dette problemet kan løses ved å vokse 2D-cellekulturer som syntetiserer vekstfaktorene for å produsere betinget CMGF +. Cellekulturen L-WRN produserer vekstfaktorene Wnt-3a, R-Spondin-3 og Noggin37. Cellekolonien bruker 90% DMEM / F12 og 10% FBS kulturmedier. Når kulturen oppnår 90 prosent samløp, høstes media hver dag i 1 uke. De høstede mediene blandes deretter med 2x CMGF + (uten disse vekstfaktorene). Mens 2D-kulturer kan produsere de nødvendige vekstfaktorene til en brøkdel av kostnaden, må det forventes ekstra tid og forberedelser til å produsere media. Konsentrasjoner av vekstfaktorer mellom betingede mediepartier kan også variere fra 37,38.
Canine voksen stamcelle-avledede organoidkulturer er en unik biomedisinsk modell som kan bidra til å nå målene til One Health Initiative39. Den organoide teknologien kan brukes på mange grunnleggende og biomedisinske forskningsområder, som spenner fra utviklingsbiologi, patofysiologi, legemiddeloppdagelse og testing, toksikologi til studiet av smittsomme sykdommer og regenerativ medisin40. Translasjonell og omvendt translasjonell forskning er begge områder der hundeorganoider gjelder15. Hunder har blitt brukt i århundrer i translasjonelle eksperimentelle omgivelser, og deres følgesvenn dyrestatus har også lagt til rette for sin posisjon som en av de mest utforskede artene i veterinærmedisin.
Til slutt gir dette manuskriptet standardiserte driftsprotokoller for isolasjon, vedlikehold, høsting og biobanking av hundehjerne- og tarmorganoider for å lette anvendelsen av denne modellen i ulike biomedisinske felt. Denne modellen er unikt egnet til å fremme omvendt translasjonell forskning som et verktøy for One Health Initiative for å fremme den inter- og intradisiplinære kunnskapsdelingen.
Disclosures
K. Allenspach er medgrunnlegger av LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Hun er konsulent for Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics og Mars. J. P. Mochel er medgrunnlegger av LifEngine Animal Health og 3D Health Solutions. Dr. Mochel fungerer som konsulent for Ceva Animal Health og Ethos Animal Health. Andre forfattere har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å uttrykke takknemlighet til ansatte ved Veterinary Diagnostic Laboratory of Iowa State University, nemlig Haley M. Lambert, Emily Rahe, Rosalyn M. Branaman, Victoria J. Green og Jennifer M. Groeltz-Thrush, for rettidig behandling av prøvene som tilbys. Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra fakultetets oppstart, ISU VPR Miller Award, ISU VPR Miller Award og NSF SBIR underpris til ISU # 1912948.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelating solution | |||
| D-Sorbitol | Fisher Chemical | BP439-500 | |
| DTT | Promega | V3151 | |
| KCl | Fisher Chemical | P217-500 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655-100G | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | S5136-100G | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S5-500 | |
| Organoid media | |||
| [Leu15]-Gastrin I human | Sigma | G9145-.5MG | |
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| FBS | Corning | 35-010-CV | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | |
| Human R-Spondin-1 | PeproTech | 120-38-500UG | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38-250UG | |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | |
| N2 supplement | Gibco | 17502-048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | EMD Millipore Corp. | SCM 075 | |
| SB202190 (P38 inhibitor) | Sigma | S7067-25MG | |
| Stemolecule CHIR99021 (GSK3β) | Reprocell | 04-0004-base | |
| Trimethoprim | Sigma | T7883-5G | |
| Sulfamethoxazole | Sigma-Aldrich | S7507-10G | |
| Reagents | |||
| Acetic Acid, Glacial | Fisher Chemical | A38-500 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Chemicals | D128-500 | |
| EDTA, pH 8.0, 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| Formaldehyde (37%) | Fisher Chemical | F79P-4 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma | G5882 | |
| Matrigel Matrix For Organoid Culture | Corning | 356255 | Extracellular Membrane Matrix |
| Paraformaldehyde, 97% | Alfa Aesar | A11313 | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) | Corning | 21-040-CM | |
| RNAlater Soln. | Invitrogen | AM7021 | RNA Storage Reagent |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | Trypsin-like Protease |
| Other | |||
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| ACD Hybez II Hybridization System | ACD a biotechne brand | 321710 | |
| Centrifuge Tube, 15 mL | Corning | 430766 | |
| CoolCell LX | Corning | BCS-405MC | |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | |
| Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | Fisherbrand | 05-539-13 | |
| GyroMini Nutating mixer (Rocker) | Labnet | S0500-230V-EU | |
| Heat Bath | Lab-Line Instruments | 3000 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| NanoDrop 2000 | ThermoFisher Scientific | ND2000CLAPTOP | SpectrophotometerAnalysis |
| Panasonic incubator | Panasonic | MCO-170ML-PA | |
| Parafilm M Wrapping Film | Bemis Company Inc | PM996/EMD | Laboratory Flexible Film Tape |
| Protected Disposable Scalpels | Bard-Parker | 239844 | |
| RNAscope 2.5 HD Assay – RED | ACD a biotechne brand | 322350 | |
| RNAscope H2O2 & Protease Plus Reagents | ACD a biotechne brand | 322330 | |
| RNAscope Target Retrieval Reagents | ACD a biotechne brand | 322000 | |
| RNAscope Wash Buffer Reagents | ACD a biotechne brand | 310091 | |
| Tissue Culture Dish | Dot Scientific | 6676621 | |
| Tissue Culture Plate 24 wells | Fisherbrand | FB012929 |
References
- Hickman, D. L., Johnson, J., Vemulapalli, T. H., Crisler, J. R., Shepherd, R.
- De Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: Are they the same? - Implications in cancer translational research. Journal of Nuclear Medicine. 51 (4), 501-504 (2010).
- Cannarozzi, G., Schneider, A., Gonnet, G. A phylogenomic study of human, dog, and mouse. PLoS Computational Biology. 3 (1), 0009-0014 (2007).
- Jacob, J. A. Researchers turn to canine clinical trials to advance cancer therapies. JAMA - Journal of the American Medical Association. 315 (15), 1550-1552 (2016).
- Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
- Swanson, K. S., et al. Phylogenetic and gene-centric metagenomics of the canine intestinal microbiome reveals similarities with humans and mice. ISME Journal. 5 (4), 639-649 (2011).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. Microbiome. 6 (1), 72 (2018).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Bontempo, V. Nutrition and health of dogs and cats: Evolution of petfood. Veterinary Research Communications. 29, 45-50 (2005).
- Allenspach, K., Gaschen, F. Canine chronic enteropathies: A review. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde. 145 (5), 209-222 (2003).
- Tribuddharatana, T., Kongpiromchean, Y., Sribhen, K., Sribhen, C. Biochemical alterations and their relationships with the metabolic syndrome components in canine obesity. Kasetsart Journal - Natural Science. 45 (4), 622-628 (2011).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 33 (2019).
- Schaefer, K., Rensing, S., Hillen, H., Burkhardt, J. E., Germann, P. G. Is Science the only driver in species selection? An internal study to evaluate compound requirements in the minipig compared to the dog in preclinical studies. Toxicologic Pathology. 44 (3), 474-479 (2016).
- MacArthur Clark, J. The 3Rs in research: A contemporary approach to replacement, reduction and refinement. British Journal of Nutrition. 120, 1-7 (2018).
- Schneider, B., et al. Model-based reverse translation between veterinary and human medicine: The one health initiative. CPT: Pharmacometrics and Systems Pharmacology. 7 (2), 65-68 (2018).
- Lehmann, R., et al. Human organoids: A new dimension in cell biology. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1129-1137 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (10), 571-584 (2020).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. S. Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936 (2018).
- Truskey, G. A. Human microphysiological systems and organoids as in vitro models for toxicological studies. Frontiers in Public Health. 6, 185 (2018).
- Caipa Garcia, A. L., Arlt, V. M., Phillips, D. H. Organoids for toxicology and genetic toxicology: applications with drugs and prospects for environmental carcinogenesis. Mutagenesis. , (2021).
- Augustyniak, J., et al. Organoids are promising tools for species-specific in vitro toxicological studies. Journal of Applied Toxicology. 39 (12), 1610-1622 (2019).
- Zietek, T., et al. Organoids to study intestinal nutrient transport, drug uptake and metabolism - Update to the human model and expansion of applications. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 577656 (2020).
- Zietek, T., Rath, E., Haller, D., Daniel, H. Intestinal organoids for assessing nutrient transport, sensing and incretin secretion. Scientific Reports. 5 (1), 1-10 (2015).
- Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 1-17 (2021).
- Borcherding, D. C., et al. Sa1976 polyphenols reverse the pathologic effects of palmitic acid and high fat diet in canine enteroids. Gastroenterology. 158 (6), 486 (2020).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 0231423 (2020).
- Zdyrski, C., et al. Su124 homology directed repair in canine duodenal enteroids to mimic the wild-type P-glycoprotein mutation. Gastroenterology. 160 (6), 625 (2021).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Kurr, L. A., Allenspach, K., Jergens, A., Mochel, J. P. Harnessing the biology of intestinal organoids to accelerate drug discovery in inflammatory bowel disease: A one health approach. The FASEB Journal. 34, 1 (2020).
- Nantasanti, S., et al. Disease modeling and gene therapy of copper storage disease in canine hepatic organoids. Stem Cell Reports. 5 (5), 895-907 (2015).
- Favier, R. P., et al. COMMD1-Deficient dogs accumulate copper in hepatocytes and provide a good model for chronic hepatitis and fibrosis. PLoS ONE. 7 (8), 42158 (2012).
- Kruitwagen, H. S., et al. Long-term survival of transplanted autologous canine liver organoids in a COMMD1-deficient dog model of metabolic liver disease. Cells. 9 (2), 410 (2020).
- Vilgelm, A. E., et al. Fine-needle aspiration-based patient-derived cancer organoids. iScience. 23 (8), 101408 (2020).
- Saxena, K., et al. Human intestinal enteroids: A new model to study human rotavirus infection, host restriction, and pathophysiology. Journal of Virology. 90 (1), 43-56 (2016).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Mackenzie, J. S., Jeggo, M. The one health approach-why is it so important. Tropical Medicine and Infectious Disease. 4 (2), 88 (2019).
- Artegiani, B., Clevers, H. Use and application of 3D-organoid technology. Human Molecular Genetics. 27 (2), 99-107 (2018).
